本發(fā)明的實施方案大體上涉及在遺傳上不同的細胞的文庫的表型鑒定及原位基因分型。

發(fā)明背景

基因組工程的近期發(fā)展，例如由多元自動化基因組工程(Multiplex Automated Genomic Engineering,MAGE)和成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)相關(guān)蛋白9(Cas9)的應(yīng)用或由工程化核酸酶(諸如鋅指核酸酶(ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN))促進的其它類型的基因組編輯的應(yīng)用，結(jié)合DNA寡核苷酸合成成本的降低所例示，使得產(chǎn)生具有絕對優(yōu)勢的遺傳多樣性的大型細胞文庫成為可能。同時，技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)導致了測定細胞的表型和基因型特征的可能性。例如，F(xiàn)luidigm Dynamic Array^TM集成流體通路(IFC)可用于在單個微孔板中進行基因分型。然而，因為必須保持對遺傳上不同的細胞進行單獨分選和分析，所以可以分析的細胞文庫的大小只限于幾百個不同的細胞。

另一種能夠比Fluidigm Dynamic Array^TM IFC處理明顯更大的株系文庫的技術(shù)是熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)。然而，F(xiàn)ACS具有局限性，因為細胞文庫的表型鑒定限于在單個時間點的熒光讀數(shù)。類似于FACS，體外區(qū)室化(IVC)和基于液滴的技術(shù)能夠處理大型文庫。然而，在IVC中獲得的表型信息是有限的，這是因為液滴中成像的光學約束以及不能在液滴中進行長期細胞生長實驗的事實。

其它技術(shù)依賴于在成像后將條形碼化的寡聚體加入細胞中。將寡聚物分布到特定空間位置的需要限制了細胞可生長的條件和可分配的不同條形碼的數(shù)量。

因此，在細胞文庫的表型和基因型鑒定的技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)存在改進需要。具體來說，需要一種能夠處理大型細胞文庫并且能夠以高空間和時間分辨率監(jiān)測表型特征的技術(shù)。

發(fā)明概要

總目標是提供一種允許對大型細胞文庫進行表型和基因型鑒定的技術(shù)。

此目標和其它目標是通過如本文所定義的實施方案來滿足。

簡言之，這些實施方案的一個方面涉及一種用于鑒定多個細胞株的文庫的方法，所述細胞株在所述細胞株的遺傳物質(zhì)的至少一部分中具有不同可變區(qū)。所述方法包括在培養(yǎng)裝置中在空間上界定和分開的位置處培養(yǎng)所述細胞株的細胞。測定每個細胞株在所述培養(yǎng)裝置中的表型特征。將所述細胞株的細胞固定在所述培養(yǎng)裝置中在空間上界定和分開的位置處。所述方法還包括對培養(yǎng)裝置中在空間上界定和分開的位置處的每個細胞株的可變區(qū)進行原位基因分型。然后基于所述培養(yǎng)裝置中的在空間上界定和分開的位置將每種相應(yīng)的表型特征與每種相應(yīng)的基因型相關(guān)聯(lián)。

這些實施方案的另一方面涉及一種用于鑒定多個細胞株的文庫的系統(tǒng)，所述細胞株在所述細胞株的遺傳物質(zhì)的至少一部分中具有不同可變區(qū)。所述系統(tǒng)包括培養(yǎng)裝置，其被配置為在所述培養(yǎng)裝置中的在空間上界定和分開的位置處培養(yǎng)細胞株的細胞。所述系統(tǒng)還包括第一試劑盒，所述第一試劑盒包含用于在將細胞固定在培養(yǎng)裝置中在在空間上界定和分開的位置處之后對每個細胞株的可變區(qū)進行原位基因分型的組分。然后可以基于培養(yǎng)裝置中的在空間上界定和分開的位置將每個細胞株的相應(yīng)的表型特征與每種相應(yīng)的基因型相關(guān)聯(lián)。

本發(fā)明的實施方案可實現(xiàn)對大型細胞文庫并行進行表型和基因型鑒定。所述實施方案還允許監(jiān)測和測定細胞在培養(yǎng)裝置中的各種表型。

所述實施方案的系統(tǒng)和培養(yǎng)裝置有助于在恒定或可變條件下進行長期單細胞表型分析實驗，隨后固定以及在不損失細胞的情況下施加原位測序所需的多種試劑。

附圖簡述

通過結(jié)合附圖參考以下描述，可以最好地理解所述實施方案以及其其它目標和優(yōu)點，其中：

圖1是根據(jù)一個實施方案的培養(yǎng)裝置的圖示；

圖2是圖1所示的培養(yǎng)裝置沿著線A-A的橫截面圖；

圖3是根據(jù)另一個實施方案的培養(yǎng)裝置的圖示；

圖4是圖3所示的培養(yǎng)裝置沿著線A-A的橫截面圖；

圖5是根據(jù)另一實施方案的培養(yǎng)裝置的圖示；

圖6是根據(jù)又一實施方案的培養(yǎng)裝置的圖示；

圖7是根據(jù)另一實施方案的培養(yǎng)裝置的圖示；

圖8示出根據(jù)一個實施方案的細胞株的基因組的一部分；

圖9示出從圖8所示的基因組的所述部分獲得的mRNA序列；以及

圖10示出了從圖9所示的mRNA序列獲得的cDNA序列；

圖11示出根據(jù)另一實施方案的細胞株的基因組的部分；以及

圖12示出從圖11所示的基因組的所述部分獲得的cDNA序列。

具體實施方式

在所有附圖中，相同的附圖標記用于類似或?qū)?yīng)的元件。

本發(fā)明的實施方案大體上涉及細胞株文庫的表型鑒定和原位基因分型。具體地，本發(fā)明的實施方案允許將所監(jiān)測的表型特征與經(jīng)原位測定的基因型以高度并行的方式關(guān)聯(lián)。這意味著可以并行處理具有不同基因型的細胞株的大型文庫，以將所監(jiān)測的表型特征與所述細胞株的不同基因型關(guān)聯(lián)。

如本文所用的細胞株表示來源于通過選擇和克隆具有特定基因型的細胞獲得的原代培養(yǎng)物或細胞系的細胞。因此，細胞株的細胞都具有相同的基因型。因此，細胞株文庫是在遺傳上不同的細胞的集合。所述實施方案的文庫中的細胞株可以是任何細胞類型，包括細菌菌株，酵母菌株，真核細胞株、細胞系、原代細胞，干細胞，組織或小菌落中的細胞，在其所攜帶的移動脫氧核糖核酸(DNA)元件、載體或質(zhì)粒方面不同的等基因細胞。如本文所用的細胞株還包括多細胞復(fù)合體、組織等，只要這些可以如本文所公開地在體外培養(yǎng)。

所述實施方案的一個方面涉及一種用于鑒定多個細胞株的文庫的方法，所述細胞株在細胞株的遺傳物質(zhì)的至少一部分中具有不同可變區(qū)。所述方法包括在培養(yǎng)裝置中在空間上界定和分開的位置處培養(yǎng)所述細胞株的細胞。測定每個細胞株在所述培養(yǎng)裝置中的表型特征。將所述細胞株的細胞固定在所述培養(yǎng)裝置中在空間上界定和分開的位置處。所述方法還包括對培養(yǎng)裝置中在空間上界定和分開的位置處的每個細胞株的可變區(qū)進行原位基因分型。然后基于所述培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置將每種相應(yīng)的表型特征與每種相應(yīng)的基因型相關(guān)聯(lián)。

可以根據(jù)基因組工程中的各種技術(shù)來獲得細胞株文庫。例如，多元自動化基因組工程(MAGE)可用于每天產(chǎn)生數(shù)十億個不同的突變基因組(Wang等人，Nature，2009，460:894-898)?？捎糜趧?chuàng)建細胞文庫的其它技術(shù)包括成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)相關(guān)蛋白9(Cas9)(Wang等人，Science，2014，343:80-84；Koike-Yusa等人，Nature Biotechnology，2014，32:309-312；Zhou等人，Nature，2014，509:487-491)或大規(guī)模RNA干擾(Berns等人，Nature，2004，428:431-437)。

本發(fā)明的實施方案使用在其中文庫中的每個細胞株的細胞可與其它細胞株和或其它基因型的細胞分開保存和培養(yǎng)的培養(yǎng)裝置。因此，每個細胞株在其中可生長和研究細胞的培養(yǎng)裝置中具有分別在空間上界定和分開的位置。

可以有利地將一種或多種培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)裝置中在空間上界定和分開的位置處的細胞中?？梢詫⑴囵B(yǎng)基連續(xù)添加到細胞中，或者周期地或在選定時刻補充或更換。培養(yǎng)基更換優(yōu)選以使得過量的細胞不會附著并污染其它基因型細胞的空間上界定和分開的位置的方式進行。

優(yōu)選使細胞在培養(yǎng)裝置中在空間上界定和分開的位置處培養(yǎng)并以單層生長。單層通常優(yōu)于3D結(jié)構(gòu)或矩陣，因為如果細胞以單層存在的話，則通常更容易監(jiān)測細胞和測定細胞的表型特征。然而，如果諸如在分化或發(fā)育中監(jiān)測到與(例如)細胞間相互作用相關(guān)的表型，那么細胞可以生長在支持3D生長的結(jié)構(gòu)中。

