本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及構(gòu)建含降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯酶系基因的工程微藻治理聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯污染的水體的方法。具體是一種應(yīng)用攜帶聯(lián)苯2，3-雙加氧酶大亞基(2，3-biphenyldioxygenaselargesubunit)基因表達(dá)框架、聯(lián)苯2，3-雙加氧酶小亞基(biphenyldioxygenasesmallsubunit)基因表達(dá)框架、聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶(biphenyldihydrodioldehydrogenase)基因表達(dá)框架、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶(2，3-dihydroxybiphenyl1，2-dioxygenase)基因表達(dá)框架和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶(2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2，4-dienoicacidhydrolase)基因表達(dá)框架的基因工程藻吸收和消化水體中的聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯，而治理水體的聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯污染。
聯(lián)苯是煤焦油、石油和天然氣等物質(zhì)的天然組分，由于煤和石油的不完全燃燒，可通過(guò)廢氣形式排入環(huán)境，然后通過(guò)雨水污染水體。聯(lián)苯結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難于被降解，可造成環(huán)境的長(zhǎng)期污染。多氯聯(lián)苯和聯(lián)苯具有高毒性，能導(dǎo)致人類的癌癥等疾病。雖然商業(yè)上已經(jīng)禁用多氯聯(lián)苯，但多氯聯(lián)苯的半衰期很長(zhǎng)，化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有富集的特征，除了多氯聯(lián)苯的商業(yè)產(chǎn)品之外，有色金屬冶煉和水泥等行業(yè)的副產(chǎn)品也是環(huán)境中多氯聯(lián)苯的來(lái)源。大氣、土壤，尤其是江河湖海正在遭受著聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的污染，多氯聯(lián)苯和聯(lián)苯是食物鏈污染的主要來(lái)源。由于多氯聯(lián)苯和聯(lián)苯的水體污染對(duì)人類的健康的危害，近些年來(lái)，人們對(duì)水體多氯聯(lián)苯和聯(lián)苯的污染的治理做了多方面的研究，歸納起來(lái)有物理、化學(xué)和生物方法。物理和化學(xué)方法成本高，生物法的優(yōu)勢(shì)在于成本低，但缺乏既含完整的降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的酶系又能在水體中良好地自養(yǎng)繁殖的生物，從而限制了生物法在降解水體的聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的應(yīng)用。
聯(lián)苯2，3-雙加氧酶(包括聯(lián)苯2，3-雙加氧酶大亞基和聯(lián)苯2，3-雙加氧酶小亞基)、聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶具有聯(lián)合水解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的作用，是降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的酶系。其作用的機(jī)制是：聯(lián)苯2，3-雙加氧酶(聯(lián)苯2，3-雙加氧酶大亞基和聯(lián)苯2，3-雙加氧酶小亞基)催化聯(lián)苯/多氯聯(lián)苯的2，3位上加一分子氧，形成聯(lián)苯二氫二醇→在聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶的催化下生成2，3-二羥基聯(lián)苯→在2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶催化下降解開環(huán)，生成2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸→在2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶作用下，水解生成無(wú)毒性的苯甲酸和2-羥基-2，4-戊二烯酸，2-羥基-2，4-戊二烯酸在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步代謝為乙酰輔酶a，乙酰輔酶a進(jìn)入三羧酸循環(huán)，代謝為生物體的能量。
藻能自養(yǎng)生存于各種水環(huán)境(包括淡水、海水和污水等)，適合于廣泛的溫度和ph值環(huán)境下繁殖，在繁殖過(guò)程中通過(guò)光合作用大量吸收大氣中的co2和向大氣釋放o2，藻有飼用、食用、藥用和產(chǎn)油脂等多種用途；藻具有吸附聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的功能。但由于它缺乏降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的酶系，當(dāng)它對(duì)于聯(lián)苯和(或)多氯聯(lián)苯的吸附達(dá)到域值時(shí)將不能再吸附，即天然的藻對(duì)于聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的吸附是極其有限的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了解決用生物法治理水體聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯所面臨的缺乏既含完整的降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的酶系又能在水體中良好地自養(yǎng)繁殖的生物，而限制了生物法在降解水體的聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的應(yīng)用的問(wèn)題，利用藻是對(duì)環(huán)境有益的生物，有吸附聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的特性，針對(duì)藻缺乏降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的酶系的問(wèn)題，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建攜帶2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架，2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的基因工程藻(即含降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯酶系基因的基因工程藻)。