本發(fā)明在其一些實(shí)施方案中涉及微生物組，并且更具體地但非專一地，涉及用于通過(guò)分析微生物組預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)一種或多種試劑的應(yīng)答的方法和儀器。

人在腸道中攜帶廣泛和多樣化的微生物生態(tài)系統(tǒng)，其已與我們的物種一起共進(jìn)化且是人類健康必需的。哺乳動(dòng)物具有位于腸道中的數(shù)百萬(wàn)種微生物基因的‘?dāng)U展基因組’：微生物組。這種多基因組共生在宿主中以蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝水平表達(dá)，并且因此已提出人代表非常復(fù)雜的生物學(xué)‘超生物’，其中關(guān)于宿主代謝調(diào)節(jié)的部分責(zé)任被移交給了微生物共生。腸微生物組的現(xiàn)代解釋是基于由高通量基因組篩選技術(shù)提供的腸道的非培養(yǎng)的分子觀點(diǎn)。腸微生物組還直接牽涉許多各種各樣的病理狀態(tài)如肥胖、循環(huán)系統(tǒng)疾病、炎癥性腸?。↖BD）和孤獨(dú)癥的的發(fā)病機(jī)制。腸微生物叢也影響藥物代謝和毒性、飲食熱量的生物利用度、免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和應(yīng)答、以及手術(shù)后恢復(fù)。這意味著腸微生物組及其活性的定量分析是產(chǎn)生未來(lái)個(gè)人化健康護(hù)理策略必需的，并且腸微生物組代表了適于開發(fā)下一代治療藥物靶的沃土。還意味著可以出于宿主生物的利益而直接調(diào)節(jié)腸微生物組。

腸微生物叢因此扮演大量重要角色，其限定宿主的生理學(xué)，例如免疫系統(tǒng)成熟、對(duì)上皮細(xì)胞損傷的腸道應(yīng)答、以及異物和能量代謝。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，腸微生物組以執(zhí)行這些任務(wù)的四個(gè)細(xì)菌門為主：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。種系型組成在個(gè)體中可以是特異性和穩(wěn)定的，并且在2年間隔中，個(gè)體保留超過(guò)60%的腸微生物組種系型。這意味著每個(gè)宿主與其腸微生物叢具有獨(dú)特的生物關(guān)系，并且從定義上這影響著個(gè)體的患病風(fēng)險(xiǎn)。

背景技術(shù)：
包括Payne等人，obesity reviews（2012）13，799–809；和Cowen等人The FASEB Journal. 2013；27:224。

另外的背景技術(shù)包括美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0100172874。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了測(cè)定健康個(gè)體中對(duì)試劑的耐受的方法，其包括：

（a）測(cè)定健康個(gè)體的樣品中的微生物組的標(biāo)記，所述健康個(gè)體已經(jīng)受試劑或條件；和

（b）比較健康個(gè)體的微生物組的標(biāo)記與致病性微生物組的至少一種參考標(biāo)記，其中當(dāng)健康個(gè)體的微生物組的標(biāo)記在統(tǒng)計(jì)上顯著類似于致病性微生物組的參考標(biāo)記時(shí)，表明所述健康個(gè)體對(duì)所述試劑不耐受。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了測(cè)定試劑對(duì)健康個(gè)體的微生物組的影響的方法，其包括：

（a）使微生物組暴露于試劑；

（b）比較暴露后的微生物組的標(biāo)記與致病性微生物組的參考標(biāo)記，其中當(dāng)微生物組的標(biāo)記在統(tǒng)計(jì)上顯著類似于致病性微生物組的參考標(biāo)記時(shí)，說(shuō)明所述試劑對(duì)所述微生物組具有不利影響。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了測(cè)定健康個(gè)體中對(duì)人造甜味劑的耐受的方法，其包括分析個(gè)體的微生物組中屬于選自下述目的微生物的量：擬桿菌目（Bacteroidales）、梭菌目（Clostridilales）、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒絲菌目（Erysipelotrichales）、伯克氏菌目（Burkholderiales）和/或彎曲菌目（Campylobacterales），其中擬桿菌目、梭菌目、Bactobacillales目和/或YS2目的微生物的量超過(guò)預(yù)定水平表明所述個(gè)體對(duì)所述人造甜味劑耐受，而RF32目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目和/或彎曲菌目的微生物的量超過(guò)預(yù)定水平表明所述個(gè)體對(duì)所述人造甜味劑不耐受。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了測(cè)定健康個(gè)體中對(duì)人造甜味劑的耐受的方法，其包括分析個(gè)體的微生物組中如表4中所示的至少一種微生物或微生物類別的量，其中所述至少一種微生物或微生物類別的量超過(guò)預(yù)定水平表明所述個(gè)體對(duì)所述人造甜味劑不耐受。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了恢復(fù)個(gè)體對(duì)試劑的耐受的方法，其包括給個(gè)體施用有效量的益生菌組合物，所述益生菌組合物包含與非致病性微生物組在統(tǒng)計(jì)上顯著類似的微生物，從而恢復(fù)所述個(gè)體對(duì)所述試劑的耐受。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了益生菌組合物，其中所述組合物的微生物中的大多數(shù)是擬桿菌目、梭菌目、Bactobacillales目和/或YS2目的微生物，所述組合物配制用于直腸或口服施用。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了恢復(fù)個(gè)體對(duì)人造甜味劑的耐受的方法，其包括給個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求42的益生菌組合物，從而恢復(fù)所述個(gè)體對(duì)所述人造甜味劑的耐受。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了恢復(fù)個(gè)體對(duì)人造甜味劑的耐受的方法，其包括給個(gè)體施用有效量的抗生素，所述抗生素減少RF32目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目和/或彎曲菌目的微生物的相對(duì)豐度，從而恢復(fù)所述個(gè)體對(duì)所述人造甜味劑的耐受。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了恢復(fù)個(gè)體對(duì)人造甜味劑的耐受的方法，其包括給個(gè)體施用有效量的抗生素，所述抗生素減少如表4中所示的至少一種微生物的相對(duì)量，從而恢復(fù)所述個(gè)體對(duì)所述人造甜味劑的耐受。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了向有此需要的個(gè)體提供抗生素或益生菌治療的方法，其包括：

（a）分析個(gè)體的微生物組的晝夜節(jié)律；

（b）對(duì)個(gè)體提供抗生素或益生菌治療，其中基于所述個(gè)體的微生物組的晝夜節(jié)律選擇所述抗生素或益生菌治療的施用劑量或時(shí)間。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了用于測(cè)定個(gè)體對(duì)試劑是否耐受的試劑盒，其包括：

（i）能夠測(cè)定至少一種微生物組組分的量的試劑，其中所述至少一種微生物組組分的水平在試劑耐受的微生物組中和在試劑不耐受的微生物組中顯著不同；和

（ii）致病性微生物組。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，該方法還包括比較暴露后的微生物組的標(biāo)記與非致病性微生物組參考標(biāo)記，其中當(dāng)微生物組的標(biāo)記在統(tǒng)計(jì)上顯著不同于所述非致病性微生物組參考標(biāo)記時(shí)，表明所述試劑對(duì)所述微生物組具有不利影響。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述暴露在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述暴露在體外實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，該方法還包括比較健康個(gè)體的微生物組的標(biāo)記與至少一種非致病性參考標(biāo)記，其中當(dāng)健康個(gè)體的微生物組的標(biāo)記在統(tǒng)計(jì)上顯著不同于所述至少一種非致病性參考標(biāo)記時(shí)，表明所述健康個(gè)體對(duì)所述試劑不耐受。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述試劑是物質(zhì)。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述試劑是條件。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述物質(zhì)是食物添加劑。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述食物添加劑是防腐劑。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述物質(zhì)是人造甜味劑。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述條件是睡眠模式中的變化。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述條件是暴露于光。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述條件是暴露于煙草煙霧或輻射。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述物質(zhì)是治療劑。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述致病性微生物組來(lái)源于患有疾病的個(gè)體。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述疾病是糖尿病或糖尿病前期。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述致病性微生物組來(lái)源于對(duì)試劑不耐受的健康個(gè)體。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述非致病性微生物組來(lái)源于對(duì)試劑耐受的健康個(gè)體。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述人造甜味劑包含選自糖精、甜菊醇和阿斯巴甜的組分。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述微生物組的標(biāo)記是微生物組的微生物的存在或水平。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述微生物組的標(biāo)記是微生物組的微生物基因的存在或水平。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述微生物組的標(biāo)記是由微生物組的微生物生成的產(chǎn)物。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述產(chǎn)物選自mRNA、多肽、碳水化合物和代謝產(chǎn)物。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述產(chǎn)物包含短鏈脂肪酸（SCFA）。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，該方法還包括在分析前使個(gè)體經(jīng)受試劑。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，關(guān)于致病性微生物組的參考標(biāo)記的數(shù)據(jù)存在于第一數(shù)據(jù)庫(kù)中，而關(guān)于健康個(gè)體的微生物組的標(biāo)記的數(shù)據(jù)存在于第二數(shù)據(jù)庫(kù)中。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述第一數(shù)據(jù)庫(kù)包含關(guān)于致病性微生物組的多種參考標(biāo)記的數(shù)據(jù)。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，微生物組選自腸微生物組、口腔微生物組、支氣管微生物組、皮膚微生物組和陰道微生物組。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，該方法還包括在測(cè)定前處理樣品。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述處理包括生成核酸樣品。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，該方法還包括在分析前給個(gè)體施用人造甜味劑。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述試劑包括物質(zhì)。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述試劑包括條件。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述條件包括晝夜節(jié)律失調(diào)。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述致病性微生物組是經(jīng)處理的。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述致病性微生物組是未經(jīng)處理的。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述試劑盒還包括非致病性微生物組。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述至少一種微生物組組分是微生物組的微生物的至少一種基因。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述至少一種微生物組組分是微生物組的至少一種微生物。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，所述試劑盒還包括：

（ii）能夠測(cè)定第二微生物組組分的量的第二試劑，其中所述第二微生物組組分的水平在試劑耐受的微生物組中和在試劑不耐受的微生物組中顯著不同。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了向有此需要的個(gè)體提供抗生素或益生菌治療的方法，其包括：

（a）分析個(gè)體的微生物組的晝夜節(jié)律；

（b）對(duì)個(gè)體提供抗生素或益生菌治療，其中基于所述個(gè)體的微生物組的晝夜節(jié)律選擇所述抗生素或益生菌治療的施用劑量或時(shí)間。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，步驟（a）通過(guò)分析所述微生物組的微生物標(biāo)記來(lái)實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，步驟（a）通過(guò)分析所述微生物組的代謝產(chǎn)物來(lái)實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，其中在抗生素靶向的細(xì)菌處于晝夜節(jié)律的谷處時(shí)提供抗生素。

根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的另外的特征，在益生菌的細(xì)菌處于晝夜節(jié)律的峰處時(shí)提供益生菌。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管下文描述了示例性方法和/或材料，但與本文描述的那些類似或等價(jià)的方法和材料可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案的實(shí)踐或測(cè)試中。在沖突的情況下，以專利說(shuō)明書包括定義為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)例僅是舉例說(shuō)明性的，并且不預(yù)期一定是限制性的。

本發(fā)明的實(shí)施方案的方法和/或儀器的實(shí)現(xiàn)可以涉及人工、自動(dòng)或其組合執(zhí)行或完成所選任務(wù)。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法和/或儀器的實(shí)施方案的實(shí)際使用儀器和裝備，幾個(gè)所選任務(wù)可以使用操作系統(tǒng)通過(guò)硬件、軟件或固件或其組合來(lái)實(shí)現(xiàn)。

例如，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案用于執(zhí)行所選任務(wù)的硬件可以作為芯片或線路實(shí)現(xiàn)。作為軟件，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的所選任務(wù)可以使用任何合適的操作系統(tǒng)作為通過(guò)計(jì)算機(jī)執(zhí)行的多個(gè)軟件指令實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，根據(jù)如本文描述的方法和/或儀器的示例性實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)任務(wù)通過(guò)數(shù)據(jù)處理器，例如用于執(zhí)行多個(gè)指令的計(jì)算平臺(tái)來(lái)執(zhí)行。任選地，數(shù)據(jù)處理器包括用于貯存指令和/或數(shù)據(jù)的易失性存儲(chǔ)器和/或用于存儲(chǔ)指令和/或數(shù)據(jù)的非易失性存儲(chǔ)器，例如磁性硬盤和/或可移動(dòng)媒體。任選地，同樣提供了網(wǎng)絡(luò)連接。同樣任選提供了顯示器和/或用戶輸入裝置例如鍵盤或鼠標(biāo)。

附圖的幾個(gè)視圖的簡(jiǎn)述

本發(fā)明的一些實(shí)施方案在本文中參考附圖僅作為實(shí)例進(jìn)行描述。現(xiàn)在具體參考詳細(xì)附圖，要強(qiáng)調(diào)的是所示的細(xì)節(jié)作為實(shí)例且用于本發(fā)明的實(shí)施方案的舉例說(shuō)明性討論的目的。在這點(diǎn)上，與附圖結(jié)合的描述使得本發(fā)明的實(shí)施方案可以如何進(jìn)行實(shí)踐對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。

在附圖中：

圖1A-K腸道微生物叢產(chǎn)生日間振蕩。

（A）示意圖顯示了經(jīng)過(guò)兩個(gè)光暗周期的過(guò)程，微生物叢的取樣時(shí)間。

（B）顯示了日間振蕩的OTU。顯示了具有p<1的OTU，并且指出了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每個(gè)授時(shí)因子時(shí)間（Zeitgeber time）（ZT）的10只小鼠個(gè)體。

（C）經(jīng)過(guò)48小時(shí)的過(guò)程，糞便微生物叢的分類組成。

（D）具有p < 0.05，JTK_周期的細(xì)菌屬振蕩的直方圖表示。

（E、F）微生物叢成員的豐度中的日間振蕩的代表性實(shí)例；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的10只小鼠。

（G、H）顯示了針對(duì)對(duì)每個(gè)基因映射的讀數(shù)數(shù)目標(biāo)準(zhǔn)化的，在鞭毛基因（G）和糖胺聚糖（GAG）降解基因相對(duì)于其他基因的基因出現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分布。

（I）顯示出日間振蕩的KEGG途徑。僅顯示了具有基因覆蓋>0.2和p<1的途徑。虛線指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的2只小鼠個(gè)體。

（J）功能性KEGG途徑的豐度中的反相日間振蕩的代表性實(shí)例；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的2只小鼠個(gè)體。

（K）如通過(guò)JTK_周期鑒定的，16個(gè)最顯著振蕩的KEGG途徑的直方圖表示。

所示結(jié)果代表四次實(shí)驗(yàn)（1A-F）或兩次實(shí)驗(yàn)（1G-K）。

圖2A-H。與圖1A-K有關(guān)的組合物和功能中的日間微生物叢振蕩。

（A）示意圖顯示了經(jīng)過(guò)四個(gè)光暗周期的過(guò)程，每四個(gè)小時(shí)的微生物叢的取樣時(shí)間。

（B）顯示了日間振蕩的OTU。僅顯示了具有p<1的OTU。虛線指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每個(gè)授時(shí)因子時(shí)間（ZT）的8只小鼠個(gè)體。

（C-D）微生物叢成員的豐度中的日間振蕩的代表性實(shí)例；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的8只小鼠。

