提取分化細(xì)胞的方法與流程

文檔序號：11632878閱讀：583來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及使用在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna作為指示劑提取分化細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞療法已經(jīng)受到關(guān)注，在細(xì)胞療法中，多能干細(xì)胞如ips細(xì)胞或es細(xì)胞被誘導(dǎo)以分化成期望的細(xì)胞，然后將分化細(xì)胞施用到體內(nèi)。然而，即使在分化誘導(dǎo)完成后，未分化細(xì)胞仍可能殘留，因此已經(jīng)有人指出，如果施用包含這種未分化細(xì)胞的細(xì)胞群，則會導(dǎo)致癌變(非專利文獻(xiàn)1)。

因此，已經(jīng)研究了使用在多能干細(xì)胞中高度表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)記物作為指示劑來去除這種殘留的未分化細(xì)胞的方法。然而，在多能干細(xì)胞中高度表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)記物在分化的細(xì)胞中不表達(dá)的情況并不總是發(fā)生。即使在多能干細(xì)胞中高度表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)記物為陰性的細(xì)胞被提取，也存在未分化細(xì)胞不能被完全去除的情況。此外，這種細(xì)胞表面標(biāo)記物的類型有限，并且難以找到更特異的標(biāo)記物。

引用文獻(xiàn)列表

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：miurak，等人，natbiotechnol.200927：743-745

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

期望開發(fā)出一種在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化后從包含未分化細(xì)胞的細(xì)胞群中提取分化細(xì)胞的方法。

用于解決問題的方案

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna，并且通過使用mrna可以僅提取分化細(xì)胞，其中標(biāo)記基因的表達(dá)被mirna的表達(dá)抑制，從而完成本發(fā)明。

具體地，本發(fā)明具有以下特征：

[1]一種用于在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化后從細(xì)胞群中提取分化細(xì)胞的方法，包括以下步驟：(1)將包含與在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna的靶序列可操作地連接的標(biāo)記基因的mrna引入到細(xì)胞群中的步驟；和(2)提取標(biāo)記基因已經(jīng)被翻譯的細(xì)胞的步驟。

[2]根據(jù)[1]所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是人類多能干細(xì)胞。

[3]根據(jù)[2]所述的方法，其中在所述人類多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的所述mirna是hsa-mir-302b、hsa-mir-302a或hsa-mir-367。

[4]根據(jù)[1]～[3]中任一項所述的方法，其中使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行所述提取步驟。

[5]一種分化細(xì)胞提取試劑盒，其包括含有與在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna的靶序列可操作地連接的標(biāo)記基因的mrna。

[6]根據(jù)[5]所述的試劑盒，其中所述多能干細(xì)胞是人類多能干細(xì)胞。

[7]根據(jù)[6]所述的試劑盒，其中在所述人類多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的所述mirna是hsa-mir-302b、hsa-mir-302a或hsa-mir-367。

發(fā)明的有益效果

根據(jù)本發(fā)明，通過利用具有與對多能干細(xì)胞特異的mirna可操作地連接的標(biāo)記基因的mrna，可以選擇性提取分化細(xì)胞。由于根據(jù)本發(fā)明的方法可以通過選擇標(biāo)記物已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃缘募?xì)胞來實現(xiàn)，所以本方法的特別有利之處在于其不受mrna的引入效率的影響。另外，本發(fā)明的方法可以通過將mrna引入細(xì)胞中來進(jìn)行，該mrna在約1天的半壽期(half-life)內(nèi)分解，然后迅速從細(xì)胞中排出。因此，本方法不會引起問題，如由于細(xì)胞中的病毒感染或dna的殘留而對基因組造成的損害。此外，本方法的優(yōu)點還在于，其可以通過使用細(xì)胞儀的簡單檢測方法或通過引入抗藥性基因的藥物選擇來選擇分化細(xì)胞。

附圖說明

圖1示出通過將egfp、1×t302b-egfp和egfp-4×t302b引入ips細(xì)胞中，然后在以不同濃度添加了mirvanamirna抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述ips細(xì)胞，然后測量所培養(yǎng)的ips細(xì)胞中egfp的熒光強(qiáng)度而獲得的結(jié)果。在該圖中，誤差條表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)。

圖2示出通過測量ips細(xì)胞中egfp的熒光強(qiáng)度相對mcherry的熒光強(qiáng)度而獲得的結(jié)果，所述ips細(xì)胞中已經(jīng)共同引入了mcherry和egfp或mcherry和1×t302b-egfp，并且所述ips細(xì)胞已經(jīng)培養(yǎng)在已經(jīng)以不同濃度添加了mirvanamirna抑制劑的培養(yǎng)基中。在該圖中，誤差條表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)。

圖3示出通過流式細(xì)胞術(shù)測量在視黃酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且未引入或已引入1×t302b-egfp的ips細(xì)胞中egfp的熒光強(qiáng)度的結(jié)果(上部視圖)，通過流式細(xì)胞術(shù)測量ips細(xì)胞中或在視黃酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ips細(xì)胞中的tra-1-60的表達(dá)水平的結(jié)果(中間視圖)以及通過流式細(xì)胞術(shù)測量ips細(xì)胞中或在視黃酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ips細(xì)胞中的ssea5的表達(dá)水平的結(jié)果(下部視圖)。該圖中所示的數(shù)字表示所描述部分中相對于全部細(xì)胞的含量比。

圖4示出在視黃酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)后引入了1×t302b-egfp的ips細(xì)胞中的egfp陽性細(xì)胞(+)或egfp陰性細(xì)胞(-)中oct3/4的表達(dá)水平(左視圖)，在視黃酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ips細(xì)胞中tra-1-60陰性細(xì)胞(-)或tra-1-60陽性細(xì)胞(+)中oct3/4的表達(dá)水平(中間視圖)以及在視黃酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ips細(xì)胞中的ssea5陰性細(xì)胞(-)或ssea5陽性細(xì)胞(+)中oct3/4的表達(dá)水平(右視圖)。

圖5示出通過在視黃酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)ips細(xì)胞后將1×t302b-egfp引入所培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后將所得到的細(xì)胞中的egfp陽性細(xì)胞或tra-1-60陰性細(xì)胞在mtesr1中(上圖)或視黃酸培養(yǎng)基(下圖)中培養(yǎng)5天而獲得的細(xì)胞的堿性磷酸酶染色圖像。

圖6a示出通過流式細(xì)胞術(shù)測量在視黃酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且引入了1×t302b-egfp的ips細(xì)胞中egfp的表達(dá)水平而獲得的結(jié)果。圖6b示出通過在視黃酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)ips細(xì)胞，然后將1×t302b-egfp引入所培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后將所獲得的細(xì)胞中的上(top)10％egfp陽性細(xì)胞或上20％egfp陽性的細(xì)胞在mtesr1(上圖)或視黃酸培養(yǎng)基(下圖)中培養(yǎng)5天而獲得的細(xì)胞的堿性磷酸酶染色圖像。

圖7a是示出通過將ctrl-hmag1、302a-5p-hmag1或367-3p-hmag1共同引入無飼養(yǎng)層的人類ips細(xì)胞系(201b7、1231a3和1383d7)和hela細(xì)胞后使用bdfacsaria-ii分析hmag1的翻譯而獲得的結(jié)果的描點圖。圖7b是示出302a-5p響應(yīng)性(responsive)mrna和367-3p響應(yīng)性mrna的翻譯在人類ips細(xì)胞中被特異性抑制并且在hela細(xì)胞(右端條)恒定的視圖。圖7c是示出在將302a-5p響應(yīng)性mrna和添加量已經(jīng)改變的302a-5p抑制劑共同引入ff-201b7后，hmag1的熒光強(qiáng)度與tagbfp的熒光強(qiáng)度的比率的圖(左視圖)和來自0.003nm抑制劑濃度的青色、橙色、綠色、藍(lán)色和紅色的描點圖(從圖的下側(cè)到上側(cè))(右視圖)。圖7d是示出在將302a-5p響應(yīng)性mrna和添加量已改變的302a-5p模擬物共同引入hela細(xì)胞后，hmag1的熒光強(qiáng)度與tagbfp的熒光強(qiáng)度的比率的圖(左視圖)和來自0.003nm模擬物濃度的橙色、青色、紫色、藍(lán)色和紅色的描點圖(從圖的上側(cè)到下側(cè))(右視圖)。誤差條表示試驗重復(fù)三次時的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

圖8是示出通過使用302a-5p響應(yīng)性mrna和367-3p響應(yīng)性mrna追蹤ff-人類ips細(xì)胞分化成中腦多巴胺能細(xì)胞而得到的結(jié)果的視圖。圖8a從左依次示出引入了302a-5p響應(yīng)性mrna的ff-201b7細(xì)胞在第0天，第5天，第7天和第14天時的代表性描點圖。在第0天，藍(lán)色描點圖(該圖表中的下部點集)示出由302a-5p響應(yīng)性mrna導(dǎo)致的高翻譯抑制，并且發(fā)現(xiàn)隨著分化進(jìn)行，點集的重疊增加，因此翻譯抑制作用降低。圖8b示出在ff人類ips細(xì)胞分化期間302a-5p響應(yīng)性細(xì)胞或367-3p響應(yīng)性細(xì)胞的分布(藍(lán)色區(qū)域)和302a-5p-非響應(yīng)性細(xì)胞或367-3p-非響應(yīng)性細(xì)胞的分布(紅色區(qū)域)。圖8c示出在分化過程中發(fā)生的響應(yīng)于302a-5p響應(yīng)性mrna的細(xì)胞百分比隨時間推移的變化(左視圖)和分化過程中發(fā)生的響應(yīng)于367-3p響應(yīng)性mrna的細(xì)胞百分比隨時間推移的變化(右視圖)。誤差條表示試驗重復(fù)三次時的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

圖9是示出從第0天至第21天人類ips細(xì)胞分化成mda細(xì)胞(中腦多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞)、hela細(xì)胞和肝細(xì)胞期間個體細(xì)胞中hsa-mir-302a-5p的表達(dá)水平(圖9a)和hsa-mir-367-3的表達(dá)水平(圖9b)之間的比率的圖，其中該比率已經(jīng)用rnu6b歸一化，然后以log10標(biāo)度示出。hela細(xì)胞和肝細(xì)胞二者都被用作陰性對照，其中幾乎沒有mirna被表達(dá)，并且該圖示出隨著從人類ips細(xì)胞已向mda分化的進(jìn)展，hsa-mir-302a-5p和hsa-mir-367-3二者的表達(dá)水平已下調(diào)。誤差條表示試驗重復(fù)三次時的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

