通過微陣列分析鑒定的甘藍型油菜種子特異性啟動子的制作方法

文檔序號：11446123閱讀：311來源：國知局

優(yōu)先權聲明

本申請要求2015年1月6日提交的主題為“brassicanapusseedspecificpromotersidentifiedbymicroarrayanalysis”的美國臨時專利申請系列號62/100,394的申請日的利益，將此專利完整并入本文。

發(fā)明領域

本發(fā)明一般而言涉及植物分子生物學領域，更具體地說，涉及轉基因在植物中的表達領域。

背景

許多植物物種能夠被轉基因轉化，以引入農(nóng)藝學上期望的性狀或特征。得到的轉基因植物物種被開發(fā)和/或修飾為具有特定的期望性狀。通常，期望的性狀包括例如，提高營養(yǎng)價值質(zhì)量，增加產(chǎn)量，賦予抗蟲性或抗病性，增加干旱和脅迫耐受性，提高園藝質(zhì)量(例如，著色和生長)，賦予除草劑耐受性，使得能夠從植物生產(chǎn)在工業(yè)上有用的化合物和/或材料，和/或使得能夠生產(chǎn)藥物。

通過植物轉化技術來生產(chǎn)包含疊加在單個基因組基因座處的多個轉基因的轉基因植物物種。植物轉化技術的結果是，轉基因被導入植物細胞中，回收在植物基因組中含有轉基因的穩(wěn)定整合拷貝的能育轉基因植物、并且后續(xù)通過植物基因組的轉錄和翻譯而表達轉基因，從而生成具有期望性狀和表型的轉基因植物。然而期望有這樣的機制，能夠產(chǎn)生高表達被構建為性狀堆疊(traitstack)的多個轉基因的轉基因植物物種。

同樣，期望有這樣的機制，能夠在植物的特定組織或器官內(nèi)表達轉基因。例如，可以借助土傳病原體，用病原體抗性基因轉化植物基因組，使得病原體抗性蛋白在植物根內(nèi)強表達，從而增加植物對感染的抵抗力。或者，可以在處于特定的生長或發(fā)育階段(例如細胞分裂或伸長)的植物組織中表達轉基因。此外，可以在植物的葉和莖組織中表達轉基因。

本文中描述了甘藍型油菜accox基因啟動子調(diào)控元件、含有甘藍型油菜accox基因啟動子調(diào)控元件的構建體/載體、以及利用甘藍型油菜accox基因啟動子調(diào)控元件的方法。

概要

本文公開了用于在植物細胞和/或植物組織中表達轉基因的序列、構建體和方法。在一個實施方案中，本公開涉及包含與轉基因可操作連接的啟動子的基因表達盒，其中該啟動子包含在嚴格條件下與這樣的多核苷酸探針雜交的多核苷酸，該多核苷酸探針包含與seqidno:1的互補物的至少90％序列同一性。在進一步的實施方案中，該啟動子包含與seqidno:1具有至少90％序列同一性的多核苷酸。在另外的實施方案中，啟動子包含含有內(nèi)含子的多核苷酸。在其他實施方案中，所述內(nèi)含子與水稻肌動蛋白內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子或擬南芥泛素10內(nèi)含子具有至少90％序列同一性。在一個實施方案中，啟動子包含含有5′非翻譯區(qū)的多核苷酸。在其他實施方案中，所述可操作連接的轉基因編碼多肽或小rna。在后續(xù)的實施方案中，所述轉基因選自下組：殺蟲抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉基因、dna結合轉基因、和選擇標志物轉基因。在又另一個實施方案中，所述基因表達盒進一步包含3′-非翻譯區(qū)。在一個實施方案中，該3′-非翻譯區(qū)包含與seqidno:2具有至少90％序列同一性的多核苷酸。在一個實施方案中，重組載體包含所述基因表達盒。在實施方案的一個另外的方面，該重組載體選自下組：質(zhì)粒、粘粒、細菌人工染色體、病毒、和噬菌體。在一個實施方案中，轉基因細胞包含所述基因表達盒。在該實施方案的一個后續(xù)的方面，該細胞是轉基因植物細胞。在一個實施方案中，轉基因植物包含所述轉基因植物細胞。在該實施方案的一個另外的方面，該轉基因植物是單子葉植物或雙子葉植物。在該實施方案的其他方面，該雙子葉植物選自下組：擬南芥屬植物、煙草植物、大豆植物、卡諾拉植物和棉花植物。在一個實施方案中，從轉基因植物獲得轉基因種子。在一個后續(xù)的實施方案中，該啟動子是組織優(yōu)先啟動子。在一個另外的實施方案中，該組織優(yōu)先啟動子是胚珠或種子組織優(yōu)先啟動子。在一個實施方案中，該種子組織優(yōu)先啟動子是胚乳組織優(yōu)先啟動子。在又另一個實施方案中，啟動子包含seqidno:1的核苷酸1-1483的多核苷酸序列。

在一個實施方案中，本公開涉及包含在嚴格條件下與多核苷酸探針雜交的合成多核苷酸的轉基因細胞，所述多核苷酸探針包含seqidno:1的互補物的至少90％序列同一性。在一個另外的實施方案中，該合成多核苷酸與seqidno:1具有至少90％序列同一性。在另外的實施方案中，合成多核苷酸包括含有內(nèi)含子的多核苷酸。在其他實施方案中，所述內(nèi)含子與水稻肌動蛋白內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子或擬南芥泛素10內(nèi)含子具有至少90％序列同一性。在一個實施方案中，該合成多核苷酸包含5′非翻譯區(qū)。在一個另外的實施方案中，該轉基因細胞是轉基因植物細胞。在后續(xù)的實施方案中，該轉基因植物細胞是通過植物轉化方法產(chǎn)生的。在一個另外的實施方案中，植物轉化方法選自下組：土壤桿菌介導的轉化法、生物射彈轉化法、碳化硅轉化法、原生質(zhì)體轉化法、和脂質(zhì)體轉化法。在一個實施方案中，轉基因植物包含所述轉基因植物細胞。在一個另外的實施方案中，該轉基因植物是單子葉植物或雙子葉植物。在其他實施方案中，該單子葉植物選自下組：玉米植物、水稻植物、和小麥植物。在該實施方案的其他方面，該雙子葉植物選自下組：擬南芥屬植物、煙草植物、大豆植物、卡諾拉植物和棉花植物。在一個實施方案中，從轉基因植物獲得轉基因種子。在一個另外的實施方案中，該啟動子是組織優(yōu)先啟動子。在一個另外的實施方案中，該組織優(yōu)先啟動子是胚珠或種子組織優(yōu)先啟動子。在一個實施方案中，該種子組織優(yōu)先啟動子是胚乳組織優(yōu)先啟動子。在另一個實施方案中，該合成多核苷酸包含seqidno:1的核苷酸1-1483的多核苷酸序列。

在一個實施方案中，本公開涉及純化的多核苷酸啟動子，其中該啟動子包含在嚴格條件下與這樣的多核苷酸探針雜交的多核苷酸，所述多核苷酸探針包含seqidno:1的互補物的至少90％序列同一性。在進一步的實施方案中，所述純化的多核苷酸啟動子與seqidno:1具有至少90％序列同一性。在另外的實施方案中，所述純化的多核苷酸啟動子包含含有內(nèi)含子的多核苷酸。在其他實施方案中，所述內(nèi)含子與水稻肌動蛋白內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子或擬南芥泛素10內(nèi)含子具有至少90％同一性。在一個實施方案中，所述純化的多核苷酸啟動子包含5′非翻譯區(qū)。在另一個實施方案中，該純化的多核苷酸與轉基因可操作連接。在后續(xù)的實施方案中，所述可操作連接的轉基因編碼多肽或者是小rna。在一個實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的純化的多核苷酸序列，其與3′-非翻譯區(qū)可操作連接。在一個實施方案中，該3′-非翻譯區(qū)包含與seqidno:2具有至少90％序列同一性的多核苷酸。在另一個實施方案中，所述轉基因選自下組：殺蟲抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉基因、dna結合轉基因、和選擇標志物轉基因。在一個實施方案中，重組載體包含所述基因表達盒。在另外的實施方案中，重組載體選自下組：質(zhì)粒載體、粘粒載體和bac載體。在一個實施方案中，轉基因細胞包含所述基因表達盒。在一個后續(xù)的實施方案中，該轉基因細胞是轉基因植物細胞。在一個實施方案中，轉基因植物包含所述轉基因植物細胞。在一個另外的實施方案中，該轉基因植物是單子葉或雙子葉植物。在又另外的實施方案中，所述單子葉植物選自玉米植物、小麥植物、和水稻植物。在該實施方案的其他方面，該雙子葉植物選自下組：擬南芥屬植物、煙草植物、大豆植物、卡諾拉植物和棉花植物。在一個實施方案中，從轉基因植物獲得轉基因種子。在后續(xù)的實施方案中，該純化的多核苷酸序列促進轉基因的組織優(yōu)先表達。在一個另外的實施方案中，該組織優(yōu)先啟動子是胚珠或種子組織優(yōu)先啟動子。在一個實施方案中，該種子組織優(yōu)先啟動子是胚乳組織優(yōu)先啟動子。在其他實施方案中，所述純化的多核苷酸包含seqidno:1的核苷酸1-1483的多核苷酸序列。

在一個實施方案中，本公開涉及一種在轉基因植物中表達異源編碼序列的方法，該方法包括：

a)用包含與異源編碼序列可操作連接的多核苷酸序列的基因表達盒轉化植物細胞，所述多核苷酸序列包含與seqidno:1的至少90％序列同一性，所述異源編碼序列與3′-非翻譯區(qū)可操作連接；

b)分離包含該基因表達盒的轉化的植物細胞；

c)使該轉化的植物細胞再生為轉基因植物；和

d)獲得轉基因植物，其中該轉基因植物包含含有seqidno:1的多核苷酸序列的基因表達盒。

在另外的實施方案中，該多核苷酸序列包含內(nèi)含子。在其他實施方案中，所述內(nèi)含子與水稻肌動蛋白內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子或擬南芥泛素10內(nèi)含子具有至少90％序列同一性。在一個實施方案中，該多核苷酸序列與seqidno:1具有至少90％序列同一性。在一個另外的實施方案中，該異源編碼序列選自下組：殺蟲抗性編碼序列、除草劑耐受性編碼序列、氮利用效率編碼序列、水分利用效率編碼序列、營養(yǎng)品質(zhì)編碼序列、dna結合編碼序列、和選擇標志物編碼序列。在一個另外的實施方案中，利用植物轉化方法轉化植物細胞。在又另一個實施方案中，植物轉化方法選自下組：土壤桿菌介導的轉化法、生物射彈轉化法、碳化硅轉化法、原生質(zhì)體轉化法、和脂質(zhì)體轉化法。在其他實施方案中，所述轉基因植物是單子葉轉基因植物或雙子葉轉基因植物。在其他實施方案中，所述單子葉植物選自玉米植物、小麥植物、和水稻植物。在一個實施方案中，從轉基因植物獲得轉基因種子。在該實施方案的其他方面，該雙子葉植物選自下組：擬南芥屬植物、煙草植物、大豆植物、卡諾拉植物和棉花植物。在一個另外的實施方案中，該異源編碼序列優(yōu)先在組織中表達。在一個另外的實施方案中，該組織優(yōu)先啟動子是胚珠或種子組織優(yōu)先啟動子。在一個實施方案中，該種子組織優(yōu)先啟動子是胚乳組織優(yōu)先啟動子。在其他實施方案中，所述多核苷酸包含seqidno:1的核苷酸1-1483的序列。

在一個實施方案中，本公開涉及分離包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列的方法，該方法包括：

a)鑒定包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

b)產(chǎn)生多個寡核苷酸引物序列，其中所述寡核苷酸引物序列與包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列結合；

c)用選自多個寡核苷酸引物序列的寡核苷酸引物序列從dna樣品擴增包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列，和

d)分離包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列。

在另外的實施方案中，該多核苷酸序列包含內(nèi)含子。在其他實施方案中，所述內(nèi)含子與水稻肌動蛋白內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子或擬南芥泛素10內(nèi)含子具有至少90％序列同一性。在一個實施方案中，該多核苷酸序列包含5′非翻譯區(qū)。在一個另外的實施方案中，包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的分離的多核苷酸序列與轉基因可操作連接。在一個另外的實施方案中，所述可操作連接的轉基因編碼多肽。在一個實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的包含與seqidno:1具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列，其中該轉基因與3′-非翻譯區(qū)可操作連接。在一個實施方案中，該3′-非翻譯區(qū)包含與seqidno:2具有至少90％序列同一性的多核苷酸。在一個另外的實施方案中，該轉基因選自下組：殺蟲抗性編碼序列、除草劑耐受性編碼序列、氮利用效率編碼序列、水分利用效率編碼序列、營養(yǎng)品質(zhì)編碼序列、dna結合編碼序列、和選擇標志物編碼序列。在一個實施方案中，重組載體包含所述基因表達盒。在一個另外的實施方案中，該載體選自下組：質(zhì)粒載體、粘粒載體和bac載體。在一個實施方案中，轉基因細胞包含所述基因表達盒。在一個另外的實施方案中，該轉基因細胞是轉基因植物細胞。在一個實施方案中，轉基因植物包含所述轉基因植物細胞。在一個另外的實施方案中，該轉基因植物是單子葉植物或雙子葉植物。在一個另外的實施方案中，該單子葉植物選自下組：玉米植物、小麥植物、和水稻植物。在一個實施方案中，從轉基因植物獲得轉基因種子。在該實施方案的其他方面，該雙子葉植物選自下組：擬南芥屬植物、煙草植物、大豆植物、卡諾拉植物和棉花植物。在其他實施方案中，所述分離的多核苷酸包含seqidno:1的核苷酸1-1483的多核苷酸序列。

在一個實施方案中，本公開涉及制造包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的合成多核苷酸序列的方法，該方法包括：

a)鑒定包含seqidno:1的多核苷酸序列；

b)分離包含seqidno:1的多核苷酸序列；

c)確定多個包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

d)合成包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；和

e)制造包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的合成多核苷酸序列。

在一個另外的實施方案中，該合成包括：

a)鑒定包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；

b)產(chǎn)生多個寡核苷酸引物序列，其中所述寡核苷酸引物序列與包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列結合；

c)連接所述多個寡核苷酸引物序列，以合成包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列。

在另外的實施方案中，所述合成的多核苷酸序列包含內(nèi)含子。在其他實施方案中，所述內(nèi)含子與水稻肌動蛋白內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子或擬南芥泛素10內(nèi)含子具有至少90％序列同一性。在一個實施方案中，所述合成的多核苷酸序列包含5′非翻譯區(qū)。在一個另外的實施方案中，所述合成的多核苷酸序列包含與seqidno:1的至少90％序列同一性，其與轉基因可操作連接。在又另一個實施方案中，所述可操作連接的轉基因編碼多肽。在一個實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的包含與seqidno:1的至少90％序列同一性的合成多核苷酸序列，所述轉基因與3′-非翻譯區(qū)可操作連接。在一個實施方案中，該3′-非翻譯區(qū)包含與seqidno:2具有至少90％序列同一性的多核苷酸。在又另一個實施方案中，所述轉基因選自下組：殺蟲抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉基因、dna結合轉基因、和選擇標志物轉基因。在一個實施方案中，重組載體包含所述基因表達盒。在另外的實施方案中，重組載體選自下組：質(zhì)粒載體、粘粒載體和bac載體。在一個實施方案中，轉基因細胞包含所述基因表達盒。在一個另外的實施方案中，該轉基因細胞是轉基因植物細胞。在一個實施方案中，轉基因植物包含所述轉基因植物細胞。在一個另外的實施方案中，該轉基因植物是單子葉或雙子葉植物。在其他實施方案中，所述單子葉植物選自下組：玉米植物、小麥植物、和水稻植物。在該實施方案的其他方面，該雙子葉植物選自下組：擬南芥屬植物、煙草植物、大豆植物、卡諾拉植物和棉花植物。在一個實施方案中，從轉基因植物獲得轉基因種子。在其他實施方案中，所述合成的多核苷酸包含seqidno:1的核苷酸1-1483的多核苷酸序列。

在一個實施方案中，構建體包括包含seqidno:1的甘藍型油菜accox基因啟動子的基因表達盒。在一個實施方案中，基因表達盒包含與轉基因或異源編碼序列可操作連接的具有seqidno:1的甘藍型油菜accox基因啟動子。在一個實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的具有seqidno:2的甘藍型油菜accox基因3′-utr。在一個實施方案中，基因表達盒包含與啟動子可操作連接的具有seqidno:2的甘藍型油菜accox基因3′-utr。在一個另外的實施方案中，基因表達盒包含與具有seqidno:1的甘藍型油菜accox基因啟動子可操作連接的具有seqidno:2的甘藍型油菜accox基因3′-utr。在一個實施方案中，基因表達盒包含與轉基因或異源編碼序列可操作連接的具有seqidno:1的甘藍型油菜accox基因啟動子。在一個實施方案中，基因表達盒包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、或更多個轉基因。

在一個實施方案中，基因表達盒獨立地包含：a)seqidno:1的甘藍型油菜accox基因啟動子，和b)seqidno:2的甘藍型油菜accox基因3′-utr。

本文中公開了使用seqidno:1的甘藍型油菜accox基因啟動子和seqidno:2的3′-utr培育表達轉基因的植物的方法。本文中還公開了使用seqidno:1的甘藍型油菜accox基因啟動子和seqidno:2的3′-utr培養(yǎng)表達轉基因的植物組織和細胞的方法。在一個實施方案中，本文中公開的方法包括在植物葉和莖中的組織特異性基因表達。