（E-G）功能性KEGG途徑的豐度中的日間振蕩的代表性實(shí)例；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的2只小鼠個(gè)體。

（H）涉及鞭毛組裝、細(xì)菌趨化性（chemotyxis）和III型分泌中的基因的途徑描述。顏色指出在不同ZT時(shí)的基因的差異豐度。

圖3A-H Per1/2缺陷小鼠中的日間微生物叢節(jié)律的喪失。

（A）顯示了野生型和Per1/2缺陷小鼠中的日間振蕩的OTU。僅顯示了具有p<1的OTU。虛線指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每個(gè)授時(shí)因子時(shí)間（ZT）在每個(gè)組中的10只小鼠個(gè)體。

（B）在Per1/2缺陷小鼠中不存在的，在野生型小鼠中的日間振蕩的代表性實(shí)例；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的10只小鼠個(gè)體。

（C）與Per1/2缺陷小鼠相比較，在野生型小鼠中具有p<0.05，JTK_周期的細(xì)菌屬振蕩的直方圖表示；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的10只小鼠。

（D）在來(lái)自Per1/2缺陷小鼠的微生物叢中不存在的，來(lái)自野生型小鼠的微生物叢中的KEGG途徑的日間波動(dòng)的直方圖表示；宏基因組學(xué)分析在每個(gè)ZT時(shí)的總共三只小鼠中執(zhí)行，并且僅比較具有覆蓋>0.2的途徑。

（E）顯示了與Per1/2缺陷小鼠相比較，在野生型中的日間振蕩的KEGG途徑。僅顯示了具有基因覆蓋>0.2和p<1的途徑。虛線指出p<0.05，JTK_周期。

（F-H）在野生型和Per1/2缺陷小鼠中屬于所示功能途徑的基因中的日間變異。宏基因組學(xué)分析在每個(gè)ZT時(shí)的總共三只小鼠中執(zhí)行。

所示結(jié)果代表兩次實(shí)驗(yàn)。

圖4A-L與圖3A-H有關(guān)的在Per1/2缺陷小鼠中的生態(tài)失調(diào)。

（A-C）在野生型和Per1/2缺陷小鼠中屬于所示功能途徑的基因中的日間變異。宏基因組學(xué)分析在每個(gè)ZT時(shí)的總共三只小鼠中執(zhí)行。

（D，E）來(lái)自野生型和Per1/2缺陷小鼠的糞便微生物叢的α（D）和β（E）多樣性。樣品/基因型來(lái)自每天的不同時(shí)間；n = 每個(gè)組中各90。

（F）來(lái)自野生型和Per1/2缺陷小鼠的糞便微生物叢之間的OTU的差異豐度；n = 90個(gè)樣品。

（G，H）來(lái)自野生型和ASC缺陷小鼠的糞便微生物叢的α（D）和β（E）多樣性。

（I）顯示了ASC缺陷小鼠中的日間振蕩的OTU。僅顯示了具有p<1的OTU。虛線指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的8只小鼠個(gè)體。

（J）ASC缺陷小鼠的微生物叢中的日間振蕩的代表性實(shí)例；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的8只小鼠個(gè)體。

（K、L）在野生型（K）和Per1/2缺陷小鼠（L）中的日間飼喂模式。小鼠自由進(jìn)食且經(jīng)過(guò)三個(gè)暗光周期。所示實(shí)例代表8只小鼠個(gè)體。

圖5A-L飼喂節(jié)律引導(dǎo)日間微生物叢振蕩。

（A）示意圖顯示了定時(shí)飼喂方案。

（B）在不同飼喂時(shí)間表上，在野生型小鼠中顯示了日間振蕩的OTU。僅顯示了具有p<1的OTU。虛線指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的10只小鼠個(gè)體。

（C-F）在暗階段飼喂和光階段飼喂的野生型小鼠之間的細(xì)菌振蕩中的階段偏移的代表性實(shí)例；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的10只小鼠。

（G）在不同飼喂時(shí)間表上，在Per1/2缺陷小鼠中顯示了日間振蕩的OTU。僅顯示了具有p<1的OTU。虛線指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的10只小鼠個(gè)體。

（H-I）在暗階段飼喂和光階段飼喂的Per1/2缺陷小鼠之間的細(xì)菌振蕩中的階段偏移的代表性實(shí)例；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的10只小鼠。

（J）在不同飼喂時(shí)間表上，在野生型和Per1/2缺陷小鼠中具有p<0.05，JTK_周期的振蕩OTU的定量。

（K）示意圖顯示了來(lái)自Per1/2缺陷小鼠的微生物叢（無(wú)節(jié)律微生物叢）糞便移植到無(wú)菌接受者（獲得節(jié)律性）內(nèi)。

（L）在移植到無(wú)菌小鼠內(nèi)之前和之后，來(lái)自Per1/2缺陷小鼠的微生物叢中的日間振蕩的OTU。僅顯示了具有p<1的OTU。虛線指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每個(gè)ZT時(shí)在每個(gè)組中的10只小鼠個(gè)體。

結(jié)果代表兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖6A-H。與圖5A-L有關(guān)的飼喂節(jié)律對(duì)日間微生物叢振蕩的影響。

（A、B）在暗階段飼喂（A）和光階段飼喂（B）的小鼠中的飼喂時(shí)間。所示圖表代表測(cè)量的四只小鼠個(gè)體。

（C）在暗階段和光階段期間，在暗階段飼喂或光階段飼喂的小鼠中的Per2的結(jié)腸表達(dá)顯示了通過(guò)飼喂節(jié)律的腸道鐘的重編程；n = 每個(gè)組中的10只小鼠。** p < 0.01，*** p < 0.001。

（D、E）在僅暗階段或光階段期間，在野生小鼠（D）和Per1/2缺陷小鼠（E）中，具有p<0.05，JTK_周期的細(xì)菌屬振蕩的直方圖表示；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的10只小鼠。突出顯示了在循環(huán)OTU中的階段偏移。

（F-H）在用來(lái)自Per1/2缺陷小鼠（F，G）或野生型小鼠（H）的微生物叢移植的無(wú)菌小鼠中，經(jīng)過(guò)三個(gè)暗光周期過(guò)程的身體活動(dòng)（F、H）和VCO₂。移植后一周獲得測(cè)量。圖表代表測(cè)量的八只小鼠個(gè)體。

圖7A-H。時(shí)差導(dǎo)致日間微生物叢振蕩和生態(tài)失調(diào)的喪失。

（A）示意圖顯示了通過(guò)8小時(shí)的恒定時(shí)移的時(shí)差誘導(dǎo)。每三天，使小鼠經(jīng)歷8小時(shí)的向前或向后時(shí)移。對(duì)照保持在恒定光暗周期條件下。

（B）在暗階段、光階段和組合期間對(duì)照和時(shí)差小鼠的食物攝入。** p<0.01，n.s.不顯著。

（C）與時(shí)差小鼠相比較，在對(duì)照小鼠中具有p<0.05，JTK_周期的細(xì)菌屬振蕩的熱圖表示；n=在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)的5只小鼠。

（D）在對(duì)照和時(shí)差小鼠中顯示了日間振蕩的OTU。虛線指出p<0.05，JTK_周期；n=在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)的5只小鼠個(gè)體。

（E）在時(shí)差下喪失的野生型小鼠中的細(xì)菌振蕩的代表性實(shí)例；n=在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)的5只小鼠。

（F）在四周時(shí)移后，在對(duì)照和時(shí)差小鼠中的腸微生物群落的β多樣性。樣品由一天中的不同時(shí)間合并。

（G）在四個(gè)月時(shí)移后，在對(duì)照和時(shí)差小鼠中的腸微生物群落的β多樣性。

（H）通過(guò)時(shí)差誘導(dǎo)的微生物組成中的變化的熱圖表示。

圖8A-F與圖7A-H有關(guān)的在時(shí)差期間的晝夜節(jié)律失調(diào)。

（A、B）在對(duì)照和時(shí)差小鼠中經(jīng)過(guò)三個(gè)暗光周期過(guò)程的身體活動(dòng)。對(duì)照小鼠（A）的節(jié)律性活動(dòng)通過(guò)時(shí)差（B）的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變成隨機(jī)模式。所示結(jié)果代表測(cè)量的16只小鼠個(gè)體。

（C）經(jīng)過(guò)暗光周期的過(guò)程，在對(duì)照和時(shí)差小鼠的食物攝入中的日間變異。所示結(jié)果代表測(cè)量的16只小鼠個(gè)體。

（D-F）在結(jié)腸中的Bmal（D）、Rev-erbα（E）和RORγt（F）的節(jié)律性表達(dá)模式在時(shí)差誘導(dǎo)后改變；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的4-5只小鼠。

圖9A-K。時(shí)差誘導(dǎo)的生態(tài)失調(diào)促進(jìn)代謝紊亂。

（A-E）小鼠經(jīng)歷時(shí)移誘導(dǎo)的時(shí)差且飼喂高脂肪飲食。一半小鼠用抗生素進(jìn)行處理；n = 每個(gè)組中的10只小鼠。

（A）經(jīng)過(guò)高脂肪飼喂9周的重量增長(zhǎng)。** p<0.01，*** p<0.001。

（B）在時(shí)差誘導(dǎo)后8周進(jìn)行口服葡萄糖耐受測(cè)試。* p<0.05，** p<0.01。

（C）在時(shí)差8周后，連同或不連同Abx處理，對(duì)照和時(shí)差小鼠的空腹葡萄糖水平。* p<0.05。

（D、E）在時(shí)差8周后，連同或不連同Abx處理，對(duì)照和時(shí)差小鼠的脂肪（D）和瘦（E）體重。** p<0.01。

（F）在時(shí)差組中在4個(gè)月時(shí)移后，對(duì)照和時(shí)差小鼠的重量和脂肪含量。* p<0.05。

（G-I）來(lái)自對(duì)照或時(shí)差小鼠的微生物叢移植到無(wú)菌（GF）小鼠內(nèi)；n = 每個(gè)組中的4-6只小鼠。

（G）經(jīng)過(guò)4周的重量增長(zhǎng)。* p<0.05。

（H）在糞便轉(zhuǎn)移后第3天時(shí)進(jìn)行口服葡萄糖耐受測(cè)試。* p<0.05。

（I）在糞便轉(zhuǎn)移后一個(gè)月，接受者小鼠的脂肪和瘦體重。** p<0.01。

（J）在8周時(shí)差后，對(duì)照和時(shí)差小鼠的T₂加權(quán)MR圖像。上，冠狀圖像；下，軸向圖像。

（K）在糞便轉(zhuǎn)移后一個(gè)月，接受者小鼠的T₂加權(quán)MR圖像。上，冠狀圖像；下，軸向圖像。

所示結(jié)果代表三次（9A-E）和兩次（9G-I）獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖10A-L。與圖9A-K有關(guān)的高脂肪飲食和抗生素處理對(duì)日間行為和微生物叢振蕩的影響。

（A-D）在飼喂高脂肪飲食的對(duì)照（A、B）和時(shí)差小鼠（C、D）中，經(jīng)過(guò)2.5個(gè)暗光周期過(guò)程的身體活動(dòng)。（B）和（D）另外用抗生素進(jìn)行處理。所示結(jié)果代表測(cè)量的32只小鼠個(gè)體。

（E、F）經(jīng)過(guò)暗光周期的過(guò)程，在對(duì)照和時(shí)差小鼠的食物攝入中的日間變異。所有小鼠均飼喂高脂肪飲食。在（F）中，小鼠用抗生素進(jìn)行處理。

（G）在依靠高脂肪飲食一周后，在野生型小鼠中顯示了日間振蕩的OTU。僅顯示了具有p<1的OTU。虛線指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每個(gè)授時(shí)因子時(shí)間（ZT）的10只個(gè)別小鼠。

（H、I）在依靠高脂肪飲食的小鼠中的微生物叢成員豐度中的日間振蕩的代表性實(shí)例；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的10只小鼠。

（J）在抗生素處理一周后，在野生型小鼠中顯示了日間振蕩的OTU。僅顯示了具有p<1的OTU。虛線指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每個(gè)授時(shí)因子時(shí)間（ZT）的10只小鼠個(gè)體。

（K，L）在依靠抗生素的小鼠中的微生物叢成員豐度中的日間振蕩的代表性實(shí)例；n = 在每個(gè)ZT時(shí)的10只小鼠。

圖11A-I。人微生物叢經(jīng)歷組成和功能的日間振蕩。

（A）示意圖顯示了經(jīng)過(guò)多個(gè)光暗周期的過(guò)程，來(lái)自兩個(gè)個(gè)體的人微生物叢的取樣時(shí)間。

（B、C）顯示了兩名人類個(gè)體中的日間振蕩的OTU。僅顯示了具有p<1的OTU。虛線指出p<0.05，JTK_周期。

（D）來(lái)自具有p<0.05，JTK_周期的一名人類個(gè)體振蕩的細(xì)菌屬的直方圖表示。

（E）經(jīng)過(guò)連續(xù)五天的日間細(xì)菌振蕩的代表性實(shí)例。

（F）顯示出日間振蕩的KEGG途徑。僅顯示了具有基因覆蓋>0.2和p<1的途徑。虛線指出p<0.05，JTK_周期。

（G、H）在來(lái)自人微生物叢的KEGG途徑中的反相豐度峰的實(shí)例。合并來(lái)自連續(xù)五天的ZT數(shù)據(jù)。

（I）KEGG途徑中的振蕩的直方圖表示。

圖12A-D。與圖11A-I有關(guān)的人微生物叢的組成和功能的日間振蕩。

（A、B）經(jīng)過(guò)連續(xù)五天的過(guò)程，來(lái)自一名人類個(gè)體的共生微生物叢成員的相對(duì)豐度中的日間波動(dòng)的代表性實(shí)例。

（C）經(jīng)過(guò)五天過(guò)程，人糞便微生物叢的分類組成的振蕩。

（D）經(jīng)過(guò)連續(xù)五天的過(guò)程，來(lái)自人微生物叢的功能途徑中的日間波動(dòng)的代表性實(shí)例。

圖13A-F。人類的時(shí)差與驅(qū)動(dòng)代謝紊亂的生態(tài)失調(diào)相關(guān)。

（A）示意圖顯示了在通過(guò)8-10小時(shí)時(shí)移誘導(dǎo)的時(shí)差之前、期間和之后，來(lái)自個(gè)體的微生物叢取樣的時(shí)間。