圖10是示出通過將ff-人類ips細(xì)胞添加到完全分化的mda細(xì)胞系而獲得的細(xì)胞能夠以高靈敏度檢測到的視圖。將至少100個ff-201b7人類ips細(xì)胞添加到24孔板中的mda細(xì)胞中。總細(xì)胞量被設(shè)定為200000。將tagbfp和hmag1mrna或302a-5p-hmag1mrna引入到這些細(xì)胞中。當(dāng)302a-5p響應(yīng)性mrna只被引入到mda細(xì)胞中時，建立302pos(mir-302a-5p陽性)閘門(重復(fù)1)和p5閘門(重復(fù)2)。結(jié)果，確認(rèn)沒有mir-302a-5p陽性細(xì)胞(左側(cè)圖中的描點圖)。在重復(fù)1和重復(fù)2二者的情況下，由302a-5p響應(yīng)性mrna鑒定的人類ips細(xì)胞與mda細(xì)胞的比率的測量值非常接近估計值。

圖11a示出通過添加嘌呤霉素去除殘留的ips細(xì)胞的方案。圖11b示出單個培養(yǎng)系統(tǒng)的實驗時間軸(上視圖)和細(xì)胞毒性測定的結(jié)果(下視圖，圖)。左側(cè)兩個圖示出通過將purormrna(ctrl-puror)或302a-5p響應(yīng)性purormrna(302-puror)引入ff-201b7人類ips細(xì)胞后通過添加嘌呤霉素進(jìn)行細(xì)胞毒性測定而獲得的結(jié)果，右側(cè)兩個圖示出組通過將purormrna(ctrl-puror)或302a-5p響應(yīng)性purormrna(302-puror)引入到從ff-201b7人類ips細(xì)胞誘導(dǎo)的mda細(xì)胞中后通過添加嘌呤霉素進(jìn)行細(xì)胞毒性測定而獲得的結(jié)果。圖11c示出：通過將purormrna(ctrl-puror)或302a-5p響應(yīng)性purormrna引入到人類ips細(xì)胞(左上圖)，人類ips細(xì)胞與mda細(xì)胞的混合細(xì)胞(中上圖)和mda細(xì)胞(右上圖)，然后向這些細(xì)胞中添加嘌呤霉素，然后用alexa-488綴合的抗人類tra-1-60抗體(bdlaboratories)將這些細(xì)胞染色，然后用bdaccuri測量細(xì)胞而獲得的結(jié)果；以及示出在不同條件下tra-1-60陽性細(xì)胞的絕對數(shù)目的柱狀圖(下圖)。

具體實施方式

在下文中，將通過以下實施例詳細(xì)描述本發(fā)明。然而，這些實施例不旨在限制本發(fā)明的范圍。

根據(jù)一個實施例，本發(fā)明涉及一種用于在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化后從可能存在未分化細(xì)胞的細(xì)胞群中提取分化細(xì)胞的方法，其中該方法包括以下步驟：(1)將包含與在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna的靶序列可操作地連接的標(biāo)記基因的mrna引入到細(xì)胞群中的步驟；和(2)提取標(biāo)記基因已經(jīng)被翻譯的細(xì)胞的步驟。

在本發(fā)明中，多能干細(xì)胞是指具有多能性并且還具有增殖能力的干細(xì)胞，細(xì)胞能夠通過這種多能性分化為存在于活體內(nèi)的所有細(xì)胞。這種多能干細(xì)胞的例子包括胚胎干(es)細(xì)胞(j.a.thomson等人(1998)，science282：1145-1147；j.a.thomson等人(1995)，proc.natl.acad.sci.usa，92：7844-7848；j.a.thomson等人(1996)，biol.reprod.，55：254-259；j.a.thomson和v.s.marshall(1998)，curr.top.dev.biol.，38：133-165)、從通過核移植(ntes)獲得的克隆胚胎衍生出的胚胎干細(xì)胞(t.wakayama等人(2001)，science，292：740-743；s.wakayama等人(2005)，biol.reprod.，72：932-936；j.byrne等人(2007)，nature，450：497-502)、精原干細(xì)胞(“gs細(xì)胞”)(m.kanatsu-shinohara等人(2003)biol.reprod.，69：612-616；k.shinohara等人(2004)，cell，119：1001-1012)、胚胎生殖細(xì)胞(“eg細(xì)胞”)(y.matsui等人(1992)，cell，70：841-847；j.l.resnick等人(1992)，nature，359：550-551)、誘導(dǎo)的多能性干(inducedpluripotentstem，ips)細(xì)胞(k.takahashi和s.yamanaka(2006)cell，126：663-676；k.takahashi等人(2007)，cell，131：861-872；j.yu等人(2007)，science，318：1917-1920；nakagawa，m.等人，nat.biotechnol.26：101-106(2008)；wo2007/069666)、培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞衍生的多能細(xì)胞(muse細(xì)胞)(wo2011/007900)。更優(yōu)選地，該多能干細(xì)胞是人類多能干細(xì)胞。

在本發(fā)明中，分化的誘導(dǎo)不僅意味著將細(xì)胞分化成特異性組織細(xì)胞或其祖細(xì)胞，而且還意味著將細(xì)胞分化成包含諸如內(nèi)胚層細(xì)胞、中胚層細(xì)胞和外胚層細(xì)胞的許多類型細(xì)胞的細(xì)胞群。另外，作為本發(fā)明的目標(biāo)的組織的例子包括但不限于皮膚、血管、角膜、腎、心臟、肝臟、臍帶、腸、神經(jīng)、肺、胎盤、胰腺、腦、軟骨、四肢和視網(wǎng)膜。對于該分化誘導(dǎo)方法，可以應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，并且該方法沒有特別限制。關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，可參考日本特開2002-291469號公報，關(guān)于胰臟干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，可參照日本特開2004-121165號公報，關(guān)于造血細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，可參考pct國際申請2003-505006的日譯文等。除此之外，在pct國際申請2003-523766號的日譯文中描述了涉及形成類胚體的分化誘導(dǎo)方法的例子。

在本說明書中，多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群是指在對上述多能干細(xì)胞進(jìn)行了誘導(dǎo)分化方法后獲得的細(xì)胞群。可能存在誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞群包括未分化細(xì)胞的情況。即使不知道該細(xì)胞群是否包括未分化細(xì)胞，也可以應(yīng)用本發(fā)明的方法。優(yōu)選地，多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群是在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化后其中也存在未分化細(xì)胞的細(xì)胞群。

在本發(fā)明中，mirna也稱為“微rna”，并且是指存在于細(xì)胞內(nèi)的長度為18～25個左右的核苷酸的rna。mirna是指通過用dicer裂解pre-mirna產(chǎn)生的雙鏈rna的任一條鏈，pre-mirna是通過用稱為drosha的核內(nèi)酶部分地裂解從dna轉(zhuǎn)錄成為單鏈rna的pri-mrna而產(chǎn)生的。mirna中的核苷酸的數(shù)目例如為18～25個，優(yōu)選為20～25個，更優(yōu)選為21～23個?？梢岳么鎯τ屑s1000個mirna的信息的數(shù)據(jù)庫(例如，mirbase，http：//microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從該數(shù)據(jù)庫取得任何給定的mirna信息，并且可以容易地提取在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna。例如，通過應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的手段，如mirna微陣列或?qū)崟rpcr，可以在多能干細(xì)胞和多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞之間確認(rèn)mirna表達(dá)的差異。由此，能夠容易地指定在多能干細(xì)胞中的表達(dá)水平高于在分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞中的表達(dá)水平的mirna為在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna。應(yīng)當(dāng)注意，在多能干細(xì)胞中表達(dá)的mirna是指處于如下狀態(tài)mirna，在該狀態(tài)中，用dicer裂解的上述雙鏈rna的任一條鏈與多個預(yù)定蛋白相互作用，以在多能干細(xì)胞中形成rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(rna-inducedsilencingcomplex，risc)。

在本發(fā)明中，在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna沒有特別限制，只要它是根據(jù)出版物等已知的在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna即可。這種mirna的例子包括從hsa-mir-302a、hsa-mir-302b、hsa-mir-302c、hsa-mir-302d、hsa-mir-367、hsa-5201、hsa-mir-92b、hsa-mir-106a、hsa-mir-18b、hsa-mir-20b、hsa-mir-19b-2、hsa-mir-92a-2、hsa-mir-363、hsa-mir-20a、hsa-17、hsa-mir-18a、hsa-mir-19a、hsa-mir-19b-1、hsa-mir-373、hsa-mir-330、hsa-mir-520c、hsa-mir-182、hsa-183、hsa-mir-96、hsa-mir-92a-1、hsa-mir-92a-2、hsa-mir-141、hsa-mir-200c、hsa-mir-27a、hsa-mir-7-1、hsa-mir-7-2、hsa-mir-7-3、hsa-mir-374a、hsa-mir-106b、hsa-mir-93、hsa-mir-25、hsa-mir-584、hsa-374b、hsa-mir-21、hsa-mir-212、hsa-mir-371a、hsa-mir-371b、hsa-mir-372、hsa-mir-200b、hsa-mir-200a和hsa-mir-429中選擇的任一條鏈。除了這些例子以外，還可以使用從在tobiass.greve，等人，annu.rev.celldev.biol.2013.29：213-239中描述的mirna中適當(dāng)?shù)剡x擇的mirna。mirna的優(yōu)選例子包括hsa-mir-302a、hsa-mir-302b和hsa-mir-367，更優(yōu)選的例子包括hsa-mir-302b-3p、hsa-mir-302a-5p和hsa-mir-367-3p。

在本發(fā)明中，在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna的靶序列是指能夠與所述mirna特異性結(jié)合的序列。mirna靶序列優(yōu)選是與例如在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna互補(bǔ)的序列。或者，只要mirna靶序列可被mirna識別，它可具有與完全互補(bǔ)序列的錯配。與完全互補(bǔ)于mirna的序列的錯配通?？梢允强杀黄谕?xì)胞中的mirna識別的錯配。并且對于活體中的細(xì)胞的原始功能，可能存在約40％至50％的錯配。這種錯配沒有特別限制，例如它可以是1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸或整個識別序列的1％、5％、10％、20％、30％或40％的錯配。另外，特別地，靶序列可以包含大量的與包含在細(xì)胞中的mrna的mirna靶序列的錯配，特別是在種子(seed)區(qū)域以外的部分中，即，與mirna的3'末端側(cè)的約16個核苷酸相對應(yīng)的靶序列中的5'末端側(cè)的區(qū)域中。該種子區(qū)域可以不包括這樣的錯配，或者可以包括1個核苷酸、2個核苷酸或3個核苷酸的錯配。

標(biāo)記基因是編碼任何給定標(biāo)記蛋白的rna序列，其在細(xì)胞中被翻譯，用作標(biāo)記物，并且使得能夠提取分化的細(xì)胞，并且該標(biāo)記基因也可以被稱為對應(yīng)于標(biāo)記蛋白的序列。在細(xì)胞中被翻譯并且能夠用作標(biāo)記物的蛋白的例子可以包括但不限于熒光蛋白、光蛋白、有色蛋白、能夠被可視化并且能夠通過支持熒光、發(fā)光或顯色而被量化的蛋白、膜定位的蛋白和抗藥性蛋白。

