疏水性肽的制造方法與流程
本發(fā)明涉及簡便地對鍵合了載體的粗制肽進(jìn)行純化而制造純化肽的方法、以及適于該純化肽的制造方法的接頭。
背景技術(shù)：
作為化學(xué)合成肽和蛋白質(zhì)的方法，作為代表性的方法已知有：用聚苯乙烯高分子凝膠珠等作為固相，對其反復(fù)進(jìn)行氨基酸的縮合反應(yīng)和末端保護(hù)基的脫保護(hù)，由此使肽鏈依次延長的固相合成法；以及，在液相中反復(fù)進(jìn)行氨基酸的縮合反應(yīng)和末端保護(hù)基的脫保護(hù)，由此使肽鏈延長的液相合成法。其中，固相合成法中高分子凝膠鍵合于生成的肽鏈而不溶，因此可通過過濾等除去原料試劑等可溶性雜質(zhì)，容易進(jìn)行粗純化。然后，對于通過除去高分子凝膠而得到的肽而言，在其為親水性的情況下，可以利用反相hplc等進(jìn)一步進(jìn)行純化。然而，在生成的肽為疏水性的情況下，無法用反相hplc進(jìn)行純化，產(chǎn)生難以高純度化的問題。
作為固相合成的疏水性肽的純化技術(shù)，已知如下方法：一方面從疏水性肽上切斷除去固相載體，另一方面使親水性肽鍵合，在暫時使疏水性肽親水化而實施了hplc純化后，切斷除去該親水性肽，獲得高純度的疏水性肽。例如，專利文獻(xiàn)1中記載了通過應(yīng)用生物技術(shù)而使親水性肽鍵合于疏水性肽的技術(shù)。但是，在利用生物技術(shù)的情況下，其制造效率受到目標(biāo)疏水性肽的序列的很大影響，有時難以大量生產(chǎn)，存在缺乏技術(shù)通用性的問題。
作為將親水性氨基酸連續(xù)地鍵合于疏水性肽并進(jìn)行親水化、hplc純化的技術(shù)，除了上述使用了生物技術(shù)的肽制造方法以外，還已知：利用了boc固相合成法的技術(shù)(非專利文獻(xiàn)1)、利用了fmoc固相合成法的技術(shù)(非專利文獻(xiàn)2～5等)。在采用這些化學(xué)方法形成肽的情況下，由于連續(xù)地反復(fù)進(jìn)行氨基酸的保護(hù)基的脫保護(hù)和肽合成，因此不需要在氨基酸脫保護(hù)反應(yīng)條件下切斷疏水性肽與固相載體之間的鍵。例如，在boc固相合成法中，為了用作為強酸的tfa對氨基酸的保護(hù)基進(jìn)行脫保護(hù)，而使疏水性肽與固相載體之間的鍵具有耐強酸性。該疏水性肽與固相載體的鍵的切斷通常使用hf。但是，hf危險且有害，需要特殊的制造裝置。
在fmoc固相合成法中，由于可以在堿性條件下進(jìn)行脫保護(hù)，因此與固相載體的鍵合方法的自由度高。例如，在非專利文獻(xiàn)2、3中公開了如下方法：用fmoc固相合成法在固相載體上合成親水性肽，接著在其n末端側(cè)鍵合4-羥甲基苯甲酸作為接頭，再用fmoc固相合成法合成疏水性肽。在該方法中，固相載體與肽鏈容易切斷，而且接頭的羥基側(cè)(疏水性肽鍵合側(cè))也容易切斷。但是，在該方法中，難以根據(jù)目標(biāo)肽(疏水性肽)的氨基酸序列而適當(dāng)變更親水性肽，缺乏方法的通用性。另外，在從接頭的羥基側(cè)除去親水性肽時需要強堿性條件。因此，存在因以天冬酰亞胺(aspartimide)化為代表的副反應(yīng)所導(dǎo)致的純度降低的隱患，也存在得到的疏水性肽的c末端側(cè)的形態(tài)僅限于羧酸的問題。
非專利文獻(xiàn)4和5的方法為相同的fmoc固相合成法，而且在能夠用固相合成法先合成疏水性肽(目標(biāo)肽)方面比上述非專利文獻(xiàn)2、3的方法更優(yōu)異。該方法需要在合成n末端具有親水性肽和亞苯基型化合物的氨基酸之后完成疏水性肽的序列。因此，由于每個疏水性肽需要n末端具有親水性肽和亞苯基型化合物的氨基酸，可以認(rèn)為是繁瑣的工藝。另外，最終得到的疏水性肽無法使n末端側(cè)為半胱氨酸、蛋氨酸，缺乏通用性。另外，在該方法中，難以根據(jù)目標(biāo)肽(疏水性肽)的氨基酸序列而適當(dāng)變更親水性肽，在這一方面也缺乏方法的通用性。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1：日本特開平07-102000號公報
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)1：englebretsen、d.r.等著、tetrahedron1999、55、6623；
非專利文獻(xiàn)2：hossain、m.a等著、bioconjutgate.chem.2009、20、1390；
非專利文獻(xiàn)3：choma、c.t.等著、tetrahedronletters1998、39、2417；
非專利文獻(xiàn)4：vorherr、t.著、chimicaoggi2007、25、22；
非專利文獻(xiàn)5：dick、f等著、eur.pept.symp.29th、gdansk2006、posteth009。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
發(fā)明要解決的課題
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種制造方法，該方法在用親水性單元對固相合成的疏水性肽進(jìn)行親水化并進(jìn)行hplc純化時，能夠不依賴于n末端的氨基酸殘基的種類而以全部疏水性肽作為純化對象，且疏水性肽的c末端側(cè)的形態(tài)不受羧酸的限制，另外，可以根據(jù)疏水性肽的種類而隨機應(yīng)變地選擇親水性單元，而且通用性優(yōu)異。
解決課題的方法
本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果是，首先，以隨后向固相合成的目標(biāo)肽導(dǎo)入接頭和親水性單元的形式，將親水性單元設(shè)計為能夠隨機應(yīng)變地進(jìn)行選擇的形式。由此，可以使c末端側(cè)的形態(tài)不限定于羧酸而進(jìn)行親水化。因此發(fā)現(xiàn)，在導(dǎo)入接頭和親水性單元時，只要預(yù)先將目標(biāo)肽與接頭的鍵設(shè)計為能夠通過化學(xué)處理來切斷的形式，就能夠形成該鍵而不依賴于目標(biāo)肽的n末端氨基酸的種類，可以擴展目標(biāo)肽的種類，且這樣的鍵具有對氨基酸保護(hù)基的脫保護(hù)條件(作為fmoc脫保護(hù)條件的哌啶條件等)、對從固相載體上切下(tfa條件等)的耐性，能夠制造用于hplc純化的無載體的親水化肽體(目標(biāo)肽、接頭和親水性單元的鍵合體)，而且在該純化后可以簡便地切斷除去親水性單元及接頭，由此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下所述。
[1]一種純化肽的制造方法，其是從由載體和以c末端側(cè)鍵合于該載體的第1肽鏈構(gòu)成的帶有載體的粗制肽獲得純化肽的方法，該方法包括：
親水化工序a，向帶有載體的粗制肽的氨基依次分步導(dǎo)入或一步導(dǎo)入接頭和親水性單元，獲得無載體的親水化肽體；
載體切除工序b，用于在從將接頭鍵合于帶有載體的粗制肽之前至得到親水化肽體的任意階段中、或者在得到了帶有載體的親水化肽體之后，切斷第1肽鏈與載體之間的鍵；
色譜純化工序，用液相色譜對由親水化工序a及載體切除工序b得到的無載體的親水化肽體進(jìn)行處理；以及
接頭切除工序，通過化學(xué)處理將色譜純化后的無載體的親水化肽體中含有的接頭-第1肽鏈之間的鍵切斷。
[2]根據(jù)[1]所述的純化肽的制造方法，其中，通過催化還原或酸來進(jìn)行所述接頭切除工序。
[3]根據(jù)[2]所述的純化肽的制造方法，其中，使用含有酸和路易斯酸的混合溶液來進(jìn)行所述接頭切除工序。
[4]根據(jù)[3]所述的純化肽的制造方法，其中，使用含有tfa和路易斯酸的混合溶液來進(jìn)行所述接頭切除工序。
[5]根據(jù)[4]所述的純化肽的制造方法，其中，使用含有tfa、tmsotf及茴香硫醚的混合溶液來進(jìn)行所述接頭切除工序。
[6]根據(jù)[2]所述的純化肽的制造方法，其中，使用pka-2以下的酸來進(jìn)行所述接頭切除工序。
[7]根據(jù)[2]所述的純化肽的制造方法，其中，使用金屬擔(dān)載催化劑來進(jìn)行所述接頭切除工序。
[8]根據(jù)[1]～[7]中任一項所述的純化肽的制造方法，其中，所述親水性單元為親水性肽、聚醚或多胺。
[9]根據(jù)[1]～[8]中任一項所述的純化肽的制造方法，其中，所述親水化工序a由使接頭鍵合于粗制肽的氨基的接頭鍵合工序和將親水性單元鍵合于得到的接頭鍵合體的接頭部位的親水性單元鍵合工序構(gòu)成，
在所述親水性單元鍵合工序中，
通過fmoc固相合成法分步地使多個氨基酸鍵合于接頭部位、或
使預(yù)先制備的親水性肽鏈鍵合于接頭部位、或
使預(yù)先制備的聚醚鍵合于接頭部位、或者
使預(yù)先制備的多胺鍵合于接頭部位。
[10]根據(jù)[1]～[9]中任一項所述的純化肽的制造方法，其中，在通過所述親水化工序a得到了帶有載體的親水化肽體之后，實施載體切除工序b。
[11]根據(jù)[1]～[10]中任一項所述的純化肽的制造方法，其中，在接頭切除工序后用水或含水溶劑進(jìn)行清洗。
[12]根據(jù)[1]～[11]中任一項所述的純化肽的制造方法，其中，通過fmoc固相合成法使多個氨基酸依次鍵合于載體，形成所述帶有載體的粗制肽。
[13]根據(jù)[1]～[12]中任一項所述的純化肽的制造方法，其中，所述接頭通過形成芐氧羰基氨基或芐氨基而與第1肽鏈鍵合。
[14]根據(jù)[1]～[13]中任一項所述的純化肽的制造方法，其中，所述接頭具有：能夠與粗制肽形成芐氧羰基氨基或芐氨基的第1基團、和能夠與親水性單元化學(xué)鍵合的第2基團。
[15]根據(jù)[1]～[14]中任一項所述的純化肽的制造方法，其中，所述親水性單元的logp(式中，p為在辛醇-水體系中的分配系數(shù))值為-1以下。
[16]根據(jù)[1]～[15]中任一項所述的純化肽的制造方法，其中，所述親水性單元為親水性肽鏈，所述親水性肽鏈含有2個以上選自精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸中至少1種以上的氨基酸殘基。
[17]根據(jù)[1]～[16]中任一項所述的純化肽的制造方法，其中，所述親水性單元為親水性肽鏈，所述親水性肽鏈含有2個以上選自天冬氨酸、谷氨酸中至少1種以上的氨基酸殘基。
[18]根據(jù)[8]～[17]中任一項所述的純化肽的制造方法，其中，所述親水性肽鏈的氨基酸殘基的數(shù)量為2以上且35以下。
[19]一種接頭，其具有：能夠與伯胺或仲胺形成芐氧羰基氨基或芐氨基的第1基團、和能夠與親水性單元化學(xué)鍵合的第2基團。
[20]一種接頭，其以下式(1)表示，
[化學(xué)式1]
式(1)中，r1為具有受到保護(hù)的伯氨基的有機基團，r2為吸電子性基團，n為0～4的整數(shù)，z為下式(a)所表示的碳酸酯基、甲?；螓u代甲基，
[化學(xué)式2]
式(a)中，x表示離去基團，＊表示與化合物(1)的苯環(huán)的鍵合部位。
[21]一種接頭，其以下式(2)、下式(4)或下式(6)表示，
[化學(xué)式3]
式(2)中，r2為吸電子性基團，n為0～4的整數(shù)，pro為氨基保護(hù)基，x為-orx(式中rx為雜環(huán)酰亞胺基)，r3為碳原子數(shù)1～10的亞烷基，
[化學(xué)式4]
式(4)中，r2為吸電子性基團，n為0～4的整數(shù)，pro為氨基保護(hù)基，r3為碳原子數(shù)1～10的亞烷基，
[化學(xué)式5]
式(6)中，r2為吸電子性基團，n為0～4的整數(shù)，pro為氨基保護(hù)基，r3為碳原子數(shù)1～10的亞烷基，x3為鹵原子。
[22]一種接頭，其以下式(3a)表示。
[化學(xué)式6]
發(fā)明的效果
根據(jù)本發(fā)明，以隨后向目標(biāo)肽依次導(dǎo)入接頭和親水性單元的形式，將親水性單元設(shè)計為能夠隨機應(yīng)變地進(jìn)行選擇的形式，將目標(biāo)肽與接頭的鍵制備成能夠通過化學(xué)處理來切斷的形式，因此，目標(biāo)肽的形態(tài)及序列不受限制。因此，能夠擴展目標(biāo)肽的種類，純化后的親水性單元的切斷也簡便。
附圖說明
圖1是實施例1中得到的親水化肽體(粗產(chǎn)物)的hplc分析結(jié)果。
圖2是實施例1中得到的親水化肽體(粗產(chǎn)物)的質(zhì)量分析結(jié)果。
圖3是實施例1中得到的親水化肽體(純化后)的hplc分析結(jié)果。
圖4是實施例1中得到的親水化肽體(純化后)的質(zhì)量分析結(jié)果。
圖5是實施例1中得到的高純度的疏水性肽giltvsvav的hplc分析結(jié)果。
圖6是實施例1中得到的高純度的疏水性肽giltvsvav的質(zhì)量分析結(jié)果。
圖7是實施例4中得到的親水化肽體(粗產(chǎn)物)的hplc分析結(jié)果。
圖8是實施例4中得到的親水化肽體(粗產(chǎn)物)的質(zhì)量分析結(jié)果。
圖9是實施例4中得到的親水化肽體(純化后)的hplc分析結(jié)果。
圖10是實施例4中得到的親水化肽體(純化后)的質(zhì)量分析結(jié)果。
圖11是實施例4中得到的高純度的疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv的hplc分析結(jié)果。
圖12是實施例4中得到的高純度的疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv的質(zhì)量分析結(jié)果。
具體實施方式
＜純化肽的制造方法＞
以下所示的簡圖i示出了本發(fā)明的制造工藝的基本情況。以下，在適當(dāng)參考該簡圖的同時對本發(fā)明詳細(xì)地進(jìn)行說明。
[化學(xué)式7]
本發(fā)明的純化肽的制造方法以帶有載體的粗制肽作為純化對象(目標(biāo))，所述帶有載體的粗制肽由載體和以c末端側(cè)鍵合于該載體的第1肽鏈構(gòu)成。因此，其目的在于依次對該純化對象進(jìn)行處理，最終得到純化后的游離的第1肽鏈(純化肽)。
從該純化對象(帶有載體的粗制肽)至目標(biāo)物(第1肽鏈)的處理步驟有如下工序：
親水化工序a(簡圖i中，工序a1a及a1b或a2-i)，向粗制肽(簡圖i中，帶有載體的粗制肽或無載體的粗制肽中的任一種)的氨基依次分步導(dǎo)入或一步導(dǎo)入接頭和親水性單元，獲得親水化肽體(簡圖i中，帶有載體的親水化肽體或無載體的親水化肽體中的任一種)；
載體切除工序b(簡圖i中，工序b1、b2、b3中的任一種)，用于在從將接頭鍵合于帶有載體的粗制肽之前得到親水化肽體的任意階段中、或者在得到了帶有載體的親水化肽體之后，切斷第1肽鏈與載體之間的鍵；
色譜純化工序，將由親水化工序a及載體切除工序b得到的無載體的親水化肽體溶于水，并用液相色譜進(jìn)行處理；以及
接頭切除工序，通過化學(xué)處理將色譜純化后的無載體的親水化肽體中含有的接頭-第1肽鏈之間的鍵切斷。
在該方法中，先在載體上形成第1肽鏈(目標(biāo)肽鏈)，隨后鍵合親水性單元，因此，能夠隨機應(yīng)變地選擇親水性單元，可以提高工藝設(shè)計的自由度。而且，根據(jù)本發(fā)明，在親水化工序a中將親水性單元鍵合于第1肽鏈，且在切除工序b1～b3中除去了載體，因此，能夠使第1肽鏈親水化，可以進(jìn)行色譜純化。特別是在本發(fā)明的方法中，接頭與第1肽鏈之間形成了能夠通過化學(xué)處理切斷的鍵，這樣的鍵具有對氨基酸保護(hù)基除去條件的耐久性，因此，例如可以用fmoc合成法形成親水性單元。另外，由于也具有對固相載體的切斷除去條件(tfa條件等)的耐久性，因此，即使在導(dǎo)入了親水性單元之后(當(dāng)然，即使在導(dǎo)入親水性單元之前)也可以除去固相載體，設(shè)計的自由度極大提高。另外，該鍵可以不依賴于第1肽鏈的n末端氨基酸種類而形成，因此能夠提高第1肽鏈(目標(biāo)肽)的通用性。因此，在色譜純化結(jié)束后可以與上述相同地通過化學(xué)處理按照各個切斷除去親水性單元，因此，不需要用于該切斷除去的特殊設(shè)備，能夠簡便地制造純化第1肽鏈(純化肽)。以下，按照工序順序詳細(xì)地對本發(fā)明進(jìn)行說明。
1.帶有載體的粗制肽的制造工序