在一個實施方案中，基因表達盒包括從甘藍型油菜accox基因獲得的啟動子多核苷酸序列seqidno:1。

附圖簡述

圖1顯示了pdab113904的質(zhì)粒圖。

圖2顯示了pdab9381的質(zhì)粒圖。

圖3是轉基因擬南芥植物組織中黃色熒光蛋白表達模式的顯微鏡圖像。小圖f中提供的圖像顯示了在擬南芥植物組織的根內(nèi)yfp蛋白的表達，其由甘藍型油菜accox啟動子驅動并以如pdab113904中所述的3′utr調(diào)控元件終止。小圖g中提供的圖像顯示了在其他植物組織例如莖生葉、花、花柄、種子、和花中yfp蛋白的表達，其由甘藍型油菜accox啟動子驅動并以如pdab113904中所述的3′utr調(diào)控元件終止。莖生葉、花、花柄、種子和花組織中yfp蛋白的表達在多拷貝事件中觀察到。小圖h中提供的圖像顯示了yfp蛋白的早期胚珠表達，定位于胚乳，由甘藍型油菜accox啟動子驅動并以如pdab113904中所述的3′utr調(diào)控元件終止。

實施本發(fā)明的模式

定義

如本文中使用的，冠詞“一個(a)”、“一種(an)”和“該(the)”包括復數(shù)指稱，除非根據(jù)上下文另外清楚且無歧義地另有所指。

如本文中使用的，術語“回交”是指其中育種者使雜交后代與親本之一雜交，例如，第一代雜種f1與f1雜種的親本基因型之一雜交的過程。

如本文中使用的，術語“內(nèi)含子”是指包含在基因(或表達的感興趣核苷酸序列)中的被轉錄不被翻譯的任何核酸序列。內(nèi)含子包括表達的dna序列之內(nèi)的非翻譯核酸序列、以及從所述dna序列轉錄的rna分子中的相應序列。

本文中描述的構建體還可以含有增強翻譯和/或mrna的穩(wěn)定性的序列，如內(nèi)含子。這樣的內(nèi)含子的實例是擬南芥組蛋白變體的基因ii的第一內(nèi)含子或任何其他公知的內(nèi)含子序列。內(nèi)含子可與啟動子序列聯(lián)合用于增強翻譯和/或mrna的穩(wěn)定性。

如本文中使用的，術語“5′非翻譯區(qū)”或“5′-utr”是指前mrna或成熟mrna的5′端中的非翻譯區(qū)段。例如，在成熟mrna上，5′-utr一般在其5′端上包含7-甲基鳥苷帽并涉及許多過程，如剪接、多腺苷酸化、mrna朝向細胞質(zhì)輸出、翻譯機器對mrna的5′端的識別、以及保護mrna免于降解。

如本文中使用的，術語“3′非翻譯區(qū)”或“3′-utr”是指前mrna或成熟mrna的3′端中的非翻譯區(qū)段。例如，在成熟mrna上，這個區(qū)域包含多聚(a)尾并且已知其在mrna穩(wěn)定性、翻譯起始、和mrna輸出中具有多種作用。

如本文中使用的，術語“多腺苷酸化信號”是指存在于mrna轉錄物中的核酸序列，當存在多聚(a)聚合酶時，所述核酸序列允許轉錄物在例如位于多聚(a)信號的下游的10到30個堿基的多腺苷酸化位點上被多腺苷酸化。許多多腺苷酸化信號在本領域是已知的，并可用于本發(fā)明。示例序列包括aauaaa及其變體，正如描述于lokej.等人，(2005),plantphysiology138(3)；1457-1468。

如本文中使用的，術語“分離的”是指這樣的生物學組分(包括核酸或蛋白質(zhì))，其已經(jīng)從該組分所天然存在的生物細胞中的其他生物學組分(即，其他染色體和染色體外的dna)分離。

如本文中使用的，關于核酸分子的術語“純化的”并不要求絕對的純度(比如同質(zhì)的制備物)；而是說明序列相對于其在天然細胞環(huán)境中時更純(與天然水平相比，這個水平例如就濃度或基因表達水平而言應當至少高2-5倍)。dna分子可以直接地獲自總基因組dna或獲自總基因組rna。另外，cdna克隆并非天然存在，而是優(yōu)選地經(jīng)由部分純化的、天然存在的物質(zhì)(通過逆轉錄酶聚合酶逆轉錄的信使rna)的操作獲得。從mrna構建cdna文庫涉及合成物質(zhì)(cdna)的創(chuàng)建。通過攜帶該cdna文庫的細胞的克隆選擇，可從該合成文庫純化單獨的cdna克隆。因此，包括從mrna構建cdna文庫和純化獨特的cdna克隆的過程導致天然信息的大約10⁶倍純化。同樣，可將啟動子dna序列克隆到質(zhì)粒中。這樣的克隆并非天然存在，而是優(yōu)選地經(jīng)由部分純化的、天然存在的物質(zhì)(比如基因組dna文庫)的操作獲得或直接從基因組dna獲得。因此，在這些技術中有利于至少一個數(shù)量級、優(yōu)選兩個或三個數(shù)量級、更優(yōu)選四個或五個數(shù)量級的純化。

類似地，“純化”表示在組分dna序列中已經(jīng)發(fā)生化學或功能變化。已經(jīng)“純化的”核酸分子和蛋白質(zhì)包括通過標準純化方法純化的核酸分子和蛋白質(zhì)。術語“純化的”還包括通過重組dna方法在宿主細胞(例如，植物細胞)中制備的核酸分子和蛋白質(zhì)，以及化學合成的核酸分子、蛋白質(zhì)、和肽。

術語“重組(的)”指的是其中已經(jīng)發(fā)生遺傳重組的細胞或生物。還包括已經(jīng)通過人為干預以人工或合成方式(即，非天然)改變的分子(例如，載體、質(zhì)粒、核酸、多肽、或小rna)。改變可以對處于天然環(huán)境或狀態(tài)中的分子進行，或者對已被移出其天然環(huán)境或狀態(tài)的分子進行。

如本文中使用的，術語“表達”是指將多核苷酸轉錄為mrna(包括小rna分子)的過程和/或藉此隨后將轉錄的mrna(也稱為“轉錄物”)翻譯成肽、多肽、或蛋白質(zhì)的過程?；虮磉_可能受到外部信號的影響，例如細胞、組織、或生物暴露于增加或降低基因表達的物質(zhì)?；虮磉_也可以在從dna到rna再到蛋白質(zhì)的途徑中的任何位置受到調(diào)節(jié)。例如，通過控制對轉錄、翻譯、rna運輸和加工、中間分子比如mrna的降解的作用，或通過在特異性蛋白分子已經(jīng)產(chǎn)生之后的活化、失活、區(qū)室化、或降解，或它們的組合，由此發(fā)生基因表達的調(diào)節(jié)。通過本領域已知的任何方法，包括但不限于，northern印跡、rt-pcr、western印跡，或體外、原位或體內(nèi)蛋白活性測定，可以在rna水平或蛋白質(zhì)水平測量基因表達。

如本文中使用的，術語“基于同源性的基因沉默”或“hbgs”為通用術語，包括轉錄基因沉默和轉錄后基因沉默兩者。靶基因座被與之未連鎖的沉默基因座所沉默的原因可能是由于轉錄抑制(轉錄基因沉默；tgs)或mrna降解(轉錄后基因沉默；ptgs)，二者分別是由于對應于啟動子或轉錄序列的雙鏈rna(dsrna)的產(chǎn)生所致。在每個過程中涉及不同的細胞組分表明，dsrna誘導的tgs和ptgs很可能是由于某種古老的普遍機制發(fā)生了多樣化的結果。然而，由于通常依賴于分析不同的沉默基因座，已經(jīng)難于實現(xiàn)tgs和ptgs的嚴格比較。由于產(chǎn)生對應于不同靶基因的啟動子和轉錄序列的dsrna，一個轉基因基因座可能被描述為既觸發(fā)tgs又觸發(fā)ptgs。

如本文中使用的，術語“核酸分子”、“核酸”、或“多核苷酸”(所有這三個術語彼此同義)是指核苷酸的聚合形式，其可包括rna、cdna、基因組dna、和合成形式的正義和反義鏈、及其混合聚合物。“核苷酸”可以是指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或這兩種類型核苷酸的任一者的修飾形式。除非另外指明，核酸分子通常在長度上具有至少10個堿基。所述術語可以指具有不確定長度的rna或dna分子。所述術語包括dna的單和雙鏈形式。核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修飾核苷酸，它們通過天然存在和/或非天然存在的核苷酸連接而連接在一起。

正如本領域技術人員易于理解的那樣，核酸分子可被化學修飾或生物化學修飾，或者可以含有非天然的或衍生的核苷酸堿基。這些修飾包括，例如，標記物、甲基化、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾(例如，如不帶電連接(unchargedlinkage)的修飾：例如甲基膦酸鹽、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；帶電連接(chargedlinkage)的修飾：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；懸垂部分的修飾：例如肽類；嵌入劑修飾：例如吖啶、補骨脂素等；螯合劑修飾；烷化劑(alkylator)修飾；和修飾的連接：例如α異頭核酸等)。術語“核酸分子”還包括任何拓撲結構，包括單鏈的、雙鏈的、部分雙鏈體的、三鏈體的、發(fā)夾形的(hairpinned)、圓形的、和掛鎖形的結構。

轉錄以5′到3′的方式沿著dna鏈行進。這表明rna是通過向生長中的鏈的3′端連續(xù)添加5′-核糖核苷三磷酸而產(chǎn)生的(消除焦磷酸鹽是必不可少的)。在線性或環(huán)形核酸分子中，如果離散元件以從另一個元件的5′方向結合到或將要結合到同一核酸上，則所述離散元件(例如，特定的核苷酸序列)可被稱為相對于所述另一個元件的“上游”。類似地，如果離散元件以從另一個元件的3′方向結合到或將要結合到同一核酸上，則所述離散元件可為相對于所述另一個元件的“下游”。

如本文中使用的，術語“堿基位置”是指在指定核酸之內(nèi)的給定堿基或核苷酸殘基的位置。通過與參考核酸的比對可定義指定核酸。

如本文中使用的，術語“雜交”是指其中寡核苷酸及其類似物通過互補堿基之間的氫鍵雜交的過程，所述氫鍵包括watson-crick、hoogsteen或反hoogsteen氫鍵。通常，核酸分子由含氮堿基組成，所述堿基為嘧啶(胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u)和胸腺嘧啶(t))或嘌呤(腺嘌呤(a)和鳥嘌呤(g))。這些含氮堿基在嘧啶和嘌呤之間形成氫鍵，并且嘧啶與嘌呤的鍵合被稱為“堿基配對”。更具體地，a會與t或u鍵合，而g會與c鍵合?！盎パa”指在兩條不同的核酸序列或同一核酸序列的兩個不同區(qū)域之間發(fā)生的堿基配對。

如本文中使用的，術語“可特異性雜交”和“特異性互補”是指足夠的互補程度，使得在寡核苷酸與dna或rna靶標之間發(fā)生穩(wěn)定的和特異性的結合。寡核苷酸與和它特異性雜交的靶序列不必100％互補。當寡核苷酸與靶dna或rna分子的結合可干擾該dna或rna的正常功能，并且有足夠的互補程度以避免該寡核苷酸在期望特異性結合的條件下(例如在體內(nèi)測定或系統(tǒng)情形的生理條件下)與非靶序列發(fā)生非特異性結合時，該寡核苷酸是可特異性雜交的。這樣的結合被稱為特異性雜交。導致特定嚴格程度的雜交條件會根據(jù)選擇的雜交方法的性質(zhì)和雜交的核酸序列的組成和長度而變化。通常，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強度(尤其是na⁺和/或mg²⁺濃度)有助于雜交的嚴格性，盡管洗滌時間也影響嚴格性。關于得到特定嚴格程度所需要的雜交條件的計算論述于sambrook等人(編輯),molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,1-3卷,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989。

如本文中使用的，“嚴格條件”涵蓋這樣的條件，在該條件下，只有當雜交分子與dna靶之間的錯配小于50％時才發(fā)生雜交?！皣栏駰l件”包括更具體的嚴格性水平。因此，如本文中使用的，“中等嚴格性”條件為具有50％以上序列錯配的分子不會雜交的條件；“高嚴格性”條件為具有20％以上錯配的分子不會雜交的條件；并且“極高嚴格性”條件為具有10％以上錯配的序列不會雜交的條件。

在特定的實施方案中，嚴格條件可包括：在65℃雜交，然后在65℃用0.1xssc/0.1％sds洗滌40分鐘。以下是代表性的非限制性雜交條件：

·極高嚴格性：在5xssc緩沖液中在65℃雜交16小時；在2xssc緩沖液中在室溫下洗滌兩次，每次15分鐘；并且在0.5xssc緩沖液中在65℃洗滌兩次，每次20分鐘。

·高嚴格性：在5-6xssc緩沖液中在65-70℃雜交16-20小時；在2xssc緩沖液中在室溫下洗滌兩次，每次5-20分鐘；并且在1xssc緩沖液中在55-70℃洗滌兩次，每次30分鐘。

·中等嚴格性：在6xssc緩沖液中在室溫到55℃雜交16-20小時；在2-3xssc緩沖液中在室溫到55℃洗滌至少兩次，每次20-30分鐘。

在一個實施方案中，可特異性雜交的核酸分子可在極高嚴格性雜交條件下保持結合。在一個實施方案中，可特異性雜交的核酸分子可在高嚴格性雜交條件下保持結合。在一個實施方案中，可特異性雜交的核酸分子可在中等嚴格性雜交條件下保持結合。

如本文中使用的，術語“寡核苷酸”是指短的核酸聚合物。寡核苷酸可通過切割較長核酸區(qū)段、或通過使單獨的核苷酸前體聚合而形成。自動合成儀能夠合成在長度上高達幾百個堿基對的寡核苷酸。由于寡核苷酸可與互補的核苷酸序列結合，它們可用作檢測dna或rna的探針。由dna組成的寡核苷酸(寡脫氧核糖核苷酸)可用于聚合酶鏈反應中，聚合酶鏈反應為用于擴增小dna序列的技術。在聚合酶鏈反應中，寡核苷酸一般被稱為“引物”，其允許dna聚合酶延伸寡核苷酸并復制互補鏈。

如本文中使用的，術語“聚合酶鏈式反應”或“pcr”是指其中微量核酸、rna和/或dna被擴增的程序或技術，正如美國專利no.4,683,195中所描述。通常，需要可用的來自感興趣區(qū)域的末端的序列信息或其他信息，使得可以設計寡核苷酸引物；這些引物與有待擴增的模板的相對鏈在序列上相同或相似。兩個引物的5′端核苷酸可與擴增材料的末端一致。pcr可用來擴增特異性rna序列、來自總的基因組dna的特異性dna序列、和從總的細胞rna、噬菌體或質(zhì)粒序列等轉錄的cdna。一般性的參考可見mullis等人，coldspringharborsymp.quant.biol.,51:263(1987)；erlich編輯,pcrtechnology,(stocktonpress,ny,1989)。

如本文中使用的，術語“引物”是指當條件適合于合成引物延伸產(chǎn)物時能夠用作沿著互補鏈的合成的起始點的寡核苷酸。合成條件包括四種不同的脫氧核糖核苷三磷酸和諸如逆轉錄酶或dna聚合酶的至少一種聚合誘導劑的存在。這些物質(zhì)存在于適合的緩沖液中，所述緩沖液可包括作為輔因子或在不同的適當溫度下影響諸如ph等條件的組分。引物優(yōu)選地是單鏈序列，使得擴增效率得以最佳化，不過可以利用雙鏈序列。

如本文中使用的，術語“探針”是指與靶序列雜交的寡核苷酸或多核苷酸序列。在或型測定程序中，探針與位于兩個引物的退火位點之間的靶部分雜交。探針包含約八個核苷酸、約十個核苷酸、約十五個核苷酸、約二十個核苷酸、約三十個核苷酸、約四十個核苷酸、或約五十個核苷酸。在一些實施方案中，探針包含從約八個核苷酸到約十五個核苷酸。

在southern印跡測定程序中，探針與附著到膜上的dna片段雜交。探針包含約十個核苷酸、約100個核苷酸、約250個核苷酸、約500個核苷酸、約1,000個核苷酸、約2,500個核苷酸、或約5,000個核苷酸。在一些實施方案中，探針包含從約500個核苷酸到約2,500個核苷酸。

探針可進一步包含可檢測標記，例如，放射性標記、生物素化標記、熒光團(異硫氰酸熒光素，等)。可檢測標記可直接地共價附接到探針寡核苷酸上，例如位于探針的5′端或探針的3′端。包含熒光團的探針還可進一步包含猝滅劑，例如，blackholequencher^tm、iowablack^tm，等。

如本文中使用的，術語“序列同一性”或“同一性”可以互換地使用并且是指在針對多核苷酸或蛋白質(zhì)片段的指定比較窗口上比對最大對應性時在共享相似堿基組成的兩個序列中的核酸殘基。

如本文中使用的，術語“序列同一性百分比”是指通過在比較窗口上比較兩個最優(yōu)比對序列(例如核酸序列或氨基酸序列)確定的值，其中在該比較窗口中的序列部分可以包含相比于參考序列(不包含添加或缺失)的添加或缺失(即，空位)，以便于這兩個序列的最優(yōu)比對。通過確定相同核酸或氨基酸殘基出現(xiàn)在兩個序列中的位置的數(shù)目而產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，用匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)，將結果乘以100而產(chǎn)生序列同一性的百分比，從而計算出該百分比。用于比較的序列比對方法是熟知的。各種程序和比對算法例如描述于smith和waterman(1981)adv.appl.math.2:482；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443；pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444；higgins和sharp(1988)gene73:237-44；higgins和sharp(1989)cabios5:151-3；corpet等人(1988)nucleicacidsres.16:10881-90；huang等人(1992)comp.appl.biosci.8:155-65；pearson等人(1994)methodsmol.biol.24:307-31；tatiana等人(1999)femsmicrobiol.lett.174:247-50。

美國國家生物技術信息中心(ncbi)基本局部比對搜索工具(blast^tm；altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-10)可從幾個來源獲得，包括美國國家生物技術信息中心(bethesda,md)、以及在互連網(wǎng)上，其與幾種序列分析程序結合使用。怎樣使用該程序確定序列同一性的描述可在互聯(lián)網(wǎng)的blast^tm的“幫助”部分獲得。為了比較核酸序列，可以采用利用默認參數(shù)的blast^tm(blastn)程序的“blast2序列”函數(shù)。在用這種方法評估時，與參考序列具有較大相似性的核酸序列將顯示出同一性百分比的增加。