熒光蛋白的例子包括：藍(lán)色熒光蛋白，如sirius或ebfp；青色熒光蛋白，如mturquoise、tagcfp、amcyan、mtfp1、midorishicyan或cfp；綠色熒光蛋白，如turbogfp、acgfp、taggfp、azami-green(例如hmag1)、zsgreen，emgfp、egfp、gfp2或hyper；黃色熒光蛋白，如tagyfp、eyfp、venus、yfp、phiyfp、phiyfp-m、turboyfp、zsyellow或mbanana；橙色熒光蛋白，如kusabiraorange(例如hmko2)或morange；紅色熒光蛋白，如turborfp、dsred-express、dsred2、tagrfp、dsred-monomer、asred2或mstrawberry；和近紅外熒光蛋白，如turbofp602、mrfp1、jred、killerred、mcherry、hcred、keimared(例如hdkeimared)、mrasberry或mplum，但熒光蛋白的例子不限于此。

發(fā)光蛋白的例子是水母發(fā)光蛋白，但例子不限于此。另外，支持熒光，發(fā)光或顯色的蛋白的例子包括分解熒光、發(fā)光或顯色前體的酶，如熒光素酶、磷酸酶、過氧化物酶或β內(nèi)酰胺酶，但是該蛋白的例子不限于此。在本發(fā)明中，當(dāng)使用支持熒光、發(fā)光或顯色的物質(zhì)作為標(biāo)記物時，可以通過使細(xì)胞與相應(yīng)的前體接觸或通過將這樣的相應(yīng)前體引入細(xì)胞來進(jìn)行分化細(xì)胞的提取。

膜定位蛋白沒有特別限制，只要它是不在多能干細(xì)胞中內(nèi)源表達(dá)的膜定位蛋白即可。這種膜定位蛋白的例子包括p-gp、mrp1、mrp2(cmoat)、mrp3、mrp4、mrp5、mrp6、mdr2和mdr3蛋白。在本發(fā)明中，由于使用從引入的mrna翻譯的膜定位蛋白作為指示劑，所以不在目標(biāo)分化細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)的膜定位蛋白是更優(yōu)選的。耐藥性蛋白質(zhì)的例子包括抗生素抗性蛋白，如抗卡那霉素蛋白、抗氨芐青霉素蛋白、抗嘌呤霉素蛋白、抗殺稻瘟菌素蛋白、抗慶大霉素蛋白、抗卡那霉素蛋白、抗四環(huán)素蛋白和抗氯霉素蛋白，但例子不限于此。

通過本發(fā)明的方法用于引入到細(xì)胞群中的mrna包括與在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的mirna的靶序列可操作地連接的標(biāo)記基因。在本發(fā)明的解釋中，這種mrna也稱為“mirna響應(yīng)性報告mrna”。在本發(fā)明中，短語“標(biāo)記基因與mirna的靶序列可操作地連接”是指至少一個mirna靶序列包括在編碼標(biāo)記基因的開放閱讀框的5'utr和3'utr中(包括起始密碼子)，和/或在該開放閱讀框中。mrna在從5'末端到3'末端的方向上優(yōu)選包括cap結(jié)構(gòu)(7-甲基鳥苷5'-磷酸)、編碼標(biāo)記基因的開放閱讀框和poly(a)尾，并且還包括在5'utr中，在3'utr中和/或在開放閱讀框中的至少一個mirna靶序列。mirna靶序列在mrna中的位置可以在5'utr中或在3'utr中，或者也可以在開放閱讀框中(在起始密碼子的3'-末端側(cè))。另外，mrna可以包括所有這些位置中的mirna靶序列。因此，mirna靶序列的數(shù)目可以是1、2、3、4、5、6、7、8或更多。

優(yōu)選地，一個mirna靶序列存在于5'utr中。這是因為它可以實現(xiàn)有效的轉(zhuǎn)移抑制。此時，cap結(jié)構(gòu)和mirna靶序列之間的核苷酸數(shù)目和核苷酸類型可以自由確定，只要它們不包含作為起始密碼子的aug并且不構(gòu)成莖(stem)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)即可。例如，可以設(shè)計cap結(jié)構(gòu)和mirna靶序列，使得cap結(jié)構(gòu)和mirna靶序列之間的核苷酸數(shù)目可以是0至50個核苷酸，優(yōu)選10至30個核苷酸。此外，mirna靶序列和起始密碼子之間的核苷酸數(shù)目和核苷酸類型可以自由確定，只要它們不構(gòu)成莖結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)即可?？梢栽O(shè)計mirna靶序列和起始密碼子，使得mirna靶序列和起始密碼子之間的核苷酸數(shù)目為0至50個核苷酸，優(yōu)選10至30個核苷酸。已經(jīng)證實，即使四種mirna靶序列存在于3'utr中，也可以實現(xiàn)翻譯抑制。

mirna響應(yīng)性報告mrna優(yōu)選包括修飾的核苷酸，如假尿苷和5-甲基胞苷，而不是普通的尿苷和胞苷。這是因為細(xì)胞毒性降低。在尿苷和胞苷的兩種情況下，這種修飾的核苷酸可以獨立地或作為mrna的整體或一部分被定位。在包括為一部分的情況下，所述核苷酸能夠以任何給定的比例隨機(jī)定位。

在如上所述確定mirna響應(yīng)性報告mrna的序列后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)任何給定的已知遺傳工程方法合成mirna響應(yīng)性報告mrna。具體地，可以根據(jù)體外合成方法，使用包含啟動子序列作為模板的模板dna，獲得mirna響應(yīng)性報告mrna。

在本發(fā)明的一個實施例中，存在僅使用一種類型的mirna響應(yīng)性報告mrna的情況，或者還存在使用兩種或更多種類型，例如三種類型、四種類型、五種類型、六種類型、七種類型或八種類型或更多種mirna響應(yīng)性報告mrna的情況。當(dāng)使用在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的兩種或更多種類型的不同mirna作為指示劑提取分化細(xì)胞時，優(yōu)選使用對應(yīng)于這兩種或更多種類型的mirna的兩種或更多種類型的mirna響應(yīng)性報告mrna。例如，在使用兩種或更多種類型的mirna響應(yīng)性報告mrna的情況下，就mirna靶序列和標(biāo)記基因而言，期望mirna響應(yīng)性報告mrna彼此不同。此外，在使用兩種或更多種類型的mirna響應(yīng)性報告mrna的情況下，包括在mirna響應(yīng)性報告mrna中的mirna靶序列的數(shù)目、mirna靶序列距5'-末端的距離以及mirna響應(yīng)性報告mrna的其他結(jié)構(gòu)特征可能在各個mirna響應(yīng)性報告mrna之間不同。

在本發(fā)明的一個實施例中，在將mirna響應(yīng)性報告mrna引入細(xì)胞群的步驟(以下稱為“引入步驟”)中，通過應(yīng)用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體法、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀法、deae葡聚糖法、微注射法、基因槍法等，將一種或多種類型的mirna響應(yīng)性報告mrna直接引入包括在細(xì)胞群中的細(xì)胞中。在引入兩種或更多種不同類型的mirna響應(yīng)性報告mrna的情況下，優(yōu)選將多個mrna共同引入細(xì)胞群中。這是因為從由此共同引入的兩種或更多種mrna表達(dá)的標(biāo)記蛋白的活性的比率在細(xì)胞群中是恒定的。此時，引入的mirna響應(yīng)性報告mrna的量可以根據(jù)要引入mrna的細(xì)胞群的類型、引入的mrna的類型、引入mrna的方法和引入試劑的類型而不同。為了實現(xiàn)期望的翻譯水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)剡x擇這些條件。

在本發(fā)明的一個實施例中，當(dāng)本發(fā)明的mirna響應(yīng)性報告mrna在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化后被引入包含未分化細(xì)胞的細(xì)胞群中時，由于某些mirna在分化細(xì)胞中不以risc的形式存在，所以由mirna響應(yīng)性報告mrna編碼的標(biāo)記基因的翻譯水平不被抑制。也就是說，僅在分化的細(xì)胞中進(jìn)行標(biāo)記基因的翻譯。因此，在本發(fā)明的一個實施例中，通過提取其中標(biāo)記基因已被翻譯的細(xì)胞，可以在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化后，從還包含未分化細(xì)胞的細(xì)胞群中選擇性地只提取分化的細(xì)胞。

進(jìn)行提取其中標(biāo)記基因已被翻譯的細(xì)胞的步驟(以下稱為“提取步驟”)。在提取步驟中，提取其中標(biāo)記基因已被翻譯并且標(biāo)記蛋白的表達(dá)已被證實的上述細(xì)胞作為分化細(xì)胞。也就是說，可以通過將其中已經(jīng)引入包含與mirna的靶序列可操作地連接的標(biāo)記基因的mrna的細(xì)胞群與其中未引入包含與mirna的靶序列可操作地連接的標(biāo)記基因的這種mrna的細(xì)胞群進(jìn)行比較，然后從其中引入了包含與mirna的靶序列可操作地連接的標(biāo)記基因的mrna的細(xì)胞群中提取其中標(biāo)記蛋白已被表達(dá)的細(xì)胞來執(zhí)行該提取步驟。

具體地，可以通過使用某種檢測設(shè)備檢測來自標(biāo)記蛋白的信號來進(jìn)行提取步驟。為了檢測來自標(biāo)記蛋白的信號，可以將信號數(shù)字化和量化，或者可以僅檢測信號的存在或不存在。檢測設(shè)備的例子包括流式細(xì)胞儀、成像細(xì)胞計數(shù)器、熒光顯微鏡、發(fā)光顯微鏡和ccd相機(jī)，但是例子不限于此。作為這樣的檢測設(shè)備，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)標(biāo)記蛋白使用合適的設(shè)備。例如，當(dāng)標(biāo)記蛋白是熒光蛋白或發(fā)光蛋白時，可以使用諸如流式細(xì)胞儀、成像細(xì)胞計數(shù)器、熒光顯微鏡或ccd照相機(jī)等檢測設(shè)備來確認(rèn)標(biāo)記蛋白的表達(dá)的存在或不存在和/或量化標(biāo)記蛋白。當(dāng)標(biāo)記蛋白是支持熒光、發(fā)光或顯色的蛋白時，可以使用諸如發(fā)光顯微鏡、ccd照相機(jī)或發(fā)光計等檢測設(shè)備來確認(rèn)標(biāo)記蛋白的表達(dá)的存在或不存在或量化標(biāo)記蛋白。當(dāng)標(biāo)記蛋白是膜定位蛋白時，可以使用對細(xì)胞表面蛋白具有特異性的檢測試劑，如抗體，和上述檢測設(shè)備來確認(rèn)標(biāo)記蛋白的表達(dá)的存在或不存在和/或量化標(biāo)記蛋白。此外，還可以應(yīng)用分離細(xì)胞而不進(jìn)行量化標(biāo)記蛋白的工藝的方法，例如磁性細(xì)胞分離裝置(macs)。當(dāng)標(biāo)記蛋白是抗藥性蛋白時，可以應(yīng)用包括通過施用藥物來檢測標(biāo)記蛋白的表達(dá)，然后分離活細(xì)胞的方法。