通過(guò)基因工程藻的應(yīng)用，由于基因工程藻細(xì)胞具有表達(dá)降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯酶系基因的功能，這些酶能將被吸附進(jìn)藻細(xì)胞的聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯進(jìn)行分解，使藻對(duì)于聯(lián)苯的吸附保持持續(xù)性，即吸附-分解反復(fù)進(jìn)行從而不斷地消耗水體中的聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯。本發(fā)明提供一種應(yīng)用含降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯酶系基因的基因工程藻吸附和水解來(lái)自水體的聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的治理水體聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯污染的方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
一種應(yīng)用基因工程藻治理聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯污染的水體的方法，其步驟是：
1.構(gòu)建含2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架，2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的藻組成型表達(dá)載體。
1.1應(yīng)用分子生物學(xué)的基因克隆技術(shù)克隆植物或微生物的2，3-雙加氧酶大亞基基因，2，3-雙加氧酶小亞基基因，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因。
1.2獲得構(gòu)建表達(dá)載體的相關(guān)原件[啟動(dòng)子，重組序列，轉(zhuǎn)錄終止子序列、抗性基因、大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，氨芐青霉素抗性基因，能抑制天然的(即非基因工程的)藻細(xì)胞增殖的抗生素基因，多克隆位點(diǎn)]
1.3構(gòu)建如附圖的含2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架，2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的藻的組成型表達(dá)載體。
2.構(gòu)建含2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架，2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的基因工程藻(說(shuō)明.表達(dá)框架的dna序列組成：組成型啟動(dòng)子-基因-轉(zhuǎn)錄終止子)。
2.1將含2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架，2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的藻的組成型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化藻基因組。
2.2篩選高表達(dá)重組酶的重組子作為含2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架，2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的基因工程藻。
3.將含2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架，2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的基因工程藻應(yīng)用于治理被聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯污染的水體。
本發(fā)明的應(yīng)用基因工程藻治理聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯污染的水體的方法的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于：
應(yīng)用基因重組策略，構(gòu)建含降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯酶系基因的基因工程藻，使降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯酶系基因在基因工程藻中表達(dá)，在降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯酶系的聯(lián)合作用下，將吸附進(jìn)入基因工程藻細(xì)胞的聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯分解，改變?cè)逡蛉狈到饴?lián)苯和多氯聯(lián)苯酶系基因而只能吸附聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯，但是不能分解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯，使其對(duì)于聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的吸附極其有限的性能。