如本文中使用的，術語“可操作連接”是指被置于與另一種核酸的功能關系中的核酸。通常，“可操作連接”可意指連接的核酸是連續(xù)的?？赏ㄟ^連接在合適的限制性位點處完成連接。如果這樣的位點不存在，則合成的寡核苷酸接頭或連接子被連接或退火到核酸上，并且用于連接鄰接的多核苷酸片段。然而，可操作連接的各元件不必是連續(xù)的。

如本文中使用的，術語“啟動子”是指通常位于基因上游(朝向基因的5′區(qū))并且對于啟動和驅動基因轉錄是需要的dna區(qū)域。啟動子可容許它所控制的基因的正確激活或阻抑。啟動子可含有被轉錄因子識別的特異性序列。這些因子可與啟動子dna序列結合，導致rna聚合酶的募集，所述rna聚合酶從基因的編碼區(qū)合成rna。啟動子通常是指位于基因上游的所有基因調(diào)控元件，包括上游啟動子、5′-utr、內(nèi)含子、和前導序列。

如本文中使用的，術語“上游啟動子”是指足以指導轉錄起始的連續(xù)多核苷酸序列。如本文中使用的，上游啟動子涵蓋具有若干序列基序的轉錄起始位點，所述序列基序包括tata盒、起始序列、tfiib識別元件和其他啟動子基序(jennifere.f.等人，(2002)genes&dev.,16:2583-2592)。該上游啟動子對rna聚合酶ii提供作用位點，所述rna聚合酶ii為具有像tfiia、b、d、e、f和h的基礎或通用轉錄因子的多亞基酶。這些因子組裝成轉錄前起始復合物，所述轉錄前起始復合物催化從dna模板到rna的合成。

上游啟動子的激活是通過另外的調(diào)節(jié)性dna序列元件的序列完成的，其中各種蛋白質(zhì)結合到調(diào)節(jié)性dna序列元件上并且隨后與轉錄起始復合物相互作用而激活基因表達。這些基因調(diào)節(jié)元件序列與特異性dna結合因子相互作用。這些序列基序有時可稱為順式元件。組織特異性或發(fā)育特異性轉錄因子與之結合的這樣的順式元件可單獨地或聯(lián)合地在轉錄水平?jīng)Q定啟動子的時空表達模式。這些順式元件在它們在可操作連接的基因上發(fā)揮作用的控制類型方面變化很大。一些元件響應于環(huán)境反應(例如，溫度、濕度、和傷害)起作用而增加可操作連接的基因的轉錄。其他的順式元件可響應于發(fā)育線索(例如，萌發(fā)、種子成熟、和開花)或響應于空間信息(例如，組織特異性)。參見，例如，langridge等人，(1989),proc.natl.acad.sci.usa86:3219-23。這些順式元件位于轉錄起始位點的不同距離，一些順式元件(稱作近端元件)鄰近最小核心啟動子區(qū)，而其他元件可定位在啟動子(增強子)的上游或下游幾千個堿基處。

“dna結合轉基因”是編碼dna結合蛋白的多核苷酸編碼序列。隨后，dna結合蛋白能夠結合到另一種分子上。結合蛋白可結合到，例如，dna分子(dna結合蛋白)、rna分子(rna結合蛋白)和/或蛋白質(zhì)分子(蛋白質(zhì)結合蛋白)上。在蛋白質(zhì)結合蛋白的情況下，它可與自身結合(形成同二聚體、同三聚體，等)和/或結合到一個或多個不同的蛋白質(zhì)分子上。結合蛋白可具有超過一種類型的結合活性。例如，鋅指蛋白具有dna結合、rna結合和蛋白質(zhì)結合的活性。

dna結合蛋白的實例包括：大范圍核酸酶、鋅指、crispr和tale結合結構域，其可被“工程化”為與預定的核苷酸序列結合。工程化的dna結合蛋白(例如，鋅指、crispr、或tale)一般是非天然存在的蛋白質(zhì)。用于工程化dna結合蛋白的方法的非限制性實例是設計和選擇。設計的dna結合蛋白是非自然界產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其設計/組成主要來自合理標準(rationalcriteria)。用于設計的合理標準包括應用替換原則和計算機化算法對存儲已有zfp、crispr、和/或tale設計和結合數(shù)據(jù)的信息的數(shù)據(jù)庫進行信息處理。參見，例如，美國專利6,140,081；6,453,242；和6,534,261；還參見wo98/53058；wo98/53059；wo98/53060；wo02/016536和wo03/016496和美國公開文本no.20110301073、20110239315和20119145940。

“鋅指dna結合蛋白”(或結合結構域)是一種蛋白質(zhì)，或一種更大蛋白質(zhì)內(nèi)的結構域，其通過一個或多個鋅指以序列特異性的方式結合dna，所述鋅指是結合結構域內(nèi)的氨基酸序列區(qū)域，其結構通過與鋅離子的配位而穩(wěn)定。術語鋅指dna結合蛋白通常簡稱為鋅指蛋白或zfp。鋅指結合結構域可被“工程化”為結合預定的核苷酸序列。用于工程化鋅指蛋白的方法的非限制性實例是設計和選擇。設計的鋅指蛋白是非自然界產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其設計/組成主要來自合理標準(rationalcriteria)。用于設計的合理的標準包括應用替換原則和計算機化算法對存儲已有zfp設計和結合數(shù)據(jù)的信息的數(shù)據(jù)庫進行信息處理。參見，例如，美國專利no.6,140,081；6,453,242；6,534,261和6,794,136；還參見wo98/53058；wo98/53059；wo98/53060；wo02/016536和wo03/016496。

在其他實例中，一種或多種核酸酶的dna結合結構域包含天然存在的或工程化的(非天然存在的)tal效應子dna結合結構域。參見，例如，美國專利公開文本no.20110301073，通過提述將其完整并入本文。已知黃單胞菌屬的植物病原菌在重要作物中引起許多疾病。黃單胞菌屬的致病性依賴于保守的iii型分泌(t3s)系統(tǒng)，其將25種以上不同的效應子蛋白注入植物細胞中。這些注入的蛋白質(zhì)為轉錄激活子樣(talen)效應子，其模擬植物轉錄激活子并操縱植物轉錄組(參見kay等人，(2007)science318:648-651)。這些蛋白質(zhì)含有dna結合結構域和轉錄活化結構域。最充分表征的tal效應子之一是來自野油菜黃單胞菌皰病致病變種的avrbs3(參見bonas等人，(1989),mol.gen.genet.218:127-136和wo2010079430)。tal效應子含有串聯(lián)重復序列的集中域，每個重復序列大致含34個氨基酸，所述氨基酸對于這些蛋白質(zhì)的dna結合特異性是關鍵的。另外，它們含有核定位序列和酸性轉錄活化結構域(對于綜述參見schornacks等人(2006),j.plantphysiol.163(3):256-272)。另外，在植物病原細菌青枯勞爾氏菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在青枯勞爾氏菌生物型菌株gmi1000和生物型4菌株rs1000中的命名為brg11和hpx17的兩個基因與黃單胞菌屬avrbs3家族同源(參見heuer等人，(2007),appl.andenviro.micro.73(13):4379-4384)。這些基因在核苷酸序列上彼此具有98.9％的同一性，但是因在hpx17的重復結構域中的1,575bp的缺失而不同。然而，兩種基因產(chǎn)物都具有與黃單胞菌屬avrbs3家族蛋白小于40％的序列同一性。參見，例如，美國專利公開文本no.20110301073，通過提述將其完整并入。

這些tal效應子的特異性取決于在串聯(lián)重復序列中發(fā)現(xiàn)的序列。重復序列大致包含102個bp，并且重復序列彼此之間一般具有91-100％的同源性(bonas等人，同前)。重復序列的多態(tài)性常常位于位置12和13處，并且在位置12和13處的高變雙殘基的同一性與在tal效應子的靶序列中的連續(xù)核苷酸的同一性之間，似乎存在著在一對一的對應關系(參見moscou和bogdanove，(2009)science326:1501；和boch等人，(2009)science326:1509-1512)。在實驗上，已經(jīng)確定了這些tal效應子的dna識別的天然密碼，使得在位置12和13處的hd序列導致與胞嘧啶(c)結合，ng與t結合，ni與a、c、g或t結合，nn與a或g結合，并且ing與t結合。這些dna結合重復序列已組裝成具有新的重復序列組合和數(shù)目的蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生能夠與新的序列相互作用并激活植物細胞中的非內(nèi)源報告基因表達的人工轉錄因子(boch等人，同前)。工程化的tal蛋白已經(jīng)與foki切割半結構域連接以產(chǎn)生在酵母報告基因測定(基于質(zhì)粒的靶標)中表現(xiàn)出活性的tal效應子結構域核酸酶融合(talen)。

crispr(成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列)/cas(crispr相關的)核酸酶系統(tǒng)是基于可用于基因組工程化的細菌系統(tǒng)的最近工程化的核酸酶系統(tǒng)。其基于許多細菌和古細菌的適應性免疫應答的一部分。當病毒或質(zhì)粒侵入細菌時，侵入物的dna區(qū)段通過“免疫”應答轉化為crisprrna(crrna)。然后，這種crrna通過部分互補區(qū)域與另一類稱為tracrrna的rna結合以將cas9核酸酶引導至與稱為“原型間隔序列”的靶dna中的crrna同源的區(qū)域。cas9在由crrna轉錄物中所含的20-核苷酸引導序列指定的位點處切割dna以在dsb處產(chǎn)生平末端。cas9需要crrna和tracrrna兩者的位點特異性dna識別和切割。這種系統(tǒng)現(xiàn)已被工程化，使得crrna和tracrrna可結合成一個分子(“單個引導rna”)，單個引導rna的crrna等效部分可被工程化以引導cas9核酸酶靶向任何期望序列(參見jinek等人(2012),science337,p.816-821,jinek等人(2013),elife2:e00471；和davidsegal(2013),elife2:e00563)。因此，crispr/cas系統(tǒng)可被工程化以在基因組中的期望靶標處產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)，并且可通過使用修復抑制劑影響dsb的修復而引起易錯修復增加。

在其他實例中，dna結合轉基因為包含工程化的(非天然存在的)大范圍核酸酶(也描述為歸巢核酸內(nèi)切酶)的位點特異性核酸酶。已知歸巢核酸內(nèi)切酶或大范圍核酸酶(如i-scei、i-ceui、pi-pspi、pi-sce、i-sceiv、i-csmi、i-pani、i-sceii、i-ppoi、i-sceiii、i-crei、i-tevi、i-tevii和i-teviii)的識別序列。還參見美國專利no.5,420,032；美國專利no.6,833,252；belfort等人，(1997)nucleicacidsres.25:3379–303388；dujon等人，(1989)gene82:115–118；perler等人，(1994)nucleicacidsres.22:11127；jasin(1996)trendsgenet.12:224–228；gimble等人，(1996)j.mol.biol.263:163–180；argast等人，(1998)j.mol.biol.280:345–353和newenglandbiolabscatalogue。另外，歸巢核酸內(nèi)切酶和大范圍核酸酶的dna結合特異性可被工程化為結合非天然靶位點。參見，例如，chevalier等人，(2002)molec.cell10:895-905；epinat等人，(2003)nucleicacidsres.531:2952-2962；ashworth等人，(2006)nature441:656-659；paques等人，(2007)currentgenetherapy7:49-66；美國專利公開no.20070117128。歸巢核酸內(nèi)切酶和大范圍核酸酶的dna結合結構域總的來說可在核酸酶的背景下予以改變(即，使得核酸酶包括同源切割結構域)或可融合至異源切割結構域。

如本文中使用的，術語“轉化”涵蓋可將核酸分子導入這種細胞中的所有技術。實例包括但不限于：用病毒載體轉染；用質(zhì)粒載體轉化；電穿孔；脂質(zhì)體轉染；顯微注射(mueller等人，(1978)cell15:579-85)；土壤桿菌介導的轉移；直接dna攝??；whiskers^tm介導的轉化；和微粒轟擊。這些技術可用于植物細胞的穩(wěn)定轉化和瞬時轉化兩者。術語“穩(wěn)定轉化”指將核酸片段導入宿主生物的基因組中，從而導致在遺傳上穩(wěn)定的遺傳。一旦穩(wěn)定轉化，該核酸片段穩(wěn)定整合到宿主生物和任何后續(xù)世代的基因組中。含有該轉化的核酸片段的宿主生物被稱為“轉基因”生物。術語“瞬時轉化”指將核酸片段導入宿主生物的細胞核、或含有dna的細胞器中，從而導致不具備在遺傳上穩(wěn)定的遺傳的基因表達。

如本文中使用的，術語“轉基因”是外源核酸序列。在一個實例中，轉基因是基因序列(例如，除草劑抗性基因)、編碼工業(yè)或藥學上有用的化合物的基因、或編碼期望的農(nóng)業(yè)性狀的基因。在又另一個實例中，轉基因為小rna，例如反義核酸序列，其中小rna序列的表達抑制靶核酸序列的表達。轉基因可含有與該轉基因可操作連接的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子、內(nèi)含子、或3′-utr)。在一些實施方案中，感興趣的核酸(或者，替代地描述為感興趣的基因)為轉基因。然而，在其他實施方案中，感興趣的核酸為內(nèi)源核酸，其中所述內(nèi)源核酸的額外基因組拷貝是期望的，或者為相對于宿主生物中的靶核酸序列處于反義取向的核酸。

如本文中使用的，術語“小rna”是指幾類非編碼核糖核酸(ncrna)。術語“小rna”描述了在細菌細胞、動物、植物、和真菌中產(chǎn)生的短鏈ncrna。這些短鏈ncrna可在細胞中天然產(chǎn)生或可以通過導入表達短鏈ncrna的外源序列而產(chǎn)生。小rna序列不直接編碼蛋白質(zhì)，并且與其他rna在功能上不同之處在于，小rna序列僅僅被轉錄而不被翻譯。小rna序列涉及其他細胞功能，包括基因表達和修飾。小rna分子常常由約20個到30個核苷酸構成。小rna序列可衍生自較長的前體。所述前體形成在自身互補區(qū)中彼此折回的結構；然后它們被動物體內(nèi)的核酸酶切丁酶或植物中的dcl1加工。

許多類型的小rna天然存在或人工產(chǎn)生，包括microrna(mirna)、短干擾rna(sirna)、反義rna、短發(fā)夾rna(shrna)、和小核仁rna(snorna)。某些類型的小rna，如microrna和sirna在基因沉默和rna干擾(rnai)中是重要的?；虺聊瞧渲型ǔ１磉_的基因被細胞內(nèi)元件(在這種情況下為小rna)“關閉”的遺傳調(diào)節(jié)過程。通常經(jīng)由此遺傳信息形成的蛋白質(zhì)由于干擾而未形成，并且在該基因中編碼的信息被阻斷表達。

如本文中使用的，術語“小rna”涵蓋rna分子，其在文獻中被描述為“極小rna”(storz,(2002)science296:1260-3；illangasekare等人，(1999)rna5:1482-1489)；原核“小rna”(srna)(wassarman等人，(1999)trendsmicrobiol.7:37-45)；真核“非編碼rna(ncrna)”；“微rna(mirna)”；“小非mrna(snmrna)”；“功能性rna(frna)”；轉運rna(trna)”；“催化性rna”[例如，核酶，包括自身?；嗣?illangaskare等人，(1999)rna5:1482-1489)；“小核仁rna(snorna)”；“tmrna”(又名“10srna”,muto等人，(1998)trendsbiochemsci.23:25-29；和gillet等人，(2001)molmicrobiol.42:879-885)；rnai分子，包括但不限于“小干擾rna(sirna)”、“核酸內(nèi)切酶制備的sirna(e-sirna)”、“短發(fā)夾rna(shrna)”、和“時序調(diào)節(jié)小rna(strna)”；“切丁酶酶切的sirna(d-sirna)”、以及包含至少一個尿嘧啶堿基的適體、寡核苷酸和其他合成核酸。

如本文中使用的，術語“載體”是指當被導入細胞中時，由此產(chǎn)生轉化細胞的核酸分子。載體可以包含允許其在宿主細胞中復制的核酸序列，諸如復制起點。實例包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、細菌人工染色體(bac)、或攜帶外源dna進入細胞的病毒。載體還可包括一個或多個基因、反義分子、和/或選擇標志物基因和本領域已知的其他遺傳元件。載體可以轉導、轉化或感染細胞，由此引起細胞表達核酸分子和/或由該載體編碼的蛋白質(zhì)。任選地，載體可包括輔助核酸分子實現(xiàn)進入細胞中的物質(zhì)(例如，脂質(zhì)體)。

如本文中使用的，術語“盒”、“表達盒”和“基因表達盒”是指可在特異的限制性位點或通過同源重組插入核酸或多核苷酸中的dna區(qū)段。dna區(qū)段包括含編碼小rna或感興趣多肽的感興趣基因的多核苷酸，所述盒和限制性位點被設計為確保所述盒插入用于轉錄和翻譯的正確閱讀框中。在一個實施方案中，表達盒可包含編碼小rna或感興趣多肽的多核苷酸，并且具有除了所述多核苷酸之外的便于特定宿主細胞轉化的元件。在一個實施方案中，基因表達盒還可包括允許小rna或編碼感興趣多肽的多核苷酸在宿主細胞中增強表達的元件。這些元件可包括但不限于：啟動子、最小啟動子、增強子、反應元件、內(nèi)含子、5′非翻譯區(qū)序列、3′非翻譯區(qū)序列、終止子序列、多聚腺苷酸化序列，等。

如本文中使用的，術語“異源編碼序列”用于指示通常在宿主生物中不存在并且在適當條件下可在宿主細胞中表達的編碼或最終編碼肽或蛋白質(zhì)或其等效氨基酸序列(例如酶)的任何多核苷酸。正因為如此，“異源編碼序列”可包括通常在宿主細胞中不存在的編碼序列的一個或多個另外的拷貝，使得該細胞表達通常在細胞中不存在的編碼序列的另外的拷貝。異源編碼序列可以是rna或其任何類型(例如，mrna)、dna或其任何類型(例如，cdna)、或rna/dna雜交體。編碼序列的實例包括但不限于，包括諸如編碼序列、內(nèi)含子、啟動子區(qū)、5′-utr、3′-utr、和增強子區(qū)之類的特征的全長轉錄單位。