首先，從作為純化對象的帶有載體的粗制肽的制造工序進(jìn)行說明?！皫в休d體的粗制肽”是指由載體和以c末端側(cè)鍵合于該載體的第1肽鏈構(gòu)成的載體與第1肽鏈的鍵合體。因此，“第1肽鏈”是指兩個以上的氨基酸能夠在氨基與羧基之間形成肽鍵而聚合的化合物，在本發(fā)明中，以純化該第1肽鏈作為目標(biāo)。需要說明的是，在本說明書中，“粗制肽”是包括帶有載體的粗制肽和無載體的粗制肽兩者的概念。帶有載體的粗制肽的制造工序在本發(fā)明中不是必須的，經(jīng)過其它工藝得到的粗制肽也可以適用本發(fā)明的純化方法，但通過下述工序制造帶有載體的粗制肽較簡便。在下述帶有載體的粗制肽的制造工序中，進(jìn)行將多個氨基酸依次鍵合于載體的n末端側(cè)的固相肽合成。
上述氨基酸是指至少分別具有1個以上堿性的氨基(-nh2)和酸性的羧基(-cooh)的化合物。在本發(fā)明中，上述氨基酸沒有特別限定，可優(yōu)選列舉例如：甘氨酸、丙氨酸、3,3,3-三氟丙氨酸、2-氨基丁酸、2-氨基-2-甲基丁酸、正纈氨酸、5,5,5-三氟正纈氨酸、纈氨酸、2-氨基-4-戊烯酸、2-氨基-2-甲基戊烯酸、炔丙基甘氨酸、2-氨基環(huán)戊烷羧酸、正亮氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、叔亮氨酸、2-氨基-4-氟-4-甲基戊酸、4-氨基環(huán)己烷羧酸、絲氨酸、o-甲基絲氨酸、o-烯丙基絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸、半胱氨酸、2-甲基半胱氨酸、蛋氨酸、青霉胺、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、組氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、2-氨基己二酸、鳥氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、(1r,2s)-1-氨基-2-乙烯基環(huán)丙烷羧酸、(1r,2s)-1-氨基-2-乙基環(huán)丙烷羧酸、肌氨酸、苯丙氨酸、n-甲基丙氨酸、n,n-二甲基丙氨酸等α-氨基酸；氮丙啶羧酸、吖丁啶羧酸、脯氨酸、1-甲基脯氨酸、2-甲基脯氨酸、2-乙基脯氨酸、3-甲基脯氨酸、4-甲基脯氨酸、5-甲基脯氨酸、4-亞甲基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、4-氟脯氨酸、哌可酸、哌啶酸、異哌啶酸等環(huán)狀氨基酸；β-丙氨酸、異絲氨酸、3-氨基丁酸、3-氨基戊酸、β-亮氨酸等β-氨基酸；4-氨基丁酸、4-氨基-3-甲基丙酸、4-氨基-3-丙基丁酸、4-氨基-3-異丙基丁酸、4-氨基-2-羥基丁酸等γ-氨基酸。優(yōu)選的氨基酸為天然氨基酸、α-氨基酸等，是天然α-氨基酸，在本發(fā)明中，對于1分子氨基酸中的氨基和羧基的數(shù)量沒有特別限定，例如，可以為1個，也可以為多個。而且，每1分子氨基酸中的氨基與羧基的數(shù)量可以相同，也可以不同。
上述第1肽鏈對水的溶解性是按照gravy(grandaverageofhydropathy)得分來進(jìn)行評價的。gravy得分是指蛋白質(zhì)中的全部氨基酸的平均親水性得分。gravy得分可以按照kyte等的方法(j.kyte,rf.doolittle,jmol.biol152(1982)105)計算，通常，得分為正的肽具有疏水性的傾向，得分為負(fù)的肽具有親水性的傾向。根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)σ酝y以純化的疏水性肽進(jìn)行純化。以上述gravy得分計，這樣的疏水性肽優(yōu)選為-0.5以上，更優(yōu)選為0以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.5以上。上限沒有特別限定，但通常為10以下，可以為5以下。
另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)σ酝y以合成的包含半胱氨酸、蛋氨酸等含硫氨基酸的第1肽鏈進(jìn)行純化，因此，本發(fā)明對包含含硫氨基酸的肽的純化也是有用的。
上述第1肽鏈的氨基酸殘基的數(shù)量例如優(yōu)選為2以上，更優(yōu)選為4以上，進(jìn)一步優(yōu)選為6以上。上限沒有特別限定，例如優(yōu)選為200以下，更優(yōu)選為150以下，進(jìn)一步優(yōu)選為100以下。
在帶有載體的粗制肽的制造工序中，通過肽固相合成法制造上述第1肽鏈。肽固相合成法是指，在聚苯乙烯等水不溶性固相載體上經(jīng)由直接鍵合于該載體的接頭依次鍵合氨基酸的c末端而使肽逐漸延長的方法。在完成了希望的序列之后，從載體上切斷生成的肽鏈，由此可以制造希望的肽。根據(jù)本合成法，能夠不依賴于氨基酸的序列而合成大范圍的肽，因此易于全自動化。
作為使多個氨基酸依次鍵合于載體而合成上述帶有載體的粗制肽的方法，優(yōu)選使用fmoc基作為n末端保護(hù)基的fmoc固相合成法。通常在fmoc固相合成法中，可以在酰胺類溶劑(dmf等)和胺類堿(特別是哌啶)等堿性條件下進(jìn)行脫保護(hù)，利用酸性條件(tfa等)從載體上切下生成的肽。
fmoc固相合成中使用的氨基酸可以使用n末端受到保護(hù)的普通的氨基酸。在使接頭鍵合于肽的主鏈或支鏈的情況下，可以使用下述氨基酸，所述氨基酸具有在未使用哌啶、tfa的條件下能夠脫保護(hù)的基團。另外，也可以在第1肽鏈形成后，向任意的氨基酸殘基導(dǎo)入保護(hù)基團。
在利用fmoc固相合成法進(jìn)行肽合成的情況下，n末端被fmoc保護(hù)，且使羧酸基被活性化的氨基酸與肽的n末端發(fā)生反應(yīng)而形成新的肽鍵，接著，將fmoc保護(hù)基團脫保護(hù)，露出新的n末端，使其與n末端被fmoc保護(hù)且羧酸基被上述方法所活性化后的下一個氨基酸發(fā)生反應(yīng)，以后，重復(fù)相同的步驟，由此合成肽鏈。
上述水不溶性固相載體沒有特別限定，可以使用肽固相合成法中廣泛應(yīng)用的例如rinkamideresin、rinkamideamresin、rinkamidepegaresin、rinkamidembharesin、rinkamideamresin、rinkamidenovagel、novasyntgrresin、novasyntgaresin、tentagelresin、wangresin、hmpa-pegaresin、hmp-novagel、hmpa-novagel、2-chlorotritylresin、novasyntgtalcoholresin、hmpb-am、sieberamideresin、novasyntgsieberresin、4-{4-formyl-3-methoxyphenoxy}butyrylamresin、4-sulfamylbutyrylamresin、4-sulfamylbutyrylampega、4-fmoc-hydrozinobenzoylamresin、hmba-amresin、hmba-novagel、dhphm等各種載體。固相載體優(yōu)選在表面具有作為固相合成的起點的氨基，該氨基可以已經(jīng)被保護(hù)。在固相載體的表面存在氨基時，可以經(jīng)由酰胺基團鍵合上述第1肽鏈和載體。
在肽的合成中，可以通過各種活性酯法、或者通過1-羥基苯并三唑(hobt)、1-羥基-7-偶氮苯并三唑(hoat)等三唑類；o-(苯并三唑-1-基)-n,n,n’,n’-四甲基脲
在用fmoc固相合成法合成了帶有載體的粗制肽之后，該帶有載體的粗制肽可以根據(jù)需要進(jìn)行過濾，且可以用適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑(例如，dmf、二氯甲烷等)進(jìn)行清洗。通過這樣進(jìn)行過濾/清洗，可以簡便地除去溶解性的雜質(zhì)(原料等)，能夠提高帶有載體的粗制肽的純度。需要說明的是，在以下的工序中，只要在切斷除去載體之前，就可以適當(dāng)實施該過濾/清洗工序。
2.親水化工序
親水化工序是本發(fā)明的最初的工序，其特征在于，向上述粗制肽(帶有載體的粗制肽或無載體的粗制肽中的任一種)的氨基依次分步導(dǎo)入或一步導(dǎo)入接頭和親水性單元，獲得親水化肽體(帶有載體的親水化肽體或無載體的親水化肽體中的任一種)。
親水化工序中使用的粗制肽可以使用經(jīng)過各種工藝得到的粗制肽，從簡便方面考慮，可以使用上述工序中制造的帶有載體的粗制肽。向上述工序中制造的帶有載體的粗制肽導(dǎo)入接頭和親水性單元的方法沒有特別限定，可以由接頭鍵合工序(簡圖i中，a1a)和親水性單元鍵合工序(簡圖i中，a1b)構(gòu)成，所述接頭鍵合工序使接頭鍵合于帶有載體的粗制肽的氨基，所述親水性單元鍵合工序?qū)⒂H水性單元鍵合于得到的帶有載體的接頭鍵合體的接頭部位；也可以實施親水性單元接頭復(fù)合體鍵合工序(簡圖i中，a2-i)，所述親水性單元接頭復(fù)合體鍵合工序?qū)㈩A(yù)先使親水性單元與接頭復(fù)合而成的復(fù)合物(復(fù)合體)鍵合于帶有載體的粗制肽的氨基。
另外，在親水化工序中可以使用無載體的粗制肽?？梢耘ca1a～a1b、a2-i一樣地實施使接頭鍵合于該無載體的粗制肽的接頭鍵合工序(簡圖i中，a1c)、親水性單元鍵合工序(簡圖i中，a1d)、親水性單元接頭復(fù)合體鍵合工序(簡圖i中，a2-ii)。
對于上述接頭的鍵合位置而言，只要是至少鍵合有1個以上氫原子的粗制肽中的氨基，就可以是第1肽鏈的末端、支鏈中的任一者。
＜接頭鍵合工序a1a＞
在本發(fā)明中，“接頭”是指如下化合物，其具有能夠與第1肽鏈(例如，氨基)鍵合的第1鍵合基團，還具有能夠與下面敘述的親水性單元鍵合的第2鍵合基團，能夠在鍵合后以與第1肽鏈和親水性單元鍵合的狀態(tài)存在于第1肽鏈與親水性單元之間。在本說明書中，將該接頭鍵合工序中得到的產(chǎn)物稱為“接頭鍵合體”，將結(jié)合了載體的接頭鍵合體特別稱為“帶有載體的接頭鍵合體”，將除去了載體的接頭鍵合體特別稱為“無載體的接頭鍵合體”。因此，在本發(fā)明中，如下面所述，有時在將接頭鍵合于帶有載體的粗制肽后，通過肽合成將氨基酸與該接頭連接，制備親水性單元。因此，需要在肽合成條件(特別是在氨基酸的脫保護(hù)條件)下不能切斷接頭與第1肽鏈之間的鍵，例如，在利用fmoc合成法的情況下，要求對脫fmoc條件的堿性條件的耐久性。另外，對于該接頭與第1肽鏈之間的鍵而言，要求對于從載體上切下第1肽鏈時的試劑(例如，在fmoc固相合成法的情況下，tfa等酸性條件)的耐性。這是由于，在切斷第1肽鏈與載體時使接頭與第1肽鏈之間的鍵不被切斷，可以鍵合親水性單元。
為了滿足這些要求特性，上述接頭的第1肽鏈側(cè)的上述第1基團具有能夠與至少具有1個以上氫原子的伯胺或仲胺(例如，第1肽鏈的氨基)形成芐氧羰基氨基或芐氨基的第1基團。這樣的第1基團不僅能夠與第1肽鏈的n末端等和接頭鍵合，而且具有酸性或堿性條件下的耐性。另一方面，接頭的親水性單元側(cè)的第2基團為能夠與親水性單元化學(xué)鍵合的基團。
作為具有這樣的第1基團及第2基團的優(yōu)選接頭，可以列舉例如下述式(1)所示的化合物。
[化學(xué)式8]
式(1)中，r1為具有受到保護(hù)的伯氨基的有機基團，r2為吸電子性基團，n為0～4的整數(shù)，z為下式(a)所表示的碳酸酯基、甲酰基或鹵代甲基。
[化學(xué)式9]
式(a)中，x表示離去基團，＊表示與化合物(1)的苯環(huán)的鍵合部位。上述式(a)中的離去基團x沒有特別限定，例如為氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等鹵原子；-orx…(9)(式中rx表示脂肪族烴基、脂環(huán)烴基、芳香族烴基或雜環(huán)基，這些基團任選具有取代基)所示的有機基團。
上述脂肪族烴基的碳原子數(shù)優(yōu)選為1～20，具體而言，可以列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正辛基、正癸基、正十二烷基、正十八基等烷基；乙烯基、烯丙基等烯基；乙炔基、炔丙基這樣的炔基等。
另外，上述脂環(huán)烴基的碳原子數(shù)優(yōu)選為3～20，具體而言，可以列舉：環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)辛基、降冰片基、金剛烷基這樣的環(huán)烷基；環(huán)戊基甲基、環(huán)己基甲基這樣的環(huán)烷基烷基；等。
上述芳香族烴基的碳原子數(shù)優(yōu)選為6～20，具體而言，可以列舉：苯基、萘基、茚基等芳基；芐基、4-苯基丁基等芳烷基；等。
另外，上述雜環(huán)基是上述脂環(huán)烴基或芳香族烴基中構(gòu)成環(huán)的碳的一部分被氮、氧、硫等碳以外的原子取代后的基團，碳原子數(shù)優(yōu)選為3～20。作為雜環(huán)基，更優(yōu)選為在含氮雜環(huán)基中具有至少1個酰亞胺基的含氮雜環(huán)酰亞胺基。作為這樣的含氮雜環(huán)酰亞胺基，可以列舉例如下述例示的飽和或不飽和的含氮雜環(huán)酰亞胺基。
[化學(xué)式10]
作為這樣的雜環(huán)酰亞胺基，可以特別優(yōu)選例示出：琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基、鄰苯二甲酰亞胺基等。
脂肪族烴基、脂環(huán)烴基、芳香族烴基或雜環(huán)基任選具有取代基，作為所述取代基的例子，可以列舉：烷基；氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等鹵原子；氨基；羥基；硝基；等。
作為這樣的-orx，可以列舉例如：n-琥珀酰亞胺基氧基、n-馬來酰亞胺基氧基、n-鄰苯二甲酰亞胺基氧基、對硝基苯基氧基、芐基氧基等，其中，優(yōu)選n-琥珀酰亞胺基氧基。
由于這樣的結(jié)構(gòu)，接頭能夠通過形成芐氧羰基氨基或芐氨基而與第1肽鏈鍵合。以下，在本說明書中，根據(jù)z基團的結(jié)構(gòu)，將這些化合物稱為碳酸酯型接頭、醛型接頭或鹵素型接頭。
在上述式(1)中，r1為具有受到保護(hù)的伯氨基的有機基團。作為這樣的取代基，只要在有機基團的末端存在受到保護(hù)的伯胺基即可，沒有特別限定，例如，優(yōu)選下述式(b)所示的具有受到保護(hù)的伯氨基的有機基團。
[化學(xué)式11]
(式(b)中，r3為二價烴基，a為選自-ch2-、-o-、-s-及-nh-中的一個取代基，pro為氨基保護(hù)基團，＊表示與化合物(1)的苯環(huán)的鍵合部位。)
在上述式(b)中，r3為二價烴基，更優(yōu)選為二價的脂肪族烴基，作為上述二價的脂肪族烴基，可以是飽和、不飽和烴基的任一種，特別優(yōu)選為亞烷基，優(yōu)選為碳原子數(shù)1～10的亞烷基，更優(yōu)選為碳原子數(shù)2～5的亞烷基。例示優(yōu)選的亞烷基，可以列舉例如：-ch2-、-ch2ch2-、-ch2ch2ch2-、-ch2ch2ch2ch2-、-ch(ch2)ch2-、-ch(c2h5)ch2-、-c(ch2)2ch2-、-ch2ch2ch2ch2ch2-、-ch2ch2ch2ch2ch2ch2-等，其中，優(yōu)選為-ch2ch2-(亞乙基)、-ch(ch2)ch2-(亞丙基)或-ch2ch2ch2-(三亞甲基)，最優(yōu)選為-ch2ch2-(亞乙基)。
在上述式(b)中，a為選自-ch2-、-o-、-s-及-nh-中的一個取代基，其中，優(yōu)選為-o-或-s-，更優(yōu)選為-o-。
在上述式(b)中，pro只要是氨基保護(hù)基團即可，沒有特別限定，可以列舉：酰基類、氨基甲酸酯類、酰亞胺類、磺胺類等，其中，優(yōu)選為乙酰基、叔丁氧羰基(-boc)、芐氧羰基(-z)、9-芴甲氧羰基(-fmoc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(-troc)、烯丙氧羰基(-alloc)等氨基甲酸酯類保護(hù)基團。特別是從能夠以上述第1肽鏈中的氨基作為起點進(jìn)行隨后的反應(yīng)方面考慮，上述pro優(yōu)選與第1肽鏈中的氨基保護(hù)基團相同，更優(yōu)選為9-芴甲氧羰基(-fmoc)。
在上述式(b)中，r2為吸電子性基團，更優(yōu)選為選自鹵素、氰基、硝基、磺基、烷氧基羰基及?；械闹辽僖环N取代基。
作為上述鹵素，可以列舉氟、氯、溴、碘，其中特別優(yōu)選氯。