（B）對(duì)應(yīng)于（A）中所示的取樣時(shí)間，來(lái)自兩名人類個(gè)體的微生物叢的門水平組成。

（C）示意圖在時(shí)差進(jìn)入無(wú)菌小鼠內(nèi)之前、期間和之后，來(lái)自人類個(gè)體的糞便移植。

（D）經(jīng)過(guò)三周的接受者小鼠的重量增長(zhǎng)；n = 每個(gè)組中的5只小鼠。** p<0.01。

（E）在糞便轉(zhuǎn)移后第3天時(shí)進(jìn)行接受者小鼠的口服葡萄糖耐受測(cè)試；n = 每個(gè)組中的5只小鼠。* p<0.05。

（F）在糞便轉(zhuǎn)移后三周進(jìn)行接受者小鼠的T₂加權(quán)MR圖像。上，冠狀圖像；下，軸向圖像。

所示結(jié)果代表2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（C-F）。

圖14A-B。示意圖與圖13A-F有關(guān)的微生物叢組成和功能的日間振蕩。

（A）示意圖顯示了在24小時(shí)光暗周期期間的某些時(shí)間具有優(yōu)先豐度的“標(biāo)志”分類單位和功能途徑。

（B）示意圖描述了在夜行野生型小鼠中的日間微生物叢途徑活性，生物鐘破壞的小鼠中的振蕩喪失和人中的相逆轉(zhuǎn)波動(dòng)。

圖15A-E。實(shí)驗(yàn)方案。10周齡C57Bl/6雄性小鼠用下述飲食方案進(jìn)行處理：（A）飲用商購(gòu)可得的無(wú)熱量人造甜味劑（NAS；糖精、三氯蔗糖和阿斯巴甜）且飼喂正常食物（NC）飲食，（B）飲用作為對(duì)照的商購(gòu)可得的糖精或蔗糖且飼喂高脂肪飲食（HFD），（C）飲用純糖精或水且飼喂HFD，（D）如III中，但使用遠(yuǎn)交Swiss-Webster小鼠。葡萄糖耐受測(cè)試、微生物組分析和用抗生素補(bǔ)充飲用水在所示時(shí)間點(diǎn)執(zhí)行。（E）糞便移植實(shí)驗(yàn)的示意圖。

圖16A-H。人造甜味劑誘導(dǎo)可轉(zhuǎn)移至GF小鼠的葡萄糖耐受不良。（A-B）在抗生素之前（N=20）和之后，飲用商用NAS共11周的NC飼喂小鼠中的OGTT & AUC：環(huán)丙沙星和甲硝唑，（‘抗生素A’， N=10）；或萬(wàn)古霉素（‘抗生素B’， N=5）。（C）飼喂HFD和商用糖精（N=10）或葡萄糖（N=9）的小鼠中的OGTT。（D）飲用0.1 mgml^-1糖精或水共5周（N=20），隨后為‘抗生素A’（N=10）的HFD飼喂小鼠的OGTT。（E-F）在來(lái)自（E）商用糖精（N=12）和葡萄糖飼喂小鼠（N=11）的微生物叢移植后6天的GF小鼠的OGTT；或（F）飼喂純糖精（N=16）和水（N=16）的供體。符號(hào)（GTT）或水平線（AUC）-平均值，誤差條- S.E.M. *，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，GTT: ANOVA & Bonferroni，AUC: ANOVA和Tukey事后分析。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。（G）來(lái)自下述的16s rRNA分析：在基線（W0，黑色六角形）和W11（藍(lán)色三角形）時(shí)的糖精消耗小鼠；水對(duì)照（關(guān)于W11 & W0的黑色圓圈）；葡萄糖（關(guān)于W11 & W0的黑色方塊）；或蔗糖（關(guān)于W11 & W0的黑色三角形）。N=每個(gè)組中的 5。（H）根據(jù)1E中的供體身份在GF接受者中的分類群的PCoA。

圖17A-F。人造甜味劑誘導(dǎo)葡萄糖耐受不良。（A）飼喂HFD和商用糖精（N=10）或葡萄糖（N=9）的小鼠的AUC。（B）飲用0.1 mgml^-1糖精或水共5周（N=20），隨后為‘抗生素A’（N=10）的HFD飼喂小鼠的AUC。（C-D）飲用純糖精或水的HFD飼喂的遠(yuǎn)交Swiss-Webster小鼠（N=5）的OGTT & AUC。（E-F）糞便樣品從飲用商購(gòu)可得的純糖精、葡萄糖或水對(duì)照的供體小鼠（N=10）轉(zhuǎn)移到8周齡雄性Swiss-Webster無(wú)菌接受者小鼠。來(lái)自（E）商用糖精（N=12）和葡萄糖飼喂小鼠（N=11）的微生物叢移植后6天的GF小鼠的AUC；或（F）純糖精（N=16）和水飼喂（N=16）供體。符號(hào)（GTT）或水平線（AUC）- 平均值，誤差條- S.E.M. *，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，ANOVA和Tukey事后分析（AUC）- 平均值，誤差條- S.E.M. *，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，ANOVA和Tukey或不成對(duì)兩側(cè)斯氏t檢驗(yàn)（AUC）。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

圖18A-L。食用商用NAS制劑的小鼠的代謝表征。10周齡C57Bl/6小鼠（N=4）給予商購(gòu)可得的人造甜味劑（糖精、三氯蔗糖和阿斯巴甜）或?qū)φ眨ㄋ?、蔗糖或葡萄糖，N=每個(gè)組中的4）且飼喂NC飲食。在11周后，使用PhenoMaster代謝籠系統(tǒng)共80小時(shí)來(lái)表征代謝參數(shù)。光和暗階段分別通過(guò)X軸上的白色和黑色三角形指示，并且灰色條用于暗階段。（A）液體攝入。（B）A的AUC。（C）進(jìn)食。（D）C的AUC。（E）在72小時(shí)期間，來(lái)自食物和液體的總熱量攝入（關(guān)于計(jì)算參見(jiàn)方法）。（F）呼吸交換率（RER）。（G）F的AUC。（H）作為距離的身體活動(dòng)。（I）H的AUC。（J）能量消耗。（K）與在15周期間的原始小鼠重量相比較的質(zhì)量變化（N=10）。（L）K的AUC。代謝籠表征和重量增長(zhǎng)監(jiān)控重復(fù)兩次。

圖19A-I。食用HFD和純糖精或水的小鼠的代謝表征。10周齡C57Bl/6小鼠（N=8）飼喂HFD，連同或不連同用0.1mgml^-1純糖精補(bǔ)充飲用水。在5周后，使用PhenoMaster代謝籠系統(tǒng)共70小時(shí)來(lái)表征代謝參數(shù)。光和暗階段分別通過(guò)X軸上的白色和黑色三角形指示，并且灰色條用于暗階段。（A）液體攝入。（B）A的AUC。（C）進(jìn)食。（D）C的AUC。（E）呼吸交換率（RER）。（F）F的AUC。（G）作為距離的身體活動(dòng)。（H）H的AUC。（I）能量消耗。代謝籠表征重復(fù)兩次。

圖20A-C。葡萄糖耐受不良的飲用NAS的小鼠展示正常胰島素水平和耐受。（A）空腹血漿胰島素在商用NAS或?qū)φ眨∟=10）11周后進(jìn)行測(cè)量。（B）與A相同，但在HFD和純糖精或水（N=20）5周后進(jìn)行測(cè)量。（C）胰島素耐受測(cè)試在商用NAS或?qū)φ眨∟=10）12周后執(zhí)行。所有測(cè)量均對(duì)兩個(gè)獨(dú)立的群組進(jìn)行。

圖21。食用糖精的小鼠和GF接受者中的生態(tài)失調(diào)。代表在商用糖精和水或熱量甜味劑消耗者之間的W11對(duì)數(shù)標(biāo)度倍數(shù)分類差異的熱圖（N=每個(gè)組中的5）。右列-在來(lái)自食用商用糖精（接受者N=15）或食用葡萄糖的小鼠（N=13）的糞便移植后，在GF小鼠中的分類差異。指示了鑒定的OTU數(shù)目（GreenGenes）和最低分類水平。

圖22A-G。糖精調(diào)節(jié)的微生物叢的功能表征。（A）通過(guò)鳥槍法測(cè)序顯示的，食用商用糖精、水或葡萄糖共11周的小鼠（N=4）中的物種改變。（B）在所有接受不同處理的小鼠中，在115個(gè)KEGG途徑中的變化之間的成對(duì)關(guān)聯(lián)。（c-d）（C）糖胺聚糖或（D）其他聚糖降解途徑基因的相對(duì)豐度中的倍數(shù)變化。（E）歸于商用糖精背景下的五個(gè)分類群的更高的聚糖降解。（F-G）在飲用商用糖精或葡萄糖的小鼠（N=5）中，在W11時(shí)的糞便乙酸鹽和丙酸鹽水平。水平線-平均值，誤差條- S.E.M. **，通過(guò)兩側(cè)斯氏t檢驗(yàn)p<0.01。SCFA測(cè)量對(duì)兩個(gè)獨(dú)立的群組進(jìn)行。

圖23A-D。糖精調(diào)節(jié)的微生物叢的功能分析。（A-B）細(xì)菌相對(duì)豐度中的變化在細(xì)菌基因組各處出現(xiàn)。所示的是沿（A）普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）的10,000 bp基因組區(qū)域的測(cè)序覆蓋中的變化。（B）Akkermansia muciniphila，其中框通過(guò)糖精處理小鼠的第0周中的豐度排序。（C）在飲用商用糖精、葡萄糖或水的小鼠中，在第11周和第0周之間屬于磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）的模塊的相對(duì)豐度中的倍數(shù)變化。模塊圖解來(lái)源：KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。（D）與消耗商用糖精的小鼠中的相同途徑的相對(duì)豐度中的倍數(shù)變化（第11周/第0周）相比較，消耗HFD和純糖精相對(duì)于水的小鼠中的富集的KEGG途徑（倍數(shù)變化> 1.38作為截?cái)嘀担?/p>

圖24A-C。糖精直接調(diào)節(jié)微生物叢。（a）實(shí)驗(yàn)示意圖。（b）厭氧培養(yǎng)的微生物叢的相對(duì)分類豐度。（c）在用糖精富集或?qū)φ占S便培養(yǎng)物移植后6天的無(wú)菌小鼠的AUC（分別為N=10 & N=9）。水平線-平均值，誤差條- S.E.M. **，p<0.01，不成對(duì)兩側(cè)斯氏t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

圖25A-C。糖精直接調(diào)節(jié)微生物叢。（A）在用糖精富集或?qū)φ占S便培養(yǎng)物移植后6天的無(wú)菌小鼠的OGTT（分別為N=10 & N=9）。符號(hào)- 平均值，誤差條- S.E.M. **，p<0.01，***，p<0.001，ANOVA & Bonferroni事后分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。（B）來(lái)自a的無(wú)菌小鼠中的分類表示。（c）用由5mgml^-1糖精（與PBS相比較，y軸）厭氧培養(yǎng)的微生物組移植的W11食用糖精的小鼠（與W0相比較，x軸）和GF小鼠之間的KEGG途徑豐度的比較。

圖26A-H。急性糖精消耗通過(guò)誘導(dǎo)生態(tài)失調(diào)損害人體內(nèi)的升糖控制。（A）高NAS消耗者（N=40）相對(duì)于非消耗者（N=236）的HbA1C%。**，秩和p值< 0.002。（B）在4個(gè)應(yīng)答者（R）和3個(gè)非應(yīng)答者（NR）中的OGTT的每日增量曲線下面積（iAUC）。（C-D）在（C）4個(gè)應(yīng)答者或（D）3個(gè)非應(yīng)答者中的第1-4天相對(duì)于第5-7天的OGTT。（E）在第1-天期間，來(lái)自應(yīng)答者（N個(gè)樣品=16）相對(duì)于非應(yīng)答者（N=9）的16S rRNA序列的PCoA。（F）來(lái)自應(yīng)答者和非應(yīng)答者的第1和7天的分類樣品的次序水平相對(duì)豐度。（G-H）在（G）應(yīng)答者1（R1）或（H）非應(yīng)答者3（NR3）的D1或D7樣品的糞便移植后6天，在GF小鼠（N=6）中的OGTT。符號(hào)- 平均值，誤差條- S.E.M. *，p<0.05，**，p<0.01，ANOVA & Bonferroni事后分析。

圖27A-L。與人中的急性糖精消耗相關(guān)的升糖控制受損可轉(zhuǎn)移至GF小鼠。（A）實(shí)驗(yàn)方案（N=7）。（b-c）在（B）4個(gè)應(yīng)答者或（C）3個(gè)非應(yīng)答者中的第1-4天相對(duì)于第5-7天的iAUC。（D）16S rRNA序列的加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析證實(shí)：在第5-7天期間，在來(lái)自應(yīng)答者（N個(gè)樣品=12）相對(duì)于非應(yīng)答者（N=8）的微生物叢的主坐標(biāo)2（PC2）、3（PC3）和4（PC4）上的分離。（E）來(lái)自應(yīng)答者和非應(yīng)答者的第1-7天的分類樣品的次序水平相對(duì)豐度。（F）來(lái)自在食用糖精7天之前和之后收集的應(yīng)答者1（R1）樣品的糞便移植6天后，在GF小鼠（N=6）中的AUC。（G-H）在接受食用糖精7天之前和之后由應(yīng)答者4（R4）收集的糞便樣品6天后，在GF小鼠（N=5）中的OGTT和AUC。（I）來(lái)自在食用糖精7天之前和之后收集的非應(yīng)答者3（NR3）樣品的糞便移植6天后，在GF小鼠（N=5）中的AUC。（J-K）在接受食用糖精7天之前和之后由非應(yīng)答者2（NR2）收集的糞便樣品后6天，在GF小鼠（N=5）中的OGTT和AUC。（L）來(lái)自R1的D7相對(duì)于D1微生物組的GF接受者中改變的所選OTU的倍數(shù)分類豐度變化。點(diǎn)顏色對(duì)應(yīng)于小圖10f細(xì)菌次序。符號(hào)（GTT）或水平線（AUC）- 平均值，誤差條- S.E.M. *，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，雙因素ANOVA和Bonferroni事后分析（GTT），不成對(duì)兩側(cè)斯氏t檢驗(yàn)（AUC）。

圖28A-I。粘附于結(jié)腸上皮的微生物叢經(jīng)歷日間波動(dòng)。

（A）示意圖顯示了關(guān)于微生物叢上皮粘附、代謝組、宏基因組和結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組的取樣時(shí)間。（B）如通過(guò)粘附群落的細(xì)菌qPCR測(cè)定的，經(jīng)過(guò)兩個(gè)暗光周期與結(jié)腸上皮粘附的細(xì)菌數(shù)目中的日間波動(dòng)。（C）SEM圖像顯示了通過(guò)細(xì)菌的上皮定植中的日間波動(dòng)。圖像代表10個(gè)隨機(jī)選擇的視圖/小鼠。（D）經(jīng)過(guò)兩個(gè)光暗周期的過(guò)程，粘膜粘附細(xì)菌的β多樣性。（E）經(jīng)過(guò)兩個(gè)光暗周期的過(guò)程，粘膜粘附細(xì)菌的相對(duì)分類組成。（F）最顯著振蕩的粘膜粘附操作分類單位（OTU）的熱圖表示，p<0.05和q<0.2，JTK_周期。（G）上皮粘附OTU顯示相對(duì)豐度中的日間振蕩。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（H，I）顯示了粘膜粘附群落中的波動(dòng)相對(duì)豐度的細(xì)菌物種的實(shí)例。

數(shù)據(jù)代表具有N=45只小鼠的兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖29A-C。與粘膜結(jié)合的共生體的數(shù)目和組成的日間波動(dòng)。

（A）經(jīng)過(guò)兩天的過(guò)程，大腸的腔細(xì)菌的總數(shù)目。（B，C）顯示了經(jīng)過(guò)一天過(guò)程，通過(guò)細(xì)菌的上皮定植中的日間波動(dòng)的定量（B）和代表性SEM圖像（C）。在10個(gè)隨機(jī)選擇的圖像/小鼠上完成定量。

數(shù)據(jù)代表具有N=45只小鼠的兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖30A-I。與粘膜結(jié)合的共生體的數(shù)目和組成的日間波動(dòng)。