通過(guò)基因工程藻的構(gòu)建和應(yīng)用，通過(guò)基因工程藻細(xì)胞中降解聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯酶系基因的表達(dá)使其對(duì)于聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯的吸附和分解保持持續(xù)性，被基因工程藻消化的聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯所生成的乙酰輔酶a進(jìn)入三羧酸循環(huán)，將對(duì)環(huán)境有害的聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，如此的反復(fù)的循環(huán)而不斷地消耗水體中的聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯。本發(fā)明為治理被聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯污染的水體提供一條高效、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)的新途徑。
附圖說(shuō)明
圖1為含2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架，2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因的藻組成型表達(dá)載體圖。
酶1基因表達(dá)框架：2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架；酶2基因表達(dá)框架：2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架；酶3基因表達(dá)框架：聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架；酶4基因表達(dá)框架：2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架；酶5基因表達(dá)框架：2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架；能抑制藻細(xì)胞增殖的抗生素基因表達(dá)框架：能抑制天然的(非基因工程的)藻細(xì)胞增殖的抗生素基因表達(dá)框架：應(yīng)用于篩選藻重組子；大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)：使其載體能在大腸桿菌中復(fù)制；氨芐青霉素基因表達(dá)框架：應(yīng)用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子；藻基因組同源序列：使其載體dna能夠通過(guò)同源交換而重組于藻的基因組。
具體實(shí)施方式
下面采用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
非限定性實(shí)施例：
1.構(gòu)建含2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架，2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架、2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的藻組成型表達(dá)載體。
1.1構(gòu)建克隆載體
由專業(yè)的dna序列合成公司合成包含氨芐青霉素基因序列(ttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccactgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcat)、多克隆接頭和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條dna鏈序列的兩端形成粘性末端。通過(guò)t4dna連接酶的作用使其環(huán)化，形成dna克隆載體。將這克隆載體命名為ph。
1.2根據(jù)已知的基因序列，委托從事dna合成業(yè)務(wù)的公司合成帒嘞菌(dyella)的2，3-雙加氧酶大亞基基因[見基因序列表所附的<210>1的dna序列]，2，3-雙加氧酶小亞基基因[見基因序列表所附的<210>3的dna序列]，2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因[見基因序列表所附的<210>7的dna序列]和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因[見基因序列表所附的<210>9的dna序列]；以及委托從事dna合成業(yè)務(wù)的公司合成芽孢桿菌(bacillus)的聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因[見基因序列表所附的<210>5的dna序列]。在基因序列合成時(shí)，在每個(gè)基因序列的5’端和3’端都加上限制性dna內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
1.3分別構(gòu)建各種酶基因表達(dá)框架
1.3.1由從事dna合成業(yè)務(wù)的公司合成花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子序列(catggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaacacgggggact)。在dna序列合成時(shí)，在序列的5’端和3’端都加上限制性dna內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
1.3.2由從事dna合成業(yè)務(wù)的公司合成轉(zhuǎn)錄終止子序列(ccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaagttcgtttgtgcaagctt)。在dna序列合成時(shí)，在序列的5’端和3’端都加上限制性dna內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
1.3.3用重疊pcr法合成如下g418抗性基因序列(caattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcat)。在dna序列合成時(shí)，在序列的5’端和3’端都加上限制性dna內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
1.3.4pck擴(kuò)增藻的基因組序列
合成如下pcr引物：
引物1.5'tacgtacatgtctaagtataaactgc3’(有下劃線的6個(gè)堿基是dna限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