作為上述烷氧基羰基，可以列舉例如：甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、丁氧羰基、戊氧羰基、己氧羰基、庚氧羰基、辛氧羰基、癸氧羰基、十八烷氧羰基、以及三氟甲基氧基羰基等。
作為上述?；?，可以列舉例如：乙?；⒈；?、丁酰基、戊?；?、己?；⒏；?、辛?；?、壬?；⒐秕；?、三氟乙?；?、苯甲酰基、1-萘甲酰基、2-萘甲?；?。其中，優(yōu)選為碳原子數(shù)2～15的?；鼉?yōu)選為碳原子數(shù)2～10的?；?/p>
在上述式(1)中，n為0～4的整數(shù)，更優(yōu)選為1、2、3，進(jìn)一步優(yōu)選為2。n為2以上時，多個r2可以相同，也可以不同。
r1和r2與苯環(huán)的鍵合位置沒有特別限定。r1的鍵合位置以碳酸酯基計可以為2～6位，進(jìn)一步優(yōu)選為2位、3位、4位、5位，更優(yōu)選為2位或4位，特別優(yōu)選為4位。另外，鍵合r2時的鍵合位置可以為2～6位中的任一個，作為更優(yōu)選的方式，r2至少可以鍵合于苯環(huán)的3位及5位。
在上述的接頭中，上述碳酸酯型接頭優(yōu)選為例如下述式(2)所示的化合物。
[化學(xué)式12]
[式(2)中，r2為吸電子性基團，n為0～4的整數(shù)，pro為氨基保護(hù)基團，x為-orx(式中rx為雜環(huán)酰亞胺基)，r3為碳原子數(shù)1～10的亞烷基。]優(yōu)選的x為n-琥珀酰亞胺基氧基，優(yōu)選的r2、n、pro、r3與式(1)相同。其中，作為最優(yōu)選的碳酸酯型接頭，例如為下述式(3a)～(3e)所示的化合物。
[化學(xué)式13]
[化學(xué)式14]
[化學(xué)式15]
[化學(xué)式16]
[化學(xué)式17]
另外，醛型接頭優(yōu)選為例如下述式(4)所示的化合物。
[化學(xué)式18]
(式(4)中，r2為吸電子性基團，n為0～4的整數(shù)，pro為氨基保護(hù)基團，r3為碳原子數(shù)1～10的亞烷基)。優(yōu)選的r2、n、pro、r3與式(1)相同。其中，最優(yōu)選的醛型接頭為下述式(5)所示的化合物。
[化學(xué)式19]
另外，鹵素型接頭例如為下述式(6)所示的化合物。
[化學(xué)式20]
(式(6)中，r2為吸電子性基團，n為0～4的整數(shù)，pro為氨基保護(hù)基團，r3為碳原子數(shù)1～10的亞烷基，x3為鹵原子。)
本發(fā)明的各種接頭的制造方法沒有特別限定，碳酸酯型接頭或醛型接頭的制造方法分別包括至少將下述式(7)(式(7)中，r1、r2、n與上述相同)所示的芐醇衍生物的羥甲基碳酸酯化、氧化或鹵化的工序。
[化學(xué)式21]
對于將上述式(7)所示的芐醇衍生物的羥甲基碳酸酯化的反應(yīng)而言，其特征在于，在堿存在下使上述式(7)所示的芐醇衍生物與下述式(8)(式(8)中，x1、x2分別為離去基團)所示的化合物發(fā)生反應(yīng)。
[化學(xué)式22]
式(8)中，x1、x2的離去基團例如為氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等鹵原子；-orx…(9)(式中rx表示脂肪族烴基、脂環(huán)烴基、芳香族烴基或雜環(huán)基，這些基團任選具有取代基)所示的有機基團。
上述脂肪族烴基優(yōu)選為碳原子數(shù)為1～20的烴基，具體而言，可以列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正辛基、正癸基、正十二烷基、正十八烷基等烷基；乙烯基、烯丙基等烯基；乙炔基、炔丙基這樣的炔基等。
另外，上述脂環(huán)烴基的碳原子數(shù)優(yōu)選為3～20，具體而言，可以列舉：環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)辛基、降冰片基、金剛烷基這樣的環(huán)烷基；環(huán)戊基甲基、環(huán)己基甲基這樣的環(huán)烷基烷基；等。
上述芳香族烴基的碳原子數(shù)優(yōu)選為6～20，具體而言，可以列舉：苯基、萘基、茚基等芳基；芐基、4-苯基丁基等芳烷基；等。
另外，上述雜環(huán)基是上述脂環(huán)烴基或芳香族烴基中構(gòu)成環(huán)的碳的一部分被氮、氧、硫等碳以外的原子取代后的基團，碳原子數(shù)優(yōu)選為3～20。作為雜環(huán)基，更優(yōu)選為在含氮雜環(huán)基中具有至少1個酰亞胺基的含氮雜環(huán)酰亞胺基。作為這樣的含氮雜環(huán)酰亞胺基，可以列舉例如下述例示的飽和或不飽和的含氮雜環(huán)酰亞胺基。
[化學(xué)式23]
作為這樣的雜環(huán)酰亞胺基，可以特別優(yōu)選例示出：琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基、鄰苯二甲酰亞胺基等。
脂肪族烴基、脂環(huán)烴基、芳香族烴基或雜環(huán)基任選具有取代基，作為所述取代基的例子，可以列舉：烷基；氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等鹵原子；氨基；羥基；硝基；等。
作為這樣的-orx，可以列舉例如：n-琥珀酰亞胺基氧基、n-馬來酰亞胺基氧基、n-鄰苯二甲酰亞胺基氧基、對硝基苯基氧基、芐基氧基等。
在式(8)中，x1、x2可以相同，也可以不同。優(yōu)選的化合物(8)例如為碳酸衍生物(例如，n,n'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯等)、氯甲酸酯化合物(例如，n-琥珀酰亞胺基氯甲酸酯、對硝基苯基氯甲酸酯)等。
碳酸酯化反應(yīng)中的具有上述式(8)所示的碳酸酯基的化合物的用量相對于上述式(7)所示的芐醇衍生物1mol為0.5倍mol以上，更優(yōu)選為0.8倍mol以上，進(jìn)一步優(yōu)選為1倍mol以上，優(yōu)選為3倍mol以下，更優(yōu)選為2.5倍mol以下，進(jìn)一步優(yōu)選為2倍mol以下。
上述堿沒有特別限定，可以列舉例如：三乙胺、三正丁基胺、n-甲基嗎啉、n-甲基哌啶、二異丙基乙胺、吡啶、n,n-二甲基氨基吡啶、1,4-二氮雜雙環(huán)[2,2,2]辛烷等叔胺類；氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋇、氫氧化鎂等金屬氫氧化物；碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀等金屬碳酸鹽；碳酸氫鋰、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等金屬碳酸氫鹽；甲醇鋰、乙醇鋰、甲醇鈉、乙醇鈉、甲醇鉀、乙醇鉀、叔丁醇鉀等金屬醇鹽。其中，優(yōu)選叔胺類，更優(yōu)選吡啶或n,n-二甲基氨基吡啶。這些堿可以單獨使用1種，也可以組合使用多種。
在對上述式(7)所示的芐醇衍生物的羥甲基進(jìn)行氧化的反應(yīng)中，其特征在于使氧化劑發(fā)揮作用而對上述式(7)所示的芐醇衍生物進(jìn)行氧化。
上述氧化劑沒有特別限定，可以列舉例如：氯酸鉀、氯酸鈉、氯酸銨、氯酸鋇、氯酸鈣等氯酸鹽；高氯酸鉀、高氯酸鈉、高氯酸銨等高氯酸鹽；過氧化鉀、過氧化鈉、過氧化鈣、過氧化鎂、過氧化鋇等無機過氧化物；亞氯酸鉀、亞氯酸鈉、亞氯酸銅等亞氯酸鹽；溴酸鉀、溴酸鈉、溴酸鎂等溴酸鹽；硝酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鋇、硝酸銀等硝酸鹽；碘酸鉀、碘酸鈉、碘酸鈣等碘酸鹽；高錳酸鉀、高錳酸銨等高錳酸鹽；重鉻酸鈉、重鉻酸銨等重鉻酸鹽；高碘酸鈉、偏高碘酸等高碘酸鹽；二氧化錳；三氧化鉻、鉻酸酐、鉻酸、重鉻酸等鉻酸鹽；二氧化鉛、亞硝酸鈉、次氯酸鉀、次氯酸鈉、過二硫酸鉀、過二硫酸鈉、過二硫酸銨、過硼酸鉀、過硼酸銨、臭氧、高氯酸、氧化鎢、或者過氧化氫等。其中，從容易獲得的觀點考慮，優(yōu)選為二氧化錳。這些氧化劑可以單獨使用1種，也可以組合使用多種。
在接頭鍵合工序中，需要根據(jù)各接頭的特性調(diào)整反應(yīng)條件。以下，按照本發(fā)明中代表性使用的碳酸酯型接頭、醛型接頭分別對反應(yīng)條件進(jìn)行說明。
<<碳酸酯型接頭的情況>>
對使用了碳酸酯型接頭時的接頭鍵合工序進(jìn)行說明。在使用碳酸酯型接頭時，通過將碳酸酯型接頭與粗制肽混合形成芐氧羰基氨基而使接頭與第1肽鏈的氨基鍵合，由此形成接頭鍵合體。
在該反應(yīng)中，相對于粗制肽1mol，碳酸酯型接頭的用量優(yōu)選為0.5倍mol以上，更優(yōu)選為1倍mol以上，進(jìn)一步優(yōu)選為2倍mol以上，優(yōu)選為20倍mol以下，更優(yōu)選為10倍mol以下。
碳酸酯型接頭與粗制肽的反應(yīng)優(yōu)選在溶劑存在下實施，作為反應(yīng)溶劑，可以使用例如：二異丙基醚、叔丁基甲基醚、二丁基醚、二
作為上述反應(yīng)溶劑的用量，相對于粗制肽，優(yōu)選為50倍重量以下，進(jìn)一步優(yōu)選為20倍重量以下，下限沒有特別限定，但優(yōu)選為2倍重量以上。
另外，在本反應(yīng)中，為了加速反應(yīng)，可以共存例如三乙胺、三正丁基胺、n-甲基嗎啉、n-甲基哌啶、二異丙基乙胺、吡啶、n,n-二甲基氨基吡啶、1,4-二氮雜雙環(huán)[2,2,2]辛烷等叔胺類作為反應(yīng)促進(jìn)劑。
反應(yīng)溫度只要在使用的溶劑的沸點以下即可，沒有特別限定，例如優(yōu)選為0℃以上，更優(yōu)選為10℃以上，進(jìn)一步優(yōu)選為20℃以上，優(yōu)選為100℃以下，更優(yōu)選為80℃以下。
反應(yīng)時間也沒有特別限定，優(yōu)選為1小時以上，更優(yōu)選為2小時以上，優(yōu)選為100小時以下，更優(yōu)選為50小時以下。
反應(yīng)結(jié)束后，可以對得到的接頭鍵合體進(jìn)行清洗，除去不需要的成分。作為清洗用的溶劑，可以使用反應(yīng)溶劑一欄中詳細(xì)敘述的各種溶劑。
<<醛型接頭的情況>>
對使用了醛型接頭時的接頭鍵合工序進(jìn)行說明。在使用醛型接頭時，使上述醛型接頭與上述粗制肽脫水縮合，制造上述醛型接頭經(jīng)由亞氨基鍵合于上述粗制肽而得到的亞胺化樹脂，使還原劑與得到的上述亞胺化樹脂反應(yīng)而還原亞氨基，通過形成芐氨基將上述接頭與第1肽鏈的氨基鍵合，由此可以制造接頭鍵合體。
上述醛型接頭與上述粗制肽的脫水縮合反應(yīng)通過將醛型接頭與粗制肽混合而進(jìn)行。在制造上述亞胺化樹脂時，相對于粗制肽1mol，醛型接頭的用量優(yōu)選為1倍mol以上，更優(yōu)選為3倍mol以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5倍mol以上，優(yōu)選為50倍mol以下，更優(yōu)選為30倍mol以下，進(jìn)一步優(yōu)選為20倍mol以下。
醛型接頭與粗制肽的反應(yīng)優(yōu)選在溶劑存在下實施，作為反應(yīng)溶劑，可以使用例如：苯、甲苯、二甲苯等芳香烴溶劑；二異丙基醚、叔丁基甲基醚、二丁基醚、二乙二醇二甲醚等醚類溶劑；丙二醇單甲醚乙酸酯等改性醚類；乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯類溶劑；氯仿、二氯甲烷等含鹵素溶劑；環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、乙基環(huán)己烷等環(huán)狀烴溶劑；戊烷、己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、異十二烷等鏈狀烴溶劑；等有機溶劑、甲醇、乙醇等醇類；乙二醇、二甲氧基乙烷、四氫呋喃等醚類；乙腈等腈類；二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮等酰胺類；等水性溶劑。這些反應(yīng)溶劑可以僅單獨使用1種，也可以組合使用多種。且中，優(yōu)選為含鹵素溶劑，更優(yōu)選為二氯甲烷。
作為上述反應(yīng)溶劑的用量，相對于粗制肽，優(yōu)選為100倍重量以下，進(jìn)一步優(yōu)選為50倍重量以下，下限沒有特別限定，但優(yōu)選為2倍重量以上。
另外，脫水縮合反應(yīng)中可以適當(dāng)使用脫水劑。作為上述脫水劑，優(yōu)選為例如：原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯、原甲酸三丙酯等原甲酸酯類；原乙酸三甲酯、原乙酸三乙酯、原乙酸三丙酯等原乙酸酯類；原丙酸三甲酯、原丙酸三乙酯、原丙酸三丙酯等原丙酸酯類；等所代表的原酸酯類、二甲氧基甲烷、1,1-二甲氧基乙烷、1,1-二甲氧基丙烷、二乙氧基乙烷、1,1-二乙氧基乙烷、1,1-二乙氧基丙烷等所代表的縮醛類、1-甲氧基-1-乙醇、1-甲氧基-1-丙醇、1-甲氧基-1-丁醇、1-乙氧基-1-乙醇、1-乙氧基-1-丙醇、1-乙氧基-1-丁醇等所代表的半縮醛類。其中，優(yōu)選為原甲酸酯類，更優(yōu)選為原甲酸三甲酯。
在使用上述脫水劑的情況下，脫水劑的用量相對于粗制肽優(yōu)選為100倍重量以下，進(jìn)一步優(yōu)選為50倍重量以下，下限沒有特別限定，但優(yōu)選為1倍重量以上。
反應(yīng)溫度只要在使用的溶劑的沸點以下即可，沒有特別限定，例如優(yōu)選為0℃以上，更優(yōu)選為10℃以上，進(jìn)一步優(yōu)選為20℃以上，優(yōu)選為100℃以下，更優(yōu)選為80℃以下，進(jìn)一步優(yōu)選為60℃以下。
反應(yīng)時間也沒有特別限定，優(yōu)選為1小時以上，更優(yōu)選為12小時以上，優(yōu)選為20天以下，更優(yōu)選為15天以下。
反應(yīng)結(jié)束后，可以對得到的接頭鍵合體進(jìn)行清洗，除去不需要的成分。作為清洗用的溶劑，可以使用反應(yīng)溶劑一欄中詳細(xì)敘述的各種溶劑。
在上述亞胺化樹脂的還原反應(yīng)中，作為還原劑，可以列舉例如：氫化鋁鋰、二異丁基氫化鋁、氫化雙(2-甲氧乙氧基)鋁鈉等鋁氫化物類；硼氫化鋰、硼氫化鈉、硼氫化鉀等硼氫化堿金屬、硼氫化鈣、氰基硼氫化鈉、三乙酰氧基硼氫化鈉、三乙基硼氫化鋰、三仲丁基硼氫化鋰、三仲丁基硼氫化鉀等硼氫化合物；三丁基氫化錫；硼烷等，從化學(xué)選擇性的觀點考慮，其中優(yōu)選為硼氫化合物，更優(yōu)選為氰基硼氫化鈉。
作為上述還原劑的用量，相對于上述亞胺化樹脂1質(zhì)量份，優(yōu)選為0.1質(zhì)量份以上，更優(yōu)選為0.3質(zhì)量份以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.6質(zhì)量份以上，優(yōu)選為3質(zhì)量份以下，更優(yōu)選為2.5質(zhì)量份以下，進(jìn)一步優(yōu)選為2質(zhì)量份以下。
亞胺化樹脂的還原反應(yīng)優(yōu)選在溶劑存在下實施，作為反應(yīng)溶劑，可以使用例如：苯、甲苯、二甲苯等芳香烴溶劑；二異丙基醚、叔丁基甲基醚、二丁基醚、二乙二醇二甲醚等醚類溶劑；丙二醇單甲醚乙酸酯等改性醚類；乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯類溶劑；乙酸、丙酸等羧酸類溶劑；氯仿、二氯甲烷等含鹵素溶劑；環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、乙基環(huán)己烷等環(huán)狀烴溶劑；戊烷、己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、異十二烷等鏈狀烴溶劑；等有機溶劑、甲醇、乙醇等醇類；乙二醇、二甲氧基乙烷、四氫呋喃等醚類；乙腈等腈類；二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮等酰胺類；等水性溶劑。這些反應(yīng)溶劑可以僅單獨使用1種，也可以組合使用多種。在使用醇類、羧酸類溶劑時，可以期待加快反應(yīng)速度。在本發(fā)明中，其中優(yōu)選醇類溶劑、羧酸類溶劑、酰胺類。
作為上述反應(yīng)溶劑的用量，相對于亞胺化樹脂，優(yōu)選為100倍重量以下，進(jìn)一步優(yōu)選為50倍重量以下，下限沒有特別限定，但優(yōu)選為5倍重量以上。