（A、B）如通過(guò)得自兩個(gè)連續(xù)暗光階段的樣品的主坐標(biāo)分析所示，粘膜粘附細(xì)菌的β多樣性的日間節(jié)律性。（C）經(jīng)過(guò)兩個(gè)光暗周期的過(guò)程，與所有其他時(shí)間點(diǎn)相比較，初始時(shí)間點(diǎn)的UniFrac距離。（D）經(jīng)過(guò)兩天的過(guò)程，不同粘膜粘附細(xì)菌類別的總數(shù)目。（E）上皮粘附的OTU顯示了總數(shù)目中的日間振蕩。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（F-I）經(jīng)過(guò)兩天的過(guò)程，經(jīng)歷總數(shù)目中的節(jié)律性波動(dòng)的粘膜粘附的細(xì)菌物種的實(shí)例。數(shù)據(jù)代表具有具有N=45只小鼠的兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖31A-K。腸道代謝組經(jīng)歷日間振蕩。

（A）顯示了日間振蕩的代謝產(chǎn)物。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（B、D、F、H）所示化學(xué)組的代謝產(chǎn)物顯示了糞便物中的日間振蕩。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（C、E、G）關(guān)于屬于不同化學(xué)組的腸道代謝產(chǎn)物中的節(jié)律性的實(shí)例。（I-K）最顯著振蕩的細(xì)菌基因（I）、結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物（J）和腸腔代謝產(chǎn)物（K）的熱圖表示，其中p<0.05，q<0.2，JTK_周期。數(shù)據(jù)代表具有N=18-27只小鼠的1-2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖32A-H。微生物叢代謝組的日間節(jié)律。

（A、C、E）所示化學(xué)組的代謝產(chǎn)物顯示了糞便物中的日間振蕩。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（B、F、D）關(guān)于屬于不同化學(xué)組的腸道代謝產(chǎn)物中的節(jié)律性的實(shí)例。（G、H）關(guān)于兩種微生物基因bioD和bioB（其涉及生物素合成）中的節(jié)律性的實(shí)例。數(shù)據(jù)代表在每個(gè)組中具有N=18-27個(gè)樣品的1-2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖33A-L?？股靥幚韽U除了微生物粘附節(jié)律且重新編程腸道轉(zhuǎn)錄組振蕩。（A）示意圖顯示了關(guān)于抗生素處理的小鼠和對(duì)照中的微生物叢上皮粘附和結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組的飼喂模式和取樣時(shí)間。（B）在抗生素處理的小鼠和對(duì)照中，經(jīng)過(guò)兩個(gè)暗光周期的過(guò)程，與結(jié)腸上皮粘附的細(xì)菌數(shù)目中的日間波動(dòng)。（C）代表性SEM圖像顯示了在ZT0時(shí)在抗生素處理的小鼠和對(duì)照中通過(guò)細(xì)菌的上皮定植。（D）上皮粘附的OTU顯示了在抗生素處理的小鼠和對(duì)照中，相對(duì)豐度中的日間振蕩。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（E）經(jīng)過(guò)兩個(gè)暗光周期的過(guò)程，在抗生素處理的小鼠和對(duì)照中，羅伊乳桿菌（Lactobacillus reuteri）的上皮粘附群落中的相對(duì)豐度。（F）與對(duì)照相比較，抗生素處理的小鼠的共享和獨(dú)特振蕩結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物的維恩圖，p<0.05和q<0.2，JTK_周期。（G-I）在抗生素處理的小鼠和對(duì)照之間共享的循環(huán)結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物（G）、在對(duì)照小鼠中獨(dú)特循環(huán)的轉(zhuǎn)錄物（H）、以及在抗生素處理的小鼠中獨(dú)特振蕩的轉(zhuǎn)錄物（I）的熱圖表示，p<0.05和q<0.2，JTK_周期。（J-L）在抗生素處理的小鼠和對(duì)照之間共享的循環(huán)結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物（J）、在對(duì)照小鼠中獨(dú)特循環(huán)的轉(zhuǎn)錄物（K）、以及在抗生素處理的小鼠中獨(dú)特振蕩的轉(zhuǎn)錄物（L）的KEGG分析。數(shù)據(jù)代表在每個(gè)組中具有N=45個(gè)樣品的兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖34A-E。抗生素處理廢除了微生物粘附節(jié)律。

（A，B）在抗生素處理的小鼠和對(duì)照中，經(jīng)過(guò)一天過(guò)程，通過(guò)細(xì)菌的上皮定植中的日間波動(dòng)的代表性SEM圖像（A）和定量（B）。（C）在抗生素處理后，經(jīng)過(guò)兩個(gè)光暗周期的過(guò)程，粘膜粘附的細(xì)菌的相對(duì)分類組成。（D）經(jīng)過(guò)一天過(guò)程，每6小時(shí)在抗生素處理的小鼠中的粘膜粘附群落的主坐標(biāo)分析。（E）在抗生素處理的小鼠中，經(jīng)過(guò)兩個(gè)光暗周期的過(guò)程，與所有其他時(shí)間點(diǎn)相比較，初始時(shí)間點(diǎn)的UniFrac距離。數(shù)據(jù)代表具有N=36只小鼠的兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖35A-I。微生物叢是腸道轉(zhuǎn)錄組中的協(xié)同振蕩所需的。

（A）在抗生素處理的小鼠和對(duì)照中顯示了日間振蕩的結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（B-D）在抗生素處理的小鼠之間具有共享的節(jié)律性（B）、在抗生素處理后節(jié)律性的喪失（C）和抗生素處理的小鼠中的從頭節(jié)律性（D）的結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物的代表性實(shí)例。

（E）與對(duì)照相比較，在抗生素處理的小鼠的結(jié)腸中的峰代謝活性的圖示。指定每種振蕩轉(zhuǎn)錄物，并且對(duì)于每個(gè)ZT通過(guò)KEGG分析測(cè)定峰相位ZT和峰概況。注意到峰代謝活性在兩個(gè)組之間不同。（F）在無(wú)菌小鼠和對(duì)照中顯示了日間振蕩的結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（G-I）在無(wú)菌小鼠和對(duì)照之間共享的循環(huán)轉(zhuǎn)錄物（G）、在對(duì)照小鼠中獨(dú)特循環(huán)的轉(zhuǎn)錄物（H）、以及在無(wú)菌小鼠中獨(dú)特振蕩的轉(zhuǎn)錄物（I）的熱圖表示，p<0.05，JTK_周期。數(shù)據(jù)代表在每個(gè)組中具有N=27-45只小鼠的1-2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖36A-J。飼喂時(shí)間控制宏基因組和結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組的振蕩。

（A-C）在自由進(jìn)食（A）、僅在暗階段期間飼喂（B）或僅在光階段期間飼喂（C）的小鼠中，經(jīng)過(guò)三個(gè)暗光階段的過(guò)程的食物攝入的分布。（D）在光階段飼喂后顯示階段偏移的細(xì)菌基因的實(shí)例。（E、F）在飼喂時(shí)間逆轉(zhuǎn)后，顯示階段偏移的振蕩宏基因組KEGG模塊（E）和途徑（F）的熱圖表示。（F）在飼喂時(shí)間逆轉(zhuǎn)后，顯示階段偏移的振蕩宏基因組KEGG途徑的熱圖表示。（G）在小鼠的光階段飼喂后，與細(xì)菌粘膜降解有關(guān)的宏基因組模塊中的階段偏移的實(shí)例。（H）在飼喂時(shí)間逆轉(zhuǎn)后，顯示階段偏移的涉及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的所選KEGG模塊和途徑的熱圖表示。（I，J）在暗階段飼喂相對(duì)于光階段飼喂的小鼠中的振蕩轉(zhuǎn)錄物的相逆轉(zhuǎn)的實(shí)例。數(shù)據(jù)代表在每個(gè)組中具有N=18-27個(gè)樣品的1-2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖37A-L。飼喂時(shí)間控制宏基因組振蕩、上皮粘附和宿主轉(zhuǎn)錄組。（A）示意圖顯示了關(guān)于微生物叢宏基因組、上皮粘附和結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組的飼喂模式和取樣時(shí)間。（B）在自由進(jìn)食相對(duì)于光階段飼喂的小鼠中，顯示了日間振蕩的微生物基因。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（C）在光階段飼喂后經(jīng)歷階段偏移的循環(huán)細(xì)菌基因的熱圖表示。（D）在自由進(jìn)食的小鼠中，在ZT12時(shí)在豐度中達(dá)到峰值的微生物基因中的振蕩的階段偏移。（E、F）在小鼠的光階段飼喂后，與細(xì)菌粘膜降解相關(guān)的宏基因組模塊（E）和途徑（F）中的階段偏移的實(shí)例。（G）在計(jì)劃的飼喂時(shí)，在小鼠中與結(jié)腸上皮粘附的細(xì)菌數(shù)目中的日間波動(dòng)。（H）在暗階段飼喂相對(duì)于光階段飼喂的小鼠中，顯示了日間振蕩的結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（I）與光階段飼喂的小鼠相比較，暗階段飼喂的小鼠的共享和獨(dú)特的振蕩結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物的維恩圖，p<0.05和q<0.2，JTK_周期。

（J）在暗階段飼喂相對(duì)于光階段飼喂的小鼠之間共享的循環(huán)轉(zhuǎn)錄物的熱圖表示。注意到兩個(gè)組中的振蕩之間的階段偏移。

（K、L）在暗階段飼喂相對(duì)于光階段飼喂的小鼠中的振蕩轉(zhuǎn)錄物的階段逆轉(zhuǎn)的實(shí)例。數(shù)據(jù)代表在每個(gè)組中具有N=18-27個(gè)樣品的兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖38A-J。通過(guò)飼喂時(shí)間和微生物組的腸道轉(zhuǎn)錄組振蕩的組合重新編程。（A）Chow-Ruskey圖解顯示了連同和不連同抗生素處理，暗階段飼喂和光階段飼喂的小鼠中的結(jié)腸振蕩的四向重疊。轉(zhuǎn)錄物計(jì)數(shù)為關(guān)于p<0.05，JTK_周期的振蕩。面積顏色指明重疊程度。邊界顏色指明分別的實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)結(jié)構(gòu)域的面積與轉(zhuǎn)錄物數(shù)目成比例。通過(guò)所有四種條件共享的振蕩轉(zhuǎn)錄物的KEGG指定顯示于下文。（B）在抗生素處理后，在飼喂時(shí)間逆轉(zhuǎn)后階段偏移且喪失振蕩的振蕩基因的熱圖表示（p<0.05，q<0.2，JTK_周期）。（C-F）Ifngr1和Cldn2作為結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物的實(shí)例，所述結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物在暗階段飼喂和光階段飼喂的小鼠（C、E）中振蕩，但在抗生素處理的組（D、F）中不振蕩。（G-J）Cry1和Per2作為結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物的實(shí)例，所述結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物在暗階段飼喂和光階段飼喂的小鼠中循環(huán)，所述兩種飼喂均不連同（G、I）和連同抗生素處理（H、J）。注意到暗階段飼喂和光階段飼喂的組之間的階段差異在抗生素處理后更不顯著。N=在每個(gè)組中的27個(gè)樣品。

圖39A-G。在Per1/2缺陷小鼠中的轉(zhuǎn)錄組振蕩的誘導(dǎo)通過(guò)微生物叢節(jié)律性驅(qū)動(dòng)。（A）示意圖顯示了在抗生素處理的Per1/2缺陷小鼠和對(duì)照中關(guān)于宏基因組和結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組的飼喂模式和取樣。（B）在自由進(jìn)食和光階段飼喂的Per1/2缺陷小鼠中，顯示了日間振蕩的微生物基因。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（C）在光階段飼喂的Per1/2缺陷小鼠中恢復(fù)微生物基因振蕩的熱圖表示。（D）在光階段飼喂的Per1/2缺陷小鼠中，在暗階段期間在豐度中達(dá)到峰值的微生物基因中的振蕩的誘導(dǎo)。（E）與自由進(jìn)食的對(duì)照相比較，在Per1/2缺陷小鼠的光階段飼喂后，在微生物基因中的節(jié)律性獲得的實(shí)例。（F）在自由進(jìn)食和光階段飼喂的Per1/2缺陷小鼠中，顯示了日間振蕩的微生物KEGG模塊。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（G）在Per1/2缺陷小鼠中的結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物的熱圖表示，所述Per1/2缺陷小鼠在光階段飼喂后獲得節(jié)律性，但在抗生素處理的小鼠中則不是。

N=在每個(gè)組中的18-27個(gè)樣品。

圖40A-H。通過(guò)抗生素處理對(duì)肝臟轉(zhuǎn)錄鐘重新編程。（A）描述了在對(duì)照和抗生素處理的小鼠之間的獨(dú)特和共享的振蕩肝臟轉(zhuǎn)錄物的維恩圖，其中p<0.05和q<0.2，JTK_周期。（B）在抗生素處理的小鼠和對(duì)照之間具有共享振蕩的肝臟轉(zhuǎn)錄物的熱圖表示。（C、D）在對(duì)照小鼠中獨(dú)特振蕩的轉(zhuǎn)錄物的熱圖表示（C）和KEGG途徑分析（D）。（E、F）在抗生素處理的小鼠中獨(dú)特振蕩的轉(zhuǎn)錄物的熱圖表示（E）和KEGG途徑分析（F）。（G）在抗生素處理和對(duì)照小鼠的肝中的峰代謝活性的圖示。指定每種振蕩轉(zhuǎn)錄物，并且對(duì)于每個(gè)ZT通過(guò)KEGG分析測(cè)定峰相位ZT和峰概況。N=在每個(gè)組中的36個(gè)樣品。（H）示意圖概括了微生物組的節(jié)律性活動(dòng)和粘膜粘附。在微生物組破壞后，宿主轉(zhuǎn)錄組被重新編程，包括正常振蕩的喪失和振蕩的從頭發(fā)生。

圖41A-H?？股靥幚韺?duì)肝臟轉(zhuǎn)錄組振蕩的影響。

（A）在抗生素處理的小鼠和對(duì)照中，顯示出日間振蕩的肝臟轉(zhuǎn)錄物。描述了波動(dòng)幅度。虛線指出p<0.05，JTK_周期。（B）在抗生素處理的小鼠和對(duì)照之間共享的肝臟循環(huán)轉(zhuǎn)錄物的KEGG途徑分析。（C-F）在抗生素處理的小鼠和對(duì)照之間共享的肝臟轉(zhuǎn)錄物振蕩的實(shí)例。（G）對(duì)于對(duì)照小鼠獨(dú)特的肝臟轉(zhuǎn)錄物振蕩的實(shí)例。（H）關(guān)于測(cè)定轉(zhuǎn)錄組振蕩中的遺傳和環(huán)境因子的相互作用的提示模型的示意圖。構(gòu)成分子鐘的轉(zhuǎn)錄因子的網(wǎng)絡(luò)整合來(lái)自飲食和微生物叢的信號(hào)，其確定靶基因的節(jié)律性活化。這繼而確定經(jīng)歷循環(huán)振蕩的轉(zhuǎn)錄組的部分。N=每個(gè)組中的45個(gè)樣品。

圖42是舉例說(shuō)明良好周中的平均升糖反應(yīng)低于糟糕周的條形圖。良好（綠色）和糟糕（紅色）周中的16名參與者的平均iAUCmed水平。iAUCmed是在膳食消耗前15分鐘超過(guò)中值葡萄糖水平的增量曲線下面積（AUC）。參與者的iAUCmed水平是所有其早餐、午餐和晚餐iAUCmed的平均值。在x軸中，IG表示葡萄糖受損的參與者，并且H表示健康參與者。圓括號(hào)中的符號(hào)IG/H后的第一個(gè)數(shù)目是實(shí)驗(yàn)6天的平均喚醒葡萄糖水平，并且圓括號(hào)中的第二個(gè)數(shù)目是在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的HbA1C。