引物2.5’cctagggtactgttcgctatcgtctct3’(有下劃線的6個(gè)堿基是dna限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
應(yīng)用植物dna提取試劑盒提取小球藻的基因組dna。以小球藻藻的的基因組dna為模板，應(yīng)用引物1和引物2進(jìn)行pcr擴(kuò)增出約3600的dna片段，將獲得的pcr產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用ncbi提供的blast軟件分析證明是小球藻的基因組序列的片段。
1.3.5構(gòu)建基因表達(dá)框架(啟動(dòng)子-基因-轉(zhuǎn)錄終止子序列)
a.構(gòu)建2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架：
通過(guò)dna限制性內(nèi)切酶和t4dna連接酶的作用，將花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子dna序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)；將帒嘞菌(dyella)的2，3-雙加氧酶大亞基基因序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子dna序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架的載體稱為ph1。
b.構(gòu)建2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架：
通過(guò)dna限制性內(nèi)切酶和t4dna連接酶的作用，將花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子dna序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)；將帒嘞菌(dyella)的2，3-雙加氧酶小亞基基因序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子dna序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架的載體稱為ph2。
c.構(gòu)建聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架：
通過(guò)dna限制性內(nèi)切酶和t4dna連接酶的作用，將花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子dna序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)；將芽孢桿菌(bacillus)的聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子dna序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架的載體稱為ph3。
d.構(gòu)建2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架：
通過(guò)dna限制性內(nèi)切酶和t4dna連接酶的作用，將花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子dna序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)；將帒嘞菌(dyella)的2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子dna序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架的載體稱為ph4。
e.構(gòu)建2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架：
通過(guò)dna限制性內(nèi)切酶和t4dna連接酶的作用，將花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子dna序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)；將帒嘞菌(dyella)的2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子dna序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止子序列重組于ph載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的載體稱為ph5。
f.將以上5套基因表達(dá)框架組裝于同一個(gè)克隆載體。
通過(guò)dna限制性內(nèi)切酶和t4dna連接酶的作用，切取ph2，ph3，ph4和ph5載體的表達(dá)框架，并將切下的這套表達(dá)框架依次插入于ph1的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為ph12345。
g.通過(guò)dna限制性內(nèi)切酶和t4dna連接酶的作用將g418基因和小球藻的基因組dna片段重組于ph12345載體的多克隆位點(diǎn)，從而構(gòu)成含2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架、2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架、聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的藻組成型表達(dá)載體。
h.將構(gòu)建的的藻組成型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后提取載體dna。以載體dna為模板，分別應(yīng)用這5個(gè)酶基因的基因特異引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行dna序列測(cè)定證明構(gòu)建的的藻組成型表達(dá)載體中含這5個(gè)酶基因；進(jìn)一步用dna限制性內(nèi)切酶酶切構(gòu)建的的藻組成型表達(dá)載體，通過(guò)對(duì)其的藻組成型表達(dá)載體的分子量分析，證明所構(gòu)建的藻組成型表達(dá)載體是正確的。
1.2構(gòu)建攜帶2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架，2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架、2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的基因工程小球藻