反應(yīng)溫度只要為使用的溶劑的沸點以下即可，沒有特別限定，例如優(yōu)選為0℃以上，更優(yōu)選為10℃以上，進(jìn)一步優(yōu)選為20℃以上，優(yōu)選為100℃以下，更優(yōu)選為80℃以下，進(jìn)一步優(yōu)選為60℃以下。
反應(yīng)時間也沒有特別限定，優(yōu)選為1小時以上，更優(yōu)選為10小時以上，優(yōu)選為50小時以下，更優(yōu)選為30小時以下。
反應(yīng)結(jié)束后，可以對得到的接頭鍵合體進(jìn)行清洗，除去不需要的成分。作為清洗用的溶劑，可以使用反應(yīng)溶劑一欄中詳細(xì)敘述的各種溶劑。
得到的接頭鍵合體經(jīng)由-ch2-nh-鍵合有接頭和粗制肽。但是，-nh-中的氫原子的反應(yīng)性高，有對隨后的反應(yīng)造成影響的隱患，因此，優(yōu)選根據(jù)需要進(jìn)行還原反應(yīng)后的接頭鍵合體(稱為還原體樹脂)的n保護(hù)反應(yīng)。作為氨基的保護(hù)基團，可以列舉氨基甲酸酯類、酰亞胺類、磺胺類等，其中，優(yōu)選為叔丁氧羰基(-boc)、芐氧羰基(-z)、9-芴甲氧羰基(-fmoc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(-troc)、烯丙氧羰基(-alloc)等氨基甲酸酯類保護(hù)基團。醛型接頭中的氨基保護(hù)基團為fmoc時，可以選擇例如叔丁氧羰基(-boc)，以便不對該fmoc的脫保護(hù)條件造成影響。
在保護(hù)基的導(dǎo)入中，在堿性條件下，可以通過向還原反應(yīng)后的反應(yīng)液添加與各保護(hù)基團對應(yīng)的保護(hù)試劑來進(jìn)行。作為上述保護(hù)試劑，可以列舉例如：甲氧羰基氯、乙氧羰基氯、異丙氧羰基氯、烯丙氧羰基氯、芐氧羰基氯、苯氧羰基氯等氯化物、或二碳酸二叔丁酯等酐等氨基甲酸酯化劑等。
上述保護(hù)試劑的用量相對于還原體樹脂1mol優(yōu)選為1～30倍mol，更優(yōu)選為10～25倍mol。
另外，在上述保護(hù)時，為了中和作為副產(chǎn)物生成的酸而加速反應(yīng)，可以進(jìn)一步添加堿。作為堿，可以列舉：碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鎂、碳酸鈣等金屬碳酸鹽；碳酸氫鋰、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫銫等金屬碳酸氫鹽；氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀等金屬氫氧化物；三乙胺、n-甲基嗎啉、乙基二異丙基胺、吡啶等叔胺類。優(yōu)選為叔胺類，進(jìn)一步優(yōu)選為n-甲基嗎啉。
上述堿的用量相對于還原體樹脂1mol優(yōu)選為0.5～20倍mol，更優(yōu)選為3～15倍mol。
n保護(hù)反應(yīng)可以在溶劑存在下實施。作為上述反應(yīng)溶劑，只要不對反應(yīng)造成影響就沒有特別限制，可以使用例如：水；四氫呋喃、乙醚、1,4-二
作為溶劑的用量，如果過多，則從成本、后處理的觀點考慮，不優(yōu)選，因此，相對于還原體樹脂，優(yōu)選為50倍重量以下，更優(yōu)選為30倍重量以下。
反應(yīng)溫度只要在使用的溶劑的沸點以下即可，沒有特別限定，為了能夠在短時間內(nèi)結(jié)束反應(yīng)且抑制副反應(yīng)，優(yōu)選為-10℃以上，更優(yōu)選為0℃以上，優(yōu)選為90℃以下，更優(yōu)選為50℃以下。
反應(yīng)時間也沒有特別限定，優(yōu)選為1小時以上，更優(yōu)選為3小時以上，優(yōu)選為100小時以下，更優(yōu)選為50小時以下。
＜親水性單元鍵合工序a1b＞
在親水性單元鍵合工序中，將親水性單元鍵合于如上所述得到的接頭鍵合體。該“親水性單元”是指能夠?qū)宇^鍵合體賦予親水性的單元，其可以鍵合于上述接頭鍵合體(與第1肽的接頭的鍵合體)的接頭部位，例如，親水性單元自身具有以logp(p為在辛醇-水體系中的分配系數(shù))值計為-1以下的親水性。通過使這樣的親水性單元經(jīng)由接頭鍵合于第1肽鏈，可以在切斷除去載體時使第1肽鏈親水化，能夠進(jìn)行第1肽鏈的色譜純化。需要說明的是，在本說明書中，將該親水性單元鍵合工序中得到的產(chǎn)物、即包含第1肽、接頭及親水性單元這三個成分的連接體稱為“親水化肽體”，將鍵合有載體的連接體特別稱為“帶有載體的親水化肽體”，將除去了載體的連接體特別稱為“無載體的親水化肽體”。
logp值是指化合物的疏水性的參數(shù)，代表性的辛醇-水體系中的分配系數(shù)p可以通過以下方式求出。首先，將化合物(在本發(fā)明為親水性單元)溶解于辛醇(或水)，并向其加入等量的水(或辛醇)，用griffin振蕩器(griffinflaskshaker)(griffin&georgeltd.制造)振蕩30分鐘。隨后，以2000rpm離心分離1～2小時，用分光學(xué)或glc等各種方法測定辛醇層及水層中的化合物的各濃度，由此根據(jù)下式求出。
p＝coct/cw
coct：辛醇層中的化合物濃度
cw：水層中的化合物濃度
目前為止，許多研究者對各種化合物的logp值進(jìn)行了實際測定，由c.hansch等對這些實測值進(jìn)行了整理(參考“partitioncoefficientsandtheiruses；chemicalreviews、71卷、525頁、1971年”)。
logp值可以用上述方法求出，但在本發(fā)明中，原則上使用通過advancedchemistrydevelopment制造的acd/logpdbrelease100productversion10.01在溫度25℃的條件下計算出的值。
在探索有效的結(jié)構(gòu)作為親水性單元時，對具有各種logp值的化合物進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親水化單元的logp值為例如-1以下時，對粗制肽的親水化有效。另外，在logp值超過-1時，無法發(fā)揮足夠的親水性，存在無載體的親水化肽體的純化效率降低的隱患。logp值更優(yōu)選為-1.2以下，進(jìn)一步優(yōu)選為-1.5以下。另外，logp值的下限沒有特別限定，例如優(yōu)選為-10以上。
作為具有這樣的logp值的親水性單元，可以列舉例如：親水性肽鏈、親水性聚醚或親水性多胺等。親水性肽鏈可以通過將氨基酸依次連接于接頭鍵合體來制備，在該情況下，優(yōu)選通過fmoc固相合成法制備。另外，親水性肽鏈也可以將另行預(yù)先制備的肽鏈連接于接頭鍵合體。
因此，在親水性單元鍵合工序的優(yōu)選方式中，可以通過以下工序使親水性單元鍵合于接頭部位。
(1)通過fmoc固相合成法分步地使多個氨基酸鍵合于接頭部位；
(2)使預(yù)先制備的親水性肽鏈鍵合于接頭部位；
(3)使預(yù)先制備的聚醚鍵合于接頭部位；
(4)使預(yù)先制備的多胺鍵合于接頭部位。
以下，對上述各工序進(jìn)行說明。
(1)利用fmoc固相合成法進(jìn)行的親水化肽體形成
在本方法中，親水性肽可以通過在上述工序中得到的接頭鍵合體的氨基上用fmoc固相合成法依次形成肽而得到。在如本方法這樣依次形成親水性肽時，能夠驗證每1循環(huán)中形成的親水化肽體的性質(zhì)(例如，親水性等)，因此不消耗多余的試劑，因此優(yōu)選。fmoc固相合成法的具體步驟沒有特別限定，例如，可以是與上述的帶有載體的粗制肽的制造工序的情況相同的步驟。總之，只要能將循環(huán)持續(xù)進(jìn)行至得到希望的親水性肽鏈即可，所述循環(huán)在堿存在下進(jìn)行fmoc的脫保護(hù)，對氨基酸或肽進(jìn)行脫水縮合而延長主鏈。
構(gòu)成上述親水性肽的氨基酸沒有特別限定，可以使用第1肽鏈一欄中詳細(xì)敘述的各種氨基酸。在親水性肽中，可以從這些氨基酸中組合使用不同種的氨基酸，也可以單獨使用同種的氨基酸。在本發(fā)明中，為了提高上述親水性肽的親水性，優(yōu)選上述親水性肽具有例如來自于具有堿性支鏈的氨基酸的單元，具體而言，優(yōu)選上述親水性肽鏈的全部氨基酸殘基中含有2個以上的下述殘基，更優(yōu)選含有4個以上的下述殘基，上限沒有特別限定，優(yōu)選含有35個以下的下述殘基，更優(yōu)選含有20個以下的下述殘基，進(jìn)一步優(yōu)選含有10個以下的下述殘基，所述殘基為選自精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸中至少1種以上的氨基酸殘基。根據(jù)相同的原因，優(yōu)選上述親水性肽具有例如來自于具有酸性支鏈的氨基酸的殘基，具體而言，優(yōu)選上述親水性肽鏈的全部氨基酸殘基中含有2個以上的下述殘基，更優(yōu)選含有4個以上的下述殘基，上限沒有特別限定，優(yōu)選含有35個以下的下述殘基，更優(yōu)選含有20個以下的下述殘基，進(jìn)一步優(yōu)選含有10個以下的下述殘基，所述殘基為選自天冬氨酸、谷氨酸中至少1種以上的氨基酸殘基。
上述親水性肽鏈的氨基酸殘基的數(shù)量沒有特別限定，例如為2個以上，更優(yōu)選為3個以上，進(jìn)一步優(yōu)選為4個以上，優(yōu)選為35個以下，可以為20個以下，可以為10個以下。構(gòu)成親水性肽的氨基酸殘基的數(shù)量增加時，對接頭鍵合體與親水性肽鏈的鍵合體(親水化肽體)中的親水性肽鏈的親水化的貢獻(xiàn)率增高，因此易于控制上述親水化肽體的特性。
(2)利用預(yù)先制備的親水性肽鏈進(jìn)行的親水化肽體的形成
在將上述親水性肽鏈鍵合于接頭鍵合體之前，可以預(yù)先通過液相合成法、固相合成法制造希望的親水性肽鏈，并將得到的親水性肽鏈鍵合于接頭。
(3)利用預(yù)先制備的聚醚進(jìn)行的親水化肽體的形成
親水性單元不限于多肽，也可以是聚醚或多胺。上述親水性聚醚沒有特別限定，例如為在主鏈骨架中具有-ry-o-所示的重復(fù)單元的化合物。作為ry，可以列舉例如：-ch2ch2-、-ch(ch3)ch2-、-ch(c2h5)ch2-、-c(ch3)2ch2-、-(ch2)4-。親水性聚醚可以是由這些重復(fù)單元中的1種重復(fù)單元構(gòu)成的均聚物，也可以是共聚物。
-ry-o-所示的重復(fù)單元的數(shù)量例如優(yōu)選為1～200，更優(yōu)選為50～150。
對于親水性聚醚而言，優(yōu)選在親水性聚醚中含有50重量％以上-ry-o-所示的重復(fù)單元，進(jìn)一步優(yōu)選含有80重量％以上，更優(yōu)選含有95重量％以上。
對于親水性聚醚而言，凝膠滲透色譜(gpc)的以換算為聚苯乙烯計的數(shù)均分子量優(yōu)選為例1000～100,000左右。
(4)利用預(yù)先制備的多胺進(jìn)行的親水化肽體的形成
上述多胺沒有特別限定，可以列舉例如，鍵合了至少2個以上氨基的脂肪烴，作為上述脂肪烴，可以是飽和脂肪烴(鏈狀或環(huán)狀)或不飽和脂肪烴的任一者。鍵合于多胺的氮原子的氫原子可以是被取代或未被取代中的任一者，為了提高親水性，優(yōu)選未被取代。
具體地例示這樣的多胺，可以列舉例如：二亞乙基三胺、n-(2-氨基乙基)-1,3-丙二胺、n-(3-氨基丙基)-1,3-丙二胺、亞精胺、雙(六亞甲基)三胺、4-(氨基甲基)-1,8-辛二胺、三亞乙基四胺、1,4,7,11-四氮雜十一烷、n,n’-雙(3-氨基丙基)乙二胺、n,n’-雙(2-氨基乙基)-1,3-丙二胺、n,n’-雙(3-氨基丙基)-1,3-丙二胺、精胺、三(2-氨基乙基)胺、四亞乙基五胺、五亞乙基六胺等鏈狀脂肪族多胺；1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷、1,5,9-三氮環(huán)十二烷、環(huán)烯、1,4,8,11-四氮環(huán)十四烷、1,4,8,12-四氮環(huán)十五烷、六環(huán)烯、3,3’-二氨基聯(lián)苯胺、1,2,4,5-苯四胺等環(huán)狀脂肪族多胺。
＜親水性單元接頭復(fù)合體鍵合工序a2＞
為了將接頭和親水性單元鍵合于粗制肽而得到親水化肽體，可以將親水性單元與接頭預(yù)先鍵合成一個化合物的親水性單元接頭復(fù)合體導(dǎo)入粗制肽的氨基。通過預(yù)先制備復(fù)合體，可以縮短從粗制肽至親水性肽體的制造工藝，能夠提高工藝總體的效率。
復(fù)合體中的親水性單元及接頭可以使用與上述接頭鍵合工序a1a、親水性單元鍵合工序a1b相同的親水性單元及接頭。作為該復(fù)合體的制備方法，可以采用與親水性單元鍵合工序a1b相同的方法，在將復(fù)合體鍵合于粗制肽的情況下，可以采用與上述接頭鍵合工序a1a相同的方法。
需要說明的是，在將親水性單元接頭復(fù)合體鍵合于粗制肽之后，可以根據(jù)需要進(jìn)一步延長親水性單元側(cè)的氨基酸。例如，作為親水性單元接頭復(fù)合體，預(yù)先準(zhǔn)備有限種類的復(fù)合體作為基本單元，將該基本單元鍵合于粗制肽后，在根據(jù)粗制肽的特性延長氨基酸等時，可以減少作為基本單元而預(yù)先準(zhǔn)備的親水性單元接頭復(fù)合體的種類，是很簡便的。
另外，a2-ii也可以用與a2-i相同的方法實施。
3.載體切除工序
載體切除工序是指將載體和第1肽鏈斷開的工序。不僅將接頭及親水性單元鍵合于第1肽鏈，而且可以通過切除載體而使第1肽鏈親水化。需要說明的是，在本說明書中，將接頭及親水性單元鍵合、且載體被切除后的第1肽鏈稱為無載體的親水化肽體。
該載體切除工序只要在下面敘述的色譜純化工序之前即可，可以在任意階段實施，例如，可以在從將接頭鍵合于帶有載體的粗制肽之前至得到親水化肽體的任意階段中、或者在得到帶有載體的親水化肽體之后，切斷第1肽鏈與載體之間的鍵。具體而言，可以從由第1肽鏈和載體形成的帶有載體的粗制肽上切除載體(參考簡圖i的載體切除工序b1)，也可以從將接頭鍵合于帶有載體的粗制肽而得到的帶有載體的接頭鍵合體上切除載體(參考簡圖i的載體切除工序b2)，還可以從將接頭和親水性單元鍵合于帶有載體的粗制肽而得到的帶有載體的親水化肽體上切除載體(參考簡圖i的載體切除工序b3)。在從帶有載體的粗制肽上切除載體時(載體切除工序b1)，可以與上述同樣地實施接頭鍵合工序a1a，由得到的無載體的粗制肽得到無載體的接頭鍵合體(簡圖i的a1c)，而且實施親水性單元接頭復(fù)合體鍵合工序a2，由無載體的粗制肽得到無載體的親水化肽體。另外，通過與上述同樣地實施親水性單元鍵合工序a1b，可以由無載體的接頭鍵合體得到無載體的親水化肽體(簡圖i的a1d)，所述無載體的接頭鍵合體通過實施載體切除工序b2、或者通過在接頭鍵合工序a1a中對無載體的粗制肽進(jìn)行處理而得到。需要說明的是，在本發(fā)明中，優(yōu)選在通過上述親水化工序得到了親水化肽體后實施載體切除工序(即，簡圖i的載體切除工序b3)。
在這些載體切除工序b1、b2、b3中，對連接上述第1肽鏈與上述載體的酰胺鍵或酯鍵進(jìn)行水解。在從載體上切下第1肽鏈時，可以實施在固相合成法中廣泛采用的操作。例如，在用fmoc固相合成法形成了第1肽鏈、親水性單元的情況下，可以通過用于切斷的試劑進(jìn)行處理而從載體上切下第1肽鏈。
上述切斷用試劑可以使用從通常的載體上切下的條件中使用的試劑。切斷用試劑在制成水溶液使用的情況下，以容積比計，上述切斷用試劑占該試劑100％的濃度優(yōu)選為40％以上，更優(yōu)選為50％以上，優(yōu)選為100％以下，在97％以下也沒有問題。
另外，上述切斷用試劑可以含有tis(三異丙基硅烷)。以容積比計，tis占試劑100％的濃度優(yōu)選為1％以上，更優(yōu)選為1.5％以上，優(yōu)選為20％以下，更優(yōu)選為10％以下。
切斷工序可以在無溶劑下(可允許由上述試劑混入的溶劑)實施，可以根據(jù)需要在溶劑存在下實施。作為其溶劑，可以列舉：水、有機溶劑、水性溶劑等，有機溶劑包含例如：四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯苯等含鹵素溶劑等；水性溶劑包含例如：甲醇、乙醇等醇類；乙二醇、二甲氧基乙烷、四氫呋喃等醚類；丙酮、二
處理溫度只要在使用的溶劑的沸點以下即可，沒有特別限定，例如，優(yōu)選為0℃以上，更優(yōu)選為10℃以上，優(yōu)選為100℃以下，更優(yōu)選為80℃以下，進(jìn)一步優(yōu)選為60℃以下。
另外，處理時間例如優(yōu)選為0.5小時以上，更優(yōu)選為1小時以上，進(jìn)一步優(yōu)選為1.5小時以上，優(yōu)選為20小時以下，更優(yōu)選為10小時以下。