在應(yīng)用本發(fā)明的方法之前，還可以進(jìn)行將對照mrna以及mirna響應(yīng)性報告mrna共同引入未分化細(xì)胞和/或分化細(xì)胞，然后確認(rèn)細(xì)胞中mirna響應(yīng)性報告mrna的翻譯效率的任選步驟。通過確認(rèn)和計算翻譯效率，可以比較研究是否mrna已經(jīng)被引入靶細(xì)胞中并且翻譯已經(jīng)被mirna的表達(dá)抑制，或者是否mrna已經(jīng)以低水平引入細(xì)胞中。通過進(jìn)行這樣的比較研究，可以適當(dāng)?shù)剡x擇本發(fā)明中使用的mrna。對照mrna是指不具有mirna靶位點并編碼與由mirna響應(yīng)性報告mrna編碼的標(biāo)記基因不同的標(biāo)記基因的mrna。對照mrna表達(dá)標(biāo)記蛋白，而不管mirna的表達(dá)。這是因為，由于對照mrna不具有mirna靶序列，所以即使將其引入細(xì)胞中，其翻譯也不受mirna的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。

本發(fā)明還涉及一種分化細(xì)胞提取試劑盒，其包括含有與在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)的前述mirna的靶序列可操作地連接的標(biāo)記基因的mrna。本發(fā)明的試劑盒可以進(jìn)一步包括對照mrna。另外，本發(fā)明的試劑盒還可以包括判別分析裝置，例如描述用于提取分化細(xì)胞的步驟的紙張或說明書、用于使計算機(jī)執(zhí)行用于提取分化細(xì)胞的步驟的程序、程序列表、其中記錄有所述程序的計算機(jī)可讀記錄介質(zhì)(例如，軟盤、光盤、cd-rom、cd-r、cd-rw等)以及用于執(zhí)行分化細(xì)胞的提取的裝置或系統(tǒng)(計算機(jī)等)。

[實施例]

在下文中，將在以下例子中更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，這些例子不旨在限制本發(fā)明的范圍。

[實施例1]

[mir-302b響應(yīng)性報告mrna的設(shè)計]

修飾egfpmrna(seqidno:1)，egfpmrna編碼熒光報告基因egfp并且包括α球蛋白的5'非翻譯區(qū)(5'utr)和3'非翻譯區(qū)(3'utr)，并且設(shè)計在5'utr中包含mir-302b的靶序列的1個拷貝的mir-302b響應(yīng)性報告mrna(1×t302b-egfp)(seqidno：2)和在3'utr中包含mir-302b的靶序列的4個拷貝的mir-302b響應(yīng)性報告mrna(egfp-4×t302b)(seqidno：3)的每一個。此外，還設(shè)計了包含被用作對照的α球蛋白的5'utr和3'utr的mcherrymrna(seqidno：4)。這些基因序列如下所示。

egfp-mrna的基因序列(seqidno：1)

gggcgaauuaagagagaaaagaagaguaagaagaaauauaagacaccggucgccaccaugggauccgugagcaagggcgaggagcuguucaccgggguggugcccauccuggucgagcuggacggcgacguaaacggccacaaguucagcguguccggcgagggcgagggcgaugccaccuacggcaagcugacccugaaguucaucugcaccaccggcaagcugcccgugcccuggcccacccucgugaccacccugaccuacggcgugcagugcuucagccgcuaccccgaccacaugaagcagcacgacuucuucaaguccgccaugcccgaaggcuacguccaggagcgcaccaucuucuucaaggacgacggcaacuacaagacccgcgccgaggugaaguucgagggcgacacccuggugaaccgcaucgagcugaagggcaucgacuucaaggaggacggcaacauccuggggcacaagcuggaguacaacuacaacagccacaacgucuauaucauggccgacaagcagaagaacggcaucaaggugaacuucaagauccgccacaacaucgaggacggcagcgugcagcucgccgaccacuaccagcagaacacccccaucggcgacggccccgugcugcugcccgacaaccacuaccugagcacccaguccgcccugagcaaagaccccaacgagaagcgcgaucacaugguccugcuggaguucgugaccgccgccgggaucacucucggcauggacgagcuguacaagagaucucauaugcaucucgagugauagucuagaccuucugcggggcuugccuucuggccaugcccuucuucucucccuugcaccuguaccucuuggucuuugaauaaagccugaguaggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

加下劃線部分表示5'utr或3'utr。

1×t302b-egfp的基因序列(seqidno:2)

ggucagauccgcuaggaucctactaaaacatggaagcacttacaccggucgccaccaugggauccgugagcaagggcgaggagcuguucaccgggguggugcccauccuggucgagcuggacggcgacguaaacggccacaaguucagcguguccggcgagggcgagggcgaugccaccuacggcaagcugacccugaaguucaucugcaccaccggcaagcugcccgugcccuggcccacccucgugaccacccugaccuacggcgugcagugcuucagccgcuaccccgaccacaugaagcagcacgacuucuucaaguccgccaugcccgaaggcuacguccaggagcgcaccaucuucuucaaggacgacggcaacuacaagacccgcgccgaggugaaguucgagggcgacacccuggugaaccgcaucgagcugaagggcaucgacuucaaggaggacggcaacauccuggggcacaagcuggaguacaacuacaacagccacaacgucuauaucauggccgacaagcagaagaacggcaucaaggugaacuucaagauccgccacaacaucgaggacggcagcgugcagcucgccgaccacuaccagcagaacacccccaucggcgacggccccgugcugcugcccgacaaccacuaccugagcacccaguccgcccugagcaaagaccccaacgagaagcgcgaucacaugguccugcuggaguucgugaccgccgccgggaucacucucggcauggacgagcuguacaagagaucucauaugcaucucgagugauagucuagaccuucugcggggcuugccuucuggccaugcccuucuucucucccuugcaccuguaccucuuggucuuugaauaaagccugaguaggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

加下劃線部分表示5'utr或3'utr，小寫字母表示mir-302b靶序列的1個拷貝。

egfp-4×t302b的基因序列(seqidno:3)

gggcgaauuaagagagaaaagaagaguaagaagaaauauaagacaccggucgccaccaugggauccgugagcaagggcgaggagcuguucaccgggguggugcccauccuggucgagcuggacggcgacguaaacggccacaaguucagcguguccggcgagggcgagggcgaugccaccuacggcaagcugacccugaaguucaucugcaccaccggcaagcugcccgugcccuggcccacccucgugaccacccugaccuacggcgugcagugcuucagccgcuaccccgaccacaugaagcagcacgacuucuucaaguccgccaugcccgaaggcuacguccaggagcgcaccaucuucuucaaggacgacggcaacuacaagacccgcgccgaggugaaguucgagggcgacacccuggugaaccgcaucgagcugaagggcaucgacuucaaggaggacggcaacauccuggggcacaagcuggaguacaacuacaacagccacaacgucuauaucauggccgacaagcagaagaacggcaucaaggugaacuucaagauccgccacaacaucgaggacggcagcgugcagcucgccgaccacuaccagcagaacacccccaucggcgacggccccgugcugcugcccgacaaccacuaccugagcacccaguccgcccugagcaaagaccccaacgagaagcgcgaucacaugguccugcuggaguucgugaccgccgccgggaucacucucggcauggacgagcuguacaagagaucucauaugcaucucgagugauagucuagaccuucugcggggccuacuaaaacauggaagcacuuacuacuaaaacauggaagcacuuacuacuaaaacauggaagcacuuacuacuaaaacauggaagcacuuaugaauaaagccugaguaggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

加下劃線部分表示5'uur或3'utr，小寫字母表示mir-302b靶序列的4個拷貝。

mcherry-mrna的基因序列(seqidno:4)

gggcgaauuaagagagaaaagaagaguaagaagaaauauaagacaccggucgccaccauggugagcaagggcgaggaggauaacauggccaucaucaaggaguucaugcgcuucaaggugcacauggagggcuccgugaacggccacgaguucgagaucgagggcgagggcgagggccgccccuacgagggcacccagaccgccaagcugaaggugaccaaggguggcccccugcccuucgccugggacauccuguccccucaguucauguacggcuccaaggccuacgugaagcaccccgccgacauccccgacuacuugaagcuguccuuccccgagggcuucaagugggagcgcgugaugaacuucgaggacggcggcguggugaccgugacccaggacuccucccugcaggacggcgaguucaucuacaaggugaagcugcgcggcaccaacuuccccuccgacggccccguaaugcagaagaagaccaugggcugggaggccuccuccgagcggauguaccccgaggacggcgcccugaagggcgagaucaagcagaggcugaagcugaaggacggcggccacuacgacgcugaggucaagaccaccuacaaggccaagaagcccgugcagcugcccggcgccuacaacgucaacaucaaguuggacaucaccucccacaacgaggacuacaccaucguggaacaguacgaacgcgccgagggccgccacuccaccggcggcauggacgagcuguacaaguaaaucuagaccuucugcggggcuugccuucuggccaugcccuucuucucucccuugcaccuguaccucuuggucuuugaauaaagccugaguaggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

加下劃線部分表示5'utr或3'utr。

[ivt(體外翻譯)模板dna的構(gòu)建]

通過混合5'utr片段、標(biāo)記基因的orf區(qū)片段和3'utr片段，然后通過pcr(融合pcr)鏈接它們來制備ivt模板dna。這些片段通過pcr擴(kuò)增產(chǎn)生，或作為寡dna購買，然后使用。下文中，描述生產(chǎn)egfpmrna、mcherrymrna、1×t302b-egfp和egfp-4×t302b這四種ivt模板dna的方法的細(xì)節(jié)。

在egfp和mcherry基因orf區(qū)域上進(jìn)行以下pcr擴(kuò)增。使用pctp-egfp(saitoh等人等人，nat.commun.2：1602011)作為模板，用tapegfp_ivtfwd(kec-67)(seqidno：5)和tap_ivtrev((kec-23))(seqidno：6)進(jìn)行pcr擴(kuò)增來制備egfp_orf片段。類似地，使用pcr2.1-mcherry(tanakaa等人，plosone.2013apr23；8(4))：e61540.)作為模板，用mcherry_ivtfwd(kec-888)(seqidno:7)和mcherry_ivtrev(kec-889)(seqidno：8)進(jìn)行pcr擴(kuò)增來制備mcherry_orf片段。

此外，在不含有靶序列的5'utr片段和3'utr片段上進(jìn)行以下pcr擴(kuò)增。使用ivt5primeutr(kec-62)(seqidno：9)作為模板，使用tap_t7_1g(kec-876)(seqidno：10)和rev5utr(kec-1)(seqidno：11)作為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，來制備5'utr片段。使用ivt3primeutr(kec-63)(seqidno：12)作為模板，使用fwd3utr(kec-4)(seqidno：13)和rev3utr2t20(kec-65)(seqidno：14)作為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，來制備3'utr片段。