“異源編碼序列”還包括肽或酶的編碼部分，即，肽或酶的cdna或mrna序列，以及全長轉錄單位的編碼部分，即，包含內(nèi)含子和外顯子的基因，以及編碼酶或編碼其等效氨基酸序列的“密碼子優(yōu)化的”序列、截短序列或其他形式的改變序列，前提是等效氨基酸序列產(chǎn)生功能蛋白。這樣的等效氨基酸序列可具有一個或多個氨基酸缺失，其中該缺失在n端、c端或內(nèi)部。截短形式在考慮之中，只要它們具有本文中指示的催化能力即可。

如本文中使用的，術語“對照”是指在用于比較目的的分析程序中使用的樣品。對照可為“陽性”或“陰性”。例如，在分析程序的目的為檢測細胞或組織中的差異表達的轉錄物或多肽的情況下，通常優(yōu)選包括陽性對照，例如來自展現(xiàn)出期望表達的已知植物的樣品，以及陰性對照，例如來自缺乏期望表達的已知植物的樣品。

如本文中使用的，術語“植物”包括植物和植物部分，包括但不限于，植物細胞和植物組織，如葉、莖、根、花、花粉、和種子?？捎糜诒景l(fā)明中的植物類別通常寬泛地為適合于誘變的高等和低等植物類別，包括被子植物、裸子植物、蕨類和多細胞藻類。因此，“植物”包括雙子葉和單子葉植物。雙子葉植物的實例包括煙草、擬南芥、大豆、番茄、木瓜、蕓苔、向日葵、棉花、苜蓿、馬鈴薯、葡萄樹、木豆、豌豆、蕓苔屬植物、鷹嘴豆、糖用甜菜、油菜、西瓜、甜瓜、胡椒、花生、南瓜(pumpkin)、蘿卜、菠菜、倭瓜(squash)、綠花椰菜、卷心菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黃瓜、茄子、和萵苣。單子葉植物的實例包括玉米、水稻、小麥、甘蔗、大麥、黑麥、高粱、蘭花、竹子、香蕉、香蒲、百合、燕麥、洋蔥、小米、和黑小麥。

如本文中使用的，術語“植物材料”是指葉、莖、根、花或花的部分、果實、花粉、卵細胞、接合子、種子、插條、細胞或組織培養(yǎng)物、或一種植物的任何其他部分或產(chǎn)物。在一個實施方案中，植物材料包括子葉和葉。在一個實施方案中，植物材料包括種子、胚或胚珠。在一個實施方案中，植物材料包括根組織和位于地下的其他植物組織。

如本文中使用的，術語“選擇標志物基因”是指任選地在植物轉化中使用的基因，以便例如保護植物細胞免受選擇劑的影響或提供針對選擇劑的抗性/耐受性。另外，“選擇標志物基因”意味著涵蓋報告基因。只有那些接收功能性選擇標志物的細胞或植物才能在具有選擇劑的條件下分裂或生長。選擇劑的實例可以包括，例如包括大觀霉素、新霉素、卡那霉素、巴龍霉素、慶大霉素、和潮霉素之類的抗生素。這些選擇標志物包括表達賦予抗生素卡那霉素抗性的酶的針對新霉素磷酸轉移酶的基因(nptii)，和針對有關抗生素新霉素、巴龍霉素、慶大霉素和g418的基因，或表達賦予潮霉素抗性的酶的針對潮霉素磷酸轉移酶的基因(hpt)。其他選擇標志物基因可以包括編碼除草劑抗性的基因，包括bar或pat(針對草胺磷或膦絲菌素的抗性)、乙酰乳酸合酶(als，針對抑制劑諸如磺酰脲類(su)、咪唑啉酮類(imi)、三唑并嘧啶類(tp)、嘧啶氧基苯甲酸類(pob)、和阻止支鏈氨基酸合成第一步的磺?；被驶蜻惖目剐?、草甘膦、2,4-d、和金屬抗性或敏感性?？捎米鬟x擇標志物基因的“報告基因”的實例包括表達的報告基因蛋白的視覺觀察，所述報告基因蛋白例如編碼的蛋白質(zhì)：β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)、螢光素酶、綠色熒光蛋白(gfp)、黃色熒光蛋白(yfp)、dsred、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶(cat)、堿性磷酸酶等。短語“標志物陽性”是指已經(jīng)被轉化而包含選擇標志物基因的植物。

如本文中使用的，術語“可檢測標志物”是指能夠被檢測的標記，例如放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學發(fā)光化合物、金屬螫合劑、或酶?？蓹z測標志物的實例包括但不限于下列各項：熒光標記(例如，fitc、羅丹明、鑭系磷光體)、酶標記(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學發(fā)光標記、生物素基；由次級報道分子識別的預定多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、第二抗體的結合位點、金屬結合結構域、表位標簽)。在一個實施方案中，可檢測標志物可通過不同長度的間隔臂附接，以降低潛在的空間位阻。

如本文中使用的，術語“檢測”在最廣義上用來包括特異性分子的定性和定量測量兩者，例如特異性多肽的測量。

除非另外特別地解釋，本文中使用的全部技術術語和科學術語具有與屬于本公開的領域之內(nèi)的普通技術人員通常所理解的相同的含義?？梢栽谝韵鲁霭嫖镏姓业椒肿由飳W中常見術語的定義：例如，lewin,genesv,oxforduniversitypress,1994；kendrew等人(編)，theencyclopediaofmolecularbiology,blackwellscienceltd.,1994；和meyers(編)，molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,vchpublishers,inc.,1995。

調(diào)控元件

用于基礎研究或生物技術應用的植物啟動子通常是單向的，其僅僅指導融合在其3′端(下游)的轉基因的表達。對于代謝工程和性狀疊加而言，常常有必要在植物內(nèi)強表達轉基因。另外，在轉基因作物中一般需要多個新穎的啟動子來驅動多個基因的表達。在本文中公開了啟動子，它可指導融合在其3′端(下游)的第一基因的表達。

轉基因產(chǎn)品的開發(fā)變得日益復雜，這需要強表達轉基因以及將多個轉基因疊加在單基因座中。傳統(tǒng)上，每個轉基因需要用于表達的獨特啟動子，其中需要多個啟動子來表達一個基因疊加中的不同轉基因。隨著基因疊加的大小增加，這時常導致相同啟動子的重復使用，以獲得用于單個多基因性狀表達的不同轉基因的表達模式的相似水平。已知由相同啟動子驅動的多基因構建體引起基因沉默，從而在該領域產(chǎn)生不十分有效的轉基因產(chǎn)品。由于啟動子重復導致的轉錄因子(tf)結合位點的過量可引起內(nèi)源tf的消耗，從而導致轉錄失活。轉基因的沉默將很可能不良地影響產(chǎn)生的轉基因植物表達轉基因的性能。轉基因內(nèi)的重復序列可引起導致多核苷酸重排的基因座內(nèi)(intra-locus)同源重組。

組織特異性(即，組織優(yōu)先的)或器官特異性啟動子驅動某些組織中(如植物的胚珠、胚、種子、果仁、根、葉或絨氈層中)的基因表達。組織和發(fā)育階段特異性啟動子驅動在特定組織中或在植物發(fā)育過程中特定時期表達的基因的表達。組織特異性啟動子在轉基因植物行業(yè)中對于某些應用是需要的和期望的，因為它們允許異源基因以組織和/或發(fā)育階段選擇性方式特異性表達，表明異源基因在各個器官、組織和/或時間有差別地表達，而非其他。例如，可以借助于土傳病原體通過用病原體抗性基因轉化植物基因組使得病原體抗性蛋白在植物根內(nèi)強表達而實現(xiàn)植物對感染的抵抗力增加?；蛘撸赡芟Ｍ谔幱谔囟ǖ纳L或發(fā)育階段(例如像細胞分裂或伸長)的植物組織中表達轉基因。另一種應用是使用組織特異性啟動子的需要，例如，使得將編碼農(nóng)藝性狀的轉基因的表達局限在發(fā)育的木質(zhì)部中。另一種應用是驅動轉基因在種子、胚珠或胚內(nèi)表達。在組織特異性啟動子的鑒定中保留的一個特殊問題是怎樣鑒定可能最重要的基因及其相應的啟動子，以及怎樣把它們與細胞的具體發(fā)育特性關聯(lián)起來。另一個問題是克隆全部有關的順式作用轉錄控制元件，使得克隆的dna片段以想要的具體表達模式驅動轉錄。一個特殊的問題是鑒定與具體細胞類型、發(fā)育階段和/或不表達于其他植物組織中的植物中的功能有關的組織特異性啟動子。

提供了使用甘藍型油菜accox基因啟動子調(diào)控元件在植物中表達轉基因的方法和構建體。在一個實施方案中，啟動子可以是甘藍型油菜accox基因啟動子，其具有如下序列：

在一個實施方案中，基因表達盒包含啟動子。在一個實施方案中，啟動子可以是本主題公開的甘藍型油菜accox基因啟動子。在一個實施方案中，基因表達盒包含啟動子，其中該啟動子與seqidno:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性。在一個實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子。在一個實施方案中，包含該甘藍型油菜accox基因啟動子的基因表達盒可驅動兩個或更多個轉基因的表達。在說明性實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子，其中所述轉基因可以是殺蟲抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉基因、dna結合轉基因、選擇標志物轉基因、或它們的組合。

還可通過位于基因的編碼序列下游的3′非翻譯區(qū)(即，3′-utr)來調(diào)節(jié)轉基因表達。啟動子和3′-utr兩者都能調(diào)節(jié)轉基因表達。雖然啟動子對于驅動轉錄是必要的，但3′-utr基因區(qū)能終止轉錄并起始用于翻譯和蛋白質(zhì)合成的所得mrna轉錄物的多腺苷酸化。3′-utr基因區(qū)有助于轉基因的穩(wěn)定表達。在一個實施方案中，3′-utr可以是甘藍型油菜accox基因的3′-utr，其具有如下序列：

atggatgtgggattttttatgaaggcaagaaagatggggttttgatatgtgtgtgggcaacaatgttaaataagtattgaagctaatgttatagtagaatcaagaactaagttgtgatcacttatgaatctagtgtggttaagtgtgggagtgtttatgcaataattgtattggaaatatgaattttaaagattatactacaagttcgtaacatttgagatatgaatacttgaaaaaaactcgaatgtttacaaaagtaacaaactcctcacacatgcataattgaaatcatcaacagatttgggcttatgtatattggatcaaaggcccaaaatattttaaaattgtattagggggattctagggcatcactctgtatcctactataaatactcctctagagctgagatttctcatacagcacgggttacagcttacagtcgatgaatcattagagtttctctctttctacacagtagtacagtacacatctcgttttg(seqidno:2)。

在一個實施方案中，基因表達盒包含3′-utr。在一個實施方案中，3′-utr可以是甘藍型油菜accox基因的3′-utr。在一個實施方案中，基因表達盒包含3′-utr，其中該3′-utr與seqidno:2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性。在一個實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因的3′-utr。在說明性實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的3′-utr，其中所述轉基因可以是殺蟲抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉基因、dna結合轉基因、選擇標志物轉基因、或它們的組合。

在一個實施方案中，基因表達盒包含從甘藍型油菜accox基因純化的啟動子和3′-utr。在一個實施方案中，基因表達盒包含：a)啟動子，其中該啟動子與seqidno:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性；和/或，b)3′-utr，其中該3′-utr與seqidno:2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一性。

例如，基因表達盒可包括啟動子和3′-utr兩者，其中該啟動子是多核苷酸seqidno:1，并且該3′-utr是多核苷酸seqidno:2。當基因表達盒包含一個或多個轉基因時，啟動子和3′-utr可與基因表達盒之內(nèi)的不同轉基因可操作連接。在說明性實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子(seqidno:1)，其中所述轉基因可以是殺蟲抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉基因、dna結合轉基因、選擇標志物轉基因、或它們的組合。在說明性實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因3′-utr(seqidno:2)，其中所述轉基因可以是殺蟲抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉基因、dna結合轉基因、選擇標志物轉基因、或它們的組合。

在一個實施方案中，載體包含如本文中公開的基因表達盒。在一個實施方案中，載體可以是質(zhì)粒、粘粒、細菌人工染色體(bac)、噬菌體、病毒、或在轉化或基因打靶中使用的切離多核苷酸片段，如供體dna。

在一個實施方案中，細胞或植物包含如本文中公開的基因表達盒。在一個實施方案中，細胞或植物包含含有如本文中公開的基因表達盒的載體。在一個實施方案中，載體可以是質(zhì)粒、粘粒、細菌人工染色體(bac)、噬菌體、或病毒。由此，包含如本文中公開的基因表達盒的細胞或植物分別是轉基因細胞或轉基因植物。在一個實施方案中，轉基因植物可以是單子葉植物。在一個實施方案中，轉基因單子葉植物可以是，但不限于，玉米、小麥、水稻、高粱、燕麥、黑麥、香蕉、甘蔗、和小米。在一個實施方案中，轉基因植物可以是雙子葉植物。在一個實施方案中，轉基因雙子葉植物可以是，但不限于，大豆、棉花、向日葵、和卡諾拉。一個實施方案還包括來自如本文中公開的轉基因植物的轉基因種子。

在一個實施方案中，基因表達盒包含兩個或更多個轉基因。所述兩個或更多個轉基因可與如本文中公開的甘藍型油菜accox基因啟動子或3′-utr可操作連接。在一個實施方案中，基因表達盒包含一個或多個轉基因。在具有一個或多個轉基因的實施方案中，至少一個轉基因與本主題公開的甘藍型油菜accox基因啟動子或3′-utr可操作連接。

選擇標志物

還描述為報告基因的各種選擇標志物可以被納入經(jīng)選擇的表達載體中，以允許鑒定和選擇經(jīng)轉化的植物(“轉化體”)?？梢垣@得確認選擇標志物在經(jīng)轉化植物中表達的許多方法，例如包括dna測序和pcr(聚合酶鏈反應)、southern印跡法、rna印跡法、用于檢測從載體中表達出來的蛋白質(zhì)的免疫學方法，所述蛋白質(zhì)例如介導膦絲菌素抗性的沉淀蛋白質(zhì)，或其他蛋白質(zhì)的視覺觀察，所述其他蛋白質(zhì)如報告基因編碼的β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)、螢光素酶、綠色熒光蛋白(gfp)、黃色熒光蛋白(yfp)、紅色熒光蛋白(dsred)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶(cat)、堿性磷酸酶，等(參見sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual,thirdedition,coldspringharborpress,n.y.,2001，其全部內(nèi)容通過提述并入本文)。

利用選擇標志物基因來選擇轉化的細胞或組織。選擇標志物基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如編碼新霉素磷酸轉移酶ii(nptii)和潮霉素磷酸轉移酶(hpt)的那些基因，以及賦予對除草化合物的抗性的基因。除草劑抗性基因通常編碼對該除草劑不敏感的修飾的靶蛋白或編碼在植物中在該除草劑能夠起作用之前降解該除草劑或將其脫毒的酶。例如，通過使用編碼突變體靶酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)的基因，已獲得對草甘膦的抗性。針對epsps的基因和突變體是熟知的，并且在下文進一步描述。已經(jīng)通過使用編碼使對應的除草劑脫毒的pat或dsm-2、腈水解酶、aad-1或aad-12基因的細菌基因獲得了對草銨膦、溴苯腈、以及2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)的抗性。

在一個實施方案中，除草劑可以抑制生長點或分生組織，所述除草劑包括包括咪唑啉酮或磺酰脲，并且針對這些除草劑的乙酰羥酸合酶(ahas)和乙酰乳酸合酶(als)的抗性/耐受性的基因是熟知的。草甘膦抗性基因分別包括突變體5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(epsp)和dgt-28基因(經(jīng)由導入重組核酸和/或天然epsp基因的各種形式的體內(nèi)誘變)、aroa基因和草甘膦乙酰轉移酶(gat)基因)。其他膦酰基化合物的抗性基因包括來自鏈霉菌屬物種(包括吸水鏈霉菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌)的bar基因、以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和環(huán)己酮(acc酶抑制劑編碼基因)。賦予對環(huán)己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸(包括氟吡甲禾靈、禾草靈、精惡唑禾草靈、吡氟禾草靈、喹禾靈)抗性的示例性基因包括乙酰輔酶a羧化酶(accase)基因，--acc1-s1、acc1-s2和acc1-s3。在一個實施方案中，除草劑可以抑制光合作用，包括三嗪(psba和1s+基因)或芐腈(腈水解酶基因)。

在一個實施方案中，選擇標志物基因包括但不限于，編碼下列物質(zhì)的基因：新霉素磷酸轉移酶ii；氰酰胺水合酶；天冬氨酸激酶；二氫吡啶二羧酸合成酶；色氨酸脫羧酶；二氫吡啶二羧酸合成酶和脫敏型天冬氨酸激酶；bar基因；色氨酸脫羧酶；新霉素磷酸轉移酶(neo)；潮霉素磷酸轉移酶(hpt或hyg)；二氫葉酸還原酶(dhfr)；膦絲菌素乙酰轉移酶；2,2-二氯丙酸脫鹵素酶；乙酰羥酸合酶；5-烯醇丙酮酰-莽草酸-磷酸合酶(aroa)；鹵代芳基腈水解酶；乙酰輔酶a羧化酶；二氫蝶酸合酶(suli)；和32kd光合體系ii多肽(psba)。

一個實施方案還包括編碼對下列物質(zhì)的抗性的基因：2,4-d；氯霉素；甲氨蝶呤；潮霉素；大觀霉素；溴苯腈；草甘膦；和膦絲菌素。

以上列出的選擇標志物基因并非意味著限制。本發(fā)明涵蓋任何報告基因或選擇標志物基因。

合成選擇標志物基因，以便在植物中優(yōu)化表達。例如，在一個實施方案中，基因的編碼序列已通過密碼子優(yōu)化進行修飾，以增強在植物中的表達。選擇標志物基因可以被優(yōu)化用于在特定的植物物種中表達，或者替代地，被修飾以用于在雙子葉或單子葉植物中優(yōu)化表達。根據(jù)在感興趣的特定植物物種中以最大量表達的蛋白質(zhì)中最高頻率的密碼子，可以確定植物優(yōu)選的密碼子。在一個實施方案中，選擇標志物基因被設計為以較高水平在植物中表達，從而導致較高的轉化效率。用于基因的植物優(yōu)化的方法是熟知的。關于合成的多核苷酸序列的優(yōu)化和制造的指南可例如在wo2013016546、wo2011146524、wo1997013402、美國專利no.6166302、美國專利no.5,380,831中找到，將上述文獻通過提述并入本文。