作為反應(yīng)后的后處理，可以進(jìn)行用于從反應(yīng)液中獲得產(chǎn)物的通常的處理。具體而言，通過對切斷后的載體進(jìn)行過濾等而進(jìn)行分離，并根據(jù)需要進(jìn)行濃縮、清洗，然后加入有機溶劑使其析出而獲得固體的操作等通常的純化方法，可以進(jìn)一步提高純度。
第1肽的支鏈的保護(hù)基可以通過載體切除工序中的處理進(jìn)行脫保護(hù)，也可以未脫保護(hù)。如果能夠通過載體切除工序中的處理將鍵合于第1肽的支鏈的保護(hù)基也進(jìn)行脫保護(hù)，則可以省略支鏈的脫保護(hù)工序，因此簡便。另外，在載體切除工序中未對第1肽的支鏈進(jìn)行脫保護(hù)的情況下，可以另行實施第1肽鏈的支鏈的脫保護(hù)。鍵合于第1肽鏈的支鏈的保護(hù)基可以在親水性單元導(dǎo)入前或?qū)牒蟮娜我浑A段中進(jìn)行脫保護(hù)。另外，支鏈的脫保護(hù)可以根據(jù)保護(hù)基而利用通常的方法來實施。
4.色譜純化工序
如上所述鍵合接頭親水性單元、且切除了載體的第1肽鏈(無載體的親水化肽體)具有親水性，因此能夠進(jìn)行色譜純化。因此，在色譜純化工序中，用液相色譜對通過親水化工序及載體切除工序得到的無載體的親水化肽體進(jìn)行處理。此時，優(yōu)選預(yù)先將親水化肽體溶解于水中。
色譜純化所使用的柱和洗脫液可以根據(jù)待純化的無載體的親水化肽體的種類、待分離的雜質(zhì)而適當(dāng)選擇。柱的填充劑沒有特別限定，可以廣泛使用公知的填充劑，作為代表性的填充劑，可以優(yōu)選例示出例如：硅膠、十八烷基鍵合硅膠、辛基鍵合硅膠、丁基鍵合硅膠、三甲基甲硅烷基鍵合硅膠、弗羅里硅土(florisil)、氧化鋁、氧化鋯、羥基磷灰石、苯乙烯-乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸酯、聚羥基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、離子交換樹脂、活性炭等。裝填了這些填充劑的柱可以單獨使用，也可以組合2種以上使用。
另外，洗脫液可以根據(jù)待使用的柱、純化對象目標(biāo)物以及除去對象雜質(zhì)而適當(dāng)制備，例如，可以使用將水與親水性有機溶劑(例如，甲醇、乙醇等醇類；乙二醇、二甲氧基乙烷、四氫呋喃等醚類；丙酮、二
色譜純化工序可以根據(jù)需要實施2次以上，柱(填充劑)和/或洗脫液可以每次變更。
5.接頭切除工序
在接頭切除工序中，通過化學(xué)處理對色譜純化后的無載體的親水化肽體所含有的接頭-第1肽鏈之間的鍵進(jìn)行切斷。作為上述化學(xué)處理，可以舉出例如利用催化還原或酸進(jìn)行的處理等。
＜利用催化還原反應(yīng)進(jìn)行的接頭的切斷＞
利用催化還原反應(yīng)進(jìn)行的接頭的切斷優(yōu)選在溶劑存在下實施。作為上述溶劑，可以列舉例如：甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、2-丁醇、正戊醇等醇類溶劑；乙酸、甲酸、丙酸等羧酸類溶劑；四氫呋喃、乙醚、二
催化還原反應(yīng)中使用的上述溶劑的用量沒有特別限定，例如，以相對于親水化肽體的重量比率計，優(yōu)選為2倍量以上，更優(yōu)選為5倍量以上，優(yōu)選為500倍量以下，更優(yōu)選為400倍量以下。
作為催化還原反應(yīng)的氫源，例如，可以使用氫氣、甲酸或其鹽，從經(jīng)濟性的觀點考慮，優(yōu)選使用氫氣。在使用氫氣的情況下，通常優(yōu)選將氫氣壓調(diào)整至大氣壓(1.013×105pa)～0.5mpa的范圍來進(jìn)行。
作為催化還原反應(yīng)用的催化劑，例如，可以使用含有鉑、鈀等的催化劑，其中，優(yōu)選含有鈀的催化劑，特別優(yōu)選擔(dān)載于活性炭的鈀催化劑等金屬擔(dān)載催化劑。
催化還原反應(yīng)可以通過在溶劑及氫源的存在下使親水化肽體與催化劑的混合物發(fā)生反應(yīng)來實施。反應(yīng)溫度只要在使用的溶劑的沸點以下即可，沒有特別限定，例如，優(yōu)選為0℃以上，更優(yōu)選為15℃以上，進(jìn)一步優(yōu)選為30℃以上，優(yōu)選為70℃以下，更優(yōu)選為60℃以下。另外，反應(yīng)時間也沒有限制，例如優(yōu)選為1小時以上，更優(yōu)選為3小時以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5小時以上，優(yōu)選為50小時以下，更優(yōu)選為30小時以下。
在催化還原反應(yīng)結(jié)束后，除去了接頭的第1肽鏈通常進(jìn)行后處理，例如，可以通過濃縮、溶解于有機溶劑、過濾、清洗、析出等的操作來進(jìn)行分離純化。
＜利用酸進(jìn)行的接頭的切斷＞
作為本工序中使用的酸，可以列舉例如：tfa(三氟乙酸)、tca(三氯乙酸)等鹵代羧酸類；氫溴酸、鹽酸、硫酸等無機酸；對甲苯磺酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、氟磺酸等磺酸類等。優(yōu)選pka為0以下的酸，進(jìn)一步優(yōu)選pka為-2以下的酸，下限沒有特別限定，但通常pka為-20以上，優(yōu)選pka為-18以上。這些酸可以單獨使用1種，也可以組合使用多種。相對于親水化肽體，酸的用量以重量比計優(yōu)選為10倍量以上，更優(yōu)選為20倍量以上，優(yōu)選為100倍量以下，更優(yōu)選為80倍量以下。
利用酸進(jìn)行的接頭的切斷反應(yīng)可以在溶劑存在下實施。作為上述溶劑，可以列舉例如：乙酸、丙酸等羧酸類溶劑；水等。這些溶劑可以單獨使用1種，也可以組合使用多種。相對于親水化肽體，上述溶劑的用量以重量比計優(yōu)選為1倍量以上，更優(yōu)選為2倍量以上，優(yōu)選為100倍量以下，更優(yōu)選為50倍量以下。
作為這樣的溶劑，優(yōu)選必須含有tfa的溶劑，更優(yōu)選為含有tfa和tfa以外的無機酸兩者的混合溶液、或者含有tfa和路易斯酸的混合溶液。作為含有tfa和tfa以外的無機酸兩者的混合溶液，例如，優(yōu)選為含有hbr(濃度優(yōu)選為15～40％)、乙酸、茴香硫醚及tfa的混合溶液。另外，作為含有tfa和路易斯酸的混合溶液，可以列舉例如：含有tfa、三氟甲磺酸三甲基硅酯(tmsotf)以及茴香硫醚的混合溶液；含有tfa、tmsotf以及間甲酚的混合溶液等。從實用性的觀點考慮，更優(yōu)選使用含有tfa和路易斯酸的混合溶液。
另外，在利用酸進(jìn)行的接頭的切斷反應(yīng)中，也可以使用在酸中含有三氟甲磺酸三甲基硅酯(tmsotf)、三甲基溴硅烷(tmsbr)、三甲基碘硅烷(tmsi)、bf3乙醚絡(luò)合物、cp2hfcl2-agclo4等路易斯酸作為反應(yīng)促進(jìn)劑的混合溶液。相對于親水化肽體，上述反應(yīng)促進(jìn)劑的用量以重量比計優(yōu)選為1倍量以上，更優(yōu)選為5倍量以上，優(yōu)選為100倍量以下，更優(yōu)選為50倍量以下。
在利用酸進(jìn)行的接頭的切斷反應(yīng)中，可以添加用于加速反應(yīng)的添加劑。作為上述添加劑，可以列舉例如：苯酚、間甲酚、對甲酚、茴香醚、茴香硫醚、二苯硫醚、二甲基硫醚。這些添加劑可以僅使用1種，也可以組合使用2種以上。
反應(yīng)溫度只要在使用的溶劑的沸點以下即可，沒有特別限定，例如，優(yōu)選為-35℃以上，更優(yōu)選為-20℃以上，進(jìn)一步優(yōu)選為-10℃以上，優(yōu)選為100℃以下，更優(yōu)選為80℃以下，進(jìn)一步優(yōu)選為60℃以下。
反應(yīng)時間也沒有特別限定，優(yōu)選為0.1小時以上，更優(yōu)選為1小時以上，進(jìn)一步優(yōu)選為2小時以上，優(yōu)選為50小時以下，更優(yōu)選為30小時以下，進(jìn)一步優(yōu)選為20小時以下。
在利用酸進(jìn)行的反應(yīng)結(jié)束后，除去了接頭的第1肽鏈通常進(jìn)行后處理，例如，可以通過實施加入通常的有機溶劑使肽析出并獲取的操作等來進(jìn)行分離純化。
6.清洗工序
為了對上述工序中得到的疏水性肽進(jìn)一步進(jìn)行純化，可以實施清洗除去親水性單元與接頭的鍵合體的清洗工序。在本工序中，用任選含有助劑的水或含水溶劑對通過接頭切除工序得到的無載體且無接頭的第1肽鏈進(jìn)行清洗。
上述含水溶劑例如為水與親水性溶劑的混合物，作為該親水性溶劑，可以列舉例如：甲醇、乙醇等醇類；乙二醇、二甲氧基乙烷、四氫呋喃等醚類；丙酮、二
清洗操作可以根據(jù)需要實施2次以上，清洗中使用的水或含水溶劑可以每次變更?？梢允骨逑床僮骱蟮募兓母稍?，除去殘渣，制成產(chǎn)品。
如上所述，在親水化工序a和載體切除工序b中處理帶有載體的粗制肽，接著在色譜純化工序及接頭切除工序中進(jìn)行處理，由此能夠高度且簡便地對肽進(jìn)行純化。而且，本發(fā)明不限于肽的種類，通用性優(yōu)異，適于簡便地對各種肽進(jìn)行純化的用途。
本申請主張基于2014年9月26日申請的美國專利申請第62/055,991號的優(yōu)先權(quán)。本申請參考并引用2014年9月26日申請的美國專利申請第62/055,991號說明書的全部內(nèi)容。
實施例
以下，列舉實施例更具體地對本發(fā)明進(jìn)行說明，本發(fā)明當(dāng)然不受下述實施例的限制，也當(dāng)然可以在符合上述/下述的主旨的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)變更來實施，這些均包含于本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
本申請實施例中使用的裝置如下所述。
·自動肽合成裝置：proteintechnologies,inc制造的symphony
·nmr：日本電子株式會社制造的“jmtc-500”
·質(zhì)量分析裝置：使用brukerdartonics公司制造的“microflex”，基質(zhì)使用二羥基苯甲酸(dihydroxybenzoicacid)。
·hplc分析裝置；株式會社島津制作所制造的“spd-10avp”“l(fā)c-10advp”“scl-10avp”“dgu-12a”“cto-10asvp”“c-r8a”
·hplc純化裝置；xxvarian制造的“prostar(制備色譜裝置)”和raining制造的“dynamaxabsorbancedetectormodeluv-dii(uv檢測裝置制備色譜裝置)”
合成例1
4-(2-fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二氯芐基琥珀酰亞胺基碳酸酯(3a)
[化學(xué)式24]
將4-(2-fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二氯苯甲醇(純度98.3％、200mg、0.429mmol)溶解于二氯甲烷(4ml)。向其中依次加入n,n’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(165mg、0.643mmol)的乙腈(8ml)溶液和吡啶(51.8μl、0.643mmol)。在25℃下攪拌3小時后，進(jìn)行了濃縮。向殘渣中加入乙酸乙酯(50ml)進(jìn)行溶解，用10％碳酸氫鈉水(25ml，3次)、h2o(25ml，2次)、飽和食鹽水(25ml，1次)依次進(jìn)行了清洗。用硫酸鎂干燥有機層，然后進(jìn)行過濾和濃縮，獲得了活性化碳酸酯型接頭(3a)的白色固體(276.7mg，定量產(chǎn)率)。
1hnmr(500mhz,cdcl3):δ7.77(d,3jhh＝7.0hz,2h),7.62(d,3jhh＝7.5hz,2h),7.40(dd,3jhh＝15.0and7.5hz,2h),7.33(t,3jhh＝7.5hz,2h),5.51(bs,1h),5.21(s,2h),4.41(d,3jhh＝7.0hz,2h),4.25(t,3jhh＝7.0hz,1h),4.20-4.16(m,2h),3.68-3.65(m,2h)
合成例2
4-(2-fmoc-氨基)乙氧基-1-甲?；?5)
[化學(xué)式25]
向4-(2-fmoc-氨基)乙氧基苯甲醇(1.00g、2.57mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液加入二氧化錳(4.47g、51.4mmol)，在25℃下攪拌35小時。進(jìn)行硅藻土過濾。將濾液濃縮后，通過硅膠柱色譜(乙酸乙酯/己烷/二氯甲烷＝1/1/1)純化，以0.92g白色固體的形式獲得了醛型接頭(5)(2.37mmol、產(chǎn)率92％)。
1hnmr(500mhz,cdcl3):δ9.90(s,1h),7.85(d,3jhh＝8.5hz,2h),7.75(d,3jhh＝7.5hz,2h),7.59-7.57(m,2h),7.40-7.39(m,2h),7.31-7.26(m,2h),7.01(d,3jhh＝8.0hz,2h),5.19(s,1h),4.45(d,3jhh＝7.0hz,2h),4.22(t,3jhh＝6.5hz,1h),4.14-4.10(m,2h),3.66-3.63(m,2h)
合成例3
2-(2-fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二氯芐基琥珀酰亞胺基碳酸酯(3d)
[化學(xué)式26]
向2-(2-fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二氯苯甲醇(458mg、1.00mmol)的ch2cl2(14ml)溶液添加n,n’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(384mg、1.5mmol)的乙腈(28ml)溶液，制成均勻的溶液。向其中用時1分鐘滴加吡啶(0.121ml、1.5mmol)，然后在25℃下攪拌11小時。減壓餾去溶劑，向殘渣中加入etoac(100ml)。用飽和碳酸氫鈉水(50ml，3次)、水(50ml，4次)和飽和食鹽水(50ml，1次)依次進(jìn)行清洗，對得到的etoac層進(jìn)行利用mgso4的干燥和過濾，并進(jìn)行減壓濃縮，以白色固體的形式得到了2-(2-fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二氯芐基琥珀酰亞胺基碳酸酯(純度94.7％；615mg、0.972mmol、產(chǎn)率97％)。
1hnmr(500mhz,cdcl3):δ7.77(d,3jhh＝7.5hz,2h),7.63(d,3jhh＝7.5hz,2h),7.45(d,4jhh＝2.0hz,1h),7.40(t,3jhh＝7.5hz,2h),7.33-7.30(m,2h),7.32(d,4jhh＝2.5hz,1h),5.57(t,3jhh＝6.0hz,1h),5.32(s,2h),4.40(d,3jhh＝7.0hz,2h),4.25(t,3jhh＝7.0hz,1h),4.12(t,3jhh＝5.0hz,2h),3.66(dt,3jhh＝5.5hzand5.0hz,2h),2.79(s,4h)
合成例4
4-(2-fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二溴芐基琥珀酰亞胺基碳酸酯(3b)
[化學(xué)式27]
向4-(2-fmoc-氨基)乙氧基-3,5-二溴苯甲醇(547mg、1.00mmol)的ch2cl2(14ml)溶液加入n,n’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(384mg、1.5mmol)的乙腈(28ml)溶液，制成均勻的溶液。向其中用時1分鐘滴加吡啶(0.121ml、1.5mmol)，然后在25℃下攪拌11小時。減壓餾去溶劑，向殘渣中加入etoac(100ml)。用飽和碳酸氫鈉水(50ml，3次)、水(50ml，4次)和飽和食鹽水(50ml，1次)依次進(jìn)行清洗，對得到的etoac層進(jìn)行利用mgso4的干燥和過濾，并進(jìn)行減壓濃縮，獲得了白色固體(純度93.2％；674mg、0.913mmol、產(chǎn)率91％)。
