一種重組轉(zhuǎn)氨酶及其制備方法與應用與流程

文檔序號：11626167閱讀：353來源：國知局

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種重組轉(zhuǎn)氨酶及其制備方法和應用。

背景技術：

轉(zhuǎn)氨酶(transaminase)是不對稱合成光學純手性胺的關鍵酶，為輔酶磷酸吡哆醛(plp)依賴型，在動、植物和微生物中分布廣泛。其中ω-轉(zhuǎn)氨酶是從前手性酮出發(fā)制備光學純胺類化合物的高效催化劑，因其優(yōu)良的催化活性和對映體選擇性成為了不對稱合成手性胺類化合物的重要選擇之一。

2006年10月，美國食品藥品管理局(fda)批準磷酸西他列汀單水合物(sitagliptin，商品名januvia)用于治療ⅱ型糖尿病。西他列汀可抑制胰高血糖素的分泌和胰島β細胞增殖及提高葡萄糖耐受水平，其降糖作用較為適中，不引起患者水腫及體重增加，導致低血糖的風險較小，并且無增加體重、惡心、嘔吐等副作用。西他列汀單獨使用或與其他降糖藥合用，均可達到降糖的目的。

目前西他列汀及其中間體的合成方法有多種，其中化學合成方法存在反應路線長、需要使用有毒原料、產(chǎn)物收率和光學純度低、反應條件苛刻等缺點；而酶催化合成西他列汀及其中間體具有反應條件溫和、對映體選擇性強、產(chǎn)物的收率、產(chǎn)物容易分離純化、能耗低、催化劑無毒且可降解等綠色合成過程的優(yōu)點，具有很好的應用前景。本發(fā)明開發(fā)了一種具有優(yōu)良的催化活性和對映選擇性，且底物及溶劑耐受性好的重組轉(zhuǎn)氨酶，可用于大規(guī)模催化合成手性胺化合物，特別是催化合成西他列汀及其中間體(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是，針對目前西他列汀及其中間體合成路線長、需要使用有毒原料、產(chǎn)物收率和手性純度低、反應條件苛刻等缺點，提供一種催化活性高、對映選擇性好、底物耐受性好的重組轉(zhuǎn)氨酶，該轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因，含有該基因的重組表達載體、重組表達轉(zhuǎn)化體及其制備方法，以及該重組轉(zhuǎn)氨酶突變體在催化制備手性胺化合物中的應用。特別的，將該重組轉(zhuǎn)氨酶用于西他列汀及其中間體(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的制備。

本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：

一種高活性的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體，以seqidno.3所示的基因編碼的煙曲霉(aspergillusfumigatusaf293)野生型轉(zhuǎn)氨酶為出發(fā)酶；所述的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體氨基酸序列為seqidno.2。

本發(fā)明中seqidno.3所示的核酸來源于煙曲霉(aspergillusfumigatusaf293)。本發(fā)明所述seqidno.3所示的核酸可以從煙曲霉(aspergillusfumigatusaf293)的基因組中分離獲得，也可以從含有seqidno.3所示核酸的重組表達載體或者重組轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可以人工合成獲得。

一種編碼本發(fā)明所述的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體的基因，其核苷酸序列選自seqidno.1。

一種包含本發(fā)明所述的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體編碼基因的重組表達載體。其可通過本領域常規(guī)方法將本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)氨酶基因的核酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成。所述的載體可為本領域常規(guī)的各種載體，如市售的質(zhì)粒、噬菌體或病毒載體等等，優(yōu)選質(zhì)粒pet21a。

一種包含本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體編碼基因或其重組表達載體的重組表達轉(zhuǎn)化體，本發(fā)明優(yōu)選大腸埃希氏菌(escherichiacoli)bl21(de3)。將前述重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌(escherichiacoli)bl21(de3)中，即可得到本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌。

一種制備所述的重組轉(zhuǎn)氨酶的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)該基因工程菌，以及收集和制備重組轉(zhuǎn)氨酶。

所述方法包括在一定生產(chǎn)罐發(fā)酵條件下，進行工業(yè)化制備所述重組轉(zhuǎn)氨酶的步驟；所述的生產(chǎn)罐發(fā)酵條件優(yōu)選：do35％以上，空氣流量1:1.5vvm。

本發(fā)明所述的重組轉(zhuǎn)氨酶應用于不對稱合成手性胺類化合物，特別是用于合成西他列汀及其中間體(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。

本發(fā)明重組轉(zhuǎn)氨酶催化反應如下：

優(yōu)選：在ph6.5～7.5的反應液中，在磷酸吡哆醛存在下，在本發(fā)明所述的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體作用下，以化合物a為底物不對稱酶催化還原制備光學手性胺化合物