轉基因

公開的方法和組合物可用于在植物基因組中表達多核苷酸基因序列。因此，可通過植物啟動子驅動編碼除草劑耐受性、抗蟲性、養(yǎng)分、抗生素或其他治療分子的基因的表達。

在一個實施方案中，本主題公開的甘藍型油菜accox基因調(diào)控元件與編碼多核苷酸序列的基因結合或可操作連接，所述多核苷酸序列提供對草甘膦或另一種除草劑的抗性或耐受性，和/或提供選擇昆蟲或疾病的抗性和/或營養(yǎng)增強、和/或改進的農(nóng)藝性狀、和/或在飼料、食品、工業(yè)、制藥或其他用途中有用的蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)品。轉基因可與植物基因組內(nèi)的兩個或更多個感興趣的核酸序列“疊加”。疊加可例如通過使用兩個或更多個事件的常規(guī)植物育種、用含有感興趣的序列的構建體轉化植物、轉基因植物的再轉化、或者經(jīng)由同源重組通過靶向整合添加新的性狀來實現(xiàn)。

這樣的感興趣的多核苷酸序列包括但不限于以下提供的那些實例：

1.賦予害蟲或疾病抗性的基因或編碼序列(例如，irna)

(a)植物疾病抗性基因。植物中疾病抗性基因(r)的產(chǎn)物與病原體中相應的無毒性(avr)基因的產(chǎn)物之間的特異相互作用經(jīng)常激活植物防御?？梢杂每寺〉目剐曰蜣D化植物品種，從而工程構建對特定病原體株有抗性的植物。這樣的基因的例子包括，抵抗黃枝孢霉(cladosporiumfulvum)的番茄cf-9基因(jones等人，1994science266:789)、編碼蛋白激酶的用于抵抗丁香假單胞菌番茄致病變種(pseudomonassyringaepv.tomato)的番茄pto基因(martin等人，1993science262:1432)、以及抵抗丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)的擬南芥rssp2基因(mindrinos等人，1994cell78:1089)。

(b)蘇云金芽孢桿菌蛋白質(zhì)、其衍生物或以其為模本的合成多肽，例如btδ-內(nèi)毒素基因的核苷酸序列(geiser等人，1986gene48:109)和植物殺蟲(vip)基因(參見，例如，estruch等人(1996)proc.natl.acad.sci.93:5389-94)。而且，編碼δ-內(nèi)毒素基因的dna分子可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(rockville,md.)購得，atcc登錄號為40098、67136、31995和31998。

(c)凝集素，例如幾種君子蘭(cliviaminiata)甘露糖結合凝集素基因的核苷酸序列(vandamme等人，(1994),plantmolec.biol.24:825)。

(d)維生素結合蛋白質(zhì)，例如親和素及親和素同源物，其可用作針對昆蟲類害蟲的殺幼蟲劑。參見美國專利no.5,659,026。

(e)酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。這些基因的實例包括水稻半胱氨酸蛋白質(zhì)酶抑制劑(abe等人(1987),j.biol.chem.262:16793)、煙草蛋白酶抑制劑i(huub等人(1993),plantmolec.biol.21:985)、和α-淀粉酶抑制劑(sumitani等人(1993),biosci.biotech.biochem.57:1243)。

(f)昆蟲特異性激素或信息素，例如蛻皮激素和保幼激素或其變體、基于它們的模擬物，或其拮抗劑或激動劑，例如桿狀病毒表達的克隆保幼激素酯酶，其為保幼激素滅活劑(hammock等人(1990),nature344:458)。

(g)昆蟲特異性肽或神經(jīng)肽，其在表達時會擾亂受影響的害蟲的生理機能(j.biol.chem.269:9)。這些基因的實例包括昆蟲利尿激素受體(regan,1994)、在太平洋折翅蠊(diplopterapunctata)中鑒定的咽側體抑制素(allostatin)(pratt,1989)、和昆蟲特異性麻痹神經(jīng)毒素(美國專利no.5,266,361)。

(h)在自然界中由蛇、馬蜂等產(chǎn)生的昆蟲特異性毒液，例如蝎子昆蟲毒性肽(pang(1992),gene116:165)。

(i)負責超富集單萜、倍半萜、甾體、異羥肟酸、苯丙烷衍生物或其他具有殺蟲活性的非蛋白質(zhì)分子的酶。

(j)參與生物活性分子修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如糖酵解酶、蛋白質(zhì)水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶，無論是天然的還是合成的。這樣的基因的實例包括馬蹄蓮基因(pct公開申請wo93/02197)、幾丁質(zhì)酶編碼序列(例如可以獲自atcc登錄號3999637和67152)、煙草鉤蟲幾丁質(zhì)酶(kramer等人(1993),insectmolec.biol.23:691)、以及歐芹ubi4-2聚泛素基因(kawalleck等人(1993),plantmolec.biol.21:673)。

(k)刺激信號轉導的分子。這樣的分子的例子包括綠豆鈣調(diào)蛋白cdna克隆的核苷酸序列(botella等人(1994),plantmolec.biol.24:757)和玉米鈣調(diào)蛋白cdna克隆的核苷酸序列(griess等人(1994),plantphysiol.104:1467)。

(l)疏水矩肽(hydrophobicmomentpeptide)。參見美國專利no.5,659,026和5,607,914，后者教導了賦予疾病抗性的合成抗微生物肽。

(m)膜通透酶，通道形成劑或通道阻斷劑，例如殺菌肽-β裂解肽類似物(jaynes等人(1993),plantsci.89:43)，其使轉基因煙草植物對青枯假單胞菌有抗性。

(n)病毒侵襲性蛋白質(zhì)或由其衍生的復合毒素。例如，在經(jīng)轉化的植物細胞中，病毒衣殼蛋白的積累可賦予針對該衣殼蛋白所來源的病毒以及相關病毒所致的病毒感染和/或疾病發(fā)展的抗性。已經(jīng)給轉化植物賦予了衣殼蛋白介導的針對苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草條紋病毒、馬鈴薯x病毒、馬鈴薯y病毒、煙草蝕紋病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的抗性。參見，例如，beachy等人(1990)ann.rev.phytopathol.28:451。

(o)昆蟲特異性抗體或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆蟲腸道關鍵代謝功能的抗體可以使受影響的酶失活，從而殺死昆蟲。例如，taylor等人(1994)，在第七屆國際分子植物-微生物相互作用研討會(seventhint'l.symposiumonmolecularplantmicrobeinteractions)上的第497號摘要顯示了轉基因煙草中通過產(chǎn)生單鏈抗體片段的酶失活。

(p)病毒特異性抗體。參見，例如，tavladoraki等人(1993),nature266:469表明表達重組抗體基因的轉基因植物受到免于病毒攻擊的保護。

(q)由病原體或寄生物自然產(chǎn)生的發(fā)育阻滯(developmental-arrestive)蛋白。因此，真菌內(nèi)切α-1,4-d多聚半乳糖醛酸酶通過溶解植物細胞壁的均聚-α-1,4-d-半乳糖醛酸而促進真菌定殖和植物營養(yǎng)素釋放(lamb等人(1992),bio/technology10:1436)。toubart等人((1992),plantj.2:367)描述了豆類內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的編碼基因的克隆和表征。

(r)由植物自然產(chǎn)生的發(fā)育阻滯(developmental-arrestive)蛋白，例如大麥核糖體失活基因，其提供了增加的針對真菌疾病的抗性(longemann等人(1992),bio/technology10:3305)。

(s)rna干擾，其中用rna分子抑制靶基因的表達。一個實施例中的rna分子是部分或完全雙鏈的，其觸發(fā)沉默響應，導致dsrna被切割成小的干擾rna，它們隨后被納入到靶向復合體中，靶向復合體破壞同源的mrna。參見，例如，fire等人，美國專利6,506,559；graham等人，6,573,099。

2.賦予除草劑抗性的基因

(a)編碼針對抑制生長點或分生組織的除草劑，例如咪唑啉酮類(imidazalinone)、磺酰苯胺類(sulfonanilide)或磺酰脲類除草劑的抗性或耐受性的基因。這類基因的實例編碼突變體乙酰乳酸合酶(als)(lee等人(1988),emboj.7:1241)，其也被稱作乙酰羥酸合酶(ahas)酶(miki等人(1990),theor.appl.genet.80:449)。

(b)一種或多種另外的編碼針對草甘膦抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性是由突變體epsp合酶和aroa基因賦予的，或者是通過基因如dgt-28、2mepsps、gat(草甘膦乙酰轉移酶)或gox(草甘膦氧化酶)和其他膦酰基化合物，如草銨膦(pat、bar、和dsm-2基因)、以及芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己二酮(acc酶抑制劑編碼基因)所致的代謝失活而獲得的。參見，例如，美國專利no.4,940,835，其公開了可賦予草甘膦抗性的epsp形式的核苷酸序列。編碼突變體aroa基因的dna分子能夠以atcc登錄號39256獲得，并且所述突變體基因的核苷酸序列在美國專利no.4,769,061中公開。歐洲專利申請no.0333033和美國專利no.4,975,374公開了可賦予除草劑如l-膦絲菌素抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。在歐洲申請no.0242246中提供了膦絲菌素乙酰轉移酶基因的核苷酸序列。degreef等人(1989),bio/technology7:61中描述了表達編碼膦絲菌素乙酰轉移酶活性的嵌合bar基因的轉基因植物的產(chǎn)生。賦予針對芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己二酮如稀禾定和甲禾靈(haloxyfop)的抗性的示例性基因是accl-s1、accl-s2和accl-s3基因，如marshall等人在(1992),theor.appl.genet.83:435中所述。

(c)編碼針對抑制光合作用的除草劑如三嗪(psba基因和gs+基因)和芐腈(腈水解酶基因)的抗性或耐受性的基因。przibilla等人在(1991),plantcell3:169描述了編碼轉化衣藻屬(chlamydomonas)的突變體psba基因的質(zhì)粒的用途。在美國專利no.4,810,648中公開了腈水解酶基因的核苷酸序列，含有這些基因的dna分子可以通過atcc登錄號53435、67441和67442獲得。編碼谷胱甘肽s轉移酶的dna的克隆和表達由hayes等人在(1992),biochem.j.285:173中描述。

(d)編碼針對可結合羥基苯基丙酮酸二加氧酶(hppd)的除草劑的抗性或耐受性的基因，hppd是催化對-羥基苯基丙酮酸(hpp)轉化形成尿黑酸的反應的酶。這包括例如異噁唑(ep418175、ep470856、ep487352、ep527036、ep560482、ep682659、美國專利no.5,424,276)，特別是異噁唑草酮，其為玉米的選擇性除草劑，二酮腈(diketonitrile)(ep496630、ep496631)，特別是2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-so2ch3-4-cf3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-so2ch3-4-2,3cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，三酮類(ep625505、ep625508、美國專利no.5,506,195)，特別是磺草酮、和吡唑特(pyrazolinate)等除草劑。在植物中產(chǎn)生過量hppd的基因能夠提供針對這些除草劑的耐受性或抗性，包括例如美國專利no.6,268,549和6,245,968和美國專利申請公開文本no.20030066102中描述的基因。

(e)編碼針對苯氧基生長素除草劑，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)的抗性或耐受性的基因，其也可以賦予針對芳氧基苯氧基丙酸類(aopp)除草劑的抗性或耐受性。這些基因的實例包括α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(aad-1)基因，如美國專利no.7,838,733所述。

(f)編碼針對苯氧基生長素除草劑如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)的抗性或耐受性的基因，其也可以賦予針對吡啶基氧基生長素除草劑，如氟草煙或綠草定的抗性或耐受性。這些基因的實例包括α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(aad-12)基因，如wo2007/053482a2中所述。

(g)編碼針對麥草畏的抗性或耐受性的基因(參見，例如美國專利公開文本no.20030135879)。

(h)提供針對抑制原卟啉原氧化酶(ppo)的除草劑的抗性或耐受性的基因(見美國專利no.5,767,373)。

(i)提供針對可結合光系統(tǒng)ii反應中心(psii)核心蛋白質(zhì)的三嗪除草劑(例如阿特拉津)和尿素衍生物(如敵草隆)除草劑的抗性或耐受性的基因(參見brussian等人(1989),emboj.1989,8(4):1237-1245)。

3.賦予或貢獻增值性狀的基因

(a)修飾的脂肪酸代謝，例如，通過用反義基因或硬脂酰-acp去飽和酶轉化玉蜀黍或蕓苔屬而增加所述植物的硬脂酸含量(knultzon等人(1992),proc.nat.acad.sci.usa89:2624)。

(b)降低的植酸含量

(1)引入植酸酶編碼基因，如黑曲霉植酸酶基因(vanhartingsveldt等人(1993),gene127:87)，提高植酸降解，向被轉化植物添加更多游離磷酸鹽。

(2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，這可以通過，例如，克隆然后重新導入與單個等位基因相關的dna來實現(xiàn)，所述單個等位基因是導致以低植酸水平為特征的玉米突變體的原因(raboy等人(1990),maydica35:383)。

(c)改良的碳水化合物組成，例如通過用編碼改變淀粉的分支模式的酶的基因轉化植物而實現(xiàn)。這樣的酶的例子包括，粘液鏈球菌(streptococcusmucus)果糖基轉移酶基因(shiroza等人(1988),j.bacteriol.170:810、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因(steinmetz等人(1985),mol.gen.genel.200:220)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)α-淀粉酶(pen等人(1992),bio/technology10:292)、番茄轉化酶基因(elliot等人(1993))、大麥淀粉酶基因(sogaard等人(1993),j.biol.chem.268:22480)、以及玉米胚乳淀粉分支酶ii(fisher等人(1993),plantphysiol.102:10450)。

轉化

用于植物轉化的適合方法包括可將dna導入細胞中的任何方法，例如但不限于：電穿孔(參見，例如，美國專利5,384,253)；微粒轟擊(參見，例如，美國專利5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865)；土壤桿菌介導的轉化(參見，例如，美國專利5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840；和6,384,301)；和原生質(zhì)體轉化(參見，例如，美國專利5,508,184)。這些方法可用于穩(wěn)定轉化或瞬時轉化植物。

使用諸如利用碳化硅纖維攪動的技術(參見，例如，美國專利5,302,523和5,464,765)可以將dna構建體直接導入到植物細胞的基因組dna中，或者可以使用生物射彈法如dna粒子轟擊將dna構建體直接導入到植物組織中(參見，例如，klein等人(1987)nature327:70-73)?；蛘撸赏ㄟ^納米顆粒轉化將dna構建體導入植物細胞中(參見，例如，美國專利公開文本no.2009/0104700，通過提述完整并入本文)。

另外，可以使用非土壤桿菌細菌或病毒，例如根瘤菌菌種ngr234，苜蓿中華根瘤菌、百脈根根瘤菌、馬鈴薯病毒x、花椰菜花葉病毒和木薯葉脈花葉病毒和/或煙草花葉病毒實現(xiàn)基因轉移，參見，例如chung等人(2006),trendsplantsci.11(1):1-4。

通過應用轉化技術，基本上任何植物物種的細胞可被穩(wěn)定轉化，并且可通過熟知的技術將這些細胞開發(fā)為轉基因植物。例如，在棉花轉化背景下可以特別有用的技術描述于美國專利5,846,797；5,159,135；5,004,863；和6,624,344中；用于轉化蕓苔屬植物的技術例如描述于美國專利5,750,871中；用于轉化大豆的技術例如描述于美國專利6,384,301中；并且用于轉化玉米的技術例如描述于美國專利7,060,876和5,591,616、以及國際pct公開文本wo95/06722中。

在完成外源核酸到受體細胞的遞送之后，通常鑒定出轉化的細胞用于進一步培養(yǎng)和植物再生。為了提高鑒定轉化體的能力，人們可能期望采用選擇標志物基因，其中轉化載體用來再生轉化體。在說明性實施方案中，可通過使細胞暴露于一種或多種選擇劑來測定轉化的細胞群，或者可篩選所述細胞的期望標志物基因性狀。

暴露于選擇劑后存活的細胞、或者在篩選測定中已被評分為陽性的細胞，可以在支持植物再生的介質(zhì)中進行培養(yǎng)。在一個實施方案中，可通過包含其他物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)劑來改良任何適合的植物組織培養(yǎng)基?？蓪⒔M織維持在具有生長調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基上，直到可得到足夠的組織開始植物再生的努力時為止，或者在重復輪的手動選擇之后，直到組織形態(tài)適合于再生時為止(例如，至少2周)，然后轉移到有助于芽形成的介質(zhì)中。定期轉移培養(yǎng)物，直到已經(jīng)出現(xiàn)充分的芽形成時為止。一旦芽形成，將它們轉移到有助于根形成的介質(zhì)中。一旦形成足夠的根，可將植物轉移到土壤中，以便進一步生長和成熟。

為了證實提供在再生植物中的包含期望核酸的構建體的存在，可進行多種測定。這樣的測定可包括：分子生物學測定，如southern和northern印跡以及pcr；生物化學測定，如檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在，例如通過免疫學方法(elisa、western印跡、和/或lc-msms分光光度法)或借助于酶功能；植物部分測定，如葉或根測定；和/或再生的全植物的表型分析。