通過混合上述5'utr片段、3'utr片段和egfp_orf片段或mcherry_orf片段，然后使用tap_t7_1g和3utr120a(kec-308)(seqidno：15)作為引物進(jìn)行融合pcr來產(chǎn)生egfpmrna和mcherrymrna的ivt模板dna。

通過混合5utr-t302b-3p(ktc-004)(seqidno：16)、egfp_orf片段和3'utr片段，然后使用gct7cmv_del4(kec-97)(seqidno：17)和3utr120a作為引物進(jìn)行融合pcr來制備1×t302b-egfp的ivt模板dna。

通過使用tap_t7_1g和3utr120a作為引物，在5'utr片段、egfp_orf片段和3utrtemp_4×t302b-3p(ktc-001)寡dna(seqidno：18)上進(jìn)行融合pcr來制備egfp-4×t302b的ivt模板dna。

可以酌情將上述引物和模板等寡dna的制備委托給其他方，然后使用如此生產(chǎn)的寡dna。其序列示于表1。

使用minelutepcr純化試劑盒(qiagen)按照制造商的說明書純化如上所述通過pcr擴(kuò)增獲得的ivt模板dna。

表1

[mrna的ivt合成]

使用通過修改warrenl.等人，cellstemcell，7(5)：618-30，2010中描述的方法而準(zhǔn)備的方案，通過ivt合成mrna。具體地，使用megascriptt7試劑盒(ambion)從上述ivt模板制備mrna。此時，使用假尿苷-5'-三磷酸和5-甲基胞苷-5'-三磷酸(trilinkbiotechnologies)代替使用尿苷三磷酸和胞苷三磷酸。在反應(yīng)之前，用antireversecapanalog(newenglandbiolabs)將鳥苷-5'-三磷酸稀釋5倍，然后使用。將反應(yīng)混合物在37℃溫育4小時。然后，向所得物中加入turbodnase(ambion)，并將所得混合物在37℃進(jìn)一步溫育30分鐘。使用favorprep血/培養(yǎng)細(xì)胞(blood/culturedcells)總rna提取柱(favorgenbiotech)純化所獲得的mrna，然后使用antarcticphosphatase(newenglandbiolabs)在37℃溫育所得物30分鐘。此后，使用rneasyminielutecleanupkit(qiagen)進(jìn)一步純化反應(yīng)混合物。

[人類ips細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)]

人類ips細(xì)胞(201b7、409b2和427f1)得自京都大學(xué)shinyayamanaka博士。將該人類ips細(xì)胞在含有5ng/ml的bfgf(reprocell)和0.5％青霉素-鏈霉素(invitrogen)的primatees細(xì)胞培養(yǎng)基(reprocell)中的mmc處理的snl飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)。當(dāng)ips細(xì)胞的集落增加到一定程度時，對它們進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)中，除去培養(yǎng)溶液，然后用d-pbs(nacalaitesq)洗滌細(xì)胞，然后將ctk(2型膠原酶(invitrogen)、2.5％胰蛋白酶-edta(nacalaitesq)和ksr(invitrogen))添加到所得細(xì)胞。將該混合物用d-pbs洗滌兩次，然后除去飼養(yǎng)細(xì)胞。將培養(yǎng)液加入去除了飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，使用細(xì)胞刮刀收集ips細(xì)胞。此后，通過吹吸(pipet)解離ips細(xì)胞的集落。將解離的ips細(xì)胞集落在新培養(yǎng)皿中以1:3的比例傳代培養(yǎng)。對于無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，使用matrigel(bd)包被的平板或皿，并且使用mtesr1(stemcelltechnologies)作為培養(yǎng)基。按照制造商的說明書應(yīng)用該培養(yǎng)方法。

[轉(zhuǎn)染mir-302b響應(yīng)性報告mrna]

將人類ips細(xì)胞接種在matrigel(bd)包被的24孔板上。在第二天，按照制造商的說明書，使用1μl的stemfect(stemgent)將200ng的egfpmrna或每個mir-302b響應(yīng)性報告mrna引入ips細(xì)胞。引入完成后，為了檢查mirna的作用，在2pmol、0.5pmol或0pmol的mirvanamirna抑制劑(appliedbiosciences)的存在下培養(yǎng)細(xì)胞。

[使用mir-302b響應(yīng)性報告mrna檢測人類ips細(xì)胞]

將egfpmrna和每個mir-302b響應(yīng)性報告mrna轉(zhuǎn)染到人類ips細(xì)胞中，然后在mirvanamirna抑制劑的存在下培養(yǎng)該混合物。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析反應(yīng)混合物。在1×t302b-egfp和egfp-4×t302b中egfp的熒光水平都根據(jù)mirvanamirna抑制劑的濃度而改變(圖1)。也就是說，這些結(jié)果表明，在具有多能性的人類ips細(xì)胞中高度表達(dá)的mir-302b的活性使1×t302b-egfp和egfp-4×t302b中egfp的翻譯水平降低。因此，結(jié)果證明了通過使用mir-302b響應(yīng)性報告mrna可以特異性識別在誘導(dǎo)分化后包含在細(xì)胞群中的喪失其多能性的細(xì)胞的可能性。

[mir-302b-應(yīng)答報告mrna的翻譯效率]

將mcherrymrna和egfp或1×t302b-egfp共同引入人類ips細(xì)胞(201b7)中，然后在mirvanamirna抑制劑的存在下培養(yǎng)它們。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)測量egfp和mcherry各自的熒光強(qiáng)度，然后計算egfp的熒光強(qiáng)度與mcherry的熒光強(qiáng)度的比率。結(jié)果，確認(rèn)了當(dāng)通過mirvanamirna抑制劑抑制了mirna的活性時，通過egfp中的mcherry的熒光強(qiáng)度校正的egfp的熒光強(qiáng)度和1×t302b-egfp中的egfp的熒光強(qiáng)度彼此為相同水平，但是當(dāng)mirna的活性未被抑制時，1×t302b-egfp中egfp的熒光強(qiáng)度顯著降低(圖2)。由這些結(jié)果可以確認(rèn)，ips細(xì)胞中egfp的熒光強(qiáng)度降低，不是因為1×t302b-egfp的引入效率低，而是因為mirna的活性。即使使用其它ips細(xì)胞系(409b2和427f1)，也獲得了與上述相同的結(jié)果。

[實施例2]

[分化誘導(dǎo)細(xì)胞的分選]

將人類ips細(xì)胞接種在matrigel(bd)包被的10cm培養(yǎng)皿上，然后在視黃酸培養(yǎng)基(含有0.5μm視黃酸(sigma)、10％fbs(gibco)、0.5％青霉素-鏈霉素(invitrogen)、1％glutamax(invitrogen)和1％neaa(invitrogen)的dmem-f12(invitrogen))中培養(yǎng)3天(tangc等人，naturebiotechnology，29(9)：829-34，2011)。培養(yǎng)完成后，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中分離，然后再次接種在含有mtesr1培養(yǎng)基(stemcelltechnologies)或上述相同培養(yǎng)基的matrigel包被的10cm培養(yǎng)皿上。第二天，將1×t302b-egfp轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。按照制造商的說明書，使用24μl的stemfect(stemgent)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時，從培養(yǎng)皿中分離所得的細(xì)胞，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析egfp的熒光強(qiáng)度。此時，也使用抗-tra-1-60抗體(alexa647，bd)或抗-ssea5抗體(8e11，genetex)測量ra處理的細(xì)胞或未ra處理的細(xì)胞，并且還分析了各表面標(biāo)記物。結(jié)果，一些ra處理的細(xì)胞對tra-1-60是陰性的。對于ssea5也獲得與上述相同的結(jié)果(圖3)。另一方面，在已經(jīng)用ra處理并且已經(jīng)引入了1×t302b-egfp的細(xì)胞中，確認(rèn)了一些egfp陽性細(xì)胞。此外，通過量化的pcr測量在egfp陽性或陰性細(xì)胞、tra-1-60陽性或陰性細(xì)胞和ssea5陽性或陰性細(xì)胞每個中oct3/4的表達(dá)水平。結(jié)果，證實當(dāng)與egfp陰性細(xì)胞相比時，egfp陽性細(xì)胞中oct3/4的表達(dá)水平降低(圖4)。因此，表明已經(jīng)引入了1×t302b-egfp并且對egfp呈陽性的細(xì)胞是分化細(xì)胞。此外，egfp陽性細(xì)胞與egfp陰性細(xì)胞的表達(dá)的比率低于tra-1-60陰性細(xì)胞與tra-1-60陽性細(xì)胞的表達(dá)的比率，或ssea5陰性細(xì)胞與ssea5陽性細(xì)胞的表達(dá)的比率。這些結(jié)果證明了，利用涉及使用1×t302b-egfp的egfp可以提取分化細(xì)胞的可能性，與使用抗-tra-1-60抗體或抗抗-ssea5抗體的情況相比，具有更高的靈敏度。

隨后，根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)，將分離的egfp陽性細(xì)胞或tra-1-60陰性細(xì)胞接種在matrigel包被的6孔板上，然后在mtesr1培養(yǎng)基中或視黃酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。此時，每隔一天將培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基。使用堿性磷酸酶染色試劑盒(sigma)對獲得的細(xì)胞染色。在轉(zhuǎn)染了1×t302b-egfp的egfp陽性細(xì)胞的情況下，堿性磷酸酶染色的陽性細(xì)胞(未分化細(xì)胞)的剩余量顯著降低(圖5)。因此，證明了通過使用1×t302b-egfp，可以從包含未分化細(xì)胞和分化細(xì)胞的細(xì)胞群中選擇性分選出分化細(xì)胞，而不混有未分化細(xì)胞。另一方面，確認(rèn)了分選出的tra-1-60陰性細(xì)胞可能包含未分化細(xì)胞。

隨后，為了實現(xiàn)未分化細(xì)胞的完全去除，通過流式細(xì)胞術(shù)分選出上10％的egfp陽性細(xì)胞和上20％的egfp陽性細(xì)胞(圖6a)。通過上述方法將分選的樣品培養(yǎng)5天，然后用堿性磷酸酶染色。結(jié)果，在上10％的egfp陽性細(xì)胞和上20％的egfp細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)完全沒有被堿性磷酸酶染色的未分化細(xì)胞(圖6b)。因此，證實了甚至在上20％的egfp陽性細(xì)胞中也不包含未分化細(xì)胞。

[實施例3]

[302a-5p和367-3p應(yīng)答報告mrna的設(shè)計]