圖43是舉例說(shuō)明對(duì)膳食的升糖反應(yīng)遵循日間模式的圖表，其中早餐具有最低應(yīng)答，隨后為午餐，而晚餐具有最高應(yīng)答。每個(gè)點(diǎn)代表與良好周（y軸）相比較，在糟糕周（x軸）中的膳食的平均iAUCmed。大多數(shù)點(diǎn)低于x=y線，意指平均起來(lái)糟糕周中的AUC與良好周相比較更高。所示的是早餐（紅色）、午餐（綠色）和晚餐（藍(lán)色）的iAUCmed水平。實(shí)心點(diǎn)對(duì)應(yīng)于葡萄糖受損的參與者，并且空心點(diǎn)對(duì)應(yīng)于健康個(gè)體。葡萄糖受損的參與者中的所有早餐的線性擬合的斜率（紅線）與午餐（綠線）相比較最高，隨后為晚餐（綠線）。虛線對(duì)應(yīng)于健康參與者，并且完整線對(duì)應(yīng)于葡萄糖受損的參與者。

圖44A-B是舉例說(shuō)明在通過(guò)膳食熱量和碳水化合物水平標(biāo)準(zhǔn)化后，膳食后的AUC顯示日間模式的圖表。圖44A顯示了通過(guò)膳食熱量含量標(biāo)準(zhǔn)化的iAUCmed，并且圖44B顯示了通過(guò)膳食碳水化合物含量標(biāo)準(zhǔn)化的iAUCmed。

發(fā)明具體實(shí)施方案的描述

本發(fā)明在其一些實(shí)施方案中涉及微生物組，并且更具體地但非專一地，涉及用于通過(guò)分析微生物組預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)一種或多種試劑的應(yīng)答的方法和儀器。

在詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)理解本發(fā)明在其應(yīng)用中不一定限制于下述說(shuō)明書中闡述或通過(guò)實(shí)施例例示的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有其他實(shí)施方案或者以各種方式實(shí)踐或進(jìn)行。

腸微生物組處于持續(xù)變化中，響應(yīng)于外部刺激例如食物攝入、抗生素?cái)z入和疾病而不斷改變其微生物組成。因此，微生物組的系統(tǒng)發(fā)育組成在個(gè)體間變化。此類差異已與疾病例如結(jié)腸癌和炎性腸病、易患肥胖、自閉癥譜系障礙的嚴(yán)重程度以及對(duì)醫(yī)學(xué)治療的應(yīng)答差異相關(guān)。

本發(fā)明人目前已發(fā)現(xiàn)試劑或條件對(duì)特定個(gè)人的毒性水平可以通過(guò)分析其對(duì)他的微生物組的影響進(jìn)行測(cè)量。更具體而言，對(duì)特定個(gè)體有毒的試劑將驅(qū)使他的微生物組的組成更類似于致病性微生物組（例如來(lái)自患病個(gè)體的微生物組），而無(wú)毒試劑將不具有這種效應(yīng)。因此，他的微生物組可以用作衡量外部刺激的毒性的晴雨表。

當(dāng)實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，本發(fā)明人已證實(shí)食用常用的人造甜味劑制劑通過(guò)誘導(dǎo)腸道微生物組的組成和功能的改變，推動(dòng)特定個(gè)體中的葡萄糖耐受不良的發(fā)展。雖然一些個(gè)體似乎對(duì)人造甜味劑的效應(yīng)更耐受，但其他的則更不耐受。對(duì)人造甜味劑的個(gè)體應(yīng)答被證明是由于測(cè)試個(gè)體的微生物組的差異。

另外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)腸微生物組的細(xì)菌含量易受晝夜節(jié)律改變破壞的影響。晝夜節(jié)律的破壞促使腸微生物組的微生物含量更類似于肥胖或葡萄糖耐受不良的個(gè)體的微生物組。因此，當(dāng)時(shí)差微生物從小鼠或人轉(zhuǎn)移到無(wú)菌小鼠內(nèi)時(shí)，嚙齒類動(dòng)物變得對(duì)葡萄糖耐受不良和糖尿病更敏感。

當(dāng)進(jìn)一步實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，本發(fā)明人證明腸微生物組具有其自身固有的晝夜節(jié)律，其影響宿主的每日局部和全身轉(zhuǎn)錄組振蕩。這種日間宏生物（metaorganism）活性適合食物攝入，其時(shí)間安排決定了微生物組活性的階段和與宿主的同步。本發(fā)明人證明：通過(guò)抗生素處理破壞微生物叢或在無(wú)菌小鼠中重新編程腸道和肝臟宿主轉(zhuǎn)錄組以同時(shí)表征振蕩的大量喪失和從頭發(fā)生，導(dǎo)致代謝途徑的時(shí)間再組構(gòu)。

相應(yīng)地，本發(fā)明人提出當(dāng)確定抗生素或益生菌治療方案時(shí)，應(yīng)考慮到宿主的微生物組的天然晝夜節(jié)律（即應(yīng)小心以便不破壞微生物組的晝夜節(jié)律）。

因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了測(cè)定試劑對(duì)個(gè)體的微生物組的影響的方法，其包括：

（a）使微生物組暴露于試劑；

（b）比較暴露后的微生物組的標(biāo)記與致病性微生物組的參考標(biāo)記，其中當(dāng)微生物組的標(biāo)記在統(tǒng)計(jì)上顯著類似于致病性微生物組的參考標(biāo)記時(shí)，表明所述試劑對(duì)所述微生物組具有不利影響。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“微生物組”指在限定環(huán)境中微生物（細(xì)菌、真菌、原生生物）、其遺傳元件（基因組）的總體。

微生物組可以是腸微生物組、口腔微生物組、支氣管微生物組、皮膚微生物組或陰道微生物組。

根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，所述微生物組是腸微生物組（即腸道微生物組）。

本發(fā)明涵蓋了這樣的認(rèn)知：可以依賴微生物標(biāo)記作為關(guān)于微生物組組成和/或活性的代表。微生物標(biāo)記包含作為微生物組組成和/或活性的指示劑的數(shù)據(jù)點(diǎn)。因此，根據(jù)本發(fā)明，微生物組中的變化可以通過(guò)檢測(cè)微生物標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)特征進(jìn)行檢測(cè)和/或分析。

在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包括與一個(gè)或多個(gè)類型的微生物和/或其產(chǎn)物的絕對(duì)量有關(guān)的信息。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包括與五個(gè)、十個(gè)、二十個(gè)或更多個(gè)類型的微生物或其產(chǎn)物的相對(duì)量有關(guān)的信息。

微生物產(chǎn)物的實(shí)例包括但不限于mRNA、多肽、碳水化合物和代謝產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含與至少十個(gè)類型的微生物的存在、水平和/或活性有關(guān)的信息。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含與5至100個(gè)類型的微生物的存在、水平和/或活性有關(guān)的信息。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含與100至1000個(gè)或更多個(gè)類型的微生物的存在、水平和/或活性有關(guān)的信息。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含與微生物組內(nèi)基本上所有類型的細(xì)菌的存在、水平和/或活性有關(guān)的信息。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含與微生物組內(nèi)基本上所有類型的微生物的存在、水平和/或活性有關(guān)的信息。

在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含與至少十個(gè)類型的微生物的代謝產(chǎn)物的存在、水平和/或活性有關(guān)的信息。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含與5至100個(gè)類型的微生物的代謝產(chǎn)物的存在、水平和/或活性有關(guān)的信息。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含與100至1000個(gè)或更多個(gè)類型的微生物的代謝產(chǎn)物的存在、水平和/或活性有關(guān)的信息。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含與微生物組內(nèi)基本上所有類型的細(xì)菌的代謝產(chǎn)物的存在、水平和/或活性有關(guān)的信息。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含與微生物組內(nèi)基本上所有類型的微生物的代謝產(chǎn)物的存在、水平和/或活性有關(guān)的信息。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，微生物組標(biāo)記包括微生物組中至少一種、至少10種、至少20種、至少50種、至少100種、至少200種、至少300種、至少400種、至少500種、至少600種、至少700種、至少800種、至少900種、至少1000種、至少1200種、至少1500種或所有種類的微生物的存在或水平。

在一些實(shí)施方案中，微生物組標(biāo)記包含至少一個(gè)、或至少五個(gè)、或至少十個(gè)或更多個(gè)類型的微生物（例如細(xì)菌）或者其組分或副產(chǎn)物的水平或水平組。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含至少一種或至少五種或至少十種或更多種DNA序列的水平或水平組。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含十種或更多種16S rRNA基因序列的水平或水平組。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含18S rRNA基因序列的水平或水平組。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含至少五種或至少十種或更多種RNA轉(zhuǎn)錄物的水平或水平組。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含至少五種或至少十種或更多種蛋白質(zhì)的水平或水平組。在一些實(shí)施方案中，微生物標(biāo)記包含至少一種或至少五種或至少十種或更多種代謝產(chǎn)物的水平或水平組。

16S和18S rRNA基因序列分別編碼原核生物和真核生物核糖體的小亞基組分。rRNA基因?qū)τ趨^(qū)分微生物類型特別有用，因?yàn)楸M管這些基因的序列在微生物物種之間不同，但這些基因具有高度保守的引物結(jié)合區(qū)域。保守的引物結(jié)合區(qū)之間的這種特異性允許許多不同類型的微生物的rRNA基因用單一引物組擴(kuò)增，并隨后通過(guò)擴(kuò)增序列區(qū)分。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，處于分析下的個(gè)體是健康個(gè)體（即未診斷有已知影響微生物組的疾病的個(gè)體）。因此，根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，處于分析下的個(gè)體未患有代謝疾?。ɡ绮⒎翘悄虿』蛱悄虿∏捌?、未患有克羅恩氏?。┗虬┌Y。個(gè)體通常是哺乳動(dòng)物（例如人）。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，處于分析下的個(gè)體的微生物組概況被包括在個(gè)體特異性數(shù)據(jù)庫(kù)中，并且來(lái)源于非健康個(gè)體的參考微生物組（致病性微生物組）的概況被包括在第二數(shù)據(jù)庫(kù)中。所述第二數(shù)據(jù)庫(kù)可包含不止一種致病性微生物組的概況，并且可以包含來(lái)自多個(gè)致病性微生物組的平均數(shù)據(jù)。

個(gè)體特異性數(shù)據(jù)庫(kù)和第二數(shù)據(jù)庫(kù)兩者均可以計(jì)算機(jī)可讀形式存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)可讀媒體上，并且任選且優(yōu)選由數(shù)據(jù)處理器例如通用計(jì)算機(jī)或?qū)Ｓ秒娐吩L問(wèn)。

個(gè)體特異性數(shù)據(jù)庫(kù)可以包含描述個(gè)體的另外數(shù)據(jù)。除微生物組概況或標(biāo)記外的數(shù)據(jù)類型的代表性實(shí)例包括但不限于對(duì)食物的應(yīng)答、個(gè)體的血液化學(xué)、個(gè)體的部分血液化學(xué)、個(gè)體的遺傳學(xué)概況、與個(gè)體相關(guān)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)、個(gè)體的身體狀況、個(gè)體的睡眠模式、個(gè)體的食物攝入習(xí)慣（例如個(gè)體是否使用人造甜味劑）等等。個(gè)體特異性數(shù)據(jù)庫(kù)還可以包含關(guān)于對(duì)試劑的攝入或暴露頻率、對(duì)試劑的攝入或暴露時(shí)間等等的數(shù)據(jù)。這些及其他類型的數(shù)據(jù)在下文更詳細(xì)地描述。

為了分析微生物組，從個(gè)體中獲取樣品。因此，例如可以獲取大便樣品以分析腸微生物組，可以獲取支氣管樣品以分析支氣管微生物組等。根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，個(gè)體的微生物組由所述個(gè)體的大便樣品進(jìn)行測(cè)定。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)相同來(lái)源的微生物組進(jìn)行了比較（即個(gè)體的腸微生物組與第二個(gè)體或個(gè)體組的腸微生物組比較）。

本發(fā)明人已證明進(jìn)食模式（例如由于晝夜節(jié)律失調(diào)）中的變化影響微生物組的組成。因此，優(yōu)選地，在每天的固定時(shí)間獲取樣品。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面進(jìn)行分析的試劑可以是物質(zhì)或條件。

可能分析的物質(zhì)通常是無(wú)熱量物質(zhì)（即具有小于3卡路里/100 g）。

示例性無(wú)熱量物質(zhì)包括食物添加劑。

食物添加劑可以根據(jù)歐盟用E編號(hào)進(jìn)行分類。因此，例如E編號(hào)在100-199之間的物質(zhì)是色素，E編號(hào)在200-299之間的物質(zhì)是防腐劑，E編號(hào)在300-399之間的物質(zhì)是抗氧化劑，E編號(hào)在400-499之間的物質(zhì)是增稠劑、穩(wěn)定劑或乳化劑，E編號(hào)在500-599之間的物質(zhì)是酸性調(diào)節(jié)劑或抗結(jié)塊劑，E編號(hào)在600-699之間的物質(zhì)是風(fēng)味增強(qiáng)劑，E編號(hào)在700-799之間的物質(zhì)是抗生素，E編號(hào)在900-999之間的物質(zhì)是上光劑或甜味劑。另外的化學(xué)制品的E編號(hào)在1000-1599之間。

食物添加劑可以分類成下列組：酸、酸度調(diào)節(jié)劑、抗結(jié)塊劑、消泡劑、抗氧化劑、填充劑、著色劑、乳化劑、香料、風(fēng)味增強(qiáng)劑、上光劑、保濕劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、人造甜味劑和增稠劑。

根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，所述物質(zhì)是咖啡因。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述物質(zhì)是人造甜味劑。

人造甜味劑的實(shí)例包括但不限于阿斯巴甜、安賽蜜、甜菊醇、糖精、甜蜜素、赤蘚醇、益壽糖、麥芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、新橙皮苷二氫查耳酮、紐甜、山梨糖醇、木糖醇和三氯蔗糖。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述物質(zhì)是治療劑。治療劑的實(shí)例包括但不限于無(wú)機(jī)或有機(jī)化合物；小分子（即小于1000道爾頓）或大分子（即超過(guò)1000道爾頓）；生物分子（例如蛋白性分子，包括但不限于：肽、多肽、翻譯后修飾的蛋白質(zhì)、抗體等）或核酸分子（例如雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA或三螺旋核酸分子）或化學(xué)制品。治療劑可以是來(lái)源于任何已知生物（包括但不限于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌、原生生物或病毒）的天然產(chǎn)物或來(lái)源于合成分子的文庫(kù)。治療劑可以是單體以及聚合化合物。

根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，所述物質(zhì)是代謝產(chǎn)物。

如本文使用的，“代謝產(chǎn)物”是代謝的中間產(chǎn)物或產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)代謝產(chǎn)物一般局限于小分子，并且不包括聚合化合物例如DNA或蛋白質(zhì)。代謝產(chǎn)物可以充當(dāng)代謝途徑的酶的底物、此類途徑的中間產(chǎn)物或通過(guò)該代謝途徑獲得的產(chǎn)物。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，代謝產(chǎn)物包括但不限于糖、有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸、激素、維生素、寡肽（長(zhǎng)度小于約100個(gè)氨基酸）以及其離子片段。細(xì)胞還可以進(jìn)行裂解，以便測(cè)量細(xì)胞內(nèi)存在的細(xì)胞產(chǎn)物。特別地，所述代謝產(chǎn)物分子量小于約3000道爾頓，并且更特別地約50至約3000道爾頓。