可例如通過使用對感興趣核酸分子特異的寡核苷酸引物進行pcr擴增來篩選轉基因事件。pcr基因分型應當理解為包括但不限于，來源于分離的宿主植物愈傷組織的基因組dna的聚合酶鏈反應(pcr)擴增，所述愈傷組織預期含有整合到基因組中的感興趣核酸分子，然后進行標準克隆和pcr擴增產(chǎn)物的序列分析。pcr基因分型方法已被很好地描述(參見，例如，rios等人(2002),plantj.32:243-53)，并可應用于來源于任何植物物種或組織類型(包括細胞培養(yǎng)物)的基因組dna?？砂错樞蚴褂门c靶序列和導入序列兩者都結合的寡核苷酸引物的組合，或將所述組合在pcr擴增反應中多重化?？僧a(chǎn)生被設計為退火到靶位點、導入的核酸序列、和/或這兩者的組合上的寡核苷酸引物。因此，pcr基因分型策略可包括，例如但不限于：在植物基因組中的特異性序列的擴增；在植物基因組中的多個特異性序列的擴增；在植物基因組中的非特異性序列的擴增；以及任何前述項的組合。本領域技術人員可設計探詢基因組的引物和擴增反應的另外組合。例如，可以設計退火到核酸序列(一個或多個)上的一組正向和反向寡核苷酸引物，所述核酸序列對于導入的核酸序列的邊界外部的靶標而言是特異性的。

正向和反向寡核苷酸引物可被設計為特異性地退火到導入的核酸分子上，例如，在相應于包含在其中的感興趣核苷酸序列之內(nèi)的編碼區(qū)、或所述核酸分子的其他部分的序列處。引物的使用可以結合本文中描述的引物。寡核苷酸引物可根據(jù)期望的序列加以合成并且可商購(例如，來自integrateddnatechnologies,inc.,coralville,ia)。擴增之后可以進行擴增產(chǎn)物的克隆和測序、或直接序列分析。在一個實施方案中，在pcr擴增中采用了對基因靶特異的寡核苷酸引物。

表達轉基因的方法

在一個實施方案中，在植物中表達至少一個轉基因的方法包括種植包含與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子的植物。在一個實施方案中，在植物中表達至少一個轉基因的方法包括種植包含與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因3′-utr的植物。在一個實施方案中，在植物中表達至少一個轉基因的方法包括種植包含與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子和3′-utr的植物。

在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達至少一個轉基因的方法包括培養(yǎng)包含與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子的植物組織或植物細胞。在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達至少一個轉基因的方法包括培養(yǎng)包含與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因3′-utr的植物組織或植物細胞。在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達至少一個轉基因的方法包括培養(yǎng)包含與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子和甘藍型油菜accox基因3′-utr的植物組織或植物細胞。

在一個實施方案中，在植物中表達至少一個轉基因的方法包括種植包含含有與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子的基因表達盒的植物。在一個實施方案中，在植物中表達至少一個轉基因的方法包括種植包含含有與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因3′-utr的基因表達盒的植物。在一個實施方案中，在植物中表達至少一個轉基因的方法包括種植包含含有與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子和玉米葉綠素a/b結合基因3′-utr的基因表達盒的植物。

在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達至少一個轉基因的方法包括培養(yǎng)包含含有與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子的基因表達盒的植物組織或植物細胞。在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達至少一個轉基因的方法包括培養(yǎng)包含含有與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因3′-utr的基因表達盒的植物組織或植物細胞。在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達至少一個轉基因的方法包括培養(yǎng)包含含有與至少一個轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子和甘藍型油菜accox基因3′-utr的基因表達盒的植物組織或植物細胞。

在一個實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含甘藍型油菜accox基因啟動子(還包括上游啟動子)。在一個實施方案中，甘藍型油菜accox基因啟動子可以是seqidno:1。在一個實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有甘藍型油菜accox基因啟動子的基因表達盒，其中所述啟動子與seqidno:1至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一。在一個實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子的基因表達盒。在說明性實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子的基因表達盒，其中所述轉基因可以是殺蟲抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉基因、dna結合轉基因、選擇標志物轉基因、或它們的組合。

在一個實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有甘藍型油菜accox基因3′-utr的基因表達盒。在一個實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有甘藍型油菜accox基因3′-utr的基因表達盒。在一個實施方案中，該甘藍型油菜accox基因3′-utr為具有seqidno:2的多核苷酸。在一個實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有甘藍型油菜accox基因3′-utr的基因表達盒，其中所述甘藍型油菜accox基因3′-utr與seqidno:2至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％同一。在一個實施方案中，基因表達盒包含與啟動子可操作連接的甘藍型油菜accox基因3′-utr，其中所述啟動子為甘藍型油菜accox基因啟動子，或為源自植物(例如，擬南芥泛素10啟動子)、病毒(例如，木薯葉脈花葉病毒啟動子)或細菌(例如，根癌土壤桿菌δmas)的啟動子。在一個實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因3′-utr的基因表達盒。在說明性實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因3′-utr的基因表達盒，其中所述轉基因可以是殺蟲抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉基因、dna結合轉基因、選擇標志物轉基因、或它們的組合。

在一個實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子和甘藍型油菜accox基因3′-utr的基因表達盒。當基因表達盒包含兩個或更多個轉基因時，啟動子和3′-utr可與基因表達盒之內(nèi)的不同轉基因可操作連接。在說明性實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因啟動子，其中所述轉基因可以是殺蟲抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉基因、dna結合轉基因、選擇標志物轉基因、或它們的組合。在說明性實施方案中，基因表達盒包含與轉基因可操作連接的甘藍型油菜accox基因3′-utr，其中所述轉基因可以是殺蟲抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉基因、dna結合轉基因、選擇標志物轉基因、或它們的組合。

在一個實施方案中，使用本文中描述的方法的轉基因表達為在植物的胚珠和種子組織內(nèi)表達。在一個實施方案中,轉基因表達包括一個以上在植物的胚珠和種子組織中表達的轉基因。在一個實施方案中，如本文中描述的種植轉基因植物的方法包括胚珠和種子優(yōu)選轉基因表達。在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達轉基因的方法包括胚珠和種子優(yōu)選組織以及胚珠和種子優(yōu)選細胞。在一個實施方案中，胚珠和種子優(yōu)選表達包括雙子葉植物的葉和莖優(yōu)選表達。

在一個另外的實施方案中，使用本文中描述的方法的轉基因表達為在地上植物組織(例如，胚珠或種子)內(nèi)表達。在一個實施方案中，轉基因表達包括一個以上在諸如胚珠和種子的地上植物組織中表達的轉基因。在其他實施方案中，轉基因的表達在種子的胚乳組織內(nèi)。在一個實施方案中，如本文中描述的種植轉基因植物的方法包括地上植物組織轉基因表達。在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達轉基因的方法包括地上植物組織和地上植物細胞。在一個實施方案中，地上植物組織表達包括雙子葉地上植物組織表達。

在一個實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有如本文中公開的甘藍型油菜accox基因啟動子或3′-utr調(diào)控元件的載體。在一個實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有與轉基因可操作連接的如本文中公開的甘藍型油菜accox基因啟動子或3′-utr調(diào)控元件的載體。在一個實施方案中，植物、植物組織、或植物細胞包含含有如本文中公開的基因表達盒的載體。在一個實施方案中，載體可以是質(zhì)粒、粘粒、細菌人工染色體(bac)、噬菌體、或病毒片段。

在一個實施方案中，根據(jù)本文中公開的方法的植物、植物組織、或植物細胞可以是單子葉植物的。所述單子葉植物、植物組織、或植物細胞可以是，但不限于玉米、水稻、甘蔗、大麥、黑麥、高粱、蘭花、竹子、香蕉、香蒲、百合、燕麥、洋蔥、小米、和黑小麥。

在一個實施方案中，根據(jù)本文中公開的方法的植物、植物組織、或植物細胞可以是雙子葉植物的。所述雙子葉植物、植物組織、或植物細胞可以是，但不限于，油菜、蕓苔、芥菜、埃塞俄比亞芥、大豆、向日葵、和棉花。

關于遺傳修飾植物的生產(chǎn)，用于植物的基因工程的方法在本領域中是熟知的。例如，已經(jīng)開發(fā)了用于植物轉化的多種方法，包括雙子葉植物以及單子葉植物的生物和物理轉化方案(例如，goto-fumiyuki等人,naturebiotech17:282-286(1999)；miki等人,methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology,glickb.r.和thompsonj.e.編輯，crcpress,inc.,bocaraton,pp.67-88(1993))。另外，用于植物細胞或組織轉化和植物再生的載體和體外培養(yǎng)方法是可獲得的，例如，見于gruber等人,methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology,glickb.r.和thompsonj.e.編輯，crcpress,inc.,bocaraton,pp.89-119(1993)。

本領域技術人員將認識到，在外源序列穩(wěn)定納入轉基因植物中并經(jīng)證實為可操作之后,可通過有性雜交將其導入其他植物中?？梢允褂迷S多標準育種技術中的任何一種，這取決于被雜交的物種。

可以通過對工程化的植物材料進行選擇或篩選，利用轉化dna上存在的標志物基因所編碼的性狀來鑒定和分離轉化的植物細胞、愈傷組織、組織、或植物。例如，可以通過在含有抑制量的抗生素或除草劑(轉化基因構建體提供對該抗生素或除草劑的抗性)的培養(yǎng)基上培育工程化的植物材料來實施選擇。此外，還可以通過篩選重組核酸構建體上可能存在的任何可見的標志物基因(例如yfp、gfp、β葡糖苷酸酶、熒光素酶、b或c1基因)的活性，來鑒定轉化的細胞。這樣的選擇和篩選方法是本領域技術人員公知的。

還可以使用物理和生物化學方法來鑒定含有插入的基因構建體的植物或植物細胞轉化體。在某些實施方案中，本公開涉及包括確認基因組dna的修飾，例如插入植物基因組中的基因表達盒的方法。在某些實施方案中，確認基因組的這種修飾的方法包括通過基于pcr的測定、southern印跡測定、northern印跡測定、蛋白質(zhì)表達測定、western印跡測定、elisa測定或下一代測序測定進行的確認。

因此，可以通過多種方式(包括使用序列的引物或探針)確認基因組dna的修飾，例如插入到植物基因組中的基因表達盒。在某些實施方案中，基于轉基因在植物的某些組織中或在某些發(fā)育階段的組成型表達或選擇性表達，可以檢測到穩(wěn)定整合的轉基因，或者所述轉基因可基本上在所述植物的整個生命周期表達于基本上所有植物組織中。

可以通過任何適合的擴增方法來進行插入到植物基因組中的基因表達盒的確認。總體上參見kwoh等人,am.biotechnol.lab.8,14-25(1990)。適合的擴增技術的實例包括但不限于，聚合酶鏈反應、連接酶鏈反應、鏈置換擴增(總體上參見g.walker等人,proc.natl.acad.sci.usa89:392-396(1992)；g.walker等人,nucleicacidsres.20:1691-1696(1992))、基于轉錄的擴增(參見d.kwoh等人,proc.natl.acadsci.usa86:1173-1177(1989))、自我持續(xù)序列復制(或“3sr”)(參見j.guatelli等人,proc.natl.acad.sci.usa87:1874-1878(1990))、qβ復制酶系統(tǒng)(參見p.lizardi等人,biotechnology6:1197-1202(1988))、基于核酸序列的擴增(或“nasba”)(參見r.lewis,geneticengineeringnews12(9),1(1992))、修復鏈反應(或“rcr”)(參見r.lewis，上文)、和自返式(boomerang)dna擴增(或“bda”)(參見r.lewis，上文)。聚合酶鏈式反應通常是優(yōu)選的。

“擴增”是涉及模板特異性的核酸復制的特殊情況。它與非特異性模板復制(即，依賴于模板但不依賴特異性模板的復制)相反。這里的模板特異性區(qū)別于復制保真性(即，正確的多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)特異性。模板特異性經(jīng)常是就“靶”特異性而言描述的。

如本文中使用的，術語“聚合酶鏈式反應”和“pcr”通常是指不用克隆或純化而增加基因組dna混合物中的一段靶序列的濃度的方法(美國專利no.4,683,195；4,683,202；和4,965,188；通過提述并入本文)。這個擴增靶序列的過程包括將過量的兩個寡核苷酸引物導入含有期望靶序列的dna混合物中，隨后在dna聚合酶的存在下進行一些列精確的熱循環(huán)。這兩個引物與它們的雙鏈靶序列的對應鏈互補。為了實施擴增，使混合物變性，然后使引物退火到它們的靶分子內(nèi)的互補序列上。退火之后，用聚合酶延伸引物，從而形成新的互補鏈對?？梢远啻沃貜妥冃?、引物退火和聚合酶延伸步驟(即，變性、退火和延伸構成一個“循環(huán)”；可以有許多個“循環(huán)”)，以獲得高濃度的期望靶序列的擴增區(qū)段。期望靶序列的擴增區(qū)段的長度是由引物相對于彼此的相對位置決定的，因此，這個長度是可控的參數(shù)。由于該過程的重復方面，該方法被稱為“聚合酶鏈反應”(在下文中的“pcr”)。由于靶序列的期望擴增區(qū)段成為混合物中的主要序列(就濃度而言)，它們被說成是經(jīng)pcr擴增的。

術語“逆轉錄酶”或“rt-pcr”是指起始材料為mrna的pcr類型。利用逆轉錄酶，起始mrna被酶促轉化為互補dna或“cdna”。然后，cdna用作“pcr”反應的“模板”。

在一個實施方案中，擴增反應被定量。在其他實施方案中，利用標志譜(signatureprofile)將擴增反應定量，其中標志譜選自解鏈溫度或熒光標志譜。

本公開的實施方案的核酸分子或其區(qū)段可以用作pcr擴增引物。在進行pcr擴增中，可容許一定程度的在引物與模板之間的錯配。因此，例示引物的突變、缺失和插入(特別是在5′或3′端的核苷酸添加)也落在本主題公開的范圍內(nèi)?？梢酝ㄟ^本領域普通技術人員已知的方法在給定的引物中產(chǎn)生突變、插入和缺失。

分子信標已被描述用于序列檢測。簡要地說，設計與側翼基因組和插入物dna接點重疊的fret寡核苷酸探針。fret探針的獨特結構導致它含有使熒光部分和猝滅部分保持非常靠近的二級結構。在熱穩(wěn)定聚合酶和dntp的存在下，使fret探針和pcr引物(一個引物在插入dna序列內(nèi)，一個引物在側翼基因組序列內(nèi))循環(huán)。在成功的pcr擴增之后，fret探針與靶序列的雜交導致探針的二級結構消除以及熒光部分和淬滅部分的空間分離。熒光信號指示由于成功的擴增和雜交導致的側翼基因組/轉基因插入序列的存在。這樣的用于檢測擴增反應的分子信標測定是本主題公開的實施方案。

水解探針測定，或者也稱作(lifetechnologies,fostercity,ca)，是一種檢測和定量dna序列的存在的方法。簡要地說，設計fret寡核苷酸探針，其具有一段在轉基因內(nèi)的寡聚體，一段在側翼基因組序列內(nèi)的寡聚體，用于事件特異性檢測。在熱穩(wěn)定聚合酶和dntp的存在下，使fret探針和pcr引物(一個引物在插入dna序列內(nèi)，一個引物在側翼基因組序列內(nèi))循環(huán)。fret探針的雜交導致熒光部分從fret探針上的猝滅部分被切斷并釋放。熒光信號指示由于成功的擴增和雜交導致的側翼/轉基因插入序列的存在。這樣的用于檢測擴增反應的水解探針測定是本主題公開的實施方案。

測定是檢測和定量dna序列的存在的方法。簡要地說，利用被稱為測定系統(tǒng)的基于聚合酶鏈反應(pcr)的測定，篩選了包含插入到植物基因組中的基因表達盒的基因組dna樣品。在主題公開的實踐中使用的測定可利用含有多種引物的pcr測定混合物。在pcr測定混合物中使用的引物可包括至少一個正向引物和至少一個反向引物。正向引物含有相應于供體dna多核苷酸的特定區(qū)域的序列，并且反向引物含有相應于基因組序列的特定區(qū)域的序列。另外，在pcr測定混合物中使用的引物可包括至少一個正向引物和至少一個反向引物。例如，pcr測定混合物可利用相應于兩個不同等位基因的兩個正向引物和一個反向引物。正向引物之一含有相應于內(nèi)源基因組序列的特定區(qū)域的序列。第二正向引物含有相應于供體dna多核苷酸的特定區(qū)域的序列。反向引物含有相應于基因組序列的特定區(qū)域的序列。這樣的用于檢測擴增反應的測定是本主題公開的實施方案。

在一些實施方案中，該熒光信號或熒光染料選自下組：hex熒光染料、fam熒光染料、joe熒光染料、tet熒光染料、cy3熒光染料、cy3.5熒光染料、cy5熒光染料、cy5.5熒光染料、cy7熒光染料、和rox熒光染料。

在其他實施方案中，使用適合的第二熒光dna染料進行擴增反應，所述第二熒光dna染料能夠在流式細胞術可檢測的濃度范圍內(nèi)使細胞dna染色，并且具有通過實時熱循環(huán)儀可檢測的熒光發(fā)射光譜。本領域普通技術人員應當理解的是，其他核酸染料是已知的并且正在被不斷地鑒定。可以采用具有適當激發(fā)和發(fā)射光譜的任何適合的核酸染料，如green、greeni、和在一個實施方案中，第二熒光dna染料是以少于10μm、少于4μm、或少于2.7μm使用的

在另外的實施方案中，可以使用下一代測序(ngs)確認插入到植物基因組中的基因表達盒。如由brautigma等人，2010所述，可以使用dna序列分析來確定分離和擴增的片段的核苷酸序列?？梢苑蛛x擴增的片段并亞克隆到載體中，并使用鏈終止子法(也稱為sanger測序)或染料終止子測序進行測序。另外，可以用下一代測序對擴增子進行測序。ngs技術不需要亞克隆步驟，并且可以在單個反應中完成多個測序讀取。有三種ngs平臺可商購：來自454lifesciences/roche的genomesequencerflx，來自solexa的illuminagenomeanalyzer和appliedbiosystems的solid(首字母縮寫詞，代表：“寡聚物連接和檢測測序”(“sequencingbyoligoligationanddetection”)。另外，目前正在開發(fā)兩種單分子測序方法。這些包括來自helicosbioscience的真實單分子測序(tsms)和來自pacificbiosciences的單分子實時測序(smrt)。

由454lifesciences/roche推向市場的genomesequencerflx是長讀段ngs，其使用乳液pcr和焦磷酸測序來生成測序讀段。可以使用300-800bp的dna片段或含有3-20kbp片段的文庫。反應每次運行可以產(chǎn)生超過100萬個約250至400個堿基的讀段，總產(chǎn)量為250至400兆堿基。與其他ngs技術相比，這種技術產(chǎn)生的讀段最長，但每次運行的總序列輸出較低。