修飾hmag1-mrna(seqidno：19)，其編碼熒光報告基因hmag1并且包括α球蛋白的5'末端非翻譯區(qū)(5'utr)和3'末端非翻譯區(qū)(3'utr)，并且分別設(shè)計了在5'utr中包含mir-302a-5p的靶序列的1個拷貝的mir-302a-5p響應(yīng)性報告mrna(seqidno：20)和在5'utr中包含mir-367-3p的靶序列的1個拷貝的mir-367-3p響應(yīng)性報告mrna(seqidno：21)。此外，為了將轉(zhuǎn)染歸一化，還設(shè)計了用作對照的包含α球蛋白的5'utr和3'utr的tagbfpmrna(seqidno：22)。此外，作為抗藥性基因，修飾了包含嘌呤霉素抗性基因的嘌呤霉素r-mrna(seqidno：23)，并且設(shè)計了在5'utr中包含mir-302a-5p的靶序列的1個拷貝的302a-5p響應(yīng)性嘌呤霉素r-mrna(seqidno：24)。這些mrna的基因序列如下所示。

hmag1-mrna的基因序列(seqidno：19)

gggcgaattaagagagaaaagaagagtaagaagaaatataagacaccggtcgccaccatggtgagcgtgatcaagcccgagatgaagatcaagctgtgcatgaggggcaccgtgaacggccacaacttcgtgatcgagggcgagggcaagggcaacccctacgagggcacccagatcctggacctgaacgtgaccgagggcgcccccctgcccttcgcctacgacatcctgaccaccgtgttccagtacggcaacagggccttcaccaagtaccccgccgacatccaggactacttcaagcagaccttccccgagggctaccactgggagaggagcatgacctacgaggaccagggcatctgcaccgccaccagcaacatcagcatgaggggcgactgcttcttctacgacatcaggttcgacggcaccaacttcccccccaacggccccgtgatgcagaagaagaccctgaagtgggagcccagcaccgagaagatgtacgtggaggacggcgtgctgaagggcgacgtgaacatgaggctgctgctggagggcggcggccactacaggtgcgacttcaagaccacctacaaggccaagaaggaggtgaggctgcccgacgcccacaagatcgaccacaggatcgagatcctgaagcacgacaaggactacaacaaggtgaagctgtacgagaacgccgtggccaggtactccatgctgcccagccaggccaagtgaatctagaccttctgcggggcttgccttctggccatgcccttcttctctcccttgcacctgtacctcttggtctttgaataaagcctgagtaggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

起始密碼子和終止密碼子用小寫字母表示。加下劃線部分表示5'utr或3'utr。

302a-5p響應(yīng)性hmag1-mrna的基因序列(seqidno：20)

ggttccgcgatcgcggatccagcaagtacatccacgtttaagtagatccaccggtcgccaccatggtgagcgtgatcaagcccgagatgaagatcaagctgtgcatgaggggcaccgtgaacggccacaacttcgtgatcgagggcgagggcaagggcaacccctacgagggcacccagatcctggacctgaacgtgaccgagggcgcccccctgcccttcgcctacgacatcctgaccaccgtgttccagtacggcaacagggccttcaccaagtaccccgccgacatccaggactacttcaagcagaccttccccgagggctaccactgggagaggagcatgacctacgaggaccagggcatctgcaccgccaccagcaacatcagcatgaggggcgactgcttcttctacgacatcaggttcgacggcaccaacttcccccccaacggccccgtgatgcagaagaagaccctgaagtgggagcccagcaccgagaagatgtacgtggaggacggcgtgctgaagggcgacgtgaacatgaggctgctgctggagggcggcggccactacaggtgcgacttcaagaccacctacaaggccaagaaggaggtgaggctgcccgacgcccacaagatcgaccacaggatcgagatcctgaagcacgacaaggactacaacaaggtgaagctgtacgagaacgccgtggccaggtactccatgctgcccagccaggccaagtgaatctagaccttctgcggggcttgccttctggccatgcccttcttctctcccttgcacctgtacctcttggtctttgaataaagcctgagtaggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

起始密碼子和終止密碼子用小寫字母表示，mirna靶序列用小寫字母表示。加下劃線部分表示5'utr或3'utr。

367-3p響應(yīng)性hmag1-mrna的基因序列(seqidno：21)

ggttccgcgatcgcggatcctcaccattgctaaagtgcaattagatcacaccggtcgccaccatggtgagcgtgatcaagcccgagatgaagatcaagctgtgcatgaggggcaccgtgaacggccacaacttcgtgatcgagggcgagggcaagggcaacccctacgagggcacccagatcctggacctgaacgtgaccgagggcgcccccctgcccttcgcctacgacatcctgaccaccgtgttccagtacggcaacagggccttcaccaagtaccccgccgacatccaggactacttcaagcagaccttccccgagggctaccactgggagaggagcatgacctacgaggaccagggcatctgcaccgccaccagcaacatcagcatgaggggcgactgcttcttctacgacatcaggttcgacggcaccaacttcccccccaacggccccgtgatgcagaagaagaccctgaagtgggagcccagcaccgagaagatgtacgtggaggacggcgtgctgaagggcgacgtgaacatgaggctgctgctggagggcggcggccactacaggtgcgacttcaagaccacctacaaggccaagaaggaggtgaggctgcccgacgcccacaagatcgaccacaggatcgagatcctgaagcacgacaaggactacaacaaggtgaagctgtacgagaacgccgtggccaggtactccatgctgcccagccaggccaagtgaatctagaccttctgcggggcttgccttctggccatgcccttcttctctcccttgcacctgtacctcttggtctttgaataaagcctgagtaggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

起始密碼子和終止密碼子用小寫字母表示，mirna靶序列用小寫字母表示。加下劃線部分表示5'utr或3'utr。

tagbfp-mrna的基因序列(seqidno：22)

gggcgaattaagagagaaaagaagagtaagaagaaatataagacaccggtcgccaccatgggatccagcgagctgattaaggagaacatgcacatgaagctgtacatggagggcaccgtggacaaccatcacttcaagtgcacatccgagggcgaaggcaagccctacgagggcacccagaccatgagaatcaaggtggtcgagggcggccctctccccttcgccttcgacatcctggctactagcttcctctacggcagcaagaccttcatcaaccacacccagggcatccccgacttcttcaagcagtccttccctgagggcttcacatgggagagagtcaccacatacgaagacgggggcgtgctgaccgctacccaggacaccagcctccaggacggctgcctcatctacaacgtcaagatcagaggggtgaacttcacatccaacggccctgtgatgcagaagaaaacactcggctgggaggccttcaccgagacgctgtaccccgctgacggcggcctggaaggcagaaacgacatggccctgaagctcgtgggcgggagccatctgatcgcaaacatcaagaccacatatagatccaagaaacccgctaagaacctcaagatgcctggcgtctactatgtggactacagactggaaagaatcaaggaggccaacaacgagacctacgtcgagcagcacgaggtggcagtggccagatactgcgacctccctagcaaactggggcacagatctcatatgcatctcgagtgatctagaccttctgcggggcttgccttctggccatgcccttcttctctcccttgcacctgtacctcttggtctttgaataaagcctgagtaggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

起始密碼子和終止密碼子用小寫字母表示，加下劃線部分表示5'utr或3'utr。

嘌呤霉素r-mrna的基因序列(seqidno：23)

gggcgaattaagagagaaaagaagagtaagaagaaatataagacaccggtcgccaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgatctagaccttctgcggggcttgccttctggccatgcccttcttctctcccttgcacctgtacctcttggtctttgaataaagcctgagtaggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

起始密碼子和終止密碼子用小寫字母表示。加下劃線部分表示5'utr或3'utr。

302a-5p響應(yīng)性嘌呤霉素r-mrna的基因序列(seqidno：24)ggttccgcgatcgcggatccagcaagtacatccacgtttaagtagatccaccggtcgccaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgatctagaccttctgcggggcttgccttctggccatgcccttcttctctcccttgcacctgtacctcttggtctttgaataaagcctgagtaggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

起始密碼子和終止密碼子用小寫字母表示，mirna靶序列用小寫字母表示。加下劃線部分表示5'utr或3'utr。

[制備模板和體外轉(zhuǎn)錄(ivt)]

通過混合5'utr片段、標(biāo)記基因的orf區(qū)片段和3'utr片段，然后以與實施例1相同的方式通過pcr(融合pcr)將它們鏈接而制備ivt模板dna。通過pcr擴(kuò)增制備這些片段。在下文中，描述制備hmag1、302a-5p響應(yīng)性hmag1、367-3p響應(yīng)性hmag1、tagbfp、嘌呤霉素r和302a-5p響應(yīng)性嘌呤霉素r這六種ivt模板dna的方法的細(xì)節(jié)。

在hmag1、tagbfp和嘌呤霉素r基因的orf區(qū)域上進(jìn)行以下pcr擴(kuò)增。使用質(zhì)粒模板：s/g2/mgreen(amalgammbl)作為模板，用hmag1_ivtfwd(kec-330)(seqidno：25)和hmag1_ivtrev(kec-331)(seqidno：26)進(jìn)行pcr擴(kuò)增來制備hmag1_orf片段。類似地，使用質(zhì)粒模板：ptap_tagbfp(miki等人，cellstemcell，卷16，期6，4，6月，2015，頁699-711)作為模板，用tagbfp_fwd(ked-90)(seqidno：33)和tap_ivtrev(kec-23)進(jìn)行pcr擴(kuò)增來制備tagbfp_orf片段。類似地，使用質(zhì)粒模板：ppycag-nanog-ip(plasmid13838，addgene)作為模板，用orf_puror_fwd(stc-035)(seqidno：31)和orf_puror_rev(stc-036)(seqidno：32)進(jìn)行pcr擴(kuò)增來制備tagbfp_orf片段。

此外，在不含有靶序列的5'utr片段和3'utr片段上進(jìn)行以下pcr擴(kuò)增。使用ivt5primeutr(kec-62)作為模板，使用tap_t73gc(skc-111)(seqidno：30)和rev5utr(kec-1)(seqidno：11)作為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增來制備5'utr片段。使用ivt3primeutr(kec-63)作為模板，使用fwd3utr(kec-4)和rev3utr2t20(kec-65)作為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增來制備3'utr片段。

此外，在含有302a-5p靶序列的5'utr和含有367-3p靶序列的5'utr上進(jìn)行以下pcr擴(kuò)增。使用5utrtemp_t302a-5p(kec-653)(seqidno：27)作為模板，使用gct7pro_5utr2(kec-948)(seqidno：29)和rev5utr(kec-1)作為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，來制備302a-5p-5'utr片段。使用5utrtemp_t367-3p(kec-845)(seqidno：28)作為模板，使用gct7pro_5utr2(kec-948)和rev5utr(kec-1)作為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，來制備367-3p-5'utr片段。

通過混合上述5'utr片段和3'utr片段、hmag1_orf片段、tagbfp_orf片段或嘌呤霉素r_orf片段，然后使用tap_t73gc(skc-111)和3utr120a(kec-308)作為引物進(jìn)行融合pcr，來制備hmag1mrna、tagbfpmrna和嘌呤霉素rmrna的ivt模板dna。