在培養(yǎng)裝置中在空間上界定和分開的位置處培養(yǎng)的細胞可以優(yōu)選地暴露于各種物理和/或化學刺激或試劑而不被滌除，以便監(jiān)測細胞對物理和/或化學刺激或試劑的響應(yīng)。例如，可以將各種化學測試試劑，諸如營養(yǎng)物質(zhì)、藥物、抗生素、基因表達誘導物或阻遏物加入培養(yǎng)基中并由此與細胞接觸。然后可以例如使用顯微術(shù)在不同細胞株的細胞對各種測試試劑的響應(yīng)方面測定所述細胞株的表型特征。相應(yīng)地，可以改變細胞所暴露于的溫度、pH、壓力、流量、氣體、曝光量或機械應(yīng)力，并且可以例如使用顯微術(shù)測定不同細胞株的細胞對此類不斷變化的物理條件的響應(yīng)。

所述細胞株具有不同的基因型，如在其遺傳物質(zhì)的至少一部分中具有不同的可變區(qū)所表現(xiàn)的。所述可變區(qū)通常存在于細胞株的基因組中?；蛘?，可變區(qū)存在于可移動遺傳元件如質(zhì)?；蜉d體中，并且因此不一定必須穩(wěn)定地結(jié)合到細胞的基因組中。在下文中，主要討論了關(guān)于基因組中存在的可變區(qū)的實施方案。然而，替代實施方案是可能的，其中本文提及的可變區(qū)和另外的DNA元件替代地存在于細胞株的質(zhì)粒或其它可移動遺傳元件中。可變區(qū)或可變區(qū)的部分也可存在于不穩(wěn)定的遺傳元件中，諸如轉(zhuǎn)座子、病毒或噬菌體。此類編碼有時將在固定細胞以供原位測序之前擴增可變序列方面具有優(yōu)勢，例如通過在固定細胞之前從dsDNA基因組中特異性切除或環(huán)化可變區(qū)的部分。

將在本文中進一步描述根據(jù)實施方案可使用的各種培養(yǎng)裝置。

在一個實施方案中，所述方法還包括在所述培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置處隨機接種所述細胞株的細胞。優(yōu)選進行細胞的隨機接種，使得每個空間上界定和分開的位置僅包含相同基因型的細胞，即相同細胞株的細胞。

所述實施方案的優(yōu)點是遺傳同一性，即在培養(yǎng)裝置中接種細胞之前不需要測定和已知細胞的基因型。因此，不需要在接種前使細胞文庫中的細胞保持經(jīng)分選，因為必須了解每個細胞株的遺傳同一性并在整個方法中連續(xù)監(jiān)測每種基因型的位置。這意味著，本發(fā)明的實施方案在清晰的對比下首先在不了解基因型的任何知識的情況下并行分析表型特征，然后測定基因型并將它們與表型特征相關(guān)聯(lián)。

通過對個別細胞株進行原位測序，有可能比如果例如特異性的條形碼化測序引物將在表型分析之前或之后分配到空間上分開的位置時生長出可能更密集的不同株系。

因此，可以通過使來自文庫的個別細胞在空間上界定和分開的位置處以塊狀沉淀(bulk settle)產(chǎn)生并形成等基因細胞的微菌落來進行隨機接種。

在一種替代方法中，可以通過以下方式來進行隨機接種：將文庫中第一細胞株的細胞加入到培養(yǎng)裝置中的第一空間上界定和分開的位置處，將文庫中的第二細胞株的細胞加入到培養(yǎng)裝置中的第二空間上界定和分開的位置處等等，直至所有待監(jiān)測的細胞株已經(jīng)分配到培養(yǎng)裝置中的不同空間上界定和分開的位置處。

文庫中的每個細胞株的所測定表型特征優(yōu)選是對應(yīng)于文庫中每種基因型的表型特征。因此，文庫中的細胞是具有不同基因型的在遺傳上不同的細胞，即每個細胞株具有相應(yīng)的基因型?；蛐筒町愐馕吨毎麑⒕哂袑?yīng)于每種相應(yīng)基因型的不同表型特征。

在一個實施方案中，使用顯微術(shù)測定細胞的表型特征。用于監(jiān)測和測定表型的顯微術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有若干優(yōu)點。例如，熒光顯微術(shù)允許對多世代的細胞譜系(cell linages)進行廣泛縮時攝影(extensive time laps)，單分子檢測靈敏度以及以任何方式監(jiān)測對不斷變化的生長條件的瞬時響應(yīng)的可能性。因此，可以在延長的時間段內(nèi)而不是如在FACS中僅在單個時間點處并行地監(jiān)測細胞系的表型。

可以根據(jù)實施方案使用顯微術(shù)監(jiān)測和測定的表型特征的非限制性而是說明性的實例包括各種分子(諸如核糖核酸(RNA)或蛋白質(zhì))的細胞形態(tài)、空間和/或時間表達模式，特定代謝產(chǎn)物的水平，諸如響應(yīng)于不同的物理或化學刺激或試劑的添加的壽命或生長速率變化，細胞之間的基因表達水平變化，胚胎發(fā)育，報告蛋白或RNA適體的亮度等。

因此，如果需要，可以長時間在顯微鏡下并行地進行對細胞株的表型鑒定。此外，表型鑒定是在不了解文庫中各個細胞株的基因型的知識的情況下進行的。在清晰對比下，表型鑒定替代地測定培養(yǎng)裝置中的每個空間上界定和分開的位置處的相應(yīng)的表型特征。例如，假設(shè)細胞株的待測定的相關(guān)表型特征是在添加測試試劑之后，具有可變基因調(diào)控區(qū)或編碼序列的熒光報告蛋白靶基因的基因表達。在這種情況下，顯微術(shù)可以用于拍攝培養(yǎng)裝置的圖像，在所述圖像中可以可視地確定相應(yīng)的基因表達水平。然后可以將每一個別基因表達水平量化，以獲得培養(yǎng)裝置中的每個空間上界定和分開的位置的相應(yīng)值。因此，表型鑒定的測定輸出可以是培養(yǎng)裝置中的每個空間上界定和分開的位置的一個或多個相應(yīng)值的列表或矩陣。

有利地，如果所述在空間上界定的位置被標記、編號或標示，則易于定義在空間上界定的位置和表型之間的關(guān)系，即，哪個在空間上界定的位置對應(yīng)于哪種表型。還可能在在空間上界定的位置之間的距離或順序方面來界定空間位置。

例如，列表可以是位置0＝值0，位置1＝值1，位置2＝值2，等等的形式。矩陣可以相應(yīng)地為位置(x,y)＝值0，位置(x+1,y)＝值1的形式，等等。

在一個實施方案中，測定表型特征包括在培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)細胞期間使用顯微術(shù)測定每個細胞株的表型特征?？梢栽谒鰧嵤┓桨钢惺褂玫娘@微術(shù)技術(shù)的實例包括例如亮視野顯微術(shù)、相差顯微術(shù)、熒光顯微術(shù)、光片顯微術(shù)，或任何類型的超分辨率成像模式，諸如受激發(fā)射損耗(STED)顯微術(shù)、光激活定位顯微術(shù)(PALM)、近場掃描光學顯微術(shù)(NSOM)、4Pi顯微術(shù)、結(jié)構(gòu)照明顯微術(shù)(SIM)、基態(tài)損耗(GSD)顯微術(shù)、光學間距精密顯微術(shù)(SPDM)、隨機光學重建顯微術(shù)(STORM)。此外，還可以使用細胞內(nèi)單粒子追蹤(SPT)或熒光相關(guān)光譜(FCS)。顯微鏡分析可以在固定時間點或使用延時成像進行。

其它表型測量法也是可能的，諸如使用原子力顯微術(shù)測量機械性質(zhì)，使用指示劑染料或微電極測量膜電位，使用質(zhì)譜成像技術(shù)或指定的生物傳感器陣列測量小分子分泌。直接連接到培養(yǎng)裝置的近場光學陣列檢測器也是可能的。

一旦已經(jīng)測定了細胞株的表型特征，就優(yōu)選地將細胞固定在培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置處?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)進行細胞固定。例如，甲醛可用于細胞固定。在一個非限制性實例中，將細胞用4％的甲醛固定約15分鐘或用3％(w/v)的多聚甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液固定約30分鐘。

在一個實施方案中，將固定的細胞透化，然后再進行原位基因分型。可以根據(jù)實施方案使用傳統(tǒng)上用于細胞透化的各種方案。例如，可以使用曲拉通X-100(諸如0.25％曲拉通X-100)或另一種表面活性劑如非離子表面活性劑?；蛘?，可以使用乙醇，諸如70％乙醇，來進行細胞透化。其它實例包括鹽酸(諸如0.1M鹽酸)任選地與蛋白酶(諸如胃蛋白酶，例如0.01％的胃蛋白酶)或溶菌酶組合來降解細菌細胞壁。

在一個實施方案中，在固定之前，細胞經(jīng)誘導而表達或激活一種或多種酶來修飾或擴增可變序列或可變序列的部分。非限制性實例包括激活或鈍化導致條形碼和鄰近序列轉(zhuǎn)錄成RNA的轉(zhuǎn)錄因子或RNA聚合酶，從染色體DNA切割可變序列的限制性內(nèi)切酶，切除包含可變序列的DNA的轉(zhuǎn)座酶，連接ssDNA或dsDNA以形成用于滾環(huán)擴增的模板的連接酶，等等。