本發(fā)明的這個(gè)方面的代謝產(chǎn)物可以是主要代謝產(chǎn)物（即微生物生長(zhǎng)必需的）或次要代謝產(chǎn)物（在生長(zhǎng)、發(fā)育或繁殖中不起作用，并且在生長(zhǎng)結(jié)束后或接近生長(zhǎng)靜止期所形成的代謝產(chǎn)物）。

本發(fā)明的代謝產(chǎn)物所涉及的代謝途徑的代表實(shí)例包括但不限于檸檬酸循環(huán)、呼吸鏈、光合作用、光呼吸作用、糖酵解、糖異生、磷酸己糖途徑、氧化磷酸戊糖途徑、脂肪酸的生產(chǎn)和氧化、尿素循環(huán)、氨基酸生物合成途徑、蛋白質(zhì)降解途徑如蛋白酶體降解、氨基酸降解途徑、下列物質(zhì)的生物合成或降解：脂質(zhì)、聚酮（包括例如類黃酮和異黃酮）、類異戊二烯（包括例如萜烯、甾醇、類固醇、類胡蘿卜素、葉黃素）、碳水化合物、類苯基丙烷和衍生物、生物堿、苯環(huán)型化合物、吲哚、吲哚-硫化合物、卟啉、花青素、激素、維生素、輔因子如輔基或電子載體、木質(zhì)素、硫代葡糖苷、嘌呤、嘧啶、核苷、核苷酸和相關(guān)分子如tRNA、微小RNA（miRNA）或mRNA。

根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，所述治療劑不是食物或食物添加劑。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述治療劑并非用于治療肥胖或與葡萄糖耐受不良相關(guān)的疾病（例如糖尿病）。

根據(jù)另外一個(gè)實(shí)施方案，所述物質(zhì)不是治療劑。

所述物質(zhì)可以是分離的或可以摻入載體例如食物或飲料中。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述載體是無(wú)熱量載體例如無(wú)熱量食物或飲料。因此，例如，所述物質(zhì)可以是減肥飲料或不加奶的咖啡。

優(yōu)選地，微生物組暴露于相似量的試劑，所述試劑量是處于檢查下的個(gè)體常規(guī)經(jīng)受的。

如所述的，測(cè)試的試劑還可以是條件。

本發(fā)明設(shè)想的示例性條件包括但不限于睡眠模式改變、暴露于煙草煙霧、暴露于輻射、曝露于光和食物攝入模式。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的第一步涉及使微生物組暴露于試劑。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)試劑是物質(zhì)時(shí)，這個(gè)步驟可以在體內(nèi)或體外實(shí)現(xiàn)。當(dāng)試劑是條件時(shí)，這個(gè)步驟通常在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)。暴露可以是直接暴露（例如接觸）或可以經(jīng)由個(gè)體（例如個(gè)體暴露于不同的睡眠模式）來(lái)實(shí)現(xiàn)。

接觸可以一次進(jìn)行，或可以在特定時(shí)間段的過(guò)程中在多個(gè)時(shí)機(jī)實(shí)現(xiàn)。

應(yīng)當(dāng)理解，標(biāo)記可以在個(gè)體的微生物組中進(jìn)行測(cè)定，所述個(gè)體已知或已經(jīng)經(jīng)受試劑或條件。這個(gè)信息可以直接得自處于分析下的個(gè)體（例如使用問(wèn)卷）。優(yōu)選地，個(gè)體已經(jīng)受試劑一段時(shí)間（例如一周、一個(gè)月或更久）。根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，個(gè)體已經(jīng)受試劑一天至少一次、一天至少兩次、一天至少三次或更多次。優(yōu)選地，在分析之前至少1個(gè)月，在分析前至少一周且任選在分析前至少一天，個(gè)體已經(jīng)受試劑。

在接觸之后，將測(cè)試個(gè)體的微生物組的標(biāo)記與致病性微生物組的參考標(biāo)記相比較。

如本文使用的，短語(yǔ)“致病性微生物組”指來(lái)源于個(gè)體的微生物組，所述個(gè)體已知患有疾?。ɡ绱x疾病例如糖尿病或糖尿病前期、癌癥）或已經(jīng)預(yù)分類為具有對(duì)試劑不耐受的微生物組。

定量微生物的水平：在依照本發(fā)明的方法中，通過(guò)定量微生物的水平獲得并且/或者測(cè)定微生物標(biāo)記。定量各種類型的微生物的水平的方法在本文下文描述。

在一些實(shí)施方案中，測(cè)定一個(gè)或多個(gè)類型的微生物或者其組分或產(chǎn)物的水平或水平組包括測(cè)定一種或多種DNA序列的水平或水平組。在一些實(shí)施方案中，一種或多種DNA序列包括可以用于區(qū)分不同微生物類型的任何DNA序列。在某些實(shí)施方案中，一種或多種DNA序列包括16S rRNA基因序列。在某些實(shí)施方案中，一種或多種DNA序列包括18S rRNA基因序列。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增了1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、1,000、5,000種或更多種序列。

在一些實(shí)施方案中，直接測(cè)定微生物叢樣品（例如糞便樣品）的一種或多種DNA序列的水平或水平組。在一些實(shí)施方案中，從微生物叢樣品中分離DNA，并且測(cè)定分離的DNA的一種或多種DNA序列的水平或水平組。分離微生物DNA的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。實(shí)例包括但不限于苯酚-氯仿提取，以及廣泛多樣的商購(gòu)可得的試劑盒，包括QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen，Valencia，Calif.）。

在一些實(shí)施方案中，一種或多種DNA序列的水平或水平組通過(guò)使用PCR（例如標(biāo)準(zhǔn)PCR、半定量或定量PCR）擴(kuò)增DNA序列進(jìn)行測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，一種或多種DNA序列的水平或水平組通過(guò)使用定量PCR擴(kuò)增DNA序列進(jìn)行測(cè)定。這些及其他基本DNA擴(kuò)增程序是本領(lǐng)域從業(yè)者眾所周知的，并且在Ausebel等人（Ausubel F M，Brent R，Kingston R E，Moore D D，Seidman J G，Smith J A，Struhl K（編輯）. 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York）中描述。

在一些實(shí)施方案中，DNA序列使用特異于一種或多種序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增，所述一種或多種序列將個(gè)別微生物類型與其他不同的微生物類型區(qū)分開。在一些實(shí)施方案中，16S rRNA基因序列或其片段使用特異于16S rRNA基因序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，18S DNA序列使用特異于18S DNA序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方案中，一種或多種16S rRNA基因序列的水平或水平組使用phylochip技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。phylochip的使用是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在Hazen等人（"Deep-sea oil plume enriches indigenous oil-degrading bacteria." Science，330，204-208，2010）中描述，所述參考文獻(xiàn)全文通過(guò)引用并入。簡(jiǎn)言之，擴(kuò)增16S rRNA基因序列且由從微生物叢樣品中提取的DNA進(jìn)行標(biāo)記。擴(kuò)增的DNA隨后與含有針對(duì)微生物16S rRNA基因的探針的陣列雜交。隨后定量與每種探針的結(jié)合水平，提供對(duì)應(yīng)于探測(cè)到的16S rRNA基因序列的微生物類型的樣品水平。在一些實(shí)施方案中，phylochip分析通過(guò)商用供應(yīng)商來(lái)進(jìn)行。實(shí)例包括但不限于Second Genome Inc.（San Francisco，Calif.）。

在一些實(shí)施方案中，測(cè)定一個(gè)或多個(gè)類型的微生物或者其組分或產(chǎn)物的水平或水平組包括測(cè)定一種或多種微生物RNA分子（例如轉(zhuǎn)錄物）的水平或水平組。定量RNA轉(zhuǎn)錄物的水平的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括但不限于RNA分析、半定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和微陣列分析。

在一些實(shí)施方案中，測(cè)定一個(gè)或多個(gè)類型的微生物或者其組分或產(chǎn)物的水平或水平組包括測(cè)定一種或多種微生物多肽的水平或水平組。定量多肽水平的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括但不限于蛋白質(zhì)分析和質(zhì)譜法。這些及其他基本多肽檢測(cè)程序在Ausebel等人中描述。

在一些實(shí)施方案中，測(cè)定一個(gè)或多個(gè)類型的微生物或者其組分或產(chǎn)物的水平或水平組包括測(cè)定一種或多種微生物代謝產(chǎn)物的水平或水平組。在一些實(shí)施方案中，代謝產(chǎn)物的水平通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，代謝產(chǎn)物水平通過(guò)核磁共振波譜法進(jìn)行測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，代謝產(chǎn)物水平通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）進(jìn)行測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，代謝產(chǎn)物水平通過(guò)比色法進(jìn)行測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，代謝產(chǎn)物水平通過(guò)分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

分析SCFA的方法是本領(lǐng)域已知的。示例性方法在本文下文實(shí)施例部分進(jìn)行描述。

應(yīng)當(dāng)理解，選擇致病性微生物組參考標(biāo)記以便與個(gè)體的微生物組標(biāo)記對(duì)應(yīng)。例如，如果個(gè)體的微生物組標(biāo)記包含微生物代謝產(chǎn)物的量，則致病性微生物組參考標(biāo)記也包含所述微生物代謝產(chǎn)物的量。如果個(gè)體的微生物組標(biāo)記包含涉及糖胺聚糖合成的一組基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，則致病性微生物組參考標(biāo)記也包含涉及糖胺聚糖合成的該組基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)兩種微生物組標(biāo)記包含的微生物至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同時(shí)，它們可以是統(tǒng)計(jì)上顯著相似的標(biāo)記。

另外或可替代地，當(dāng)微生物組中至少一種目標(biāo)微生物的數(shù)量（例如出現(xiàn)）相同時(shí)，微生物組可以具有統(tǒng)計(jì)上顯著相似的標(biāo)記。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)微生物組中其微生物的至少10%的相對(duì)比率相同時(shí)，微生物組可以具有統(tǒng)計(jì)上顯著相似的標(biāo)記。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)微生物組中其微生物的至少20%的相對(duì)比率相同時(shí)，微生物組可以具有統(tǒng)計(jì)上顯著相似的標(biāo)記。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)微生物組中其微生物的至少30%的相對(duì)比率相同時(shí)，微生物組可以具有統(tǒng)計(jì)上顯著相似的標(biāo)記。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)微生物組中其微生物的至少40%的相對(duì)比率相同時(shí)，微生物組可以具有統(tǒng)計(jì)上顯著相似的標(biāo)記。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)微生物組中其微生物的至少50%的相對(duì)比率相同時(shí)，微生物組可以具有統(tǒng)計(jì)上顯著相似的標(biāo)記。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)微生物組中其微生物的至少60%的相對(duì)比率相同時(shí)，微生物組可以具有統(tǒng)計(jì)上顯著相似的標(biāo)記。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)微生物組中其微生物的至少70%的相對(duì)比率相同時(shí)，微生物組可以具有統(tǒng)計(jì)上顯著相似的標(biāo)記。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)微生物組中其微生物的至少80%的相對(duì)比率相同時(shí)，微生物組可以具有統(tǒng)計(jì)上顯著相似的標(biāo)記。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)微生物組中其微生物的至少90%的相對(duì)比率相同時(shí)，微生物組可以具有統(tǒng)計(jì)上顯著相似的標(biāo)記。因此，總體微生物的分?jǐn)?shù)百分比（例如相對(duì)量、比率、分布、頻率、百分比等）可以是統(tǒng)計(jì)上類似的。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，為了將微生物劃歸特定的屬、科、目、綱或門，其必須與已知屬于特定屬的參考微生物具有至少90%序列同源性、至少91%序列同源性、至少92%序列同源性、至少93%序列同源性、至少94%序列同源性、至少95%序列同源性、至少96%序列同源性、至少97%序列同源性、至少98%序列同源性、至少99%序列同源性。根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，序列同源性是至少95%。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，為了將微生物劃歸特定的種，其必須與已知屬于特定種的參考微生物具有至少90%序列同源性、至少91%序列同源性、至少92%序列同源性、至少93%序列同源性、至少94%序列同源性、至少95%序列同源性、至少96%序列同源性、至少97%序列同源性、至少98%序列同源性、至少99%序列同源性。根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，序列同源性是至少97%。

在測(cè)定核酸或蛋白質(zhì)是否與本發(fā)明的序列基本上同源或共享一定百分比的序列同一性中，序列相似性可以通過(guò)常規(guī)算法進(jìn)行限定，所述常規(guī)算法通常允許引入少量空位，以便實(shí)現(xiàn)最佳擬合。特別地，兩個(gè)多肽或兩個(gè)核酸序列的“同一性百分比”使用Karlin和Altschul（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268，1993）的算法進(jìn)行測(cè)定。將此類算法結(jié)合到Altschul等人（J. Mol. Biol. 215:403-410，1990）的BLASTN和BLASTX程序內(nèi)。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序執(zhí)行，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。同等地，BLAST蛋白質(zhì)搜索可以用BLASTX程序執(zhí)行，以獲得與本發(fā)明的多肽同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對(duì)，如Altschul等人（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402，1997）中所述的使用Gapped BLAST。當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，采用各自程序（例如BLASTX和BLASTN）的缺省參數(shù)。關(guān)于更多細(xì)節(jié)參考wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov。

根據(jù)仍另一個(gè)實(shí)施方案，如果屬于特定途徑的基因的相對(duì)數(shù)目相似，則兩種微生物組標(biāo)記可以歸為相似的。此類途徑在本文下文描述。

根據(jù)仍另一個(gè)實(shí)施方案，如果由微生物生成的產(chǎn)物的相對(duì)量相似，則兩種微生物組標(biāo)記可以歸為相似的。此類產(chǎn)物在本文下文描述。

正如比較處于分析下的個(gè)體的微生物組標(biāo)記與致病性參考微生物組，個(gè)體的微生物組標(biāo)記還（或可替代地）可以與非致病性參考微生物組相比較。

因此，根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，該方法還包括比較暴露后的微生物組的標(biāo)記與非致病性微生物組參考標(biāo)記，其中當(dāng)微生物組的標(biāo)記在統(tǒng)計(jì)上顯著不同于非致病性微生物組參考標(biāo)記時(shí)，表明所述試劑對(duì)所述微生物組具有不利影響。另外，當(dāng)微生物組的標(biāo)記在統(tǒng)計(jì)上顯著類似于非致病性微生物組參考標(biāo)記時(shí)，表明所述試劑對(duì)所述微生物組不具有不利影響。

非致病性微生物組通常來(lái)源于健康個(gè)體（即，不患有任何疾病，尤其是代謝疾病）。另外，非致病性微生物組通常來(lái)源于未長(zhǎng)期攝入試劑的健康個(gè)體，所述試劑已知會(huì)不利地影響微生物組。因此，例如，非致病性微生物組通常來(lái)源于未長(zhǎng)期攝入人造甜味劑的健康個(gè)體。