1hnmr(500mhz,cdcl3):δ7.77(d,3jhh＝7.5hz,2h),7.62(d,3jhh＝7.5hz,2h),7.57(s,2h),7.41(t,3jhh＝7.5hz,2h),7.32(t,3jhh＝7.5hz,2h),5.52(t,3jhh＝6.0hz,1h),5.21(s,2h),4.42(d,3jhh＝6.5hz,2h),4.25(t,3jhh＝6.5hz,1h),4.13(t,3jhh＝6.5hz,2h),3.69-3.66(m,2h),2.85(s,4h)
合成例5
4-(2-fmoc-氨基)乙氧基-3-硝基芐基琥珀酰亞胺基碳酸酯(3c)
[化學(xué)式28]
向4-(2-fmoc-氨基)乙氧基-3-硝基苯甲醇(純度94.5％；0.63g、1.37mmol)的ch2cl2(14ml)溶液加入n,n’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(530mg、2.07mmol)的乙腈(28ml)溶液，制成均勻的溶液。向其中用時1分鐘滴加吡啶(0.167ml、2.07mmol)，然后在25℃下攪拌4小時。減壓餾去溶劑，向殘渣中加入etoac(100ml)。用飽和碳酸氫鈉水(50ml，3次)、水(50ml，4次)和飽和食鹽水(50ml，1次)依次進(jìn)行清洗，對得到的etoac層進(jìn)行利用mgso4的干燥和過濾，并進(jìn)行減壓濃縮，以白色固體的形式得到了4-(2-fmoc-氨基)乙氧基-3-硝基芐基琥珀酰亞胺基碳酸酯(3c)(純度92.9％；794mg、1.28mmol、產(chǎn)率93％)。
1hnmr(500mhz,cdcl3):δ7.97(d,4jhh＝1.5hz,1h),7.74(d,3jhh＝7.5hz,2h),7.62-7.59(m,1h),7.60(d,3jhh＝7.0hz,2h),7.38(t,3jhh＝7.5hz,2h),7.29(t,3jhh＝7.5hz,2h),7.11(d,3jhh＝8.5hz,1h),5.48(t,3jhh＝5.5hz,1h),5.29(s,2h),4.38(d,3jhh＝7.0hz,2h),4.23-4.19(m,3h),3.69-3.66(m,2h),2.84(s,4h)
合成例6
4-(6-fmoc-氨基)己氧基-3,5-二氯芐基琥珀酰亞胺基碳酸酯(3e)
[化學(xué)式29]
向4-(6-fmoc-氨基)己氧基-3,5-二氯苯甲醇(360mg、0.7mmol)的ch2cl2(5ml)溶液添加n,n’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(269mg、1.05mmol)的乙腈(10ml)溶液，再滴加吡啶(83mg、1.05mmol)的乙腈(1ml)溶液，然后在25℃下攪拌4小時。減壓餾去溶劑，向殘渣中加入etoac(20ml)。用飽和碳酸氫鈉水(10ml，3次)、水(10ml，1次)和飽和食鹽水(10ml，1次)依次進(jìn)行清洗，用硫酸鎂對得到的etoac層進(jìn)行干燥，然后濾去硫酸鎂，將濾液進(jìn)行減壓濃縮，以高粘性的白色固體的形式得到了4-(6-fmoc-氨基)己氧基-3,5-二氯芐基琥珀酰亞胺基碳酸酯(3e)(383mg、產(chǎn)率96％)。
1hnmr(500mhz,cdcl3):δ7.77(d,j＝7.5hz,2h),7.60(d,j＝7.5hz,2h),7.40(t,j＝7.5hz,2h),7.34(s,2h),7.32(t,j＝7.0hz,2h),4.7(d,j＝6hz,2h),4.40(d,j＝7hz,2h),4.23-4.20(m,1h),4.03(t,j＝6.5hz,2h),3.25-3.18(m,2h),2.85(s,4h),1.88-1.80(m,2h),1.60-1.51(m,4h),1.47-1.38(m,2h)。
實施例1
＜帶有載體的粗制肽的制造：rink酰胺樹脂擔(dān)載9殘基疏水性肽giltvsvav(gravy得分：2.31)＞
通過fmoc/boc固相合成法，使用0.41mmol/g的rink酰胺樹脂及作為偶聯(lián)試劑的o-(6-氯苯并三唑-1-基)-n,n,n’,n’-四甲基脲
＜接頭鍵合工序(對rink酰胺樹脂擔(dān)載9殘基疏水性肽giltvsvav連接活性化碳酸酯型接頭(3a))＞
將溶解于dmf(0.7ml)的活性化碳酸酯型接頭(3a)(73.7mg、0.123mmol)與rink酰胺樹脂擔(dān)載9殘基疏水性肽giltvsvav(0.41mmol/g、100mg、0.041mmol)混合，在25℃下振蕩14小時。接著進(jìn)行過濾，用dmf(10ml)和二氯甲烷(10ml)清洗得到的帶有載體的接頭鍵合體，得到了連接有活性化碳酸酯型接頭(3a)的帶有載體的接頭鍵合體122mg。
得到的接頭鍵合體按照下述簡圖制成了高純度的疏水性肽。
[化學(xué)式30]
＜親水性單元鍵合工序＞
用dmf(3ml)清洗2次帶有載體的接頭鍵合體(616mg)，再用ch2cl2(3ml)清洗1次，然后在減壓下除去過量的溶劑。向其中加入20％(v/v)哌啶dmf溶液(3ml)，在25℃下振蕩20分鐘，然后進(jìn)行過濾，實施了脫fmoc反應(yīng)。總計重復(fù)了4次該哌啶處理操作，最后用dmf(3ml)進(jìn)行了清洗。加入dmf(3ml)溶液，所述dmf溶液是相對于脫fmoc后的帶有載體的接頭鍵合體1mol以fmoc氨基酸︰hobt︰hbtu︰dipea(二異丙基乙胺)＝3mol︰3mol︰6mol的比率添加后的dmf溶液，在25℃下攪拌20分鐘，然后進(jìn)行過濾，使fmoc氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)?？傆嬛貜?fù)了3次該偶聯(lián)操作。通過茚三酮試劑的顯色反應(yīng)確認(rèn)不存在未反應(yīng)的氨基之后，重復(fù)進(jìn)行利用20％哌啶dmf溶液的脫fmoc反應(yīng)、偶聯(lián)操作，直至得到希望的序列。由此，獲得了在接頭分子上連接了依次由(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly構(gòu)成的11殘基肽鏈的帶有載體的親水化肽體963mg。
＜載體切除工序＞
向帶有載體的親水化肽體(200mg)加入tfa(三氟乙酸)︰tis(三異丙基硅烷)︰h2o＝95︰2.5︰2.5(容積比、2ml)的混合溶液，在25℃下振蕩2小時。濾去載體，用tfa(1ml)清洗了殘渣?；旌蠟V液和清洗液，并加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。進(jìn)行離心分離，然后除去上清液，用乙醚進(jìn)一步清洗3次固體。通過在減壓下餾去乙醚，以白色固體的形式得到了無載體的親水化肽體的粗產(chǎn)物71mg。
對獲得的親水化肽體進(jìn)行了hplc分析及質(zhì)量分析。將結(jié)果示于以下，將得到的圖譜示于圖1、2。
＜無載體的親水化肽體(粗產(chǎn)物)＞
hplc柱：supelcodiscoverybiowideporec18-5、25cm×4.6mm、5μm
流速：1ml/ml
柱溫：40℃
波長：220nm
洗脫液：0.1％tfa乙腈/0.1％tfa水溶液＝0→100(0-20分鐘)、100(20-34.5分鐘)、100→0(34.5-35分鐘)、0(35-39.9分鐘)
保留時間：13.7分鐘
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝2101.917(計算值：2101.14)
＜色譜純化工序＞
基于以下的條件進(jìn)行了利用高效液相色譜(hplc)的無載體的親水化肽體的純化。示出實施條件、結(jié)果。另外，將得到的圖譜示于圖3、4。
hplc純化條件
柱：supelcoc18柱
洗脫液：0.1％tfa水溶液/0.1％乙腈溶液＝85/15→50/50(70分鐘)
流速：20ml/分
檢測波長：225nm
＜無載體的親水化肽體(純化物)＞
hplc柱：supelcoc18柱
流速：1.0ml/分
柱溫：40℃
檢測波長：225nm
洗脫液：0.1％tfa水溶液/0.1％乙腈溶液＝95/5→40/60(8分鐘)
保留時間：4.8分鐘
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝2103.6(計算值2101.14)
＜接頭切除工序(利用催化還原反應(yīng)進(jìn)行的接頭的切斷)＞
將無載體的親水化肽體(10mg)溶解于甲醇(3ml)，加入10％pd/c(10％waterwet；30mg)。進(jìn)行容器內(nèi)的氫氣置換，使其為1氣壓的氫氣體氛圍下。將混合物在50℃下攪拌15小時，然后減壓餾去溶劑。向得到的殘渣加入三氟乙酸(1.0ml)并進(jìn)行過濾。用tfa(1ml)清洗固體，將濾液和清洗液混合，加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。離心分離后除去上清液，進(jìn)一步用乙醚對固體實施了3次清洗操作。通過在減壓下餾去乙醚，得到了11.8mg的白色粉末。
＜疏水性肽的獲得(可溶部位的除去)＞
用10％碳酸氫鈉1.0ml和乙腈/h2o＝1/1(容積比)1.0ml依次對上一工序中得到的切斷接頭后的疏水性肽實施了清洗操作。通過對殘渣進(jìn)行真空干燥，以白色粉末的形式獲得了疏水性肽giltvsvav5.0mg。將得到的疏水性肽的hplc分析結(jié)果及質(zhì)量分析結(jié)果示于圖5、6。
實施例2
＜帶有載體的粗制肽的制造：tentagel樹脂擔(dān)載淀粉狀蛋白β(17～40片段)lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(gravy得分：1.63)＞
通過fmoc/boc固相合成法，使用0.41mmol/g的tentagel樹脂及作為偶聯(lián)試劑的o-(6-氯苯并三唑-1-基)-n,n,n’,n’-四甲基脲
＜接頭鍵合工序(向tentagel樹脂擔(dān)載淀粉狀蛋白β(17～40片段)連接活性化碳酸酯型接頭(3a))＞
將溶解于dmf(3ml)的活性化碳酸酯型接頭(3a)(144mg、0.24mmol)與tentagel樹脂擔(dān)載淀粉狀蛋白β(17～40片段)(0.15mmol/g、800mg、0.12mmol)混合，在25℃下振蕩2小時。接著，用dmf(10ml)和二氯甲烷(10ml)清洗帶有載體的接頭鍵合體，由此得到了連接有活性化碳酸酯型接頭(3a)的帶有載體的接頭鍵合體846mg。
＜親水性單元鍵合工序＞
通過與實施例1相同的fmoc固相合成法，對帶有載體的接頭鍵合體(846mg)重復(fù)fmoc基的脫保護(hù)與fmoc氨基酸的偶聯(lián)操作。由此，在接頭分子上連接依次由(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly構(gòu)成的總計由11個氨基酸構(gòu)成的肽鏈，得到了992mg帶有載體的親水化肽體2。
＜載體切除工序(序列中含有s原子的情況)＞
向帶有載體的親水化肽體(400mg)加入tfa︰茴香硫醚︰3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇︰h2o＝90︰5︰3︰5(容積比)的混合溶液3ml，在25℃下振蕩2小時。濾去樹脂，用tfa清洗了殘渣。將濾液與清洗液混合，加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，進(jìn)一步用乙醚對固體清洗了3次。在減壓下餾去乙醚，得到了無載體的親水化肽體的粗產(chǎn)物133mg。
對得到的親水化肽體進(jìn)行了hplc分析及質(zhì)量分析。將結(jié)果示于以下。
＜無載體的親水化肽體(粗產(chǎn)物)＞
hplc柱：supelcodiscoverybiowideporec18-5、25cm×4.6mm、5μm
流速：1ml/分
柱溫：40℃
波長：220nm
洗脫液：0.1％tfa乙腈/0.1％tfa水溶液＝0→100(0-20分鐘)、100(20-34.5分鐘)、100→0(34.5-35分鐘)、0(35-39.9分鐘)
保留時間：15.7分鐘
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝3635.872(計算值：3635.887)
＜色譜純化工序＞
色譜純化工序用與實施例1相同的方法進(jìn)行即可。
＜接頭切除工序(利用酸性條件進(jìn)行的接頭的切斷)＞
向無載體的親水化肽體(5mg)加入由tfa︰間甲酚︰tmsotf＝68︰12︰20(容積比)構(gòu)成的混合溶液1.0ml，在0℃下攪拌4小時。加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，用乙醚進(jìn)一步對固體實施了3次清洗操作。在減壓下餾去乙醚，由此得到了粗產(chǎn)物10.1mg。
實施例3
＜帶有載體的接頭鍵合工序(向rink酰胺樹脂擔(dān)載9殘基疏水性肽giltvsvav連接醛型接頭(5))(gravy得分：2.31)＞
將rink酰胺樹脂擔(dān)載9殘基疏水性肽giltvsvav(0.41mmol/g；150mg、0.063mmol)、醛型接頭(5)(240mg、0.615mmol)、以及二氯甲烷/原甲酸三甲酯混合溶液(容積比2/1；3.0ml)混合，在25℃下振蕩13天。進(jìn)行過濾后，用二氯甲烷(5ml)清洗，并進(jìn)行減壓干燥，得到了155.9mg亞胺化樹脂。
向得到的亞胺化樹脂26mg加入nabh3cn(32.0mg、0.51mmol)和dmf/乙酸/甲醇混合溶液(9/9/2.6ml)，在25℃下振蕩24小時。進(jìn)行過濾，并進(jìn)行利用dmf(3ml)和二氯甲烷(3ml)進(jìn)行的清洗，得到了還原體樹脂28mg。
向得到的還原體樹脂(183mg、0.075mmol)中混合二碳酸二叔丁酯(164mg、0.75mmol)、n-甲基嗎啉(83μl、0.75mmol)及dmf(1ml)，在25℃下振蕩19小時。進(jìn)行過濾，并進(jìn)行利用dmf(3ml)進(jìn)行的清洗，然后再次向樹脂添加二碳酸二叔丁酯(164mg、0.75mmol)、n-甲基嗎啉(83μl、0.75mmol)及dmf(1ml)，在25℃下振蕩23小時。進(jìn)行過濾、利用dmf(3ml)和二氯甲烷(3ml)進(jìn)行的清洗，并進(jìn)行減壓干燥，由此得到了連接有醛型接頭(5)的帶有載體的接頭鍵合體209mg。
得到的帶有載體的接頭鍵合體按照以下的簡圖制成了高純度的疏水性肽。
[化學(xué)式31]
＜親水性單元鍵合工序＞
通過與實施例1相同的fmoc固相合成法，對帶有載體的接頭鍵合體(400mg)重復(fù)了fmoc基的脫保護(hù)和fmoc氨基酸的偶聯(lián)操作。由此，在接頭分子上連接了依次由(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)gly構(gòu)成的總計由11個氨基酸構(gòu)成的肽鏈，得到了帶有載體的親水化肽體472mg。
＜載體切除工序＞
通過與實施例1相同的方法，由親水化肽體(200mg)獲得了無載體的親水化肽體的粗產(chǎn)物(78mg)。對獲得的親水化肽體進(jìn)行了hplc分析及質(zhì)量分析。
＜無載體的親水化肽體(粗產(chǎn)物)＞
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝1989.330(計算值：1989.230)
＜色譜純化工序＞
色譜純化工序用與實施例1相同的方法進(jìn)行即可。
實施例4
＜帶有載體的粗制肽的制造：tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(gravy得分：1.63)＞
通過使用了自動肽合成儀的fmoc固相合成法，得到了擔(dān)載有由leu-val-phe-phe-ala-glu(tbu)-asp(tbu)-val-gly-ser(tbu)-asn(trt)-lys(boc)-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val構(gòu)成的24殘基肽的固相樹脂(tentagel樹脂)。
＜接頭鍵合工序(向tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv連接活性化碳酸酯型接頭(3a))＞
將溶解于dmf(3ml)的活性化碳酸酯型接頭(3a)(144mg、0.24mmol)與tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(0.15mmol/g、800mg、0.12mmol)混合，在25℃下振蕩2小時。接著，進(jìn)行過濾，并用dmf(10ml)和二氯甲烷(10ml)對得到的帶有載體的接頭鍵合體進(jìn)行清洗，由此得到了連接有活性化碳酸酯型接頭(3a)的帶有載體的接頭鍵合體846mg。