其中，r選自

(1)—ocnh2n+1，其中n選自1～8的整數(shù)

(2)

r'1選自h，甲氧基，羥基

(3)

r'2選自h，—cn，—cnh2n+1，—cnh2n+1-mxm，x為鹵素原子。其中n選自1～8的整數(shù)，m選自1～4的整數(shù)；

最佳的，r為—och3，—och2ch3、—ch2ch3或

有益效果：

本發(fā)明開發(fā)到一種具有優(yōu)良的對映體選擇性和催化活性的重組轉(zhuǎn)氨酶突變體，可用于催化合成手性胺化合物。本發(fā)明的重組轉(zhuǎn)氨酶的輔酶為磷酸吡哆醛plp。

本發(fā)明所涉及的酶具有優(yōu)良的對映體選擇性和催化活力，且其催化的反應溫和、對映體選擇性強、反應轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的濃度高、產(chǎn)物容易分離純化且能耗低，易于大規(guī)模制備，具有較好的應用前景。

具體實施方式

實施例1基因工程菌的建立

根據(jù)genbank收錄的煙曲霉(aspergillusfumigatusaf293)轉(zhuǎn)氨酶的基因序列(ncbi登錄號：xm_743728.1)，人工合成該基因片段，通過pcr擴增擴展該片段(片段兩側(cè)加ndeⅰ和bamhⅰ內(nèi)切酶基因片段)，其核苷酸序列如seqidno.3所示。并利用ndeⅰ和bamhⅰ內(nèi)切酶位點將基因插入pet21a質(zhì)粒中，將連接后的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)中建立轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌。其中pcr擴增轉(zhuǎn)氨酶基因的引物為：正向引物f1：ggccacatatgtggacaaagtcttttcggga(seqidno.4)，反向引物r1：ggctgggatcctagccactgccatagtcaaca(seqidno.5)。

實施例2轉(zhuǎn)氨酶突變體基因的獲得

本研究利用易錯pcr方法，對轉(zhuǎn)氨酶進行了蛋白質(zhì)工程改造。易錯pcr是在采用dna聚合酶進行目的基因擴增時，通過調(diào)整反應條件，如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種的dntps濃度或運用低保真度dna聚合酶等，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機突變體。本研究采用保真度較低的聚合酶在特定措施下很容易向擴增產(chǎn)物中摻入隨機突變的原理，同時利用mn²⁺替代天然輔助因子mg²⁺增加易錯概率。

50μlpcr反應體系為：10×擴增緩沖液5μl，4種dntp混合物(2.5mmol/l)各4μl，引物各50pmol，模板dna1.5μg，taqdna聚合酶0.5μl，mg²⁺2mmol/l，加雙蒸水至50μl。

pcr擴增程序為：98℃預變性4min，98℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，進行30個循環(huán)；于72℃下繼續(xù)延伸10min，冷卻至4℃。擴增的基因片段經(jīng)檢測后用1％瓊脂糖凝膠電泳回收，并純化擴增產(chǎn)物，去除多余的引物。

實驗流程

按照實施例1的方法pcr擴增轉(zhuǎn)氨酶基因并利用ndeⅰ和bamhⅰ內(nèi)切酶位點將基因插入至pet21a質(zhì)粒中，作為基因突變模板；

易錯pcr擴增轉(zhuǎn)氨酶的基因，擴增后基因片段鏈接至pet21a載體，將連接后的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)中建立轉(zhuǎn)氨酶基因突變體庫；利用大腸桿菌bl21(de3)為宿主，pet21a質(zhì)粒為載體，表達擴展轉(zhuǎn)氨酶，高通量篩選高活性突變株；突變后對高活性轉(zhuǎn)氨酶基因進行鑒定。篩選出的高活性轉(zhuǎn)氨酶突變體基因的核酸序列如seqidno.1所示。

轉(zhuǎn)氨酶基因引物為：正向引物f1：ggccacatatgtggacaaagtcttttcggga(seqidno.4)，反向引物r1：ggctgggatcctagccactgccatagtcaaca(seqidno.5)。

按實施例1所述方法構(gòu)建表達該轉(zhuǎn)氨酶突變體的基因工程菌。

在獲得突變體序列后,也可以通過化學合成方式合成該基因序列后利用ndeⅰ和bamhⅰ內(nèi)切酶位點將基因插入至pet21a質(zhì)粒中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建基因工程菌。