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的小球藻，按10％的接種量接入裝有100mltap培養(yǎng)基的300ml搖瓶中，置于恒溫振蕩光照搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速100rpm，持續(xù)光照培養(yǎng)；取培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)末期的藻培養(yǎng)物，用5000rpm離心10mim收集細(xì)胞；用預(yù)冷的滲透液洗其藻細(xì)胞3次，將藻細(xì)胞重懸于30毫升預(yù)冷的滲透液中，冰上放置1h；5000rpm離心10min，收集細(xì)胞，用電擊緩沖液將藻細(xì)胞調(diào)整至108個(gè)/ml，42℃熱擊10min，冰浴5min，沿管壁加入10微克載體dna及25微克dna鮭精dna，輕輕吹打均勻，冰上放置10min，在電轉(zhuǎn)儀上采用植物轉(zhuǎn)化模式進(jìn)行點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化物涂布于含100微克g418/ml的tap瓊脂平板，于25℃光照培養(yǎng)5天，從g418抗性平板上挑取克隆接種于tap液體培養(yǎng)基繼續(xù)光照培養(yǎng)3d，收集并破碎藻細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行sds-page，根據(jù)sds-page電泳初步分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)。用離子交換和分子篩層析方法分離純化各種目標(biāo)蛋白，然后將分離純化的目標(biāo)蛋白用蛋白印跡法進(jìn)行驗(yàn)證(說(shuō)明.蛋白印跡：委托專業(yè)的多肽合成服務(wù)公司人工合成以上5種酶蛋白序列c端的35個(gè)氨基酸序列，將這些合成的多肽分別注射于家兔制備抗這些多肽的抗體而應(yīng)用于蛋白印跡)證明以上所述的5種基因倒在在其重組藻中表達(dá)。挑選重組蛋白表達(dá)量高的克隆作為基因工程小球藻。
說(shuō)明：
(1)滲透液：0.2mol/l甘露醇，0.2mol/l山梨醇，10％甘油
(2)電擊緩沖液：0.2mol/l甘露醇，0.2mol/l山梨醇，0.08mol/l氯化鉀，0.005mol/lcacl，0.01mol/ln-(2-羥乙基)哌嗪-n′-2-乙烷磺酸
(3)tap培養(yǎng)基：
1)先配置溶液i，溶液ii和溶液iii：
溶液1：
稱取氯化銨8克，含7分子水的硫酸鎂2克，含2分子水的氯化鈣1克，用水溶解并定容至1000毫升。
溶液ii：
稱取磷酸氫二鉀28.8克；磷酸二氫鉀14.4克，用水溶解并定容至100毫升。
溶液iii：
分別稱取含2分子水的乙二胺四乙酸二鈉5克，含7分子水的硫酸鋅2.2克，硼酸1.14克，含4分子水的氯化鋅0.50克，含7分子水的硫酸鐵0.50克，含4分子水的氯化亞錳0.51克，含6分子水的氯化鈷0.016克，含5分子水的硫酸銅0.016克，含4分子水的鉬酸銨0.11克；先將5克含2分子水的乙二胺四乙酸二鈉溶于400ml水中，用naoh調(diào)ph至6.5.再加入上述其余的試劑，補(bǔ)水至500ml。
2)配置tap培養(yǎng)基
稱取三羥甲基氨甲烷鹽酸鹽2.42克，取溶25毫升溶液i，取溶1毫升溶液ii和取溶5毫升溶液iii，1毫升冰醋酸，用水溶解，并定容至1000毫升。配置固體tap培養(yǎng)基則在以上液體培養(yǎng)基中加入1.5％的瓊脂。
1.3應(yīng)用基因工程藻吸收和降解水體聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯
制備6個(gè)相同大小和光照裝置的藻培養(yǎng)池。配置tap液體培養(yǎng)基，然后等量分成兩份。實(shí)驗(yàn)組：在其中的600公斤tap液體培養(yǎng)基中加入0.06克聯(lián)苯和0.06克多氯聯(lián)苯，攪拌溶解后將其倒入三個(gè)藻培養(yǎng)池中，每個(gè)池200公斤，然后在每個(gè)池中接種100克以上構(gòu)建的攜帶2，3-雙加氧酶大亞基基因表達(dá)框架，2，3-雙加氧酶小亞基基因表達(dá)框架，聯(lián)苯二氫二醇脫氫酶基因表達(dá)框架、2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶基因表達(dá)框架和2羥基-6-氧-6-苯基-2，4-己二烯酸水解酶基因表達(dá)框架的基因工程小球藻；對(duì)照組：在另外的600公斤tap培養(yǎng)基中倒入另外三個(gè)藻培養(yǎng)池中，每個(gè)水池200公斤，在每個(gè)池中接種100克天然的(用于構(gòu)建基因工程小球藻)小球藻。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組以同樣的培養(yǎng)條件培養(yǎng)30天。
在每個(gè)培養(yǎng)池中取出等量的培養(yǎng)液，并且每個(gè)池取一式三份的培養(yǎng)液，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法[以gb5009.190-2014《食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)食品中指示性多氯聯(lián)苯含量的測(cè)定方法》]為基礎(chǔ)，對(duì)聯(lián)苯與多氯聯(lián)苯的含量進(jìn)行檢測(cè)。主要步驟為定量取用樣品，使用凈化柱(先后采用酸性硅膠柱、復(fù)合硅膠柱、堿性氧化鋁柱)對(duì)樣品進(jìn)行凈化濃縮后，將濃縮液過(guò)濾即得待測(cè)液。采用gc-ms(氣相色譜-質(zhì)譜)和gc-ecd(氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)法)的方式對(duì)待測(cè)的藻培養(yǎng)液分別進(jìn)行聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯含量檢測(cè)；應(yīng)用統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案(statisticalproductandservicesolutions)軟件其檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行差異性分析，證明實(shí)驗(yàn)組的藻培養(yǎng)液中殘留的聯(lián)苯的量顯著少于對(duì)照組藻的培養(yǎng)液殘留的聯(lián)苯的量(p＜0.001)，實(shí)驗(yàn)組的藻培養(yǎng)液中殘留的多氯聯(lián)苯的量也顯著少于對(duì)照組藻的培養(yǎng)液殘留的多氯聯(lián)苯的量(p＜0.001)。