由solexa推向市場的illuminagenomeanalyzer是一種短讀段ngs，其利用熒光染料標記的可逆終止子核苷酸的邊合成邊測序法，并且以固相橋式pcr為基礎。可以使用含有高達10kb的dna片段的配對末端測序文庫的構建。反應產(chǎn)生長度為35-76個堿基的超過1億個短讀段。這些數(shù)據(jù)每次運行可以產(chǎn)生3-6千兆堿基。

由appliedbiosystems推向市場的寡聚物連接和檢測測序(solid)系統(tǒng)是一種短讀段技術。這種ngs技術使用長度最多可達10kbp的片段化雙鏈dna。該系統(tǒng)使用通過染料標記的寡核苷酸引物的連接和乳液pcr進行的測序，以生成10億個短讀段，其導致每次運行高達30千兆堿基的總序列輸出。

helicosbioscience的tsms和pacificbiosciences的smrt應用不同的方法，所述方法使用單個dna分子進行序列反應。tsmshelicos系統(tǒng)產(chǎn)生高達8億個短讀段，每次運行生成21千兆堿基。使用熒光染料標記的虛擬終止子核苷酸完成這些反應，其被描述為“邊合成邊測序”方法。

由pacificbiosciences推向市場的smrt下一代測序系統(tǒng)使用實時的邊合成邊測序。由于不受可逆終止子的限制，這種技術可以產(chǎn)生長度高達1000bp的讀段。使用這種技術每天可以產(chǎn)生相當于二倍體人類基因組的一倍覆蓋度的原始讀取通量。

在另一個實施方案中，可以使用印跡測定法完成基因表達盒插入植物基因組中的確認，包括western印跡、northern印跡和southern印跡。此類印跡測定法是在生物樣品的鑒定和定量的生物研究中常用的技術。這些測定法包括首先通過電泳法分離凝膠中的樣品組分，接著將電泳分離的組分從凝膠轉移到諸如用硝酸纖維素、聚偏二氟乙烯(pvdf)或尼龍的材料制成的轉移膜上。也可以將分析物直接點樣在這些支持物上，或通過施加真空、毛細管作用或壓力而定向到支持物上的特定區(qū)域上，而不需要預先分離。然后通常對轉移膜進行轉移后處理，以增強分析物彼此區(qū)分和在視覺上或通過自動讀取器被檢出的能力。

在進一步的實施方案中，可以使用elisa測定法來完成基因表達盒插入植物基因組中的確認，所述elisa測定法使用固相酶免疫測定法檢測液體樣品或濕樣品中物質(zhì)(通常是抗原)的存在。將來自樣品的抗原附著在平板的表面上。然后，將另一種特異性抗體施用在該表面上，使得它可以與所述抗原結合。這種抗體是與酶連接的，并且，在最后的步驟中，添加含有酶底物的物質(zhì)。隨后的反應產(chǎn)生可檢測的信號，最常見的是底物中的顏色變化。

本發(fā)明公開還涵蓋上文描述的轉基因植物的種子，其中該種子包含所述轉基因或基因表達盒。本發(fā)明公開進一步涵蓋上文描述的轉基因植物的后代、克隆、細胞系或細胞，其中所述后代、克隆、細胞系或細胞包含所述轉基因或基因構建體。

雖然已經(jīng)參考特定的方法和實施方案描述了本發(fā)明，應當理解的是，可以做出各種不偏離本發(fā)明的修改和變化。

實施例

實施例1：從甘藍型油菜中鑒定調(diào)控元件

通過微陣列概貌分析(profiling)手段鑒定甘藍型油菜基因調(diào)控元件。然后分離和克隆這些調(diào)控元件，以表征在轉基因植物中使用的調(diào)控元件的表達譜。產(chǎn)生了用phiyfp基因和pat選擇標志物基因穩(wěn)定轉化的轉基因擬南芥系，并且評定了轉基因表達水平和組織特異性。如此，鑒定和表征了甘藍型油菜調(diào)控元件。首次公開了在基因表達構建體中使用的啟動子和3′-utr調(diào)控元件。

微陣列概貌分析方法

在授粉后第15、20、25、30、35和42日(dap)，從轉基因純合子系和未轉化的野生型植物采集正在發(fā)育的甘藍型油菜種子。接下來，通過單色全局基因表達概貌分析設計(single-color,globalgeneexpressionprofiling)分析種子，以確定每個既定的時間點的全局基因表達水平。將各個60聚體寡核苷酸陣列(agilenttechnologiesinc.,santaclara,ca)的三個相同的重復與來自每個樣品的經(jīng)擴增的cy3標記的crna雜交。使用定制設計的60聚體系統(tǒng)性全轉錄組卡諾拉寡核苷酸陣列(earray,agilenttechnologiesinc.,santaclara,ca)進行雜交。寡核苷酸陣列包含從公共數(shù)據(jù)源(agilenttechnologiesinc.,santaclara,ca)獲得的超過37,000種不同的卡諾拉轉錄物。

使用來自制造商(agilenttechnologiesinc.,santaclara,ca)的sure-print^tm技術原位合成了60聚體寡核苷酸。為了高效地測量每個轉錄物的表達水平，存在于陣列中的寡核苷酸被設計為對于每個靶是獨特且特異的，以便與預測的靶序列高效雜交。對于與多于一個轉錄物形成雙鏈體的寡核苷酸，將其從陣列中排除。每個寡核苷酸還具備為了實現(xiàn)整個微陣列處理過程中的最佳性能所需的化學和物理性質(zhì)。另外，定制設計的卡諾拉寡核苷酸陣列中還包括一些特異且獨特的寡核苷酸，它們代表新引入的基因的以及其他幾種感興趣的基因。這些標準用于產(chǎn)生定制設計的60聚體系統(tǒng)性全轉錄組卡諾拉寡核苷酸陣列。

在授粉后15、20、25、30、35和42日(dap)，從每種基因型(野生型和and9ds轉基因系)的多株植物獲得正在發(fā)育的種子的樣品。將種子冷凍且合并，用作rna分離和純化的起始材料。按照agilentone-colormicroarray-basedgeneexpressionquickamplabelingprotocol^tm(agilent,santaclara,ca)進行標記，將來自每個樣品的總共1.0μg純化的總rna逆轉錄、擴增并用cy3-ctp標記。使用agilenttechnologiesgeneexpressionhybridizationkit^tm和washbufferkit^tm(agilent,santaclara,ca)，將寡核苷酸基因表達陣列雜交。在全自動tecanhs4800pro^tm(tecan,researchtrianglepark,nc)雜交站上進行雜交。

在掃描和特征提取后，將原始數(shù)據(jù)文件上傳到gxversion10.0.2^tm(agilenttechnologies,santaclara,ca)?；诩訕藢φ者M行樣品的質(zhì)量控制，以確保生成的數(shù)據(jù)具備足夠高的質(zhì)量，然后通過生成報告。接下來，使用全局百分位數(shù)移位歸一化方法對所得到的數(shù)據(jù)進行歸一化，以使系統(tǒng)性非生物差異降低至最低限度并使陣列標準化以便于交叉比較。然后，將歸一化的數(shù)據(jù)過濾，選擇在研究中的每一個樣本中被標記為“存在”的實體，消除標記為“稀少”或“缺無”的實體。將經(jīng)過歸一化和過濾的實體的表作為統(tǒng)計分析的輸入，統(tǒng)計分析使用雙向anova法，其中用p<0.05的校正p值截止值定義dap和基因型為參數(shù)。在本研究中，為所有時間點定義了甘藍型油菜種子發(fā)育的全局基因表達譜。應用另外一組選擇標準來鑒定在所有樣品中在甘藍型油菜種子發(fā)育早期一致地高水平(>50,000像素/點)表達的基因。

基于基因注釋人工選擇了其他基因，使總候選池中的靶標達到88個。為了優(yōu)化總候選池，通過實時定量聚合酶鏈式反應(rt-qpcr)以已知的油生物合成基因表達水平為對照驗證了表達水平。考察了來自15dap和20dap時間點的rna，以及從卡諾拉嫩葉提取和純化的總rna。用superscriptiii^tm(invitrogen,carlsbad,ca)進行rt-qpcr的cdna合成。使用abgeneabsolutebluesybrgreenmastermix^tm(thermofisher)，在480instrument^tm(roche,indianapolis,in)上進行實時pcr反應。使用primer3^tm(mit,cambridge,ma)設計rt-qpcr的引物。針對60℃的最佳tm設計引物。擴增子大小范圍為100-224bp。選擇引物以在被轉錄的靶序列的3′區(qū)域中產(chǎn)生擴增子。出于標準化目的，還測定了4種內(nèi)源性油生物合成基因，包括bnacp05(?；d體蛋白)、bnkcs(酮脂酰-coa合酶)、bnkasiii(酮脂酰-acp合酶)和bnsad(硬脂酰-acp去飽和酶)。

為了進一步過濾候選池，選擇了在早期種子中顯示出表達高于acp05(genbank:x16114.1)的基因。還要求基因所表現(xiàn)出的從葉到早期種子的表達增加必須大于kasii(genbank:af244520.1)的種子/葉表達差異。這些過濾條件將候選基因列表減少到一種特定基因用于鑒定靶啟動子。因此，使用微陣列測定法鑒定來自甘藍型油菜的啟動子和3′utr基因調(diào)控元件，所述甘藍型油菜在15dap高表達cdna，并且優(yōu)先在種子中表達。

實施例2：基因調(diào)控元件鑒定

使用上述篩選參數(shù)，從甘藍型油菜微陣列產(chǎn)生的數(shù)據(jù)中選擇了一條特定序列。使用pcr反應從甘藍型油菜栽培種nex710中分離特異性啟動子和3′utr序列。pcr引物是根據(jù)表達的序列標簽重疊群27160設計的，該重疊群是根據(jù)公眾可獲得的est：genbank：ev001081.1、cd813186.1、es989902.1和ev088583.1)以及甘藍栽培種to1000的基因組重疊群ctg7180009837416組裝的，后者被鑒定為與est重疊群27160具有同源性。獲得提取的啟動子和3′utr甘藍型油菜調(diào)控序列，并通過dna測序進一步表征。來自甘藍型油菜栽培種nex710基因組的、標記為accox的甘藍型油菜基因的啟動子序列作為seqidno:1的1483bp啟動子序列提供。全長820bp的啟動子序列在下文中以seqidno:1提供。500bp的3′-utr序列在下文中以seqidno:2提供。

seqidno:1

seqidno:2

實施例3：甘藍型油菜啟動子和3′utr構建體

使用標準重組dna技術構建了基因表達盒，其由seqidno:1的全長甘藍型油菜accox基因啟動子、含有馬鈴薯光特異性組織誘導型ls-1基因(st-ls1內(nèi)含子；genbank登錄號x04753)的黃色熒光蛋白基因(phiyfp；shagin等人(2004),molbiolevol21；841-50)、和具有seqidno:2的甘藍型油菜accox3′utr組成。這個基因表達盒的兩側有att位點。得到的入門質(zhì)粒含有在甘藍型油菜accox基因啟動子的控制下、并以甘藍型油菜accox基因3′utr終止的yfp基因表達盒，接下來以該入門質(zhì)粒和以及目的載體進行lrclonase(lifetechnologies,carlsbad,ca)反應，生成最終的表達載體pdab113904。該目的載體含有一個選擇標志物盒，選擇標志物盒包含pat基因(wohlleben等人,gene70:25-37；(1988))，該pat基因由木薯葉脈花葉病毒啟動子(csvmv啟動子；verdaguer等人,plantmolecularbiology31:1129-1139；(1996))驅動，并以根癌土壤桿菌開放閱讀框1的3′-utr(atuorf13′utr；huang等人,j.bacteriol.172:1814-1822；(1990))終止。得到的構建體pdab113904是一個異源表達構建體，含有一個yfp基因表達盒(seqidno:3)和一個pat基因表達構建體(seqidno:4)，由以圖1中的質(zhì)粒圖譜表示。

seqidno:3(提供來自pdab113904的黃色熒光蛋白基因表達盒的核酸序列)

ctcacatcaccaccttttaacttcgttggttaatttcttgaaaagaagatcgtcatattttacacacaaaaagatcatcattgttgtcatgtactgtttgatgatactgacttacgaaactcgattataatattaaataacatgatataggcttttagattttatatgagttactagttttttcacgtttcgtcatcatgtatatcaataacctcgctaagatcatcagttcaccaccaaataaaacgtagccaaccgaagtctttcttctcaatttgtgttgtcaaatttgtcataaagtatgaatttctcatatacttaatacagataagtattataaattgacaattcatcaactattgaacttgaaattgaataataacattttaaacttttttttgacgacgacttctgaattgttatgtagttttgggggcatcattagaaaagcaaaagagaaagtactatcacttcaaacttcttttcatttttctacttcttagtgagtttgggaatattctataacttcgattaatatgaatgaatgtataaatactctgtatgcttttcaaccttttcttaccaaacatctgatcaaagatctttattgatttgttaggaatatggaggaatatttttccctattatggaggaatccgaagataagttattgtaagtaggtcgcgaatggcaactgatattattgcagaaacaacctcataaatgataaagttacaaaaaaaaaattattatcaagcttatatactttattcccaaaatttaaagtacgcatatttgattcctttgtgatagcgtacacgttctctaaccatgatgattccaataaatacaccaaaaaccttacaaaatgactcttgaaagtaaactagataatcaattcaaattctttctatatagtttgtttgctaaaggttattggtagtttcgaaatagtcattcatatccctttttttttgcatataatgactccccgaaggggctaagcaccagataaaaagtgttcgagtgcttctctgatttgtaacaacccatacacaattattcatataaaataaaagcaaaagaaaaagccaatataattgcagagaataagagatcgaaatggaaaacacaaagtttatcccaccaattatgttgcgcacacacaccatcgtatacaacttccacaacctccttttcttttctagtaaggaaaaaaacaaatttatatctactaagttctaactttatttaaatggcacaattatagatatcgtatatataatatatcattatacatatatatatatatatataaaatataatataatattttttttaagatctttgatttactatctgcgcctataaatagcgatcctccctcaactccttaactcacatttgacaactaacatcttcaacaacattaagttgccagtttaaagatattcatacgtttacatagagagggtctagagtaggatctccatgtcatctggagcacttctctttcatgggaagattccttacgttgtggagatggaagggaatgttgatggccacacctttagcatacgtgggaaaggctacggagatgcctcagtgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatgcacaattcatctgtactaccggagatgttcctgtgccttggagcacacttgtcaccactctcacctatggagcacagtgctttgccaagtatggtccagagttgaaggacttctacaagtcctgtatgccagatggctatgtgcaagagcgcacaatcacctttgaaggagatggcaacttcaagactagggctgaagtcacctttgagaatgggtctgtctacaatagggtcaaactcaatggtcaaggcttcaagaaagatggtcacgtgttgggaaagaacttggagttcaacttcactccccactgcctctacatctggggagaccaagccaaccacggtctcaagtcagccttcaagatatgtcatgagattactggcagcaaaggcgacttcatagtggctgaccacacccagatgaacactcccattggtggaggtccagttcatgttccagagtatcatcatatgtcttaccatgtgaaactttccaaagatgtgacagaccacagagacaacatgagcttgaaagaaactgtcagagctgttgactgtcgcaagacctacctttgagtagttagcttaatcacctagagctcggtcaccatggatgtgggattttttatgaaggcaagaaagatggggttttgatatgtgtgtgggcaacaatgttaaataagtattgaagctaatgttatagtagaatcaagaactaagttgtgatcacttatgaatctagtgtggttaagtgtgggagtgtttatgcaataattgtattggaaatatgaattttaaagattatactacaagttcgtaacatttgagatatgaatacttgaaaaaaactcgaatgtttacaaaagtaacaaactcctcacacatgcataattgaaatcatcaacagatttgggcttatgtatattggatcaaaggcccaaaatattttaaaattgtattagggggattctagggcatcactctgtatcctactataaatactcctctagagctgagatttctcatacagcacgggttacagcttacagtcgatgaatcattagagtttctctctttctacacagtagtacagtacacatctcgttttg

seqidno:4(提供來自pdab113904的膦絲菌素乙酰轉移酶基因表達盒的核酸序列)

ccagaaggtaattatccaagatgtagcatcaagaatccaatgtttacgggaaaaactatggaagtattatgtaagctcagcaagaagcagatcaatatgcggcacatatgcaacctatgttcaaaaatgaagaatgtacagatacaagatcctatactgccagaatacgaagaagaatacgtagaaattgaaaaagaagaaccaggcgaagaaaagaatcttgaagacgtaagcactgacgacaacaatgaaaagaagaagataaggtcggtgattgtgaaagagacatagaggacacatgtaaggtggaaaatgtaagggcggaaagtaaccttatcacaaaggaatcttatcccccactacttatccttttatatttttccgtgtcatttttgcccttgagttttcctatataaggaaccaagttcggcatttgtgaaaacaagaaaaaatttggtgtaagctattttctttgaagtactgaggatacaacttcagagaaatttgtaagtttgtaggtaccagatctggatcccaaaccatgtctccggagaggagaccagttgagattaggccagctacagcagctgatatggccgcggtttgtgatatcgttaaccattacattgagacgtctacagtgaactttaggacagagccacaaacaccacaagagtggattgatgatctagagaggttgcaagatagatacccttggttggttgctgaggttgagggtgttgtggctggtattgcttacgctgggccctggaaggctaggaacgcttacgattggacagttgagagtactgtttacgtgtcacataggcatcaaaggttgggcctaggatctacattgtacacacatttgcttaagtctatggaggcgcaaggttttaagtctgtggttgctgttataggccttccaaacgatccatctgttaggttgcatgaggctttgggatacacagcccggggtacattgcgcgcagctggatacaagcatggtggatggcatgatgttggtttttggcaaagggattttgagttgccagctcctccaaggccagttaggccagttacccaaatctgagtagttagcttaatcacctagagctcgatcggcggcaatagcttcttagcgccatcccgggttgatcctatctgtgttgaaatagttgcggtgggcaaggctctctttcagaaagacaggcggccaaaggaacccaaggtgaggtgggctatggctctcagttccttgtggaagcgcttggtctaaggtgcagaggtgttagcgggatgaagcaaaagtgtccgattgtaacaagatatgttgatcctacgtaaggatattaaagtatgtattcatcactaatataatcagtgtattccaatatgtactacgatttccaatgtctttattgtcgccgtatgtaatcggcgtcacaaaataatccccggtgactttcttttaatccaggatgaaataatatgttattataatttttgcgatttggtccgttataggaattgaagtgtgcttgaggtcggtcgccaccactcccatttcataattttacatgtatttgaaaaataaaaatttatggtattcaatttaaacacgtatacttgtaaagaatgatatcttgaaagaaatatagtttaaatatttattgataaaataacaagtcaggtattatagtccaagcaaaaacataaatttattgatgcaagtttaaattcagaaatatttcaataactgattatatcagctggtacattgccgtagatgaaagactgagtgcgatattatggtgtaatacatagg