實施例3轉(zhuǎn)氨酶的搖瓶制備

將實施例1、實施例2構(gòu)建所得的重組大腸桿菌分別接種至50ml含氨芐青霉素(100μg/ml)的lb培養(yǎng)基(蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，ph7.2)中，于37℃，180rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)15小時以上。轉(zhuǎn)接2ml菌體培養(yǎng)液于50ml含氯霉素(或氨芐青霉素)的lb培養(yǎng)基中，置于同樣條件下振蕩培養(yǎng)，定時測量菌液在600nm下的吸光值以監(jiān)測菌體生長密度。當菌液的od600值在0.6-0.8時，加入誘導劑iptg至終濃度為0.2mmol/l，30℃誘導表達12小時以上。表達后通過離心(8000rpm，15min，4℃)收集菌體，并用磷酸緩沖液(ph7.2，50mm)清洗兩次，分散于同樣預冷的緩沖液中，于冰水浴中進行超聲破碎。離心(8000rpm，30min，4℃)收集上清液，濃縮、冷凍干燥得到重組轉(zhuǎn)氨酶或重組轉(zhuǎn)氨酶突變體的粗品粉末。實施例4重組轉(zhuǎn)氨酶活力的測定

以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯為底物，hplc檢測實施例3制備的重組轉(zhuǎn)氨酶活性，從而篩選出能夠表達具有最高轉(zhuǎn)氨酶酶活的基因工程菌。使用島津lc-20at高效液相色譜儀，配備c18柱(150mm×4.6mm,5um)，流動相0.1％三氟乙酸水溶液-甲醇(40:60)，檢測波長254nm，柱溫30℃，流速1.0ml/min。

檢測條件為：反應體系總體積2ml，其中包含0.5-50μmol/l底物，200μl1mol/l異丙胺鹽酸鹽，100μmol5-磷酸吡哆醛，5％-25％(v/v)dmso，500μl酶液，45℃反應30min，測定底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的消耗量和產(chǎn)物(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的生成量。

酶活力單位(u)的定義為：在上述反應條件下，毎分鐘催化生成1μmol(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯所需的酶量或每分鐘消耗1μmol底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯所需的酶量。

測得重組轉(zhuǎn)氨酶突變體的比酶活為765u/g，比野生型的酶活提高了3倍以上。

實施例5重組轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵制備

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：磷酸氫二鉀10.8g/l，磷酸二氫鉀4.8g/l，硫酸銨0.49g/l，nacl9.5g/l，酵母提取物10.2g/l，蛋白胨6.2g/l，甘油15.2g/l，鉬酸銨四水合物0.01g/l。發(fā)酵液通過加入氨水維持ph7.0，罐溫32℃，攪拌轉(zhuǎn)速300-1300rpm，發(fā)酵過程中控制do35％以上，空氣流量1:1.5vvm。接入種子液的od600為0.68，接入量為發(fā)酵液體積的10-15％，發(fā)酵液od600達0.8時加入iptg至終濃度1mmol/l以誘導轉(zhuǎn)氨酶的表達，此后繼續(xù)發(fā)酵18小時，罐溫25℃。發(fā)酵過程中通過加入含甘油412g/l、酵母提取物136g/l，氯化銨10.7g/l、鉬酸銨四水合物0.03mg/l的溶液維持培養(yǎng)物的生長。發(fā)酵結(jié)束后將培養(yǎng)物冷卻至4℃保存。

將發(fā)酵液經(jīng)離心(10000rpm，15min)、細胞破碎、冷凍干燥等常規(guī)處理，制備得到轉(zhuǎn)氨酶多肽凍干粉并于-80℃保存。

實施例6重組轉(zhuǎn)氨酶催化合成(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯

向2000l反應釜中加入34.2kg底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，138.6kg異丙胺鹽酸鹽，0.58kg5-磷酸吡哆醛(plp)，578ldmso，隨后向釜內(nèi)投加按照實施例5方法制備的重組轉(zhuǎn)氨酶凍干粉1.16kg，在氮氣保護下，升溫至45℃，并加入4mol/l異丙胺水溶液調(diào)節(jié)反應液的ph為8.5。反應過程中通過加入4mol/l異丙胺水溶液控制反應液的ph為8.5-9.0，攪拌反應至底物含量降至1％以下時終止反應。

反應終止后經(jīng)離心、萃取、脫色等操作，得到產(chǎn)物(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯：¹hnmr(cdcl3)d7.08(m,1h),6.94(m,1h),3.85(s,2h),3.77(s,3h),3.55(s,2h)；¹³cnmr(cdcl3)d197.9,167.1,156.9,154.5,150.4,147.9,145.5,119.4,117.0,105.5,52.4,48.3,41.9。經(jīng)hplc分析，確定底物轉(zhuǎn)化率98.2％，產(chǎn)物ee99％。

