本發(fā)明涉及分子生物學領域，更特別的，涉及一種lr酶可識別和作用的位點對，包含該位點對的引物對，以及使用該引物對的質粒構建方法。

背景技術：

gateway是一個載體構建方法的名稱，需要通過bp和lr兩個反應。bp反應需要bp酶，lr反應需要lr酶，bp反應是將目的dna片段連接到中間載體，lr反應是將連接到中間載體上的目標片段轉移到終載體上。bp反應是attb與attp特異位點的識別交換，生成attl(載體叫entry載體)和attr特異位點，lr反應是attl和attr特異位點的識別交換，生成attb和attp特異識別位點。attl一般為125bp，我們需要在目標dna片段的左右引物5’端加25bp(bp為堿基數(shù)單位)的attb位點，中間載體上有attp(載體叫pdonr載體)識別位點，終載體上有attr識別位點。

目前大多數(shù)用gateway技術構建載體的實驗室中，主要通過以下兩種方式構建：

第一，通過bp反應將dna目標片段連接到pdonr載體上，得到entry載體，然后entry載體與終載體通過lr反應，將目標片段連接到終載體。但是bp酶價格昂貴，且在實際應用中，由于回收pcr產物的質量不高，濃度要求達不到bp反應的要求，這一步有點難度。

第二，通過酶切的方式將dna片段連接到entry載體上，然后entry載體與終載體通過lr反應，將目標片段連接到終載體。這種方法通過酶切的方式連接載體，舍棄了重組位點連接快速，效率高的優(yōu)點，而且酶切連接方法的單酶切dna片段的連接方向不能確定，雙酶切又存在難以找到兩種酶的效率都高。

2008年，美國的孟山都公司發(fā)了一篇文章，在dna片段的左右引物5’端直接合成attl位點，然后將pcr產物與終載體進行l(wèi)r反應，將目標片段連接到終載體，他們是將原長125bp的attl縮短為48bp，該方法目前還沒有在實驗室中應用。該方法仍然存在缺陷，dna左右引物5’端加的48bp太長，合成引物的費用增多，且在pcr擴增時，因為引物太長，必須通過兩步法擴增dna片段，操作麻煩且也增加了重復引物的合成費用。

2013年美國的life公司也發(fā)了一篇文章，將bp，lr反應一起進行，該方法也少有實驗室應用。該方法雖然減少了實驗步驟，但是，仍然要進行bp反應和lr反應，并且，由于bp反應的試劑成本比較貴。

技術實現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本發(fā)明提供了一種lr酶可識別和作用的位點對，其由序列如seqidno:1所示的寡核苷酸1和序列如seqidno:2所示的寡核苷酸2組成。

本發(fā)明還提供了一種引物對，其由引物1和引物2組成，引物1包括序列如seqidno:1所示的寡核苷酸1和待擴增基因的5’端特征引物，引物2包括序列如seqidno:2所示的寡核苷酸2和所述基因的3’端特征引物，并且寡核苷酸1和寡核苷酸2均處于相應引物的5’端。

優(yōu)選地，寡核苷酸1和寡核苷酸2的5’末端還連接有3-5個鳥苷酸殘基。

本發(fā)明還提供了一種質粒構建方法，其包括以下步驟：

s1：使用權利要求2或3所述引物對擴增待擴增基因，得到pcr產物；

s2：將所述pcr產物連接到媒介質粒上，得到帶有所述基因的媒介質粒；

s3：將帶有所述pcr產物的媒介質粒與帶有attr位點的終質粒進行l(wèi)r反應，得到帶有所述基因的終質粒。

優(yōu)選地，s2中所述媒介質粒為t載體。

優(yōu)選地，s3中所述終質粒為帶有篩選標記的表達質粒，并且s3具體包括：

s31：將帶有所述基因的媒介質粒、所述終質粒以及l(fā)r反應試劑混合，進行l(wèi)r反應，得到反應產物；

s32：用所述反應產物轉化感受態(tài)大腸桿菌細胞；

s33：用所述篩選標記篩選轉化了帶有所述基因的表達質粒的大腸桿菌細胞；

s34：培養(yǎng)s33篩選得到的大腸桿菌細胞，提取質粒，即得到純化的帶有所述基因的表達質粒。

優(yōu)選地，所述大腸桿菌細胞為dh5α。

優(yōu)選地，所述篩選標記為除抗氨芐青霉素抗性以外的抗抗生素抗性。

本發(fā)明將lr反應中l(wèi)r酶的識別位點縮短到25bp左右，大大改進了原有的gateway克隆，使得在表達質粒構建過程中，可繞過bp反應，直接進行l(wèi)r反應，并且使用常用的t載體作為媒介質粒，簡化了操作步驟并節(jié)約了人工成本和試劑成本。