通過混合上述302a-5p-5'utr片段或367-3p-5'utr片段、3'utr片段和hmag1_orf片段，然后使用gct7pro_5utr2(kec-948)和3utr120a(kec-308)作為引物進(jìn)行融合pcr來制備302a-5p響應(yīng)性hmag1和367-3p響應(yīng)性hmag1的ivt模板dna。通過混合上述302a-5p-5'utr片段、3'utr片段和嘌呤霉素r_orf片段，然后使用gct7pro_5utr2(kec-948)和3utr120a(kec-308)作為引物進(jìn)行融合pcr來制備302a-5p響應(yīng)性嘌呤霉素r的ivt模板dna。

可以酌情將寡dna，如上述引物和模板的制備委托給其他方，然后使用如此制備的寡dna。其序列示于表1和表2中。

如上所述，按照制造商的說明書，使用minelutepcr純化試劑盒(qiagen)純化通過pcr擴(kuò)增獲得的ivt模板dna。以與實施例1相同的方式通過ivt合成mrna。

表2

[無飼養(yǎng)層的人類ips細(xì)胞的維持]

根據(jù)2014年nakagawa等的方案，將無飼養(yǎng)層的人類ips細(xì)胞(ff-hipsc)保持在stemfit(+bgf)培養(yǎng)基中的imatrix-511(e8)(nippi,inc.)上。每8天傳代培養(yǎng)該人類ips細(xì)胞。在這樣的傳代培養(yǎng)之前，在37℃用已經(jīng)用無菌pbs稀釋至0.5μg/cm²的濃度的imatrix-511(e8)包被6孔板至少1小時。包被完成后，吸出pbs，并立即將其更換為1.5ml的含有10μm的rock抑制劑(y-26732)的stemfit。為了收獲人類ips細(xì)胞，舊培養(yǎng)基被吸走，然后用1ml的pbs洗滌細(xì)胞。抽吸pbs后，將0.3ml的trypselect溶液倒入每個孔中，然后將板轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。一分鐘后，除去不必要的溶液(移去細(xì)胞上的體積)，并將殘余物進(jìn)一步溫育3分鐘。隨后，從培養(yǎng)箱中取出反應(yīng)混合物，然后吸出trypselect溶液，然后用1ml的pbs洗滌所得物。此后，吸出pbs，并將1.5ml的stemfit與rock抑制劑一起添加到每個孔中。使用橡膠刮刀收獲細(xì)胞，然后使用p1000移液管吹吸10次以獲得單細(xì)胞溶液。使用臺盼藍(lán)染色和cellcountess(invitrogen)計算細(xì)胞密度，然后以1.3×10⁴/孔的細(xì)胞數(shù)接種該細(xì)胞，使得細(xì)胞均勻分布。24小時后，將stemfit更換為不含rock抑制劑的stemfit，然后每隔一天將stemfit更換為新鮮培養(yǎng)基。

[無飼養(yǎng)層人類ips細(xì)胞分化為中腦多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞]

按照doi,d.等人，stemcells30，935-945(2012)中描述的方法進(jìn)行將無飼養(yǎng)層的人類ips細(xì)胞分化成中腦多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞的誘導(dǎo)。以與上述相同的方式用人類ips細(xì)胞包被6孔板，然后向每個孔中加入4ml的第0天分化培養(yǎng)基。通過將其中單一類型的人類ips細(xì)胞已經(jīng)懸浮在不含rock抑制劑的第0天分化培養(yǎng)基中的細(xì)胞溶液以5×10⁶/孔的細(xì)胞密度接種在6孔板上來開始分化。在將該板放回培養(yǎng)箱之前，將將板輕輕攪動(stir)。24小時后，用第1天培養(yǎng)基更換全部培養(yǎng)基。類似地，每天更換培養(yǎng)基。在從第0天分化培養(yǎng)基到第2天分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)基更換中，向每個孔中加入4ml的培養(yǎng)基；在從第3天分化培養(yǎng)基到第6天分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)基更換中，向每個孔中加入6ml的培養(yǎng)基；在從第7天分化培養(yǎng)基到第8天分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)基更換中，向每個孔中加入8ml的培養(yǎng)基；并且在從第9天分化培養(yǎng)基到第11天分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)基更換中，向每個孔中加入10ml的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)完成后的11天內(nèi)，細(xì)胞數(shù)增加2倍，細(xì)胞密度變?yōu)榧s10×10⁶/孔。將細(xì)胞在第12天、第20天和第29天傳代培養(yǎng)，并以5×10⁶/孔的細(xì)胞密度接種在6孔板上。第12天后，細(xì)胞都保持在neurobasalb27培養(yǎng)基中。每天將培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基，并且每次加入5ml/孔的新鮮培養(yǎng)基。

[分化效率的評價]

針對在第12天、第20天和第29天進(jìn)行的每個傳代培養(yǎng)，利用在標(biāo)記神經(jīng)譜系中使用的corin抗體(kanresearch)、底板標(biāo)記物和psa-ncam抗體將大量的細(xì)胞染色，然后評價細(xì)胞的分化效率。同時，使用1/200的小鼠抗人類corin抗體(kanresearch)或1/100的小鼠單克隆抗人類psa-ncam抗體(mab5324，millipore)，使已添加了rock抑制劑的200μl的染色緩沖液(hbss：hanks平衡鹽溶液/2％敲除血清，50微克/ml青霉素/鏈霉素，10μm的y-26732)中的約5×10⁵個細(xì)胞進(jìn)行染色的抗原-抗體反應(yīng)。對于該corin抗體和psa-ncam，以1/400的比率使用alexa488綴合的抗小鼠igg抗體或igm二次染色。該細(xì)胞在4℃染色30分鐘。該細(xì)胞在hbss培養(yǎng)基中染色兩次。死細(xì)胞用7-aad染色10分鐘，然后進(jìn)行facs分析。

使用fitc標(biāo)準(zhǔn)過濾器和7-aad信號，通過bdfacsaria-ii或bdaccuri測量該細(xì)胞。為了去除死細(xì)胞，基于ssc-a強(qiáng)度(p1)建立閘門，從fsc-wvsfsc-h(p2)和ssc-wvsssc-h(p3)重復(fù)地去除死細(xì)胞。最后，去除高的7-aad細(xì)胞，并保留活細(xì)胞閘門(p4/live)。分析20,000個p4門控細(xì)胞。建立corin陽性和psa-ncam陽性閘門，并且在alexa488-igg或igg同種型對照二次抗體中保留0.2％或更少的細(xì)胞。

[在誘導(dǎo)細(xì)胞分化為中腦多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞中使用的培養(yǎng)基的組成]

第0天

8gmk、10μm的y-26732(wako)、100nm的ldn-193189(stemgent)、500nm的a83-01(wako)

第1-2天

8gmk、100nm的ldn-193189、500nm的a83-01、2μm的嘌嗎啡胺(purmorphamine)(calbiochem)、100ng/ml的人類重組fgf-8(wako)

第3-7天

8gmk、100nm的ldn-193189、500nm的a83-01、2μm的嘌嗎啡胺、100ng/ml的人類重組fgf-8、30μm的chir99021(stemgent)

第7-11天

8gmk、100nm的ldn-193189、30μm的chir99021

第12天及之后

neurobasalb27、200μm的抗壞血酸(sigmaaldrich)、400μm的dbcamp(camp)、20ng/ml的人類重組bdnf、10ng/ml的人類重組gdnf

8gmk：glasgow'smem/8％敲除血清/100μm丙酮酸鈉、100μmβ-巰基乙醇

neurobasalb27：神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基/2％b27添加/2mm谷氨酰胺

[轉(zhuǎn)染]

在轉(zhuǎn)染之前，如上所述對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后將傳代培養(yǎng)的細(xì)胞以1～2×10⁵/孔的細(xì)胞密度接種在用imatrix-511(e8)包被的24孔板上包含rock抑制劑的分化培養(yǎng)基中。在第二天，不用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，按照制造商的方案，使用stemfect試劑(stemgent)將上述ivt合成的mrna轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。對于每次轉(zhuǎn)染，將已被加入到12.5μl的stemfect緩沖液中的lμl的試劑混合到管(管a)中，然后將混合物在室溫溫育5分鐘。在另一管(管b)中，將mrna(最多400ng)與12.5μl的stemfect緩沖液混合。將管b中的內(nèi)容物滴加到管a中用于輕微混合，然后將所得混合物在室溫溫育10分鐘。將該轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到細(xì)胞中，然后將所得混合物攪動，然后置于培養(yǎng)箱中。4小時后，吸出含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的舊培養(yǎng)基，然后加入不含rock抑制劑的新鮮分化培養(yǎng)基。在第二天，使用標(biāo)準(zhǔn)過濾器，根據(jù)bdfacsaria-ii，或者如上所述通過bdaccuri，根據(jù)facs分析來分析細(xì)胞?；谀M轉(zhuǎn)染的細(xì)胞評價轉(zhuǎn)染效率。

[302a-5p和367-3p響應(yīng)性hmag1mrna的特異性翻譯抑制]

已經(jīng)引入到人類ips細(xì)胞中的302a-5p和367-3p響應(yīng)性hmag1mrna的翻譯均被特異性抑制(圖7)。將50ng的hmag1mrna(ctrl-hmag1)、302a-5p響應(yīng)性hmag1mrna(302a-5p-hmag1)或367-3p響應(yīng)性hmag1mrna(367-3p-hmag1)與100ng的tagbfp一起引入到無飼養(yǎng)層的人類ips細(xì)胞系(201b7、1231a3和1383d7)中和hela細(xì)胞中。24小時后，收集細(xì)胞，然后使用bdfacsaria-ii進(jìn)行分析。結(jié)果以點圖的形式顯示在圖7a中。即使在使用這些mirna響應(yīng)性mrna的情況下，通過流式細(xì)胞術(shù)分析也發(fā)現(xiàn)人類ips細(xì)胞201b7中的特異性翻譯抑制。此外，將來自人類ips細(xì)胞系的結(jié)果與來自hela細(xì)胞的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論細(xì)胞系201b7、1231a3和1383d7，在人類ips細(xì)胞中302a-5p響應(yīng)性mrna和367-3p響應(yīng)性mrna的翻譯都被特異性抑制(圖7b)。通過將hmag1信號歸一化為tagbfp來計算翻譯效率，并且將其表示為添加了hmag1mrna/tagbfpmrna的細(xì)胞的比率。

將302a-5p響應(yīng)性mrna和302a-5p抑制劑(其添加量改變)共同引入到201b7中(圖7c)。302a-5p抑制劑的濃度在0.003nm至30nm的范圍內(nèi)變化，然后，從0.003nm的抑制劑濃度開始，將其指示為青色、橙色、綠色、藍(lán)色和紅色的點圖(圖7c，右圖)。當(dāng)以3nm和30nm的濃度添加抑制劑時，這兩種抑制劑通過302a-5p響應(yīng)性mrna分別部分地和完全地阻止翻譯抑制。另一方面，將302a-5p響應(yīng)性mrna和302a-5p模擬物(以不同的添加量)共同引入到hela細(xì)胞中，其對302a-5p響應(yīng)性mrna不響應(yīng)(圖7d)。302a-5p模擬物的濃度在0.003nm至6nm的范圍內(nèi)變化，然后，從0.003nm的濃度開始，將其指示為橙色、青色、紫色、藍(lán)色和紅色的點圖(圖7d，右圖)。這些結(jié)果表明302a-5p模擬物抑制302a-5p響應(yīng)性mrna的翻譯。如上所述，302a-5p響應(yīng)性mrna對靶mirna具有特異性。