產(chǎn)物ee值的具體分析條件為：chiralpakad-h色譜柱(150mm×4.6mm,5um)，流動相正己烷-異丙醇(80:20，v/v)；檢測波長254nm，流速1ml/min，柱溫30℃。

<110>宿遷阿爾法科技有限公司

<120>一種重組轉(zhuǎn)氨酶及其制備方法與應用

<160>5

<210>1

<211>972

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>重組轉(zhuǎn)氨酶突變體的編碼基因

<400>1

atggcctctatggacaaagtcttttcgggatattatgcgcgccagaagctgcttgaacgg60

agcgacaatcctttctctaagggcattgcttatgtggaaggaaagctcgtctttcctagt120

gatgctagaataccgctactcgacgaaggtttcatgcacagtgacctaacctatgatgtt180

atatcggtttgggatggtcgcttctttcgattggacgatcatttgcaacggattttggaa240

agctgcgataagatgcggctcaagttcccacttgcactgagcaccgtggaaaatattctg300

gctgagatggtcgccaagagtggtatccgggatgcgtttgtggaagttattgtgacacgt360

ggtctgacaggtgtacgtggttcgaagcctgaggatctgtataataacaacatatacctg420

cttgttcttccatacatttgggttatggcgcctgagaaccagctccatggtggcgaggct480

atcattacaaggacagtgcgacgaacacccccaggtgcatttgatcctactatcaaaaat540

ctacagtggggtgatttaacaaagggactttttgaggcaatggaccgtggcgccacatac600

ccatttctcactgatggagacaccaaccttactgaaggatctggtttcaacattgttttg660

gtgaagaacggtattatctatacccctgatcgaggtgtcttgcgagggatcacacgtaaa720

agtgtgattgacgttgcccgagccaacagcatcgacatccgccttgaggtcgtaccagtg780

gagcaggcttatcactctgatgagatcttcatgtgcacaactgccggcggcattatgcct840

ataacattgcttgatggtcaacctgttaatgacggccaggttggcccaatcacaaagaag900

atatgggatggctattgggagatgcactacaatccggcgtatagttttcctgttgactat960

ggcagtggctaa972

<210>2

<211>323

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>重組轉(zhuǎn)氨酶突變體氨基酸序列

<400>2

metalasermetasplysvalpheserglytyrtyralaargglnlys

51015

letletgltargseraspasnpropheserlysglyilealatyrval

202530

gltglylysletvalthrproseraspalaargileproletletasp

354045

gltglyphemethisseraspletthrtyraspvalileservaltrp

505560

aspglyargphepheargletaspasphisletglnargileletglt

65707580

sercysasplysmetargletlyspheproletalaletserpheval

859095

gltasnileletalagltmetvalalalysserglyileargaspala

100105110

phevalgltvalilevalthrargglyletthrglyvalargglyser

115120125

lysprogltasplettyrasnasnasniletyrletletvalletpro

130135140

tyriletrpvalmetalaprogltasnglnlethisglyglygltala

145150155160

ileilethrargthrvalargargthrproproglyalapheasppro

165170175

thrilelysasnletglntrpglyaspletthrlysglyletpheglt

180185190

alametaspargglyalathrtyrpropheletthraspglyaspthr

195200205

asnletthrgltglyserglypheasnilevalletvallysasngly

210215220

ileiletyrthrproaspargglyvalletargglyilethrarglys

225230235240

servalileaspvalalaargalaasnserileaspileargletglt

245250255

valvalprovalgltglnalatyrhisseraspgltilephemetcys

260265270

thrthralaglyglyilemetproilethrletletaspglyglnpro

275280285

valasnaspglyglnvalglyproilethrlyslysiletrpaspgly

290295300

tyrtrpgltmethistyrasnproalatyrserpheprovalasptyr

305310315320

glysergly

<210>3

<211>972

<212>dna

<213>煙曲霉（aspergillusfumigatusaf293）

<220>

<223>煙曲霉（aspergillusfumigatusaf293）轉(zhuǎn)氨酶的基因序列

<400>3

atggcctctatggacaaagtcttttcgggatattatgcgcgccagaagctgcttgaacgg60

agcgacaatcctttctctaagggcattgcttatgtggaaggaaagctcgtcttacctagt120

gatgctagaataccgctactcgacgaaggtttcatgcacagtgacctaacctatgatgtt180

atatcggtttgggatggtcgcttctttcgattggacgatcatttgcaacggattttggaa240

agctgcgataagatgcggctcaagttcccacttgcactgagctcagtgaaaaatattctg300