附圖說明

圖1為直接lr反應的原理示意圖；

圖2為pmdc43-gfp的質粒圖；

圖3為pb2gw7.0的質粒圖；

圖4為pjc28的質粒圖；

圖5為attl’-800+pmdc43-gfp的菌落pcr產物電泳圖；

圖6為attl’-800+pb2gw7.0和attl’-800+pjc28的菌落pcr產物電泳圖；

圖7為t-attl’-2600+pmdc43-gfp的菌落pcr產物電泳圖；

圖8為attl’-2600+pb2gw7.0的菌落pcr產物電泳圖。

具體實施方式

以下結合實例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明將傳統(tǒng)的分別為125bp左右的attl特異位點對縮短為各25bp左右(與attb的堿基數(shù)相同)，將該位點對命名為attl’(其中，attl’1序列如seqidno:1所示，attl’2序列如seqidno:2所示)。并分別在然后通過pmd18-t載體為媒介載體，通過lr反應將dna片段連接到終載體上。由于pmd18-t載體為抗氨芐青霉素抗性，所以，終載體載體的篩選標記不能為抗氨芐青霉素抗性。

本實驗中使用800bp和2600bp的dna片段和兩種超表達載體(pmdc43-gfp，pb2gw7.0)的連接以及一種rnai載體(pjc28)的連接，驗證25bp的attl’。其中，pmdc43-gfp、pb2gw7.0和pjc28的質粒圖分別如圖2-4所示。步驟如下：

1.pcr擴增目的片段

使用引物1(seqidno:3)和2(seqidno:4)擴增800bp長的目標片段，引物3(seqidno:5)和4(seqidno:6)擴增2600bp長的目標片段，15μl擴增體系的組成為：模板0.5μl，10×taqbuffer1.5μl，2.5mmdntp0.5μl，引物1/20.5μl/0.5μl,taqdnapolymerase0.4μl，余下為ddh2o。

反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃1000bp/min，31個循環(huán)；72℃延伸5min；25℃10min。

pcr結束后，用1％的瓊脂糖跑電泳，按照膠回收試劑盒(生工生物工程有限公司，中國，上海)回收目標pcr產物。

2.連接pmd18-t

將回收的pcr產物分別連接到pmd18-t(takara，日本)載體上，連接體系和反應條件如表1所示。

表1連接反應體系和條件

3.lr反應

將連接到t載體上的不同大小的片段進行l(wèi)r反應。lr反應的體系和條件如表2所示。

4.轉化dh5α和抗生素篩選

lr反應之后，將反應液轉入到dh5α感受態(tài)細胞(全式金生物，中國，北京)中。(1)將感受態(tài)從-80℃的冰箱中拿出放到冰上5min，待感受態(tài)融化后；(2)反應液全部加入感受態(tài)細胞中，冰浴30min；(3)快速將感受態(tài)混合物、42℃水浴90s；(4)將混合物拿出，冰浴3min；(5)加入800μl的lb液體培養(yǎng)基，37℃，180r/min培養(yǎng)45min；(6)將培養(yǎng)物7000r/min，1min離心，去掉700μl上清，用剩下的100μllb培養(yǎng)基將沉淀物用槍吸打混勻，用涂棒將100μl菌液均勻涂抹于含相應抗生素的培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。

5.菌落pcr驗證

12h后挑選長出的菌落為模板做菌落pcr，體系同前，所用引物以及延伸時間都與擴增dna片段的pcr條件對應。結果如圖5-8所示：圖5中1-18泳道為t-attl’-800+pmdc43-gfp的菌落pcr，其中3、7和12泳道出現(xiàn)了目標帶；圖6中1-3泳道為t-attl’-800+pb2gw7.0的菌落pcr，其中1和3泳道出現(xiàn)了目標帶；圖6中4-8泳道為t-attl’-800+pjc28的菌落pcr，其中第7和8泳道出現(xiàn)了目標帶；圖7為t-attl’-2600+pmdc43-gfp的菌落pcr，其中1和2泳道出現(xiàn)了目標帶；圖8為t-attl’-2600+pb2gw7.0的菌落pcr，其中第1和2泳道出現(xiàn)了目標帶。

由此可見，該方法能夠通過將pcr產物與t載體連接后直接進行l(wèi)r反應，并得到期望的克隆。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

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序列表

<110>華中農業(yè)大學

<120>一種lr酶可識別和作用的位點對和引物對及質粒構建方法

<130>1

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ccaactttgtacaaaaaagcagtc24

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ccaactttgtacaagaaagctgg23

<210>3

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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<210>5

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

<211>49

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

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