原位基因分型包括對培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置處的每個細胞株的可變區(qū)的至少一部分進行原位基因分型。因此，對每個細胞株的整個可變區(qū)進行原位基因型不是絕對必要的。因此，本文所用的原位測序包括對可變區(qū)的至少一部分或?qū)嶋H上整個可變區(qū)進行原位測序。原位測序優(yōu)選輸出顯示不同細胞株之間的任何可變區(qū)中核苷酸差異以及在何處這些核苷酸差異產(chǎn)生不同表型的信息。

在一個實施方案中，原位基因分型是基于如在例如Science,2014,343(6177):1360-1363中描述的熒光原位測序(FISSEQ)技術(shù)。簡言之，在FISSEQ中，在逆轉(zhuǎn)錄(RT)期間通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶和結(jié)合氨基烯丙基脫氧尿苷5’-三磷酸鹽(dUTP)來在經(jīng)固定的細胞中產(chǎn)生細胞內(nèi)的cDNA擴增子。使用BS(PEG)9重新固定cDNA，BS(PEG)9是具有4nm間隔區(qū)的胺反應(yīng)性連接物。然后將cDNA片段環(huán)化，之后進行滾環(huán)擴增(RCA)。然后使用BA(PEG)9交聯(lián)含有氨基烯丙基dUTP的RCA擴增子。然后可以使用SOLiD連接法測序來對RCA擴增子中的相關(guān)序列進行測序以獲得可變區(qū)的核苷酸序列。

在一個實施方案中，對可變區(qū)進行原位基因分型優(yōu)選包括對培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置處的可變區(qū)或可變區(qū)的至少一部分進行連接法原位測序。連接法測序依賴于脫氧核糖核酸(DNA)連接酶對堿基對錯配的敏感性。通常，待測序的可變區(qū)優(yōu)選為單鏈DNA序列的形式，其在至少一端側(cè)接有將用作錨定引物結(jié)合序列的已知序列。使與已知序列互補的錨定引物與已知序列結(jié)合。

然后根據(jù)將測序的位置，引入通常用熒光染料標記、通常為八至九個堿基長的探針寡核苷酸的混合池。使這些標記的寡核苷酸與和錨定引物相鄰的可變區(qū)雜交，并且當一寡核苷酸的序列與所述未知可變區(qū)匹配時，DNA連接酶優(yōu)先將所述寡核苷酸連接到所述錨定引物?；谟煞肿赢a(chǎn)生的熒光，可以推斷可變區(qū)的此位置處的堿基的同一性。

寡核苷酸探針還可以用可切割的連接物來構(gòu)建，可以在辨識標記后切割所述可切割的連接物。這將去除標記并在所連接探針的末端重新產(chǎn)生5'-磷酸根，從而使新一輪連接成為可能。此連接和切割循環(huán)可以重復(fù)若干次以讀取更長的序列。此技術(shù)對可變區(qū)中的每N個堿基進行測序，其中N是切割后留下的探針的長度。為了對可變區(qū)中的跳過位置進行測序，可以從可變區(qū)中去除錨定引物和連接的寡核苷酸，并用縮短一個或多個堿基的錨定引物開始另一輪連接法測序(sequencing by ligation)。

另一種技術(shù)是進行重復(fù)輪次的單一連接，其中標記對應(yīng)于探針中的不同位置，隨后去除錨定引物和連接的探針。

連接法測序可以在任一方向(5'-3'或3'-5')中進行，具體取決于寡核苷酸探針的哪一端用標記封閉。

在一個實施方案中，所測序的序列優(yōu)選是通過逆轉(zhuǎn)錄從可變區(qū)獲得的RNA轉(zhuǎn)錄物而獲得的互補DNA(cDNA)序列。在此實施方案中，可變區(qū)側(cè)接有錨定引物將結(jié)合至的至少一個已知序列。

可以對固定的細胞進行連接法測序以實現(xiàn)對培養(yǎng)裝置中的在空間上界定和分開的位置處的可變區(qū)或可變區(qū)的至少一部分進行連接法原位測序，參見例如Science 2014,343:1360-1363和Nature Methods 2013,10:857-860，所述文獻的教導以引用關(guān)于執(zhí)行連接法原位測序的方式并入本文。

簡言之，在一種變形中，通過在逆轉(zhuǎn)錄之后使用RNA酶降解mRNA鏈，來將從可變區(qū)獲得的RNA或進一步參見下文的條形碼復(fù)制成cDNA。

在第一實施方案中，鎖式探針結(jié)合至cDNA，其中探針末端之間的缺口位于靶向用于連接法測序的堿基上。此缺口通過DNA聚合和DNA連接填充以產(chǎn)生DNA環(huán)。

在第二實施方案中，僅通過ssDNA連接進行cDNA環(huán)化。

在第三實施方案中，用例如限制性內(nèi)切酶或轉(zhuǎn)座酶從周圍DNA中切除包括可變序列的至少一部分和相鄰DNA的dsDNA。然后可以用內(nèi)切核酸酶將切除的dsDNA消化成ssDNA，以便自雜交并連接形成環(huán)狀DNA。

在任一情況下，通過靶序列引發(fā)的滾環(huán)擴增(RCA)來擴增所形成的DNA環(huán)，從而產(chǎn)生滾環(huán)產(chǎn)物(RCP)，所述RCP經(jīng)受連接法測序。將錨定引物雜交在靶序列緊鄰處，然后連接寡核苷酸探針。在一個實施方案中，寡核苷酸探針由具有八個隨機位置(N)和一個固定位置(A、C、G或T)的9聚體的四個文庫組成。每個文庫用四種熒光染料中的一種標記。將在固定位置具有最佳匹配的寡核苷酸探針與其熒光標記一起通過連接并入。將樣品成像，并且每個RCP顯示出對應(yīng)于匹配堿基的顏色。滌除所述寡核苷酸探針，然后施加用于下一堿基的寡核苷酸探針。重復(fù)連接、洗滌、成像以及去除的步驟，直到已經(jīng)讀取了所需數(shù)目的堿基。

在另一實施方案中，原位基因分型包括對培養(yǎng)裝置中的在空間上界定和分開的位置處的可變區(qū)或可變區(qū)的至少一部分進行合成法原位測序。

例如，加入含有阻遏進一步聚合的終止物的四種類型的經(jīng)修飾dNTP。終止物還含有可以用相機檢測到的熒光標記。滌除未并入的核苷酸并拍攝熒光標記的核苷酸的圖像。從DNA中化學去除熒光標記以及終止物，以允許進行下一測序循環(huán)。

原位基因分型的結(jié)果優(yōu)選是每個細胞株的可變區(qū)或可變區(qū)的至少一部分的核苷酸序列。此外，每個核苷酸序列連接至培養(yǎng)裝置中相應(yīng)的空間上界定和分開的位置。這是可能的，因為基因分型是作為原位基因分型進行的，諸如連接法或合成法原位測序。原位(in situ)在本文中意味著在原地(on site)或在適當位置(in position)處，即在培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置處進行基因分型。

先前描述的表型分析的輸出是培養(yǎng)裝置中的每個空間上界定和分開的位置的相應(yīng)測定的表型特征，諸如以列表或矩陣的形式列出在每個空間上界定和分開的位置處所測定的表型特征。

原位基因分型的輸出是在培養(yǎng)裝置中的每個空間上界定和分開的位置處所測定的可變區(qū)的核苷酸序列。此輸出還可以是列出在每個空間上界定和分開的位置處所測定的核苷酸序列的列表或矩陣形式。

例如，列表可以是位置0＝序列0，位置1＝序列1，位置2＝序列2，等等的形式。矩陣可以為位置(x,y)＝序列0，位置(x+1,y)＝序列1的形式，等等。

然后，可以基于培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置將每種相應(yīng)的表型特征與每種相應(yīng)的基因型相關(guān)聯(lián)或相關(guān)。例如，在培養(yǎng)裝置中位置0處所測定的細胞株的細胞的表型特征是此細胞株的細胞的基因型結(jié)果，并且此基因型是從位置0處所測定的核苷酸序列獲得的。因此，表型和基因型的關(guān)聯(lián)可以簡單地通過匹配在培養(yǎng)裝置中的每個空間上界定和分開的位置處測定的表型特征和基因型來實現(xiàn)。

在一個實施方案中，每個細胞株在其遺傳物質(zhì)中，優(yōu)選在其基因組100中具有相應(yīng)的株系特異性條形碼序列140，參見圖8。在這種情況下，原位基因分型優(yōu)選地包括通過對培養(yǎng)裝置1中的空間上界定和分開的位置處的每個細胞株的相應(yīng)條形碼序列140的至少一部分進行原位測序來測定相應(yīng)的基因型。

因此，條形碼序列140提供了測定細胞株中的可變區(qū)150的橋梁。具體地，原位基因分型可以通過原位測序來進行，諸如通過對相對短得多的條形碼序列140進行連接法或合成法原位測序，而不是對可變區(qū)150進行測序。然后可以基于所測序的條形碼序列140和如下所述的映射信息獲得可變區(qū)150的核苷酸序列。