＜親水性單元鍵合工序＞
用dmf(3ml，2次)和ch2cl2(3ml，1次)依次清洗帶有載體的接頭鍵合體(846mg)，在減壓下除去過量的溶劑。向其中加入20％(v/v)哌啶dmf溶液(3ml)，并在25℃下振蕩20分鐘，然后進(jìn)行過濾，由此進(jìn)行了fmoc基的脫保護(hù)?？傆嬤M(jìn)行了4次該哌啶處理操作。在用dmf的清洗后，通過與實施例1相同的fmoc固相合成法重復(fù)了fmoc基的脫保護(hù)和fmoc氨基酸的偶聯(lián)。由此，在接頭分子上連接了依次由(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)構(gòu)成的3殘基的肽鏈，得到了帶有載體的親水化肽體860mg。
＜載體切除工序＞
向充分干燥后的帶有載體的親水化肽體(1.24g、0.0954mmol)加入tfa︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容積比、5ml)的混合溶液，在25℃下振蕩2小時。濾去載體，用tfa清洗了固體。將濾液與清洗液混合，并加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，進(jìn)一步用乙醚對固體清洗了3次。在減壓下餾去乙醚，得到了無載體的親水化肽體的粗產(chǎn)物196mg。
對得到的親水化肽體進(jìn)行了hplc分析及質(zhì)量分析。將結(jié)果示于以下，將得到的圖譜示于圖7、8。
＜無載體的親水化肽體(粗產(chǎn)物)＞
hplc柱：supelcodiscoverybiowideporec18-5、25cmx4.6mm、5μm
流速：1ml/分
柱溫：40℃
波長：220nm
洗脫液：0.1％tfa乙腈/0.1％tfa水溶液＝0→100(0-20分鐘)、100(20-34.5分鐘)、100→0(34.5-35分鐘)、0(35-39.9分鐘)
保留時間：13.7分鐘
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝3038.027(計算值：3037.568)
＜色譜純化工序＞
基于以下的條件，進(jìn)行了利用高效液相色譜(hplc)實施的無載體的親水化肽體的純化。示出實施條件、結(jié)果。另外，將得到的圖譜示于圖9、10。
hplc純化條件
柱：supelcoc18柱
洗脫液：0.1％tfa水溶液/0.1％乙腈溶液＝85/15→50/50(70分鐘)
流速：20ml/分
檢測波長：225nm
＜無載體的親水化肽體(純化物)＞
hplc柱：supelcoc18柱
流速：1.0ml/分
柱溫：40℃
檢測波長：225nm
洗脫液：0.1％tfa水溶液/0.1％乙腈溶液＝85/15→25/75(20分鐘)
保留時間：14.5分鐘
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝3039(計算值3037.568)
＜接頭切除工序(利用酸性條件進(jìn)行的接頭的切斷)＞
向無載體的親水化肽體(20mg)加入由tfa︰茴香硫醚︰tmsotf＝68︰12︰20(容積比)構(gòu)成的混合溶液4.0ml，在0℃下攪拌4小時。向tfa層加入乙醚(40ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，用乙醚進(jìn)一步對固體實施了3次清洗操作。在減壓下餾去乙醚，由此得到了粗產(chǎn)物22mg。
＜疏水性肽的獲得(可溶部位的除去)＞
用磷酸緩沖液(ph7.2)1ml對上一工序中得到的切斷接頭后的疏水性肽進(jìn)行2次清洗，然后再用水1ml清洗2次。對殘渣進(jìn)行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了12mg疏水性肽leu-val-phe-phe-ala-glu-asp-val-gly-ser-asn-lys-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val。
對上述疏水性肽實施了maldi-tofms分析。結(jié)果是測定值為2395.1(計算值2392.287)。將得到的疏水性肽的hplc分析結(jié)果及質(zhì)量分析結(jié)果示于圖11、12。
實施例5
＜帶有載體的粗制肽的制造：tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(gravy得分：1.63)＞
通過使用了自動肽合成儀的fmoc固相合成法獲得了擔(dān)載有由leu-val-phe-phe-ala-glu(tbu)-asp(tbu)-val-gly-ser(tbu)-asn(trt)-lys(boc)-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val構(gòu)成的24殘基肽的固相樹脂(tentagel樹脂)。
＜接頭鍵合工序(向tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv連接活性化碳酸酯型接頭(3a))＞
將溶解于dmf(3ml)的活性化碳酸酯型接頭(3a)(144mg、0.24mmol)與tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(0.15mmol/g、800mg、0.12mmol)混合，并在25℃下振蕩2小時。接著，進(jìn)行過濾，用dmf(10ml)和二氯甲烷(10ml)清洗得到的帶有載體的接頭鍵合體，由此獲得了連接有活性化碳酸酯型接頭(3a)的帶有載體的接頭鍵合體846mg。
＜親水性單元鍵合工序＞
用dmf(3ml，2次)和ch2cl2(3ml，1次)依次清洗帶有載體的接頭鍵合體(1.60g)，在減壓下除去過量的溶劑。向其中添加20％(v/v)哌啶dmf溶液(3ml)，并在25℃下振蕩20分鐘，然后進(jìn)行過濾，由此進(jìn)行了fmoc基的脫保護(hù)。總計進(jìn)行了4次該哌啶處理操作。在用dmf的清洗后，通過與實施例1相同的fmoc固相合成法重復(fù)了fmoc基的脫保護(hù)和fmoc氨基酸的偶聯(lián)。由此，在接頭分子上連接了依次由(fmoc)arg(pbf)、(fmoc)arg(pbf)、(fmoc)arg(pbf)、(fmoc)arg(pbf)、(fmoc)arg(pbf)、(fmoc)arg(pbf)構(gòu)成的6殘基肽鏈，得到了2.11g帶有載體的親水化肽體7。
＜載體切除工序＞
向充分干燥后的帶有載體的親水化肽體(1.24g、0.0954mmol)加入tfa︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容積比、5ml)的混合溶液，并在25℃下振蕩2小時。濾去載體，用tfa清洗了固體。將濾液與清洗液混合，并加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，進(jìn)一步用乙醚對固體清洗了3次。在減壓下餾去乙醚，得到了無載體的親水化肽體的粗產(chǎn)物196mg。
＜色譜純化工序＞
色譜純化工序用與實施例1相同的方法進(jìn)行即可。
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝3590.686(計算值3589.897)
＜接頭切除工序(利用酸性條件進(jìn)行的接頭的切斷)＞
向無載體的親水化肽體(20mg)加入由tfa︰茴香硫醚︰tmsotf＝68︰12︰20(容積比)構(gòu)成的混合溶液4.0ml，并在0℃下攪拌4小時。向tfa層加入乙醚(40ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，用乙醚進(jìn)一步對固體實施了3次清洗操作。在減壓下餾去乙醚，由此得到了粗產(chǎn)物22mg。
＜疏水性肽的獲得(可溶部位的除去)＞
用磷酸緩沖液(ph7.2)1ml對上一工序中得到的切斷接頭后的疏水性肽進(jìn)行2次清洗，進(jìn)一步用水1ml清洗2次。對殘渣進(jìn)行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了12.0mg疏水性肽leu-val-phe-phe-ala-glu-asp-val-gly-ser-asn-lys-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val。
對上述疏水性肽實施了maldi-tofms分析。結(jié)果是測定值為2392.683(計算值2392.287)。
實施例6
＜帶有載體的粗制肽的制造：tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(gravy得分：1.63)＞
通過使用了自動肽合成儀的fmoc固相合成法，得到了擔(dān)載有由leu-val-phe-phe-ala-glu(tbu)-asp(tbu)-val-gly-ser(tbu)-asn(trt)-lys(boc)-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val構(gòu)成的24殘基肽的固相樹脂(tentagel樹脂)。
＜接頭鍵合工序(向tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv連接活性化碳酸酯型接頭(3a))＞
將溶解于dmf(3ml)的活性化碳酸酯型接頭(3a)(144mg、0.24mmol)與tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(0.15mmol/g、800mg、0.12mmol)混合，并在25℃下振蕩2小時。接著，進(jìn)行過濾，用dmf(10ml)和二氯甲烷(10ml)對得到的帶有載體的接頭鍵合體進(jìn)行清洗，由此得到了連接有活性化碳酸酯型接頭(3a)的帶有載體的接頭鍵合體846mg。
＜親水性單元鍵合工序＞
用dmf(3ml，2次)和ch2cl2(3ml，1次)依次清洗帶有載體的接頭鍵合體(1.60g)，在減壓下除去了過量的溶劑。向其中加入20％(v/v)哌啶dmf溶液(3ml)，并在25℃下振蕩20分鐘，然后進(jìn)行過濾，由此進(jìn)行了fmoc基的脫保護(hù)?？傆嬤M(jìn)行了4次該哌啶處理操作。在用dmf的清洗后，通過與實施例1相同的fmoc固相合成法重復(fù)了fmoc基的脫保護(hù)和fmoc氨基酸的偶聯(lián)。由此，在接頭分子上連接了依次由(fmoc)asp(tbu)、(fmoc)asp(tbu)、(fmoc)asp(tbu)、(fmoc)asp(tbu)、(fmoc)asp(tbu)、(fmoc)asp(tbu)構(gòu)成的6殘基肽鏈，得到了帶有載體的親水化肽體1.98g。
＜載體切除工序＞
向充分干燥后的帶有載體的親水化肽體(1.24g、0.0954mmol)添加tfa︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容積比、5ml)的混合溶液，并振蕩2小時。濾去載體，用tfa清洗了固體。將濾液與清洗液混合，并加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，進(jìn)一步用乙醚對固體清洗了3次。在減壓下餾去乙醚，得到了無載體的親水化肽體的粗產(chǎn)物196mg。
＜色譜純化工序＞
色譜純化工序用與實施例1相同的方法進(jìn)行即可。
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝3343.304(計算值3343.452)
＜接頭切除工序(利用酸性條件進(jìn)行的接頭的切斷)＞
向無載體的親水化肽體(20mg)加入由tfa︰茴香硫醚︰tmsotf＝68︰12︰20(容積比)構(gòu)成的混合溶液4.0ml，并在0℃下攪拌4小時。向tfa層加入乙醚(40ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，用乙醚進(jìn)一步對固體實施了3次清洗操作。在減壓下餾去乙醚，由此得到了粗產(chǎn)物22mg。
＜疏水性肽的獲得(可溶部位的除去)＞
用磷酸緩沖液(ph7.2)1ml對上一工序中得到的切斷接頭后的疏水性肽進(jìn)行2次清洗，進(jìn)一步用水1ml清洗2次。對殘渣進(jìn)行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了12.0mg疏水性肽leu-val-phe-phe-ala-glu-asp-val-gly-ser-asn-lys-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val。
對上述疏水性肽實施了maldi-tofms分析。結(jié)果是測定值為2393.210(計算值2392.287)。
實施例7
＜帶有載體的粗制肽的制造：tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(gravy得分：1.63)＞
通過使用了自動肽合成儀的fmoc固相合成法，得到了擔(dān)載有由leu-val-phe-phe-ala-glu(tbu)-asp(tbu)-val-gly-ser(tbu)-asn(trt)-lys(boc)-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val構(gòu)成的24殘基肽的固相樹脂(tentagel樹脂)。
＜接頭鍵合工序(向tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv連接活性化碳酸酯型接頭(3d))＞
將溶解于dmf(1.5ml)的活性化碳酸酯型接頭(3d)(39mg、0.068mmol)與tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(0.15mmol/g、300mg、0.045mmol)混合，并在25℃下振蕩2小時。接著，進(jìn)行過濾，用dmf(10ml)和二氯甲烷(10ml)清洗得到的帶有載體的接頭鍵合體，由此得到了連接有活性化碳酸酯型接頭(3d)的帶有載體的接頭鍵合體。
＜親水性單元鍵合工序＞
向帶有載體的接頭鍵合體加入20％哌啶的dmf溶液(2ml)并振蕩20分鐘，進(jìn)行了fmoc的脫保護(hù)。總計進(jìn)行了4次該哌啶處理操作。在用dmf的清洗后，通過與實施例1相同的fmoc固相合成法重復(fù)了fmoc基的脫保護(hù)和fmoc氨基酸的偶聯(lián)。由此，在接頭分子上連接了依次由(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)構(gòu)成的3殘基肽鏈，得到了帶有載體的親水化肽體。
＜載體切除工序＞
向充分干燥后的帶有載體的親水化肽體(50mg、0.000311mmol)加入tfa︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容積比、1ml)的混合溶液，振蕩2小時。濾去載體，用tfa清洗了固體。將濾液與清洗液混合，并加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，進(jìn)一步用乙醚對固體清洗了3次。在減壓下餾去乙醚，得到了無載體的親水化肽體的粗產(chǎn)物196mg。
＜色譜純化工序＞
色譜純化工序用與實施例1相同的方法進(jìn)行即可。
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝3037.812(計算值3037.568)
＜接頭切除工序(利用酸性條件進(jìn)行的接頭的切斷)＞
向無載體的親水化肽體(5mg)加入由tfa︰茴香硫醚︰tmsotf＝68︰12︰20(容積比)構(gòu)成的混合溶液1.0ml，并在0℃下攪拌4小時。向tfa層加入乙醚(40ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，用乙醚進(jìn)一步對固體實施了3次清洗操作。在減壓下餾去乙醚，由此得到了粗產(chǎn)物6.9mg。
＜疏水性肽的獲得(可溶部位的除去)＞