組裝了含有黃色熒光蛋白(yfp)基因表達盒和膦絲菌素乙酰轉移酶基因表達盒的陽性對照構建體pdab9381。具體地說，所述黃色熒光蛋白基因表達盒含有擬南芥泛素10基因啟動子(atubi10啟動子；callis等人(1990),j.biol.chem.265:12486-12493)、含有馬鈴薯光特異性組織誘導型ls-1基因(st-ls1內(nèi)含子；genbank登錄號x04753)的黃色熒光蛋白編碼序列(phiyfp；shagin等人(2004),molecularbiologyandevolution,21(5),841-850)，并以根癌土壤桿菌開放閱讀框23的3′非翻譯區(qū)(atuorf233′utr)終止。所述選擇標志物基因表達盒含有木薯葉脈花葉病毒啟動子(csvmv啟動子；verdaguer等人,plantmolecularbiology31:1129-1139；(1996))、膦絲菌素乙酰轉移酶(pat；wohlleben等人,gene70:25-37；(1988))和根癌土壤桿菌orf13′非翻譯區(qū)(atuorf13′utr；huang等人,j.bacteriol.172:1814-1822；(1990))。得到的構建體pdab9381是一個異源表達構建體，含有yfp基因表達盒(seqidno:5)和pat基因表達構建體(seqidno:5)，將其表示在圖2中。

seqidno:5(提供來自pdab9381的黃色熒光蛋白基因表達盒的核酸序列)

gtcgacctgcaggtcaacggatcaggatattcttgtttaagatgttgaactctatggaggtttgtatgaactgatgatctaggaccggataagttcccttcttcatagcgaacttattcaaagaatgttttgtgtatcattcttgttacattgttattaatgaaaaaatattattggtcattggactgaacacgagtgttaaatatggaccaggccccaaataagatccattgatatatgaattaaataacaagaataaatcgagtcaccaaaccacttgccttttttaacgagacttgttcaccaacttgatacaaaagtcattatcctatgcaaatcaataatcatacaaaaatatccaataacactaaaaaattaaaagaaatggataatttcacaatatgttatacgataaagaagttacttttccaagaaattcactgattttataagcccacttgcattagataaatggcaaaaaaaaacaaaaaggaaaagaaataaagcacgaagaattctagaaaatacgaaatacgcttcaatgcagtgggacccacggttcaattattgccaattttcagctccaccgtatatttaaaaaataaaacgataatgctaaaaaaatataaatcgtaacgatcgttaaatctcaacggctggatcttatgacgaccgttagaaattgtggttgtcgacgagtcagtaataaacggcgtcaaagtggttgcagccggcacacacgagtcgtgtttatcaactcaaagcacaaatacttttcctcaacctaaaaataaggcaattagccaaaaacaactttgcgtgtaaacaacgctcaatacacgtgtcattttattattagctattgcttcaccgccttagctttctcgtgacctagtcgtcctcgtcttttcttcttcttcttctataaaacaatacccaaagcttcttcttcacaattcagatttcaatttctcaaaatcttaaaaactttctctcaattctctctaccgtgatcaaggtaaatttctgtgttccttattctctcaaaatcttcgattttgttttcgttcgatcccaatttcgtatatgttctttggtttagattctgttaatcttagatcgaagacgattttctgggtttgatcgttagatatcatcttaattctcgattagggtttcataaatatcatccgatttgttcaaataatttgagttttgtcgaataattactcttcgatttgtgatttctatctagatctggtgttagtttctagtttgtgcgatcgaatttgtcgattaatctgagtttttctgattaacagagatctccatgtcatctggagcacttctctttcatgggaagattccttacgttgtggagatggaagggaatgttgatggccacacctttagcatacgtgggaaaggctacggagatgcctcagtgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatgcacaattcatctgtactaccggagatgttcctgtgccttggagcacacttgtcaccactctcacctatggagcacagtgctttgccaagtatggtccagagttgaaggacttctacaagtcctgtatgccagatggctatgtgcaagagcgcacaatcacctttgaaggagatggcaacttcaagactagggctgaagtcacctttgagaatgggtctgtctacaatagggtcaaactcaatggtcaaggcttcaagaaagatggtcacgtgttgggaaagaacttggagttcaacttcactccccactgcctctacatctggggagaccaagccaaccacggtctcaagtcagccttcaagatatgtcatgagattactggcagcaaaggcgacttcatagtggctgaccacacccagatgaacactcccattggtggaggtccagttcatgttccagagtatcatcatatgtcttaccatgtgaaactttccaaagatgtgacagaccacagagacaacatgagcttgaaagaaactgtcagagctgttgactgtcgcaagacctacctttgagtagttagcttaatcacctagagctcggtcaccagcataatttttattaatgtactaaattactgttttgttaaatgcaattttgctttctcgggattttaatatcaaaatctatttagaaatacacaatattttgttgcaggcttgctggagaatcgatctgctatcataaaaattacaaaaaaattttatttgcctcaattattttaggattggtattaaggacgcttaaattatttgtcgggtcactacgcatcattgtgattgagaagatcagcgatacgaaatattcgtagtactatcgataatttatttgaaaattcataagaaaagcaaacgttacatgaattgatgaaacaatacaaagacagataaagccacgcacatttaggatattggccgagattactgaatattgagtaagatcacggaatttctgacaggagcatgtcttcaattcagcccaaatggcagttgaaatactcaaaccgccccatatgcaggagcggatcattcattgtttgtttggttgcctttgccaacatgggagtccaaggtt

seqidno:6(提供了來自pdab9381的膦絲菌素乙酰轉移酶基因表達盒的核酸序列)

實施例4：植物轉化和分子確認

土壤桿菌的制備

接下來，用60μl含有上述二元質(zhì)粒之一的土壤桿菌菌株[于50％甘油(預先制備并于-80℃冷凍)中]來制備含有大觀霉素(100mg/l)、卡那霉素(50mg/l)和利福平(10mg/l)的5ml的yep液(bactopeptone^tm10.0gm/l、酵母提取物10.0gm/l、和氯化鈉5.0gm/l)起子培養(yǎng)物，并在28℃通氣下溫育過夜。然后，將土壤桿菌起子接種到無菌的500ml帶擋板燒瓶中的含大觀霉素(100mg/l)、卡那霉素(50mg/l)和利福平(10mg/l)的300mlyep液中，在28℃以200rpm振搖過夜。將培養(yǎng)物以6000rpm離心并重懸于等體積的含有10％(w/v)蔗糖、10μg/l6-芐氨基嘌呤和.03％silwetl-77的1/2xms培養(yǎng)基中，然后轉化植物組織。

擬南芥轉化

使用自clough和bent(1998)借鑒的花序浸漬法(floraldip)轉化擬南芥。使用含有上述二元質(zhì)粒之一的經(jīng)驗證的土壤桿菌甘油儲液接種5ml含有大觀霉素(100mg/l)和卡那霉素(50mg/l)、和利福平(10mg/l)的yep肉湯預培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在28℃通氣下溫育過夜。然后，在相同的抗生素選擇條件下將預培養(yǎng)物放大至300ml，再次在225rpm恒定攪拌下在28℃溫育。在4℃使細胞在大約5,000xg下沉淀15分鐘，棄去上清液。將細胞沉淀輕輕重懸于300ml的接種培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有：10％(w/v)蔗糖、10μg/l6-芐氨基嘌呤、以及.03％silwetl-77。將41日齡的植物(在35天時修剪主花序)倒置并浸入培養(yǎng)基中。將植物(現(xiàn)在稱為t0)側放在透明覆蓋的塑料桶中，過夜，然后在第二天直立放置在生長室中。使植物在22℃、16小時光照/8小時黑暗的光周期中生長。浸漬四周后，將水去除，使植物干燥一周以備t1種子收獲。

將t1種子播種在10.5”x21”發(fā)芽托盤(germinationtray)中，每個盤放入200mg等份的層積t1種子(約10,000粒種子)，所述種子先前已懸于40ml0.1％瓊脂糖溶液中，并在4℃保存2天，以確保種子同步萌發(fā)(春化)。

將sunshinemixlp5土壤介質(zhì)用細蛭石覆蓋，并用hoagland溶液從地下灌溉至濕潤，然后通過重力排干。用移液器將每個40ml等份的層積種子均勻播種在蛭石上，并用保濕蓋(humiditydome)覆蓋4-5天。除去保濕蓋1天后，利用草銨膦(liberty)進行初始轉化體選擇。

在種植后7天日(7dap)以及9dap時，對t1植物(分別在子葉和2-4葉期)用0.2％的liberty除草劑溶液(200g活性成分/l的草銨膦，bayercropsciences,kansascity,mo)以10ml/盤(703l/公頃)的噴灑體積使用devilbiss壓縮空氣噴嘴進行噴灑，遞送的有效比率為每次施用280gai/ha的草銨膦。在最后噴灑3天后鑒定存活者(活躍生長的推定轉化植物)，并在最后噴灑選擇之后7天(16dap)逐一移栽到溫室中的備有sunshinemixlp5的3英寸盆中。將移栽的植物在溫室中培養(yǎng)(22±5℃,50±30％rh，14h光照:10小時黑暗，最低500μe/m²s¹自然光+補充光)。對存活的t1植物進行分子分析，以確認pat除草劑選擇標志物基因已經(jīng)整合到植物的基因組中。

分子確認

對推定的轉基因擬南芥植物進行取樣，用于采用針對pat的定量pcr測定法檢測轉基因的存在。使用biosprint96kitdna提取試劑盒(qiagen,valencia,ca)按照制造商的說明從葉樣品中提取總dna。

為了檢測感興趣的基因，通過水解(類似于)引物/探針組擴增基因特異性dna片段，所述引物/探針組含有用于pat基因的cy5標記的熒光探針和用于內(nèi)源性tafii-15參考基因對照(genbankid:nc003075；duarte等人，bmcevol.biol.,10:61)的hex標記的熒光探針。下列引物用于pat和內(nèi)源性tafii-15參考基因擴增。引物序列如下：

pat引物/探針：

pat正向引物：tqpats:acaagagtggattgatgatctagagaggt(seqidno:7)；

pat反向引物：tqpata:ctttgatgcctatgtgacacgtaaacagt(seqidno:8)；和

pat探針：5′-/5cy5/agggtgttgtggctggtattgcttacgct/3bhq_2/-3′(seqidno:9)；

tafii-15引物/探針：

正向引物：tafii-15f:gaggattagggtttcaacggag(seqidno:10)；

反向引物：tafii-15r:gagaattgagctgagacgagg(seqidno:11)；和

tafii-15探針：5′-/5hex/agagaagtttcgacggatttcgggc/3bhq_2/-3′(seqidno:12)；

接下來，在10μl的反應終體積中進行qpcr反應，所述反應含有5μl的roche480probes母液混合物(rocheappliedsciences,indianapolis,in)；各自0.4μl的tqpata、tqpats、tafii-15f和tafii-15r引物，其從10μm的原液稀釋為終濃度400nm；各自0.4μl的pat探針和tafii-15探針，其從5μm原液稀釋為終濃度200nm；以1:5稀釋在水中的2μl的基因組dna；和0.5μl水。在roche480system中在下列條件下擴增dna：95℃10分鐘，1個循環(huán)，接著為40個循環(huán)的下列3個步驟：95℃10秒；60℃40秒；和72℃1秒。通過將未知樣品的靶(感興趣基因)/參考(轉化酶基因)值(由480輸出)與pat拷貝數(shù)對照的靶/參考值進行比較來確定pat拷貝數(shù)。

根據(jù)分子確認，鑒定了含有上述質(zhì)粒的單個轉基因插入片段的特定擬南芥轉基因事件。使這些植物自體受精，種植所得的t1種子，以監(jiān)測和測定t1幼苗在不同發(fā)育階段的不同植物組織中的yfp蛋白表達。

實施例5：轉基因植物表達篩選

使擬南芥t1轉基因事件長成幼苗，在15dap時通過熒光顯微鏡和目視觀察評定yfp熒光。另外，在種植7周后，進一步觀察擬南芥t1轉基因事件，其中通過熒光顯微鏡和目視查看了葉、花序和長角果。最后，在種植10周后觀察擬南芥t1轉基因事件，其中通過熒光顯微鏡和目視查看正在發(fā)育的幼苗。使用leicadfc310fxstereoscope^tm(leica,buffalogrove,il)對幼苗和正在發(fā)育的種子成像，其設置如下(例如，最大激發(fā)波長-525nm、最大發(fā)射波長-482nm)。使用typhoonscanner^tm(gehealthcarelifesciences,piscataway,nj)對葉、花序和長角果進行成像，其設置如下(例如，用于葉綠素的藍色488nm激光，670bp30，用于phiyfp的520bp40，350pmt)。

t1幼苗和植物組織的yfp成像表明，在甘藍型油菜accox基因啟動子控制下并由甘藍型油菜accox基因3′utr終止的蛋白質(zhì)在種子中優(yōu)先表達，該種子優(yōu)先表達在單拷貝事件中檢測到。目視觀察表明，由這些調(diào)控元件驅動的表達是早期種子發(fā)育和早期花發(fā)育所特有的。就這點而言，在正在發(fā)育的花序的胚珠內(nèi)觀察到由甘藍型油菜accox調(diào)控元件驅動的表達模式(圖3)。在擬南芥植物種子發(fā)育期間，yfp蛋白組織的表達最可能位于胚乳組織內(nèi)。胚乳組織中的表達是顯著的，因為在種子發(fā)育早期大部分的種子組織是由這種類型的組織構成的。在含有yfp基因的多個拷貝的轉基因事件的花、莖、葉和種子中觀察到了進一步的yfp蛋白表達。

實施例6：擬南芥中的蛋白表達定量

通過phiyfpelisa測定擬南芥植物種子的樣品，收集種子并進行珠磨。在klecco^tm珠磨機中將約10mg的種子材料用2bb(4.5mm鋼珠；daisy；rogers，ar)擊打1分鐘。加入300μl提取緩沖液(pbs，補充有按重量計的0.05％tween20和0.05％牛血清白蛋白)。在輕輕敲打使樣品懸浮，在室溫下在平臺式搖床上搖動30分鐘。然后，將樣品在離心機中以14,000xg旋轉離心5分鐘。除去上清液并通過elisa分析。

將maxisorbplates^tm(thermofisherscientific)用1xpbs中的1.0μg/ml濃度的抗yfp單克隆抗體(origene#ta150028)包被。在4℃溫育過夜后，用含有0.5％牛血清白蛋白的pbst(pbs+0.5％-20)在37℃封閉平板2小時。在分析前，將平板在洗板機中洗滌4次，每次洗滌使用350μl的pbst。將純化的蛋白質(zhì)參考抗原(evrogen)在封閉緩沖液中稀釋到2ng/ml，用于生成具有2ng/ml到0.0313ng/ml系列稀釋度的標準曲線。將樣品在封閉緩沖液中稀釋到1:4的起始稀釋度，并以1:4的比率另外稀釋3次(1:4、1:16、1:64、1:256)。接著，將100μl的所有標準品和樣品稀釋物以一式兩份上樣到elisa板上。在室溫下在elisa板上溫育樣品1小時。溫育后，如上所述洗滌平板。將兔抗phiyfp多克隆抗體(evrogen)在封閉緩沖液中稀釋到1μg/ml，并以100μl/孔加入板中。在室溫下將平板溫育1小時，然后洗滌。將抗兔辣根過氧化物酶綴合的檢測抗體(pierce)以1:5000稀釋度加入板中。在室溫下將平板溫育1小時，如上進行洗滌。接著，以每孔100μl向平板中加入1-stepultratmbsubstrate^tm(thermoscientific)。當含有標準曲線最低稀釋度的孔開始顯示藍色時，加入50μl的終止溶液(0.4nh2so4)使反應停止。在使用prov5(moleculardevices)的酶標儀(moleculardevices)中在450nm下讀板，減去650nm的參比。通過二次方標準曲線的線性回歸計算測試樣品的phiyfp濃度。

將yfp的表達水平定量，并提供在下表1中。對于含有低拷貝數(shù)事件(即1至2個拷貝)的轉基因事件，yfp在甘藍型油菜accox調(diào)控元件作用下在擬南芥種子中的表達的范圍為0.004到0.020ng/mg。此外，這些結果表明，低拷貝數(shù)事件的平均表達量為約0.00875ng/mg。最后，對于含有高拷貝數(shù)事件(即，多于2個拷貝)的轉基因事件，在甘藍型油菜accox調(diào)控元件作用下在擬南芥種子中的yfp表達量為1.079ng/mg。

表1：擬南芥種子中yfp的表達定量

如此，鑒定和表征了甘藍型油菜accox基因調(diào)控元件。首次公開了在基因表達構建體中使用的新的啟動子和3′-utr調(diào)控元件。

序列表

<110>美國陶氏益農(nóng)公司

h·j·巴特勒

s·a·貝文

c·m·拉森

w·莫斯卡爾

d·o·岡薩雷斯

<120>甘藍型油菜種子特異性啟動子

<130>75732

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1483

<212>dna

<213>brassicanapus

<400>1

ctcacatcaccaccttttaacttcgttggttaatttcttgaaaagaagatcgtcatattt60

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acagtacacatctcgttttg500

<210>3

<211>2918

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>來自pdab113904的黃色熒光蛋白基因表達盒

<400>3