所述方法優(yōu)選地包括測定指定每個可變區(qū)150和相應(yīng)條形碼序列140之間的關(guān)聯(lián)的映射信息。測定相應(yīng)基因型則優(yōu)選地包括基于相應(yīng)條形碼序列的經(jīng)原位測序的至少一部分和映射信息來測定相應(yīng)基因型。

因此，映射信息可以被視為查找表，所述查找表在給定條形碼序列140的至少一部分的輸入核苷酸序列的情況下輸出可變區(qū)150的核苷酸序列。因此，映射信息可以是列出每個可變區(qū)150的相應(yīng)條形碼序列140的表格形式。

可以結(jié)合細胞株文庫的產(chǎn)生來獲得所述映射信息。例如，基因組工程可用于產(chǎn)生在可變區(qū)150方面具有遺傳多樣性的大型細胞株文庫，如由圖8中的各個點突變155所示。此類技術(shù)還可以用于針對不同可變區(qū)150定制相應(yīng)條形碼序列140。例如，可以設(shè)計細胞株文庫，使得條形碼序列no.1包含在具有可變序列no.1的細胞株的基因組100中，等等。這通常需要將條形碼140嵌入在可變區(qū)150中或其緊鄰處。

在另一個實施方案中，條形碼序列140和可變區(qū)150不是在相同反應(yīng)中引入的。則可以通過以下方式測定映射信息：對成批細胞株的文庫進行測序，以獲得每個細胞株的序列讀數(shù)(sequence read)，所述序列讀數(shù)包含可變區(qū)150和相應(yīng)的特異性條形碼序列140。這允許如可以在單個測序讀取中進行的那樣使條形碼序列140與可變區(qū)150遠離。

因此，以成批方式對文庫中大部分細胞的基因組或染色體的相關(guān)區(qū)域進行測序，使得個別讀數(shù)包含可變區(qū)150和條形碼序列140。成批測序的結(jié)果優(yōu)選是每個細胞株的序列讀數(shù)的核苷酸序列。由此，可以將此信息存儲并用作映射信息。

還可以將條形碼序列140引入染色體中的另一位置中或保持在可移動遺傳元件如質(zhì)粒中。在這些情況下，與此同時通過將可變區(qū)150和條形碼序列140引入細胞中的方法將條形碼序列140連接至可變區(qū)150。例如，可以將可變區(qū)150作為質(zhì)粒的一部分遞送至細胞，所述質(zhì)粒還運載相應(yīng)的條形碼序列140。

在一個實施方案中，每個細胞株具有構(gòu)建體，所述構(gòu)建體在其基因組100中包含相應(yīng)的株系特異性條形碼序列140和可變區(qū)150，所述可變區(qū)150側(cè)接有已知核苷酸序列的文庫共有引物結(jié)合序列160、170。所述文庫共有引物結(jié)合序列160、170可用于擴增相應(yīng)的株系特異性條形碼序列140。或者，至少一個文庫共有引物結(jié)合序列160、170可用于對直接來自基因組100或通過將轉(zhuǎn)錄的RNA序列200(參見圖9)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA序列300(參見圖10)獲得的相應(yīng)株系特異性條形碼序列140進行測序。

因此，在此實施方案中，每個細胞株在其基因組100或可移動遺傳元件中具有條形碼序列140。當創(chuàng)建如本文先前所述的細胞株文庫時，有利地與可變區(qū)150一起創(chuàng)建條形碼序列140。條形碼序列140是株系特異性的，這意味著每個細胞株，即每個基因型或版本的可變區(qū)150，具有其自身針對條形碼序列140的特定核苷酸序列。因此，所述文庫優(yōu)選不含有具有不同可變區(qū)150但具有相同條形碼序列140的兩種不同細胞株。

與株系特異性條形碼序列140相反，至少一個引物結(jié)合序列160、170優(yōu)選是文庫共有的或株系共有的，這意味著此至少一個引物結(jié)合序列160、170優(yōu)選在文庫的所有細胞株中具有相同的核苷酸序列。因此，與引物結(jié)合序列160互補或與引物結(jié)合序列160、170互補的一個相同的引物或引物對可由此出于擴增或測序目的而用于所有細胞株中。

在第一實施方案中，構(gòu)建體包含一個文庫共有引物結(jié)合序列160、170。在這種情況下，文庫共有引物結(jié)合序列160可以提供在條形碼序列140(和可變區(qū)150)的上游，或文庫共有引物結(jié)合序列170位于條形碼序列140(和可變區(qū)150)的下游。

在第二實施方案中，構(gòu)建體包含二個文庫共有引物結(jié)合序列160、170。在這種情況下，一個優(yōu)選地提供在條形碼序列140(和可變區(qū)150)的上游，而另一個提供在條形碼序列140(和可變區(qū)150)的下游，如圖8所示。然后，可將這兩個文庫共有引物結(jié)合序列160、170用作條形碼序列140周圍的鎖式探針結(jié)合位點。

圖8示出了文庫中的細胞株中的基因組100的一部分的實例。圖9示出了通過對具有株系特異性條形碼序列140、可變區(qū)150和至少一個文庫共有引物結(jié)合序列160、170的構(gòu)建體進行轉(zhuǎn)錄而獲得的轉(zhuǎn)錄RNA序列200或mRNA序列200。圖10示出了通過逆轉(zhuǎn)錄圖9的RNA序列200獲得的cDNA序列300。

在圖8至圖10中，已使用了參考標記1X0、2X0、3X0，其中X＝3-7以表示基因組100中、轉(zhuǎn)錄的RNA序列200中或cDNA序列300中的相應(yīng)核苷酸序列部分。

圖8另外示出了用于轉(zhuǎn)錄包含株系特異性條形碼序列140、可變區(qū)150和至少一個文庫共有引物結(jié)合序列160、170的構(gòu)建體的啟動子序列110?；蚪M100可任選地包含至少一個調(diào)控序列120，其控制啟動子序列110和構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄。

在一個實施方案中，文庫共有引物結(jié)合序列160、170用于例如通過原位聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)來擴增株系特異性條形碼序列140并且以及任選地擴增可變區(qū)150。在對所述株系特異性條形碼序列140進行原位測序之前擴增至少所述株系特異性條形碼序列140可為有利的，以便獲得足夠拷貝數(shù)的株系特異性條形碼序列140來進行原位測序。

可以直接對細胞文庫中的基因組序列100進行擴增。然而，可優(yōu)選地首先執(zhí)行對轉(zhuǎn)錄RNA序列200的原位逆轉(zhuǎn)錄，所述轉(zhuǎn)錄RNA序列200是通過對基因組100中具有株系特異性條形碼序列140、可能的可變區(qū)150和至少一個文庫共有引物結(jié)合序列160、170的構(gòu)建體進行轉(zhuǎn)錄而獲得的。在這種情況下，將與RNA序列200中的文庫共有引物結(jié)合序列260互補的DNA引物360與逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA依賴性DNA聚合酶一起加入，以原位產(chǎn)生如圖9所示意性圖示的cDNA序列300。然后對所產(chǎn)生的cDNA序列300進行擴增。

在一個實施方案中，擴增可以是通過在使用單鏈DNA(ssDNA)連接酶或鎖式探針的雜交和連接環(huán)化后進行滾環(huán)擴增(RCA)來原位擴增cDNA序列300的形式?；蛘撸琧DNA序列300的原位擴增可以通過原位PCR進行。

用于從cDNA序列形成環(huán)狀DNA序列的鎖式探針的使用描述于Nature Methods 2013,10：857-860中，參見例如該文獻中的圖1。

然后可以用DNA聚合酶以及與cDNA序列300中的文庫共有引物結(jié)合序列360互補的DNA引物擴增所得cDNA序列300。然后可以如本文進一步描述的那樣進行對所得cDNA序列300中的株系特異性條形碼序列360的原位測序。

在一個實施方案中，所述方法包括通過在切除，優(yōu)選原位或體內(nèi)切除來自遺傳物質(zhì)100的相應(yīng)株系特異性條形碼序列140后進行滾環(huán)擴增，來原位擴增來自遺傳物質(zhì)100的相應(yīng)株系特異性條形碼序列140或?qū)碜赃z傳物質(zhì)100的相應(yīng)株系特異性條形碼序列140進行原位測序。

優(yōu)選地使用消化或轉(zhuǎn)座作用從遺傳物質(zhì)100中切除相應(yīng)的株系特異性條形碼序列140。所述方法優(yōu)選還包括通過雜交鎖式探針，或通過ssDNA連接或通過在自雜交后進行dsDNA連接，來以外切核酸酶反應(yīng)從所切除的株系特異性條形碼序列140形成ssDNA。

所述至少一個文庫共有引物結(jié)合序列160、170可以替代地或另外用于對來自基因組100的相應(yīng)株系特異性條形碼序列140進行測序。在這種情況下，文庫共有引物結(jié)合序列160將對應(yīng)于用于連接法原位測序的錨定引物結(jié)合序列或用于合成法原位測序的引物結(jié)合序列。

可以直接對如上所述的細胞株的基因組100進行原位測序。然而，一般優(yōu)選地通過逆轉(zhuǎn)錄RNA序列200來產(chǎn)生cDNA序列300，所述RNA序列200是通過對基因組100中包含株系特異性條形碼序列140、可變區(qū)150和至少一個文庫共有引物結(jié)合序列160、170的構(gòu)建體進行轉(zhuǎn)錄而獲得的。在這種情況下，有可能在開始對株系特異性條形碼序列340進行原位測序之前原位擴增cDNA序列300。