用磷酸緩沖液(ph7.2)1ml對上一工序中得到的切斷接頭后的疏水性肽(6.9mg)進(jìn)行2次清洗，進(jìn)一步用水1ml清洗2次。對殘渣進(jìn)行真空干燥，由此，以白色粉末(3.0mg)的形式得到了3.0mg疏水性肽leu-val-phe-phe-ala-glu-asp-val-gly-ser-asn-lys-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val。
對上述疏水性肽實施了maldi-tofms分析。結(jié)果是測定值為2392.939(計算值2392.287)。
實施例8
＜帶有載體的粗制肽的制造：tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(gravy得分：1.63)＞
通過使用了自動肽合成儀的fmoc固相合成法，得到了擔(dān)載有由leu-val-phe-phe-ala-glu(tbu)-asp(tbu)-val-gly-ser(tbu)-asn(trt)-lys(boc)-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val構(gòu)成的24殘基肽的固相樹脂(tentagel樹脂)。
＜接頭鍵合工序(向tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv連接活性化碳酸酯型接頭(3b))＞
將溶解于dmf(1.5ml)的活性化碳酸酯型接頭(3b)(46mg、0.068mmol)與tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(0.15mmol/g、300mg、0.045mmol)混合，并在25℃下振蕩2小時。接著，進(jìn)行過濾，用dmf(10ml)和二氯甲烷(10ml)對得到的帶有載體的接頭鍵合體進(jìn)行清洗，由此得到了連接有活性化碳酸酯型接頭(3b)的帶有載體的接頭鍵合體。
＜親水性單元鍵合工序＞
向帶有載體的接頭鍵合體加入20％哌啶的dmf溶液(2ml)，振蕩20分鐘，進(jìn)行了fmoc的脫保護(hù)。總計進(jìn)行了4次該哌啶處理操作。在用dmf的清洗后，通過與實施例1相同的fmoc固相合成法重復(fù)了fmoc基的脫保護(hù)和fmoc氨基酸的偶聯(lián)。由此，在接頭分子上連接了依次由(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)構(gòu)成的3殘基肽鏈。
＜載體切除工序＞
向充分干燥后的帶有載體的親水化肽體(44mg、0.00410mmol)加入tfa︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容積比、1ml)的混合溶液，并振蕩2小時。濾去載體，用tfa清洗了固體。將濾液與清洗液混合，并加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，進(jìn)一步用乙醚對固體清洗了3次。在減壓下餾去乙醚，得到了無載體的親水化肽體的粗產(chǎn)物6.0mg。
＜色譜純化工序＞
色譜純化工序用與實施例1相同的方法進(jìn)行即可。
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝3125.946(計算值3125.474)
＜接頭切除工序(利用酸性條件進(jìn)行的接頭的切斷)＞
向無載體的親水化肽體(5mg)加入由tfa︰茴香硫醚︰tmsotf＝68︰12︰20(容積比)構(gòu)成的混合溶液1.0ml，并在0℃下攪拌4小時。向tfa層加入乙醚(40ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，用乙醚進(jìn)一步對固體實施了3次清洗操作。在減壓下餾去乙醚，由此得到了粗產(chǎn)物7.5mg。
＜疏水性肽的獲得(可溶部位的除去)＞
用磷酸緩沖液(ph7.2)1ml對上一工序中得到的切斷接頭后的疏水性肽進(jìn)行2次清洗，進(jìn)一步用水1ml清洗2次。對殘渣進(jìn)行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了13.0mg疏水性肽leu-val-phe-phe-ala-glu-asp-val-gly-ser-asn-lys-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val。
對上述疏水性肽實施了maldi-tofms分析。結(jié)果是測定值為2392.168(計算值2392.287)。
實施例9
＜帶有載體的粗制肽的制造：tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(gravy得分：1.63)＞
通過使用了自動肽合成儀的fmoc固相合成法，得到了擔(dān)載有由leu-val-phe-phe-ala-glu(tbu)-asp(tbu)-val-gly-ser(tbu)-asn(trt)-lys(boc)-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val構(gòu)成的24殘基肽的固相樹脂(tentagel樹脂)。
＜接頭鍵合工序(向tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv連接活性化碳酸酯型接頭(3c))＞
將溶解于dmf(1.5ml)的活性化碳酸酯型接頭(3c)(39mg、0.068mmol)與tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(0.15mmol/g、300mg、0.045mmol)混合，并在25℃下振蕩2小時。接著，進(jìn)行過濾，用dmf(10ml)和二氯甲烷(10ml)對得到的帶有載體的接頭鍵合體進(jìn)行清洗，由此得到了連接有活性化碳酸酯型接頭(3c)的帶有載體的接頭鍵合體。
＜親水性單元鍵合工序＞
向帶有載體的接頭鍵合體加入20％哌啶的dmf溶液(2ml)，振蕩20分鐘，進(jìn)行了fmoc的脫保護(hù)?？傆嬤M(jìn)行了4次該哌啶處理操作。在用dmf的清洗后，通過與實施例1相同的fmoc固相合成法重復(fù)了fmoc基的脫保護(hù)和fmoc氨基酸的偶聯(lián)。由此，在接頭分子上連接了依次由(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)構(gòu)成的3殘基肽鏈。
＜載體切除工序＞
向充分干燥后的帶有載體的親水化肽體(44mg、0.00410mmol)加入tfa︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容積比、1ml)的混合溶液，并振蕩2小時。濾去載體，用tfa清洗了固體。將濾液與清洗液混合，并加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，進(jìn)一步用乙醚對固體清洗了3次。在減壓下餾去乙醚，得到了無載體的親水化肽體的粗產(chǎn)物8.2mg。
＜色譜純化工序＞
色譜純化工序用與實施例1相同的方法進(jìn)行即可。
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝3014.550(計算值3014.638)
＜接頭切除工序(利用酸性條件進(jìn)行的接頭的切斷)＞
向無載體的親水化肽體(5mg)加入由tfa︰茴香硫醚︰tmsotf＝68︰12︰20(容積比)構(gòu)成的混合溶液1.0ml，并在0℃下攪拌4小時。向tfa層加入乙醚(4ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，用乙醚進(jìn)一步對固體實施了3次清洗操作。在減壓下餾去乙醚，由此得到了粗產(chǎn)物7.0mg。
＜疏水性肽的獲得(可溶部位的除去)＞
用磷酸緩沖液(ph7.2)1ml對上一工序中得到的切斷接頭后的疏水性肽進(jìn)行2次清洗，進(jìn)一步用水1ml清洗2次。對殘渣進(jìn)行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了13.0mg疏水性肽leu-val-phe-phe-ala-glu-asp-val-gly-ser-asn-lys-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val。
對上述疏水性肽實施了maldi-tofms分析。結(jié)果是測定值為2396.099(計算值2392.287)。
實施例10
＜帶有載體的粗制肽的制造：hmpnovagel樹脂擔(dān)載12殘基疏水性肽cewnsahfiayk(gravy得分：-0.31)＞
通過使用了自動肽合成儀的fmoc固相合成法，得到了擔(dān)載有由ac-cys(trt)-glu(otbu)-trp(boc)-asn(trt)-ser(tbu)-ala-his(trt)-phe-ile-ala-tyr(tbu)-lys(boc)構(gòu)成的12殘基肽的固相樹脂(hmpnovagel樹脂)。
＜接頭鍵合工序(向hmpnovagel樹脂擔(dān)載12殘基疏水性肽cewnsahfiayk連接活性化碳酸酯型接頭(3a)＞
將溶解于dmf(3ml)的活性化碳酸酯型接頭(3a)(179mg、0.30mmol)與hmpnovagel樹脂擔(dān)載12殘基疏水性肽cewnsahfiayk(0.27mmol/g、500mg、0.14mmol)混合，并在25℃下振蕩2小時。接著，進(jìn)行過濾，用dmf(10ml)和二氯甲烷(10ml)對得到的帶有載體的接頭鍵合體進(jìn)行清洗，由此得到了連接有活性化碳酸酯型接頭(3a)的帶有載體的接頭鍵合體。
＜親水性單元鍵合工序＞
向帶有載體的接頭鍵合體加入20％哌啶的dmf溶液(3ml)，振蕩20分鐘，進(jìn)行了fmoc的脫保護(hù)?？傆嬤M(jìn)行了4次該哌啶處理操作。在用dmf的清洗后，通過與實施例1相同的fmoc固相合成法重復(fù)了fmoc基的脫保護(hù)和fmoc氨基酸的偶聯(lián)。由此，在接頭分子上連接了依次由(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)構(gòu)成的3殘基肽鏈。
＜載體切除工序＞
向充分干燥后的帶有載體的親水化肽體(50mg、0.0088mmol)加入tfa︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容積比、1ml)的混合溶液，并振蕩2小時。濾去載體，用tfa清洗了固體。將濾液與清洗液混合，并加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，進(jìn)一步用乙醚對固體清洗了3次。在減壓下餾去乙醚，得到了無載體的親水化肽體的粗產(chǎn)物8.2mg。
＜色譜純化工序＞
色譜純化工序用與實施例1相同的方法進(jìn)行即可。
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝2028.559(計算值2027.864)
＜接頭切除工序(利用酸性條件進(jìn)行的接頭的切斷)＞
向無載體的親水化肽體(5mg)加入由tfa︰茴香硫醚︰tmsotf＝68︰12︰20(容積比)構(gòu)成的混合溶液1.0ml，并在0℃下攪拌4小時。向tfa層加入乙醚(4ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，用乙醚進(jìn)一步對固體實施了3次清洗操作。在減壓下餾去乙醚，由此得到了粗產(chǎn)物6.9mg。
＜疏水性肽的獲得(可溶部位的除去)＞
用磷酸緩沖液(ph7.2)1ml對上一工序中得到的切斷接頭后的疏水性肽進(jìn)行2次清洗，進(jìn)一步用水1ml清洗2次。對殘渣進(jìn)行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了疏水性肽ac-cys-glu-trp-asn-ser-ala-his-phe-ile-ala-tyr-lys(3.0mg)。
對上述疏水性肽實施了maldi-tofms分析。結(jié)果是測定值為1510.951(計算值1510.678)。
實施例11
＜帶有載體的粗制肽的制造：tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(gravy得分：1.63)＞
通過使用了自動肽合成儀的fmoc固相合成法，得到了擔(dān)載有由leu-val-phe-phe-ala-glu(tbu)-asp(tbu)-val-gly-ser(tbu)-asn(trt)-lys(boc)-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val構(gòu)成的24殘基肽的固相樹脂(tentagel樹脂)。
＜接頭鍵合工序(向tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv連接活性化碳酸酯型接頭(3e))＞
將溶解于dmf(1.5ml)的活性化碳酸酯型接頭(3e)(55mg、0.068mmol)與tentagel樹脂擔(dān)載24殘基疏水性肽lvffaedvgsnkgaiiglmvggvv(0.15mmol/g、300mg、0.045mmol)混合，并在25℃下振蕩2小時。接著，進(jìn)行過濾，用dmf(10ml)和二氯甲烷(10ml)對得到的帶有載體的接頭鍵合體進(jìn)行清洗，由此得到了連接有活性化碳酸酯型接頭(3e)的帶有載體的接頭鍵合體。
＜親水性單元鍵合工序＞
向帶有載體的接頭鍵合體加入20％哌啶的dmf溶液(2ml)，振蕩20分鐘，進(jìn)行了fmoc的脫保護(hù)?？傆嬤M(jìn)行了4次該哌啶處理操作。在用dmf的清洗后，通過與實施例1相同的fmoc固相合成法重復(fù)了fmoc基的脫保護(hù)和fmoc氨基酸的偶聯(lián)。由此，在接頭分子上連接了依次由(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)、(fmoc)lys(boc)構(gòu)成的3殘基肽鏈。
＜載體切除工序＞
向充分干燥后的帶有載體的親水化肽體(44mg、0.00410mmol)加入tfa︰苯酚︰水︰茴香硫醚︰3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇＝80︰8︰5︰5︰2(容積比、1ml)的混合溶液，并振蕩2小時。濾去載體，用tfa清洗了固體。將濾液與清洗液混合，并加入己烷(5ml)，劇烈振蕩，然后靜置，使其分離為兩相。除去己烷層(上層)，向殘留的tfa層加入乙醚(5ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，進(jìn)一步用乙醚對固體清洗了3次。在減壓下餾去乙醚，得到了無載體的親水化肽體的粗產(chǎn)物8.2mg。
＜色譜純化工序＞
色譜純化工序用與實施例1相同的方法進(jìn)行即可。
maldi-tofms：(m+h+)m/z＝3014.550(計算值3014.638)
＜接頭切除工序(利用酸性條件進(jìn)行的接頭的切斷)＞
向無載體的親水化肽體(5mg)加入由tfa︰茴香硫醚︰tmsotf＝68︰12︰20(容積比)構(gòu)成的混合溶液1.0ml，并在0℃下攪拌4小時。向tfa層加入乙醚(4ml)時，析出了固體。在離心分離后除去上清液，用乙醚進(jìn)一步對固體實施了3次清洗操作。在減壓下餾去乙醚，由此得到了粗產(chǎn)物7.0mg。
＜疏水性肽的獲得(可溶部位的除去)＞
用磷酸緩沖液(ph7.2)1ml對上一工序中得到的切斷接頭后的疏水性肽進(jìn)行2次清洗，進(jìn)一步用水1ml清洗2次。對殘渣進(jìn)行真空干燥，由此，以白色粉末的形式得到了13.0mg疏水性肽leu-val-phe-phe-ala-glu-asp-val-gly-ser-asn-lys-gly-ala-ile-ile-gly-leu-met-val-gly-gly-val-val。
對上述疏水性肽實施了maldi-tofms分析。結(jié)果是測定值為2396.099(計算值2392.287)。
序列表
<110>株式會社鐘化(kanekacorporation)
阿納斯派克股份有限公司(anaspec,inc.)
<120>疏水性肽的制造方法
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