[ff-人類ips細(xì)胞分化為mda細(xì)胞和mirna響應(yīng)性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的變化]

使用302a-5p響應(yīng)性mrna和367-3p響應(yīng)性mrna跟蹤ff-人類ips細(xì)胞分化為中腦多巴胺能細(xì)胞(mda細(xì)胞)(圖8)。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)分析引入302a-5p響應(yīng)性mrna的在第0天、第5天、第7天和第14天的ff-201b7細(xì)胞獲得的結(jié)果證明，隨著分化的進(jìn)展，hmag1的翻譯抑制作用降低(圖8a)。此外，即使在引入302a-5p響應(yīng)性mrna和367-3p響應(yīng)性mrna中的任一種的情況下，隨著分化的進(jìn)展，302a-5p響應(yīng)性細(xì)胞或367-3p響應(yīng)性細(xì)胞(藍(lán)色區(qū)域)的分布也減少(圖8b)。此外，在ff-人類ips細(xì)胞的所有細(xì)胞系中，確認(rèn)了與上述幾乎相同的結(jié)果。此外，證明了可以使用302a-5p響應(yīng)性mrna或367-3p響應(yīng)性mrna跟蹤分化的進(jìn)展，并且分化的容易性隨細(xì)胞系而不同。

[將ff-人類ips細(xì)胞分化為mda細(xì)胞和hsa-mir的量化]

在ff-人類ips細(xì)胞分化為mda細(xì)胞的第0、3、5、7、12和21天，通過三唑提取和異丙醇沉淀從冷凍的細(xì)胞團(tuán)中提取總rna。用dnase處理rna，然后使用mirna逆轉(zhuǎn)錄酶和靶特異性rt引物(appliedbiosystems)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后使用taqmanmirna探針進(jìn)行擴(kuò)增。分別用rnu6b標(biāo)準(zhǔn)化了的分化期間mir-302a-5p的比率(圖9a)和hsa-mir-367-3p的比率(圖9b)以log10標(biāo)度示出。作為在第0天的陰性對照，還示出了hela細(xì)胞和肝細(xì)胞。顯示出在將人類ips細(xì)胞分化為mda細(xì)胞期間，各個細(xì)胞中hsa-mir-302a-5p和hsa-mir-367-3p的表達(dá)水平被下調(diào)。

[分化細(xì)胞中ff-人類ips細(xì)胞的量化]

對于添加了已知量的ff-人類ips細(xì)胞的完全分化的mda細(xì)胞系，使用mirna響應(yīng)性mrna測量添加量(刺突試驗)(圖10)。在24孔板中，向mda細(xì)胞中加入ff-201b7人類ips細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)：0、100和500)。總細(xì)胞數(shù)設(shè)定為200,000。將50ng的hmag1mrna或302a-5p響應(yīng)性mrna和100ng的tagbfp共同引入到這些細(xì)胞中。當(dāng)將302a-5p響應(yīng)性mrna引入到不含有ips細(xì)胞的mda細(xì)胞中時，即使建立302pos(mir-302a-5p陽性)閘門(重復(fù)1)和p5閘門(重復(fù)2)，也沒有確認(rèn)表現(xiàn)出翻譯抑制的細(xì)胞(在最左側(cè)圖中的點圖)。如重復(fù)1和重復(fù)2的結(jié)果所示，由302a-5p響應(yīng)性mrna鑒定的人類ips細(xì)胞與mda細(xì)胞的比率的測量值非常接近其估計值。

[使用mirna響應(yīng)性purormrna提取分化細(xì)胞]

使用抗嘌呤霉素基因作為報告子，嘗試從共培養(yǎng)系統(tǒng)中除去剩余的ips細(xì)胞(圖11)。圖11a示出通過加入嘌呤霉素除去剩余的ips細(xì)胞的方案。該圖顯示，當(dāng)將302a-5p響應(yīng)性purormrna引入201b7細(xì)胞系和mda細(xì)胞的共培養(yǎng)系中時，未引入的細(xì)胞和hsa-mir-302a-5p高度表達(dá)的細(xì)胞由于不具有嘌呤霉素抗性基因，或者由于抗性基因的表達(dá)被抑制，而發(fā)生細(xì)胞死亡。圖11b示出單一培養(yǎng)系統(tǒng)的實驗時間軸。在此，將2×10⁴個細(xì)胞接種在用imatrix-511(e8)包被的96孔板中。在該實驗時間軸中，在含有不同量的purormrna(0至50ng)或嘌呤霉素(0至10μg)的培養(yǎng)基中處理待誘導(dǎo)的mda細(xì)胞和ff-201b7人類ips細(xì)胞。圖(圖11b的柱狀圖)中示出通過加入wst-1底物(roche)2至4小時，然后測定細(xì)胞毒性所獲得的結(jié)果。在ff-201b7人類ips細(xì)胞的情況下，當(dāng)將302a-5p響應(yīng)性purormrna(302-puror)引入細(xì)胞時，與引入對mirna不響應(yīng)的purormrna(contl-purpr)的情況相比，活細(xì)胞的比率顯著降低(圖11b，最左邊的圖和左邊的第二個圖)。相比之下，在mda細(xì)胞的情況下，即使將purormrna(cont1-purpr)引入細(xì)胞中，或者即使將302a-5p響應(yīng)性purormrna引入細(xì)胞中，也幾乎未發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞的比率變化。

將待誘導(dǎo)的mda細(xì)胞或ff-201b7人類ips細(xì)胞的單獨培養(yǎng)物或其共培養(yǎng)物接種在24孔板中，然后將它們在ips細(xì)胞相應(yīng)的培養(yǎng)基或mda細(xì)胞相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或者在包含兩種類型培養(yǎng)基(與rock抑制劑一起)的相應(yīng)混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第二天，將培養(yǎng)基更換為不含有rock抑制劑的培養(yǎng)基，然后將50ng的purormrna或302a-5p響應(yīng)性purormrna引入細(xì)胞。表達(dá)后4小時，將培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基，然后向其中加入2μg/ml的嘌呤霉素。二十小時后，用pbs洗滌細(xì)胞兩次，然后輕輕攪動，從而收獲附著的剩余細(xì)胞。將收獲的細(xì)胞用alexa-488-綴合的抗人類tra-1-60抗體(bdlaboratories)染色。圖11c的上部視圖示出通過用bdaccuri測量和門控活細(xì)胞獲得的結(jié)果。在ff-201b7人類ips細(xì)胞的單獨培養(yǎng)系統(tǒng)的情況下，如預(yù)期的，當(dāng)將302a-5p響應(yīng)性purormrna引入細(xì)胞時，fl-1(tra-1-60)的直方圖相對于幾乎所有背景大大減少，而當(dāng)將purormrna引入細(xì)胞時沒有觀察到這種影響。在從其中已經(jīng)引入了302a-5p響應(yīng)性purormrna的共培養(yǎng)系統(tǒng)獲得的柱狀圖中，tra-1-60陽性峰顯著降低。下部視圖示出在所有條件下tra-1-60陽性細(xì)胞的絕對數(shù)目。

序列表

<110>京都大學(xué)

<120>選擇分化細(xì)胞的方法

<130>2653-pct

<150>jp2014-146070

<151>2014-07-16

<160>33

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1019

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>報告子

<400>1

gggcgaauuaagagagaaaagaagaguaagaagaaauauaagacaccggucgccaccaug60

ggauccgugagcaagggcgaggagcuguucaccgggguggugcccauccuggucgagcug120

gacggcgacguaaacggccacaaguucagcguguccggcgagggcgagggcgaugccacc180

uacggcaagcugacccugaaguucaucugcaccaccggcaagcugcccgugcccuggccc240

acccucgugaccacccugaccuacggcgugcagugcuucagccgcuaccccgaccacaug300

aagcagcacgacuucuucaaguccgccaugcccgaaggcuacguccaggagcgcaccauc360

uucuucaaggacgacggcaacuacaagacccgcgccgaggugaaguucgagggcgacacc420

cuggugaaccgcaucgagcugaagggcaucgacuucaaggaggacggcaacauccugggg480

cacaagcuggaguacaacuacaacagccacaacgucuauaucauggccgacaagcagaag540

aacggcaucaaggugaacuucaagauccgccacaacaucgaggacggcagcgugcagcuc600

gccgaccacuaccagcagaacacccccaucggcgacggccccgugcugcugcccgacaac660

cacuaccugagcacccaguccgcccugagcaaagaccccaacgagaagcgcgaucacaug720

guccugcuggaguucgugaccgccgccgggaucacucucggcauggacgagcuguacaag780

agaucucauaugcaucucgagugauagucuagaccuucugcggggcuugccuucuggcca840

ugcccuucuucucucccuugcaccuguaccucuuggucuuugaauaaagccugaguagga900

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa960

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1019

<210>2

<211>1018

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>報告子

<400>2

ggucagauccgcuaggauccuacuaaaacauggaagcacuuacaccggucgccaccaugg60

gauccgugagcaagggcgaggagcuguucaccgggguggugcccauccuggucgagcugg120

acggcgacguaaacggccacaaguucagcguguccggcgagggcgagggcgaugccaccu180

acggcaagcugacccugaaguucaucugcaccaccggcaagcugcccgugcccuggccca240

cccucgugaccacccugaccuacggcgugcagugcuucagccgcuaccccgaccacauga300

agcagcacgacuucuucaaguccgccaugcccgaaggcuacguccaggagcgcaccaucu360

ucuucaaggacgacggcaacuacaagacccgcgccgaggugaaguucgagggcgacaccc420

uggugaaccgcaucgagcugaagggcaucgacuucaaggaggacggcaacauccuggggc480

acaagcuggaguacaacuacaacagccacaacgucuauaucauggccgacaagcagaaga540

acggcaucaaggugaacuucaagauccgccacaacaucgaggacggcagcgugcagcucg600

ccgaccacuaccagcagaacacccccaucggcgacggccccgugcugcugcccgacaacc660

acuaccugagcacccaguccgcccugagcaaagaccccaacgagaagcgcgaucacaugg720

uccugcuggaguucgugaccgccgccgggaucacucucggcauggacgagcuguacaaga780

gaucucauaugcaucucgagugauagucuagaccuucugcggggcuugccuucuggccau840

gcccuucuucucucccuugcaccuguaccucuuggucuuugaauaaagccugaguaggaa900

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa960

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1018

<210>3

<211>1057

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>報告子

<400>3