可以在本文描述的方法的任一種中加入另外的步驟，所述方法用于評(píng)價(jià)試劑對(duì)微生物組的作用，包括在分析微生物組標(biāo)記和/或制備用于分析的樣品（例如糞便物的取出、制造蛋白質(zhì)提取物、制備核酸樣品等）之前，給個(gè)體施用試劑。

本文描述的分析方法中的任一種均可以許多形式體現(xiàn)。例如，它可以在有形介質(zhì)例如用于執(zhí)行方法操作的計(jì)算機(jī)上體現(xiàn)。它可以在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上體現(xiàn)，包括用于進(jìn)行方法操作的計(jì)算機(jī)可讀說(shuō)明書。它還可以在電子裝置中體現(xiàn)，所述電子裝置具有數(shù)字計(jì)算機(jī)能力以安排運(yùn)行在有形介質(zhì)上的計(jì)算機(jī)程序或執(zhí)行在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的指令。

實(shí)現(xiàn)本文實(shí)施方案的分析方法的計(jì)算機(jī)程序通常可以在分發(fā)介質(zhì)例如但不限于CD-ROM或閃存介質(zhì)上分發(fā)給用戶。計(jì)算機(jī)程序可以從分發(fā)介質(zhì)拷貝到硬盤或相似的中間存儲(chǔ)介質(zhì)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)允許用戶經(jīng)由通信網(wǎng)絡(luò)例如因特網(wǎng)遠(yuǎn)程下載程序，將實(shí)現(xiàn)本文實(shí)施方案的方法的計(jì)算機(jī)程序分發(fā)給用戶?？梢酝ㄟ^(guò)從其分發(fā)介質(zhì)或其中間存儲(chǔ)介質(zhì)下載計(jì)算機(jī)指令到計(jì)算機(jī)的執(zhí)行存儲(chǔ)器內(nèi)，配置計(jì)算機(jī)以依照本發(fā)明的方法工作，來(lái)運(yùn)行計(jì)算機(jī)程序。所有這些操作均為計(jì)算機(jī)系統(tǒng)領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。

通過(guò)進(jìn)行本文描述的方法，能夠測(cè)定個(gè)體對(duì)試劑的耐受。隨后能夠提供關(guān)于可以耐受（例如攝入）的物質(zhì)的量，或可以由個(gè)體耐受的條件的量或水平的建議。

下文是經(jīng)證明對(duì)微生物組有影響的試劑的兩個(gè)實(shí)例。

人造甜味劑：本發(fā)明人已證實(shí)食用常用的人造甜味劑制劑通過(guò)誘導(dǎo)腸道微生物組的組成和功能的改變，推動(dòng)特定個(gè)體中的葡萄糖耐受不良的發(fā)展。雖然一些個(gè)體似乎對(duì)人造甜味劑的效應(yīng)更耐受，但其他的則更不耐受。對(duì)人造甜味劑的個(gè)體應(yīng)答被證明是由于測(cè)試個(gè)體的微生物組的差異。

如本文使用的，短語(yǔ)“對(duì)人造甜味劑的耐受”指攝入（進(jìn)食或飲用）FDA的每日最大容許攝入量（ADI）的人造甜味劑（例如商用糖精5mgkg^-1）而不表現(xiàn)出與擾亂的葡萄糖代謝相關(guān)的臨床參數(shù)的能力。因此，例如，如果一個(gè)人通過(guò)了葡萄糖耐量測(cè)試，則他可被視為對(duì)人造甜味劑耐受。例如，如果攝入75克葡萄糖后2小時(shí)，其血糖水平低于140 mg/dl，并且在0至2小時(shí)之間的所有值均小于200 mg/dl，則其可被視為未通過(guò)葡萄糖耐量測(cè)試。另外，如果一個(gè)人的空腹葡萄糖水平在正常范圍內(nèi)，則其可被視為對(duì)人造甜味劑耐受。

通常，就其對(duì)人造甜味劑的耐受進(jìn)行測(cè)試的個(gè)體并非糖尿病患者或糖尿病前期患者。優(yōu)選地，他們不患有代謝病癥。

當(dāng)測(cè)試對(duì)人造甜味劑的耐受時(shí)，特別有關(guān)的微生物組標(biāo)記包括：屬于擬桿菌目、梭菌目、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目、乳桿菌目、厭氧原體目（Anaeroplasmatales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）和/或彎曲菌目的微生物的水平。

根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，當(dāng)測(cè)試對(duì)人造甜味劑的耐受時(shí)，微生物組標(biāo)記包含屬于擬桿菌目、梭菌目、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目和/或彎曲菌目的微生物的水平。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)測(cè)試對(duì)人造甜味劑的耐受時(shí)，微生物組標(biāo)記包含屬于擬桿菌門、厚壁菌門和/或軟壁菌門（Tenericutes）的微生物的水平。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)測(cè)試對(duì)人造甜味劑的耐受時(shí)，微生物組標(biāo)記包含屬于擬桿菌綱（Bacteroidia）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、梭菌綱（Clostridia）、柔膜菌綱（Mollicutes）和/或γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）的微生物的水平。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)測(cè)試對(duì)人造甜味劑的耐受時(shí)，微生物組標(biāo)記包含屬于擬桿菌目、乳桿菌目、梭菌目、厭氧原體目和/或腸桿菌目的微生物的水平。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)測(cè)試對(duì)人造甜味劑的耐受時(shí)，微生物組標(biāo)記包含屬于擬桿菌科（Bacteroidaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）、厭氧原體科（Anaeroplasmataceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、臭味菌科（Odoribacteraceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）、Dehalobacteriaceae、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）和/或S24-7科的微生物的水平。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)測(cè)試對(duì)人造甜味劑的耐受時(shí)，微生物組標(biāo)記包含屬于擬桿菌屬（Bacteroides）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、紫單胞菌屬（Parabacteroides）、厭氧原體屬（Anaeroplasma）、分節(jié)絲狀菌（Candidatus Arthromitus）、臭味菌屬（Odoribacter）、乳球菌屬（Lactococcus）和/或Dehalobacterium屬的微生物的水平。

根據(jù)又另一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)測(cè)試對(duì)人造甜味劑的耐受時(shí)，微生物組標(biāo)記包含本文下文表4中所示的物種中的至少一種的微生物的水平。

如本文上文所提及的，微生物組標(biāo)記可以指在微生物組的微生物中表達(dá)的特定基因的水平。

更具體而言，當(dāng)測(cè)試對(duì)人造甜味劑的耐受時(shí)，微生物組標(biāo)記可以包含屬于聚糖降解途徑（例如糖胺聚糖途徑）的基因的水平。

根據(jù)另外一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)測(cè)試對(duì)人造甜味劑的耐受時(shí)，微生物組標(biāo)記可以包含微生物基因的水平，包括例如涉及淀粉和蔗糖代謝的基因、涉及果糖和甘露糖代謝的基因、涉及葉酸生物合成的基因、涉及甘油脂生物合成的基因、涉及脂肪酸生物合成的基因、涉及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的基因、涉及抗壞血酸和醛糖二酸鹽（aldarate）代謝的基因、涉及脂多糖生物合成的基因和/或涉及細(xì)菌趨化性的基因。

如本文上文所提及的，微生物組標(biāo)記可以指由微生物組的微生物生成的產(chǎn)物或副產(chǎn)物-例如代謝產(chǎn)物的水平。

當(dāng)測(cè)試對(duì)人造甜味劑的耐受時(shí)，可以在樣品中進(jìn)行分析的示例性代謝產(chǎn)物是短鏈脂肪酸（SCFA）。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案，如果屬于擬桿菌目、梭菌目、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目、乳桿菌目、厭氧原體目、腸桿菌目和/或彎曲菌目的微生物的相對(duì)水平是統(tǒng)計(jì)上相似的，則兩種微生物組標(biāo)記可以歸為相似的。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案，如果屬于擬桿菌目、梭菌目、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目和/或彎曲菌目的微生物的相對(duì)水平是統(tǒng)計(jì)上相似的，則兩種微生物組標(biāo)記可以歸為相似的。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案，如果屬于擬桿菌門、厚壁菌門和/或軟壁菌門的微生物的相對(duì)水平是統(tǒng)計(jì)上相似的，則兩種微生物組標(biāo)記可以歸為相似的。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案，如果屬于擬桿菌綱、芽孢桿菌綱、梭菌綱、柔膜菌綱和/或γ變形菌綱的微生物的相對(duì)水平是統(tǒng)計(jì)上相似的，則兩種微生物組標(biāo)記可以歸為相似的。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案，如果屬于擬桿菌目、乳桿菌目、梭菌目、厭氧原體目和/或腸桿菌目的微生物的相對(duì)水平是統(tǒng)計(jì)上相似的，則兩種微生物組標(biāo)記可以歸為相似的。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案，如果屬于擬桿菌科、乳桿菌科、紫單胞菌科、厭氧原體科、梭菌科、臭味菌科、瘤胃菌科、鏈球菌科、Dehalobacteriaceae科、腸桿菌科和/或S24-7科的微生物的相對(duì)水平是統(tǒng)計(jì)上相似的，則兩種微生物組標(biāo)記可以歸為相似的。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案，如果屬于擬桿菌屬、乳桿菌屬、紫單胞菌屬、厭氧原體屬、分節(jié)絲狀菌、臭味菌屬、乳球菌屬和/或Dehalobacterium屬的微生物的相對(duì)水平是統(tǒng)計(jì)上相似的，則兩種微生物組標(biāo)記可以歸為相似的。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案，如果屬于本文下文表4中所示的物種的微生物的相對(duì)水平是統(tǒng)計(jì)上相似的，則兩種微生物組標(biāo)記可以歸為相似的。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了測(cè)定個(gè)體對(duì)人造甜味劑的耐受的方法，其包括分析個(gè)體的微生物組中屬于選自下述目的微生物的量：擬桿菌目、梭菌目、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目和/或彎曲菌目，其中擬桿菌目、梭菌目、Bactobacillales目和/或YS2目的微生物的量超過(guò)預(yù)定水平表明個(gè)體對(duì)人造甜味劑耐受，而RF32目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目和/或彎曲菌目的微生物的量超過(guò)預(yù)定水平表明個(gè)體對(duì)人造甜味劑不耐受。

測(cè)定屬于特定目的微生物的量已在本文上文進(jìn)行描述。

根據(jù)這個(gè)方面，分析屬于至少一個(gè)目、兩個(gè)目、三個(gè)目、四個(gè)目、五個(gè)目、六個(gè)目、七個(gè)目、八個(gè)目、九個(gè)目、十個(gè)目、十一個(gè)目或上文提及的全部的目的微生物的相對(duì)量。

優(yōu)選地，水平增加至少1.5倍、2倍、5倍或更大。

根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了測(cè)定個(gè)體對(duì)人造甜味劑的耐受的方法，其包括分析個(gè)體的微生物組中如表4中所示的至少一種微生物或微生物類別的量，其中所述至少一種微生物或微生物類別的量超過(guò)預(yù)定水平表明個(gè)體對(duì)人造甜味劑不耐受。

根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，分析了表4中所述的微生物中的至少一種，分析了表4中所述的微生物中的至少5%，分析了表4中所述的微生物中的至少10%，分析了表4中所述的微生物中的至少20%，分析了表4中所述的微生物中的至少30%，分析了表4中所述的微生物中的至少40%，分析了表4中所述的微生物中的至少50%。

優(yōu)選地，水平增加至少1.5倍、2倍、5倍或更大。

可以在本文描述的方法的任一種中加入另外的步驟，所述方法用于評(píng)價(jià)個(gè)體對(duì)人造甜味劑的耐受，包括在分析微生物組標(biāo)記和制備用于分析的樣品（例如糞便物的取出、制造蛋白質(zhì)提取物、制備核酸樣品等）之前，給個(gè)體施用人造甜味劑。

改變的晝夜節(jié)律

本發(fā)明人已證明具有晝夜節(jié)律失調(diào)的個(gè)體（例如具有時(shí)差的那些）具有統(tǒng)計(jì)上顯著類似于致病性微生物組的微生物組，并且認(rèn)為所得到的微生物群落可以促成代謝失衡。

因此，本發(fā)明人提出通過(guò)分析個(gè)體的微生物組，測(cè)定個(gè)體對(duì)其晝夜節(jié)律改變（例如改變時(shí)區(qū)、上夜班等）是否耐受。如果其微生物組在統(tǒng)計(jì)上顯著類似于致病性微生物組，則表明其對(duì)這些條件不耐受。

本發(fā)明設(shè)想了用于分析個(gè)人的微生物組以便測(cè)定其對(duì)不同試劑或條件的耐受的試劑盒。

因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于測(cè)定個(gè)體對(duì)試劑是否耐受的試劑盒，其包含：

（i）能夠測(cè)定至少一種微生物組組分的量的試劑，其中所述至少一種微生物組組分的水平在試劑耐受的微生物組中和在試劑不耐受的微生物組中顯著不同；和

（ii）致病性微生物組。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括能夠測(cè)定至少一種微生物組組分的量的試劑，其中所述至少一種微生物組組分的水平在人造甜味劑耐受的個(gè)體中和在人造甜味劑不耐受的個(gè)體中顯著不同。

與試劑不耐受的微生物組相比較，微生物組組分（例如生物分子）在試劑耐受的微生物組中可以是富集、耗盡、上調(diào)、下調(diào)、降解或穩(wěn)定的。

如本文上文所提及的，微生物組組分（例如生物分子）可以是核酸、寡聚核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、代謝產(chǎn)物或其片段。核酸可以包括RNA、DNA、以及天然存在或合成制備的衍生物。微生物組相關(guān)組分可以存在于腸內(nèi)的微生物中，通過(guò)腸內(nèi)的微生物產(chǎn)生或通過(guò)腸內(nèi)的微生物修飾。

生物分子可以允許分析特定物種或類別的微生物。

在微生物的情況下，試劑可以是用于擴(kuò)增16S rRNA或18S rRNA的引物或引物組。此類引物組的實(shí)例在本文下文實(shí)施例部分中提供。本實(shí)施方案的試劑盒可以包括后續(xù)測(cè)序反應(yīng)所需的另外試劑。

在基因（DNA）或RNA的情況下，試劑可以是與目標(biāo)DNA或RNA特異性雜交的寡核苷酸。

寡核苷酸可以是擴(kuò)增引物的形式。在這種情況下，試劑盒可以包括執(zhí)行擴(kuò)增反應(yīng)的另外組分，例如酶、鹽和緩沖液。通常，試劑盒可以包括用于擴(kuò)增至少兩個(gè)基因的寡核苷酸，所述至少兩個(gè)基因已知在人造甜味劑耐受/不耐受微生物組中差異表達(dá)。根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，所述兩個(gè)基因是已知涉及人造甜味劑耐受的途徑，例如聚糖降解途徑（例如糖胺聚糖途徑）的一部分。

另外或可替代地，引物可以擴(kuò)增涉及至少一種過(guò)程或途徑的基因，與試劑不耐受的微生物組相比較，所述至少一種過(guò)程或途徑已知在試劑耐受的微生物組中是上調(diào)或下調(diào)的。因此，在人造甜味劑的情況下，引物可以擴(kuò)增在下述過(guò)程或途徑中的一種或多種中的基因：淀粉和蔗糖代謝、果糖和甘露糖代謝、葉酸生物合成、甘油脂-生物合成、脂肪酸生物合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、抗壞血酸和醛糖二酸鹽代謝、脂多糖生物合成和/或細(xì)菌趨化性。