還有可能通過使用等溫擴增技術(shù)，諸如環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)、鏈置換擴增技術(shù)(SDA)、解旋酶依賴性擴增(HAD)或切口酶擴增反應(yīng)(NEAR)來直接擴增包含條形碼序列140的基因組區(qū)域。

在另一實施方案中，通過使用介導兩個末端的雜交和連續(xù)連接的逆轉(zhuǎn)錄引物使cDNA 300自連接來形成RCA模板。例如，cDNA 300在其已經(jīng)自雜交后連接至優(yōu)選地至少6個堿基對以上的帶切口的雙鏈DNA。

在一個實施方案中，所述方法包括使用與轉(zhuǎn)錄的RNA序列200中的至少一個文庫共有引物結(jié)合序列260互補的引物360以及逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA依賴性DNA聚合酶，從轉(zhuǎn)錄的RNA序列200合成每個細胞株的cDNA序列300。在這種情況下，原位測序優(yōu)選地包括對培養(yǎng)裝置1中的空間上界定和分開的位置處的每個細胞株的cDNA序列300中的相應(yīng)株系特異性條形碼序列340的至少一部分進行原位測序。

原位測序可以通過對相應(yīng)的株系特異性條形碼序列340的至少一部分進行連接法或合成法原位測序來進行。

株系特異性條形碼序列340的原位測序可以使用先前提及的至少一個文庫共有引物結(jié)合序列360、370來進行?；蛘?，可以在基因組100中，優(yōu)選直接在條形碼序列140的上游，提供專用的測序引物結(jié)合序列130。此測序引物結(jié)合序列130優(yōu)選具有已知的核苷酸序列，并且有利地對于文庫中所有細胞株是文庫共有的。

在此方法中，至少一個文庫共有引物結(jié)合序列160、170主要用于逆轉(zhuǎn)錄和擴增目的，而測序引物結(jié)合序列130用于對株系特異性條形碼序列140進行原位測序。

在一個具體實施方式中，僅將條形碼序列140與側(cè)接序列160、170一起轉(zhuǎn)錄，以擴增或環(huán)化相應(yīng)的cDNA，參見圖11。在距可變區(qū)150一定距離處整合轉(zhuǎn)錄的條形碼序列140，但是當對細胞文庫的相應(yīng)區(qū)域進行成批測序時，可以通過個別序列讀數(shù)獲得可變區(qū)150和條形碼序列140之間的映射。此實施方式的優(yōu)點在于，條形碼序列140及其側(cè)接區(qū)域160、170可以獨立于可變區(qū)域150的結(jié)構(gòu)來選擇，只要條形碼序列140具有比可變區(qū)域150大得多的多樣性。例如，15個堿基對(bp)的隨機條形碼序列將允許4¹⁵至10⁹種不同的條形碼組合。如果相應(yīng)的可變區(qū)具有10⁶個變體，則一個條形碼序列匹配兩個不同的可變區(qū)的風險僅為0.001。

圖12示出從圖11所示的基因組100的轉(zhuǎn)錄部分獲得的cDNA序列300。如先前所述，cDNA序列300中側(cè)接條形碼序列或區(qū)域340的兩個文庫共有引物結(jié)合序列360、370可用于擴增、鎖式探針測量或錨定引物連接。

一旦已測定株系特異性條形碼序列140的核苷酸序列，就可以使用映射信息來獲得與此特定株系特異性條形碼序列140匹配的可變區(qū)150的相應(yīng)核苷酸序列。優(yōu)選對文庫中的每個細胞株進行此舉以測定不同的基因型。因此，結(jié)果是培養(yǎng)裝置中每個空間上界定和分開的位置處的相應(yīng)基因型。然后將基因型與先前測定的表型特征相匹配或相關(guān)聯(lián)，從而提供關(guān)于導致細胞株文庫中所測定的表型特征的特定基因型的信息。

在一個實施方案中，細胞株文庫的特征在于不同的細胞株從不同條形碼化的染色體外遺傳元件表達不同的RNA產(chǎn)物。RNA產(chǎn)物可以是例如dCas9的mRNA、iRNA或指導RNA。

所述實施方案的另一方面涉及一種用于鑒定在細胞株的基因組的至少一部分中具有不同可變區(qū)的多個細胞株的文庫的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括被配置成在所述培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置處培養(yǎng)細胞株的細胞的培養(yǎng)裝置。所述系統(tǒng)還包括第一試劑盒，所述第一試劑盒包含用于在將細胞固定在培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置處之后對每個細胞株的可變區(qū)進行原位基因分型的組分。通過使用此類系統(tǒng)，可以基于培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置將每個細胞株的相應(yīng)表型特征與每種相應(yīng)基因型關(guān)聯(lián)。

在一個實施方案中，所述系統(tǒng)還包括配置成測定培養(yǎng)裝置中的每個細胞株的表型特征和基因型的顯微鏡。因此，所述系統(tǒng)的顯微鏡用于監(jiān)測和測定培養(yǎng)裝置中的相應(yīng)空間上界定和分開的位置處的細胞株的相應(yīng)表型特征。在原位測序期間優(yōu)選也使用顯微鏡，以便讀出熒光信號。

在一個實施方案中，所述系統(tǒng)還包括多個細胞株的文庫。此細胞株文庫可以如前所述使用用于基因組工程的技術(shù)產(chǎn)生，以產(chǎn)生具有不同基因型的大型文庫。

在此類文庫中，將提供可變區(qū)和條形碼序列之間的映射，使得優(yōu)選地僅需要對條形碼序列進行測序來測定基因型。

所述文庫可以例如是基于對來自特定生物體的細胞中的每個基因的活性的有條件抑制或激活。例如，可變區(qū)可以編碼生物體中每個轉(zhuǎn)錄區(qū)的一個或幾個短指導RNA，使得個別基因的基因活性可以通過dCas9介導的調(diào)控來改變。

所述系統(tǒng)的培養(yǎng)裝置可以根據(jù)各種實施方案構(gòu)建。在一個實施方案中，所述培養(yǎng)裝置是包括多個孔、貼片或區(qū)室的培養(yǎng)裝置或平板，優(yōu)選所述文庫的每個細胞株至少一個孔、貼片或區(qū)室。例如，具有數(shù)千個孔(諸如96×96個孔)的細胞板可用于出于細胞培養(yǎng)目的的標記。此類細胞板可以用作所述實施方案中的培養(yǎng)裝置。在這種情況下，每個孔對應(yīng)于培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置。

所述培養(yǎng)板優(yōu)選地是對于成像透明的塑料材料或玻璃，或直接構(gòu)建在空間上可尋址的生物傳感器或光探測器陣列上。

在另一個實施方案中，培養(yǎng)裝置是具有多個空間上界定和分開的貼片的基板，其中細胞株的細胞可以粘附和生長在所述貼片處?；鍍?yōu)選由對于成像透明的塑料材料或玻璃制成。在一個實施方案中，所述基板可以是具有多個微孔的顯微鏡載玻片形式，所述多個微孔構(gòu)成了培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置?？梢匀芜x地處理或涂覆微孔的表面以促進細胞粘附。

一種替代方法是使顯微鏡載玻片或其它基板具有多個貼片，所述多個貼片構(gòu)成了所述顯微鏡載玻片或其它基板的已經(jīng)表面處理或涂覆以助于和促進細胞粘附的相應(yīng)部分。這意味著文庫的細胞將容易粘附并生長在貼片上，但是細胞不能有效地粘附到?jīng)]有促進粘附的表面處理或涂覆的顯微鏡載玻片或其它基板的中間表面部分。這意味著通過將培養(yǎng)基加入到顯微鏡載玻片或其它基板，中間表面部分上存在的任何細胞將被沖洗掉，而在貼片上生長的細胞保持牢固地粘附到所述表面。當稀疏地接種時，這種格式將支持等基因細胞在每個貼片處的生長。

貼片或孔可以用例如聚賴氨酸、膠原、纖連蛋白，層粘連蛋白(lamninin)和/或明膠涂覆。

關(guān)于可以根據(jù)實施方案使用的培養(yǎng)裝置的更多信息可以在Wang等人，Current Biology 20,1099-1103,2010中找到。

在一個實施方案中，培養(yǎng)裝置是微流體裝置1，參見圖1至圖7。微流體裝置1包括對于成像透明的基板10，并且具有多個空間上界定和分開的細胞通道20。細胞通道20具有用于容納單層細胞的尺寸。多個空間上界定和分開的細胞通道20的相應(yīng)末端22與流量通道30流體連通，流量通道30在流量通道30的第一端32處具有流體源31并且在流量通道30的第二端34處具有流體槽33。

基板10具有多個細胞通道20，細胞株的細胞在所述多個細胞通道20中培養(yǎng)。細胞通道20可以如圖1和圖3至圖7所示平行布置，其中相應(yīng)末端22與流量通道30流體連通并從此流量通道30延伸。為了增加細胞通道20的總數(shù)量，細胞通道20可以從流量通道30的任一縱向側(cè)延伸，從而與僅在流量通道30的一側(cè)上具有細胞通道20相比，實質(zhì)上使細胞通道20的數(shù)量加倍，參見圖6。

此外，細胞通道20和流量通道30在基板10中的更復(fù)雜布置也是可能的，以增加流量通道30的數(shù)量，參見圖7。重要的特征是每個細胞通道20具有與流量通道30流體連通的末端22，并且細胞通道20是分開的，以防止細胞從一個細胞通道20逸出并進入另一個細胞通道20。

細胞通道20的尺寸經(jīng)設(shè)定以用于容納單層細胞。這意味著，細胞通道20的高度或直徑被選擇為大約或略大于文庫中的細胞的直徑。例如，細胞通道20的橫截面可以如圖2和圖4所示是基本上方形的，其中通道側(cè)基本上與細胞的細胞直徑匹配。或者，細胞通道可具有直徑基本上匹配細胞直徑的圓形或U形橫截面。其它橫截面構(gòu)造也是可能的，只要細胞可以在細胞通道20中可存活地培養(yǎng)，優(yōu)選以單層培養(yǎng)。這意味著細胞通道20可以是若干細胞寬，但優(yōu)選地僅一個細胞高。在這種情況下，細胞可以在細胞通道中生長以形成2D單層，所述2D單層可以比一個細胞更寬，但優(yōu)選地仍然是單層。與在單行(一個細胞寬)中生長細胞相比，2D單層通常有利于細胞的相襯成像。

流量通道30優(yōu)選地具有明顯大于細胞直徑的尺寸。這意味著將通過使培養(yǎng)基從流體源31穿過流量通道30并朝向流動槽33優(yōu)選連續(xù)流動來穿過流量通道30朝向流體槽33沖洗進入流量通道30的任何細胞。

通過在每個細胞通道20中加入相應(yīng)細胞株的細胞來接種所述文庫的細胞。從而允許細胞沿著細胞通道20的長度以單層生長。每個細胞通道20由此包含單一細胞株和基因型的細胞。如果細胞通道20是一個細胞寬，則細胞通道20中的細胞可以被視為一串上的珍珠。如果細胞通道20更寬，則細胞將在細胞通道20中形成2D層。

生長和緩和經(jīng)過細胞通道20的末端22的細胞將進入流量通道30并因此被沖去。細胞通道20的另一個相對末端28優(yōu)選地經(jīng)封閉或尺寸設(shè)定以防止細胞從此末端28逸出?；蛘?，細胞通道20的這些末端28可與第二流量通道流體連通。在這種情況下，將從該第二流量通道中的培養(yǎng)基流沖去從細胞通道20逸出的任何細胞。

流體源31用于將培養(yǎng)基輸入流量通道30中并進一步進入細胞通道20中。使培養(yǎng)基穿過流動槽33排出。優(yōu)選地存在從流體槽31穿過流量通道30，進入細胞通道20并從流體槽33流出的培養(yǎng)基的連續(xù)流動。

所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有文庫中的細胞所需用于支持細胞存活以及任選地細胞生長的成分。所使用的具體培養(yǎng)基取決于細胞文庫的類型并且可以由系統(tǒng)的用戶選擇。

還可以使用流體源31將任何化學試劑或藥物作為測試試劑加入細胞通道20中的細胞中，例如通過向進入流體源31的培養(yǎng)基中加入至少一種測試試劑。在這種情況下，可以例如通過顯微術(shù)測定細胞株對培養(yǎng)裝置1中的至少一種測試試劑的表型響應(yīng)。

細胞通道20的內(nèi)表面或至少其底表面可以經(jīng)過表面處理或涂覆以促進細胞粘附和/或減少酶促步驟中的酶和探針結(jié)合。

圖1和圖2示出了圖1中的微流體裝置1沿著線A-A的橫截面圖，示出了相對于現(xiàn)有技術(shù)顯著改善培養(yǎng)基穿過細胞通道20的流動并且還促進在將細胞固定在細胞通道20中之前、期間和之后細胞通道20中的細胞的細胞加載、洗滌和溫育步驟的實施方案。

在所示實施方案中，每個細胞通道20沿其縱向側(cè)24、26中的至少一個側(cè)接有相應(yīng)的洗滌通道40，所述洗滌通道40具有與流量通道30流體連通的第一端42和與洗滌槽50流體連通的第二相對末端44。洗滌通道40的尺寸太小而不能容納細胞。

在一個實施方案中，每個細胞通道20具有至少一個與細胞通道20流體連通并沿其縱向側(cè)24、26中的一個布置的洗滌通道40。如圖1和圖2所示的實施例具有沿著每個細胞通道20的兩個縱向側(cè)24、26布置的洗滌通道40。

在一個實施例中，洗滌通道40可以互連(諸如)在其末端44中的一個或兩個處，從而在細胞通道20周圍形成連續(xù)洗滌層。

洗滌通道40(或洗滌層)的尺寸，諸如深度、高度和/或?qū)挾龋《荒苋菁{細胞。這意味著存在于細胞通道20中的細胞不能進入相鄰的洗滌通道40，而是保留在細胞通道20中。圖2清楚地示出洗滌通道40與細胞通道20相比深度相對較小。洗滌通道40可具有任何橫截面構(gòu)造，諸如方形、矩形、圓形、U形等。

在一個實施方案中，洗滌通道40形成如圖1所示的洗滌層。這意味著，洗滌通道40不僅沿著細胞通道20的縱向側(cè)24、26存在，而且還從細胞通道20的相應(yīng)第二端28延伸到槽通道52。因此，第一組洗滌通道40沿著細胞通道20行進并從流量通道30延伸到槽通道52。第二組洗滌通道40從細胞通道20的第二端28開始并在槽通道52處結(jié)束。第一組和第二組洗滌通道40一起形成洗滌層。

細胞通道20當從其在流量通道30處的第一端22行進至其第二端28時，優(yōu)選地具有基本相同的深度。此深度優(yōu)選對應(yīng)于或稍大于細胞直徑，以允許細胞通道20中的單層細胞。當進入從第二28延伸到槽通道52的洗滌通道40時，在細胞通道40的第二端28處，深度將變淺。此更淺的深度，優(yōu)選小于細胞直徑，防止存在于細胞通道20中的細胞進入洗滌通道40。

下面簡要描述微流體裝置1的操作。

在細胞加載期間，細胞以及培養(yǎng)基進入流體源31并流入流量通道30中。在一個優(yōu)選實施方案中，流體槽33和洗滌槽40都敞開以允許培養(yǎng)基和細胞被推入細胞通道20中。當洗滌通道40(洗滌層)的深度太淺而不允許細胞進入槽通道52并到達洗滌槽50時，通過流體槽33洗出過量的細胞。培養(yǎng)基從洗滌槽50和流體槽33兩者排出微流體裝置1。

在微流體裝置1的操作期間，培養(yǎng)基如上所述進入流體源31。在第一實施方案中，洗滌槽50和流體槽33是敞開的。這意味著培養(yǎng)基不僅通過流體槽33而且還通過洗滌槽50排出。這意味著用于原位測序的培養(yǎng)基和試劑將有效地到達細胞通道20內(nèi)的所有細胞。過量的細胞將流入流量通道30并進一步從流體槽33流出，而培養(yǎng)基流經(jīng)所有細胞并進入槽通道50以及從洗滌槽50流出，以保持向所有細胞供給新鮮培養(yǎng)基。

在第二實施方案中，洗滌槽50閉合，使得培養(yǎng)基和過量細胞都通過流體槽33排出。與第一實施方案相比，此實施方案通常實現(xiàn)流經(jīng)細胞通道中的細胞的較不有效的細胞培養(yǎng)基流動。

在洗滌和反應(yīng)步驟中，洗滌槽50優(yōu)選是敞開的。這意味著洗滌流體或液體或含有反應(yīng)試劑的溶液進入流體源31，并且朝向洗滌槽50流過流量通道30、細胞通道20以及洗滌通道40。在一個實施方案中，流體槽33在洗滌步驟期間閉合。在另一個實施方案中，流體槽33在洗滌步驟期間敞開。在這種情況下，洗滌流體或液體可以通過洗滌槽50或流體槽33排出。

細胞洗滌可以在將細胞固定在細胞通道20中之前進行以滌除任何培養(yǎng)基，在細胞固定期間和/或在細胞固定之后進行以滌除固定用化學品如甲醛。當需要改變反應(yīng)組分和反應(yīng)介質(zhì)時，還可以結(jié)合原位基因分型進行洗滌和反應(yīng)步驟。

洗滌通道40優(yōu)選地在其末端44中通過槽通道52互連，所述槽通道52與洗滌槽50流體連通。在圖式中，此槽通道52平行于流量通道30，其中洗滌通道40在它們之間延伸。然而，盡管細胞通道20具有與流量通道30流體連通的一個末端22，但是另一末端優(yōu)選地終止于離開槽通道52一段距離處，以防止細胞從細胞通道20排出到槽通道52中。如果洗滌槽50在細胞培養(yǎng)期間敞開，使得存在從流體源31不僅朝向流體槽33還朝向洗滌槽50的培養(yǎng)基流，則這使得能夠在整個細胞通道20中實現(xiàn)均勻的生長條件。

細胞通道20和洗滌通道40優(yōu)選為敞開通道，如圖2所示。這意味著蓋板70優(yōu)選地位于基板10上以形成用于并密封單元通道20和洗滌通道40的蓋子。

基板10優(yōu)選地包括延伸穿過基板10的整個厚度以便增加其穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)或部分60。圖1和圖2示出了沿著細胞通道20的縱向長度提供在洗滌通道40的一些之間的柱形式的此類結(jié)構(gòu)60。這些柱可以具有任何形狀，只要它們支撐洗滌層并提供流動即可。它們可以例如是矩形、星形、圓形或三角形并且有規(guī)則地或不規(guī)則地定位。這些結(jié)構(gòu)60可以是如圖所示的分開結(jié)構(gòu)，以促進洗滌液體在整個洗滌層中，即在洗滌通道40之間的流動。在一種替代方法中，圖中所示的每列柱形成在流量通道30和槽通道52之間的整個長度上延伸的單一結(jié)構(gòu)。此類解決方案可能導致更穩(wěn)定的基板10，然而代價是效率較低的洗滌。

圖5示出了微流體培養(yǎng)裝置1的另一個實施方案。此實施方案沒有沿著細胞通道20的縱向側(cè)24、26行進的洗滌通道。在清晰的對比之下，支撐結(jié)構(gòu)60存在于相鄰的細胞通道20之間并且從流量通道30延伸到槽通道52，如圖所示。洗滌通道40優(yōu)選地存在并且從細胞通道20的第二端28延伸到槽通道52。因此，洗滌通道40的第一端42與細胞通道20的第二端28流體連通并且其第二相對端44與與槽通道52流體連通。與使用如圖1所示的柱狀結(jié)構(gòu)相比，此實施方案通常提供更穩(wěn)定的微流體裝置1。

細胞通道20的結(jié)構(gòu)可以是多路的，參見例如圖6和圖7。共同的特征是細胞機械地收縮以在單層中生長，并且它們被培養(yǎng)基、緩沖液、酶等淹沒而不被洗掉，因為它們物理上太大而無法被推入洗滌通道40中。還需要用于細胞通道的兩個槽，一個用于容納不配合單層的過量細胞，即流體槽33，以及一個用于容納流過細胞的培養(yǎng)基，即洗滌槽50。

圖6的微流體裝置1基本上多路復(fù)用兩個結(jié)構(gòu)，如圖5所示。這意味著，細胞通道20和洗滌通道40的兩個結(jié)構(gòu)(圖式中的左圖和右圖)共享共同的流量通道30，流量通道30在其第一端32處連接到流體源31并且在其第二端34連接到流體槽33。細胞通道20和洗滌通道20的各自結(jié)構(gòu)在相應(yīng)的槽通道52處結(jié)束，它們互連并連接到共同的洗滌槽50。

存在于左側(cè)結(jié)構(gòu)的細胞通道20中的細胞將與存在于附圖右側(cè)結(jié)構(gòu)的細胞通道中的細胞暴露于在流體源31處輸入的相同培養(yǎng)基和試劑以及化學品。

圖7示出了微流體裝置1的一個實施方案，所述微流體裝置1具有多種(即至少兩種)結(jié)構(gòu)的細胞通道20和洗滌通道40，所述細胞通道20和洗滌通道40共享共同的流體槽33和洗滌槽50，但具有分開的(即單獨的)流體源31。這意味著與存在于一種結(jié)構(gòu)的細胞通道20中的細胞相比，可以將不同的培養(yǎng)基和/或試劑或化學品輸入至存在于另一種結(jié)構(gòu)的細胞通道20中的細胞。

在加載期間，細胞和培養(yǎng)基進入流體槽33，其中培養(yǎng)基通過洗滌槽50和單獨的流體源31流出，而過量的細胞通過流體源31流出。在另一個實施方案中，細胞進入單獨的流體源31，其中過量的細胞離開共用流體槽33。在操作期間，培養(yǎng)基進入單獨的流體源31，從而允許不同的培養(yǎng)基進入不同結(jié)構(gòu)的細胞通道20和洗滌通道40。過量的細胞通過流體槽33洗出，并且培養(yǎng)基從洗滌槽50流出并且還通過共用的流體槽33流出。

圖3和圖4示出了沒有洗滌通道、洗滌源和洗滌槽的微流體裝置1的另一個實施方案。在清晰的對比下，微流體裝置1包括半透膜80，所述半透膜80的平均孔徑小于細胞的平均直徑。半透膜80布置在基板10上以形成用于多個空間上界定和分開的細胞通道20的蓋子。

在此實施方案中，細胞通道20是敞開通道，其在基板10的主表面12的一個主表面中具有開口。然后將半透性阻擋件80安置在此主表面12上以形成用于細胞通道20的蓋子。

在洗滌期間，洗滌流體或液體可以有效地從流體源31和流量通道30流過細胞通道20并通過半透性阻擋件80流出。選擇半透性阻擋件80的平均孔徑以防止細胞穿過半透性阻擋件80，但允許洗滌流體或液體穿過半透性阻擋件80。

基板10可以由任何透明材料制成，諸如塑料材料，其中構(gòu)成單元通道20、流體源31、流體槽33、流量通道30和任選地洗滌通道40、槽通道52以及洗滌槽50的結(jié)構(gòu)可經(jīng)界定。合適材料的非限制性實例包括和其是由ZEON Chemicals L.P.銷售的環(huán)烯烴聚合物(COP)，以及其是由Advanced Polymers市售的環(huán)烯烴共聚物(COC)。這些材料在透射和本底熒光方面具有優(yōu)異的光學特性。它們還在加熱時具有良好的流動特性，因此可以折疊小結(jié)構(gòu)，從而允許形成如圖1至圖7所示的基板10。

基板10的合適材料的其它實例包括玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)，以及聚(對亞苯基硫醚)(PPS)。

半透膜80可以選自透析膜，諸如由Thermo Fisher Scientific公司銷售的透析膜?；蛘?，半透膜80可以由上述用于基板10的任何塑料材料制成。

蓋板70可以由各種材料制成，這些材料優(yōu)選地是透明的以允許成像。非限制性實例包括玻璃和塑料材料。

在一個實施方案中，系統(tǒng)還包括流體歧管，所述流體歧管配置成使用至少一個計算機控制的泵將第一試劑盒的組分分配到細胞通道20中。流體歧管優(yōu)選地配置為使得能夠改變用于表型分析的培養(yǎng)基，分配用于細胞固定的化學品，以及使用計算機控制和預(yù)編程的泵施加原位測序所需的培養(yǎng)基。在一個具體實施方案中，可在整個實驗中使試劑和細胞培養(yǎng)基保持在不同的溫度下。

在一個實施方案中，每個細胞株在其基因組或可移動遺傳元件中具有相應(yīng)的株系特異性條形碼序列。第一試劑盒則包含用于通過對培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置處的每個細胞株的相應(yīng)特異性條形碼序列的至少一部分進行原位測序來測定相應(yīng)基因型的組分。

所述實施方案的系統(tǒng)可以，例如，用于對細菌進行表型分析和基因分型。在這種情況下，細胞通道20優(yōu)選具有800-1200nm之間的尺寸，并且洗滌通道40優(yōu)選小于400nm高。在一個具體實施方案中，微流體裝置1優(yōu)選地包括多于1000個細胞通道20，所述細胞通道20有利地經(jīng)單獨標記并且因此是可識別的。

所述實施方案的微流體裝置1非常適合在用于鑒定多個細胞株的文庫的系統(tǒng)中使用。然而，微流體裝置1可替代地用于除了允許測定細胞株文庫的表型和基因型兩者外的其它目的，諸如篩選抗生素抗性和其它篩選操作。

因此，所述實施方案的一個方面涉及微流體裝置1，所述微流體裝置1包括對于成像透明的基板10并且具有多個空間上界定和分開的細胞通道，所述細胞通道具有用于容納單層細胞的尺寸。所述多個空間上界定和分開的細胞通道20的相應(yīng)第一端22與流量通道30流體連通，流量通道30的第一端32與流體源31流體連通并且其第二端34與流體槽33流體連通。所述多個空間上界定和分開的細胞通道20的相應(yīng)第二端28與相應(yīng)洗滌通道40的第一端42流體連通，所述洗滌通道40的第二端44與槽通道52流體連通，所述槽通道52與洗滌槽50流體連通。洗滌通道40的尺寸太小而不能容納細胞。

在一個實施方案中，每個細胞通道20沿其縱向側(cè)24、26中的至少一個側(cè)接有相應(yīng)的第二洗滌通道40，所述第二洗滌通道40的第一端42與流量通道30流體連通并且其第二端44與洗滌通道52流體連通。

在一個實施方案中，第一試劑盒包含用于對培養(yǎng)裝置中的在空間上界定和分開的位置處的相應(yīng)特異性條形碼序列的至少一部分進行連接法原位測序的組分。

在此實施方案中，第一試劑盒優(yōu)選包含DNA連接酶，具有與細胞株基因組中的文庫共有引物結(jié)合序列的核苷酸序列互補的核苷酸序列的錨定引物，標記的探測探針寡核苷酸的混合池。第一試劑盒優(yōu)選還包含含有用于供DNA連接酶(ATP，緩沖液)將標記的探針寡核苷酸接合至錨定引物與文庫共有引物結(jié)合序列的堿基配對，以及用于在尿嘧啶處切割雜交探針(尿嘧啶-DNA糖基化酶)所需的組分的反應(yīng)混合物。

在另一個實施方案中，第一試劑盒包含用于對培養(yǎng)裝置中的在空間上界定和分開的位置處的相應(yīng)特異性條形碼序列的至少一部分進行合成法原位測序的組分。

在此實施方案中，第一試劑盒優(yōu)選包含四種類型的經(jīng)修飾dNTP，所述dNTP含有可逆終止物，所述可逆終止物含有熒光標記。第一試劑盒優(yōu)選還包含DNA聚合酶以及與細胞株基因組中的文庫共有引物結(jié)合序列的核苷酸序列互補的核苷酸序列的測序引物。第一試劑盒還包含含有供DNA聚合酶將經(jīng)修飾的核苷酸并入測序引物所需的組分的反應(yīng)混合物。

所述系統(tǒng)優(yōu)選還包含指定每個可變區(qū)和相應(yīng)的株系特異性條形碼序列之間的關(guān)聯(lián)的映射信息。然后基于相應(yīng)的株系特異性條形碼序列的經(jīng)原位測序的至少一部分和和所述映射信息來測定相應(yīng)的基因型。

在一個實施方案中，文庫中的每個細胞株具有相應(yīng)的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體在其基因組中包含相應(yīng)的株系特異性條形碼序列和可變區(qū)，所述可變區(qū)側(cè)接有已知核苷酸序列的文庫共有引物結(jié)合序列。因此文庫共有引物結(jié)合序列可用于擴增來自基因組或通過將轉(zhuǎn)錄的RNA序列逆轉(zhuǎn)錄成cDNA序列獲得的株系特異性條形碼序列。

在一個實施方案中，所述系統(tǒng)包含第二試劑盒，所述第二試劑盒包含用于使用與轉(zhuǎn)錄的RNA序列中的至少一個文庫共有引物結(jié)合序列互補的引物以及逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA依賴性DNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄的RNA序列合成每個細胞株的cDNA序列的組分。第一試劑盒則優(yōu)選包含用于對培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置處的每個細胞株的cDNA序列中的相應(yīng)株系特異性條形碼序列的至少一部分進行原位測序的組分。

第二試劑盒優(yōu)選包含與轉(zhuǎn)錄的RNA序列中的至少一個文庫共有引物結(jié)合序列互補的引物序列，以及逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA依賴性DNA聚合酶。第二試劑盒還包含由酶用來產(chǎn)生cDNA序列的核苷酸。第二試劑盒還包含含有供逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA依賴性DNA聚合酶引入核苷酸所需的組分的反應(yīng)混合物，諸如逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNA酶抑制劑。第二試劑盒優(yōu)選還包含RNA酶以降解逆轉(zhuǎn)錄后的殘留RNA。

在一個實施方案中，所述系統(tǒng)還包含第三試劑盒，所述第三試劑盒包含用于通過在使用ssDNA連接酶或鎖式探針環(huán)化后進行滾環(huán)擴增或通過原位PCR來原位擴增cDNA序列的組分(DNA聚合酶、連接酶、dNTP)。

在一個實施方案中，所述系統(tǒng)還包括第四試劑盒，所述第四試劑盒包含用于在所述培養(yǎng)裝置中的空間上界定和分開的位置處固定細胞的組分。此第四試劑盒優(yōu)選包含可用于固定細胞的甲醛。

所述系統(tǒng)中的試劑盒的組分可以作為分開的組分提供在專用容器中。或者，試劑盒的至少一些組分可以作為存在于同一容器中的混合物提供。

所述實施方案的方法和系統(tǒng)可用于需要對細胞株文庫進行表型鑒定并將各種表型與文庫中不同基因型關(guān)聯(lián)的各種應(yīng)用中。

例如，所述實施方案可以用于優(yōu)化熒光蛋白或RNA適體以選擇快速成熟的細胞內(nèi)信號。在此應(yīng)用中，報道基因的蛋白質(zhì)或RNA編碼區(qū)，即熒光蛋白或適體，將編碼在基因組的可變區(qū)中。報道基因的表達可以用化學試劑誘導，諸如用lac抑制蛋白調(diào)控報道基因的異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)。培養(yǎng)基或細胞還含有報道熒光所需的任何輔因子。通過在誘導后測量熒光隨時間推移的變化來監(jiān)測表型，并且在達到特定熒光水平或在特定時間或用于弛豫到穩(wěn)態(tài)熒光值的時間常數(shù)后達到的熒光的時刻對表型進行評分。

在一個實施方案中，細胞株文庫可以是其中基因可以用化學信號下調(diào)的文庫，諸如用于dCAS9的指導RNA的表達。然后可以用條形碼和特定基因之間的已知映射信息將細胞株條形碼化。

此外，所述實施方案可以用于通過靈敏檢測體內(nèi)調(diào)控物的性質(zhì)來鑒定基因調(diào)控RNA序列或蛋白質(zhì)。因此，可變區(qū)然后編碼不同的此類基因調(diào)控RNA序列或蛋白質(zhì)。然后可以例如通過顯微術(shù)監(jiān)測RNA序列或蛋白質(zhì)的調(diào)控效應(yīng)，以便檢測由基因調(diào)控引起的各種表型特征。

所述實施方案還可以用于選擇用于抑制或激活細胞中的生物過程的蛋白質(zhì)或肽?？勺儏^(qū)則編碼不同形式的蛋白質(zhì)或肽。表型監(jiān)測則涉及監(jiān)測相關(guān)生物過程的抑制或激活。

此外，文庫的細胞株中的可變區(qū)可以是抑制或增強特定基因的表達或調(diào)控的一組表達序列。這可以是例如可組成型表達或條件性表達的干擾RNA(iRNA)或短指導mRNA(sgRNA)序列?？梢院Y選表型的表型差異，諸如在發(fā)育、生長、分化中的問題，以及它們對添加的測試試劑的不同響應(yīng)。

所述實施方案可以進一步用于鑒定哪些基因是分化細胞(諸如干細胞)的特定階段中所需的或?qū)y試試劑響應(yīng)的?？勺儏^(qū)可以編碼抑制不同基因表達的不同sgRNA或iRNA，使得不同基因在不同細胞中有效關(guān)閉。表型表征可以是監(jiān)測響應(yīng)于化學測試試劑(諸如生長因子或藥物)的細胞分化的形式。如果細胞、組織或生物體在一些分化階段中表現(xiàn)出改變，則在所述細胞株中表達改變的基因與所警報的分化相關(guān)。使用非常相似的方法，可以研究和測定對多細胞生物體或組織發(fā)育或癌細胞增殖重要的基因。

還可以通過用大量調(diào)控序列監(jiān)測報告蛋白表達來篩選對特異性刺激物響應(yīng)的調(diào)控序列。因此，可變區(qū)則對應(yīng)于調(diào)節(jié)序列。然后，基于監(jiān)測細胞中的報告蛋白表達以及在編碼報道基因的基因處于調(diào)控序列的調(diào)控控制下的情況中來進行表型測定。然后將細胞暴露于特定刺激，諸如物理刺激如溫度變化，或化學刺激如測試劑添加，并且通過報道基因表達監(jiān)測對特定刺激的響應(yīng)。

所述實施方案的方法和系統(tǒng)可以用于通過在選擇性地和條件性地敲落其它基因產(chǎn)物的情況下監(jiān)測文庫中的基因或基因產(chǎn)物的定位、擴散或濃縮，來辨識基因或基因產(chǎn)物的相互作用伴侶和調(diào)控因子。在這種情況下，可變區(qū)可以編碼實現(xiàn)選擇性和條件性敲落的不同產(chǎn)物，例如iRNA和sgRNA。在類似的應(yīng)用中，可以使用敲落文庫并結(jié)合對所關(guān)注的熒光標記蛋白進行表型監(jiān)測，來研究其細胞內(nèi)擴散、定位或濃縮。在這種情況下，文庫篩選可以直接辨識潛在的相互作用伴侶或調(diào)控因子。

條形碼基因組突變文庫可以通過將三種元件引入細胞而平行制備，例如通過將它們置于相同質(zhì)粒中。所述三種元件包括：(1)對應(yīng)于期望引入變化的同源但部分突變的DNA序列(可變區(qū))；(2)用于相應(yīng)未突變DNA序列的CRISPR介導的DNA切割的指導RNA；以及(3)用于原位測序的條形碼序列?？梢詫l形碼序列保持在可移動的遺傳元件上或者引入染色體上的分開位置處。

當可以在顯微鏡中或通過整合在培養(yǎng)裝置中的生物傳感器監(jiān)測所關(guān)注化合物的生物合成時，這可以用作表型讀出來優(yōu)化生物合成途徑中的酶或其氨基酸序列的表達水平。

上述應(yīng)用應(yīng)當僅被視為所述實施方案的方法和系統(tǒng)的一些但是說明性的用途。

上述實施方案應(yīng)理解為本發(fā)明的一些說明性實施例。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將理解的是，可在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下對實施方案做出各種修改、組合和變化。具體地，在技術(shù)上可能的情況下，不同實施方案中的不同部分解決方案可以組合在其它構(gòu)造中。然而，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書界定。