可替代地，寡核苷酸可以附著至固體表面（即陣列）。適合于構(gòu)建陣列的幾種基底是本領(lǐng)域已知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，隨著技術(shù)進(jìn)步可以使用其他基底?；卓梢允沁@樣的材料，其可以進(jìn)行修飾以含有適于寡核苷酸附著或結(jié)合的不連續(xù)的單獨(dú)位點(diǎn)，且適應(yīng)至少一種檢測(cè)方法?；撞牧系姆窍拗菩詫?shí)例包括玻璃、改性的或官能化的玻璃、塑料（包括丙烯酸樹脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨基甲酸酯、TeflonJ等）、尼龍或硝酸纖維素、多糖、尼龍、樹脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料（包括硅和改性的硅）、碳、金屬、無(wú)機(jī)玻璃和塑料。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，基底可以允許光學(xué)檢測(cè)而無(wú)需明顯的熒光發(fā)射。

基底可以是平面的，基底可以是孔，即364孔板，或可替代地，基底可以是微珠。另外，基底可以是用于流通樣品分析的管的內(nèi)表面，以使樣品體積降到最低。類似地，基底可以是柔性的，例如柔性泡沫，包括由特殊塑料制成的閉孔泡沫。

一種或多種寡核苷酸可以以廣泛多樣的方式附著至基底，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，的。寡核苷酸可以首先合成，隨后附著至基底，或可以在基底上直接合成?；缀凸押塑账峥梢匝苌鷰в谢瘜W(xué)官能團(tuán)用于兩者的后續(xù)附著。例如，基底可以衍生帶有化學(xué)官能團(tuán)，所述化學(xué)官能團(tuán)包括但不限于氨基、羧基、氧代基團(tuán)或硫醇基團(tuán)。使用這些官能團(tuán)，寡核苷酸可以使用接頭直接地或間接地使用寡核苷酸上的官能團(tuán)進(jìn)行附著。

寡核苷酸還可以非共價(jià)地附著至基底。例如，可以制備生物素化的寡核苷酸，其可以結(jié)合至由鏈霉親和素共價(jià)包被的表面，導(dǎo)致附著?？商娲?，一種或多種寡核苷酸可以使用技術(shù)例如光聚合和光刻法在表面上合成。將寡核苷酸附著至陣列的另外方法和在基底上合成寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，即來(lái)自Affymetrix的VLSIPS技術(shù)（例如參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6,566,495，以及Rockett和Dix，"DNA arrays: technology，options and toxicological applications," Xenobiotica 30（2）:155-177，所有這些參考文獻(xiàn)均在此通過(guò)引用全文并入）。

在一個(gè)實(shí)施方案中，附著至基底的一種或多種寡核苷酸定位于空間限定的陣列地址。陣列可以包含約1至約幾十萬(wàn)個(gè)地址或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，陣列可以包含小于10,000個(gè)地址。在另一個(gè)可替代實(shí)施方案中，陣列可以包含至少10,000個(gè)地址。在又另一個(gè)可替代實(shí)施方案中，陣列可以包含小于5,000個(gè)地址。在仍另一個(gè)可替代實(shí)施方案中，陣列可以包含至少5,000個(gè)地址。在另外的實(shí)施方案中，陣列可以包含小于500個(gè)地址。在又另外的實(shí)施方案中，陣列可以包含至少500個(gè)地址。

寡核苷酸可以在給定陣列上呈現(xiàn)不止一次。換言之，陣列的不止一個(gè)地址可以由相同寡核苷酸構(gòu)成。在一些實(shí)施方案中，陣列的兩個(gè)、三個(gè)或超過(guò)三個(gè)地址可以由相同寡核苷酸構(gòu)成。在某些實(shí)施方案中，陣列可以包含對(duì)照寡核苷酸和/或?qū)φ盏刂贰?duì)照可以是內(nèi)部對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照或背景對(duì)照。

陣列可以由與DNA或RNA雜交的寡核苷酸構(gòu)成，所述DNA或RNA指示人造甜味劑耐受或不耐受的微生物組。

在一個(gè)實(shí)施方案中，陣列可以包含這樣的試劑，所述試劑可以與試劑不耐受的宿主微生物組相比較，對(duì)在試劑耐受的宿主微生物組中富集的生物分子的存在進(jìn)行定量或定性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，陣列可以包含這樣的試劑，所述試劑可以與試劑不耐受的宿主微生物組相比較，對(duì)在試劑耐受的宿主微生物組中耗盡的生物分子的存在進(jìn)行定量或定性。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，陣列可以包含這樣的試劑，所述試劑可以與試劑不耐受的宿主微生物組相比較，對(duì)在試劑耐受的宿主微生物組中上調(diào)的生物分子的存在進(jìn)行定量或定性。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，陣列可以包含這樣的試劑，所述試劑可以與試劑不耐受的宿主微生物組相比較，對(duì)在試劑耐受的宿主微生物組中下調(diào)的生物分子的存在進(jìn)行定量或定性。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，陣列可以包含這樣的試劑，所述試劑可以與試劑不耐受的宿主微生物組相比較，對(duì)在試劑耐受的宿主微生物組中降解的生物分子的存在進(jìn)行定量或定性。在一個(gè)可替代實(shí)施方案中，陣列可以包含這樣的試劑，所述試劑可以與試劑不耐受的宿主微生物組相比較，對(duì)在試劑耐受的宿主微生物組中穩(wěn)定的生物分子的存在進(jìn)行定量或定性。

例如，當(dāng)試劑是人造甜味劑時(shí)，陣列可以包含與DNA/RNA序列雜交的寡核苷酸，所述DNA/RNA序列編碼涉及聚糖降解途徑（例如糖胺聚糖途徑）的多肽。

另外或可替代地，當(dāng)試劑是人造甜味劑時(shí)，陣列可以包含與DNA/RNA序列雜交的寡核苷酸，所述DNA/RNA序列編碼涉及下述過(guò)程或途徑中的至少一種或多種的多肽：淀粉和蔗糖代謝、果糖和甘露糖代謝、葉酸生物合成、甘油脂-生物合成、脂肪酸生物合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、抗壞血酸和醛糖二酸鹽代謝、脂多糖生物合成和/或細(xì)菌趨化性。

優(yōu)選地，特定途徑中的至少2、5、10、15、20個(gè)基因在陣列上呈現(xiàn)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，陣列包含與至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395或400種寡核苷酸雜交的寡核苷酸，所述寡核苷酸指示試劑耐受的宿主微生物組，或與試劑不耐受的宿主微生物組相比較，其在試劑耐受的宿主微生物組中是受調(diào)制的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，陣列包含專門鑒定至少 200種、至少300種、至少400種、至少500種、至少600種、至少700種、至少800種或至少900種生物分子的寡核苷酸，所述生物分子指示試劑耐受的宿主微生物組，或與試劑不耐受的宿主微生物組相比較，其在試劑耐受的宿主微生物組中是受調(diào)制的。

本文描述的試劑盒還可以包括對(duì)照樣品。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，試劑盒包括陽(yáng)性對(duì)照例如致病性微生物組。另外或可替代地，試劑盒包括陰性對(duì)照例如非致病性微生物組。

致病性和/或非致病性微生物組可以是經(jīng)處理的。因此，對(duì)照微生物組可以作為經(jīng)分離的多核苷酸或蛋白質(zhì)呈現(xiàn)?？商娲?，對(duì)照微生物組可以由微生物呈現(xiàn)。

對(duì)照樣品可以是任何合適的形式，例如粉末干燥形式。另外，對(duì)照樣品可以已經(jīng)歷處理，以增加其存活。例如，微生物可以包被或封裝在多糖、脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)或糖基質(zhì)中。可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)封裝技術(shù)。例如，可以使用美國(guó)專利號(hào)6,190,591中討論的技術(shù)，所述專利在此通過(guò)引用全文并入。

根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了恢復(fù)個(gè)體對(duì)試劑的耐受的方法，其包括給個(gè)體施用有效量的益生菌組合物，所述益生菌組合物包含與非致病性微生物組在統(tǒng)計(jì)上顯著類似的微生物，從而恢復(fù)個(gè)體對(duì)試劑的耐受。

例如，本發(fā)明設(shè)想了用于增加對(duì)人造甜味劑的耐受的微生物組合物（例如益生菌組合物），其中組合物的微生物中的大多數(shù)是擬桿菌目、梭菌目、Bactobacillales目和/或YS2目的微生物。

本發(fā)明還設(shè)想了用于增加對(duì)晝夜節(jié)律失調(diào)的耐受的微生物組合物（例如益生菌或抗生素組合物）。例如，本發(fā)明人已證明在時(shí)差期間獲得的微生物叢樣品具有更高的相對(duì)量的厚壁菌門，其在時(shí)差恢復(fù)后逆轉(zhuǎn)。因此，可以減少微生物組中的厚壁菌門水平的試劑在恢復(fù)個(gè)體對(duì)晝夜節(jié)律失調(diào)的耐受方面可能是有效的。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“益生菌”指任何微生物類型，其與宿主生物中的健康益處和/或宿主生物中的疾病、病癥、狀況或事件的危險(xiǎn)和/或癥狀減少相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，益生菌被配制在食物產(chǎn)品、功能食物或營(yíng)養(yǎng)品中。在一些實(shí)施方案中，益生菌是多種類型的細(xì)菌。

本發(fā)明的這個(gè)方面的微生物組合物可以在統(tǒng)計(jì)上顯著類似于已發(fā)現(xiàn)是試劑耐受的個(gè)體的微生物組。

微生物組合物可以取自微生物組的微生物叢樣品。

微生物叢樣品包含來(lái)自微生物組的微生物和或其組分或產(chǎn)物的樣品。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)任何手段收集微生物叢樣品，所述手段允許回收微生物且不破壞微生物組的微生物或者其組分或產(chǎn)物的相對(duì)量。特定回收方法應(yīng)適合微生物組來(lái)源。

可替代地，微生物組合物可以通過(guò)加入已知量的不同微生物而人工制備。

應(yīng)當(dāng)理解，來(lái)源于個(gè)體的微生物叢樣品的微生物組合物可以在施用前通過(guò)增加特定菌株的量或耗盡特定菌株的量進(jìn)行操縱?？商娲兀⑸锝M合物以這樣的方式進(jìn)行處理，以便不改變微生物物種和其中包含的分類群之間的相對(duì)平衡。在一些實(shí)施方案中，微生物組合物在施用前使用已知培養(yǎng)方法進(jìn)行體外擴(kuò)增。在其他實(shí)施方案中，微生物組合物在施用前不進(jìn)行體外擴(kuò)增。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，微生物組合物不來(lái)源于糞便材料。

根據(jù)仍另一個(gè)實(shí)施方案，微生物組合物不含（或僅包含痕量）糞便材料（例如纖維）。

益生菌微生物可以是任何合適的形式，例如粉末干燥形式。另外，益生菌微生物可以已經(jīng)歷處理，以增加其存活。例如，微生物可以包被或封裝在多糖、脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)或糖基質(zhì)中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)封裝技術(shù)。例如，可以使用美國(guó)專利號(hào)6,190,591中討論的技術(shù)，所述專利在此通過(guò)引用全文并入。

根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，益生菌微生物組合物被配制在食物產(chǎn)品、功能食物或營(yíng)養(yǎng)品中。

在一些實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品、功能食物或營(yíng)養(yǎng)品是或包含乳制品。在一些實(shí)施方案中，乳制品是或包含酸奶制品。在一些實(shí)施方案中，乳制品是或包含奶制品。

在一些實(shí)施方案中，乳制品是或包含奶酪制品。在一些實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品、功能食物或營(yíng)養(yǎng)品是或包含果汁或來(lái)源于水果的其他產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品、功能食物或營(yíng)養(yǎng)品是或包含來(lái)源于蔬菜的產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品、功能食物或營(yíng)養(yǎng)品是或包含谷類產(chǎn)品，包括但不限于谷物、餅干、面包和/或燕麥片。在一些實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品、功能食物或營(yíng)養(yǎng)品是或包含稻產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品、功能食物或營(yíng)養(yǎng)品是或包含肉制品。

在施用前，個(gè)體可以用試劑進(jìn)行預(yù)治療，所述試劑減少微生物組中天然存在的微生物數(shù)目（例如通過(guò)抗生素治療）。根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，治療顯著消除了至少20%、30% 40%、50%、60%、70%、80%或甚至90%的天然存在的腸微生物叢。

在一些實(shí)施方案中，施用包括給個(gè)體施用有效量（例如治療有效量）或其它所需的量的組合物的任何手段。在一些實(shí)施方案中，施用組合物包括通過(guò)任何途徑的施用，包括例如腸胃外和非腸胃外施用途徑。腸胃外途徑包括例如動(dòng)脈內(nèi)、腦室內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、門靜脈內(nèi)、脊柱內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、或其他注射途徑。非腸胃外途徑包括例如頰、鼻、眼、口服、肺、直腸、經(jīng)皮或陰道。施用還可以是通過(guò)連續(xù)輸注、局部施用、植入物（凝膠、膜等等）的持續(xù)釋放和/或靜脈內(nèi)注射。

在一些實(shí)施方案中，組合物以與特定所需結(jié)果關(guān)聯(lián)的量和/或根據(jù)與特定所需結(jié)果關(guān)聯(lián)的劑量方案施用（例如與目標(biāo)結(jié)果關(guān)聯(lián)的微生物組組合物和/或標(biāo)記中的特定變化）。在一些實(shí)施方案中，所需結(jié)果是對(duì)人造甜味劑的耐受增強(qiáng)，如上所述。在一些實(shí)施方案中，所需結(jié)果是對(duì)時(shí)差或夜班工作耐受。

依照本發(fā)明待施用的特定劑量或量可以改變，例如取決于所需結(jié)果的性質(zhì)和/或程度、或特定施用途徑和/或時(shí)機(jī)、和/或一種或多種特征（例如體重、年齡、個(gè)人病史、遺傳特征、生活方式參數(shù)、糖尿病的嚴(yán)重性和/或糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)水平等或其組合）。此類劑量或量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。在一些實(shí)施方案中，適當(dāng)劑量或量依照標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)進(jìn)行確定?？商娲鼗蛄硗猓谝恍?shí)施方案中，適當(dāng)劑量或量通過(guò)使用一種或多種體外或體內(nèi)測(cè)定法進(jìn)行確定，以幫助鑒定待施用的所需或最佳劑量范圍或量。

在一些特定實(shí)施方案中，待施用的適當(dāng)劑量或量可以由來(lái)源于體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量應(yīng)答曲線外推。對(duì)于特定個(gè)體待施用的有效劑量或量可以取決于該個(gè)體的需要隨著時(shí)間推移而改變（例如增加或減少），。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)施用細(xì)菌時(shí)，適當(dāng)劑量包含至少約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000個(gè)或更多個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋下述認(rèn)識(shí)：更大的益處可以通過(guò)提供大于約1000個(gè)或更多個(gè)（例如約1500、2000、2500、3000、35000、4000、4500、5000、5500、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1x10⁶、2x10⁶、3 x10⁶、4 x10⁶、5 x10⁶、6 x10⁶、7 x10⁶、8 x10⁶、9 x10⁶、1 x10⁷、1 x10⁸、1 x10⁹、1 x10¹⁰、1 x10¹¹、1 x10¹²、1 x10¹³或更多個(gè)細(xì)菌）細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目來(lái)實(shí)現(xiàn)。

正如用益生菌組合物治療個(gè)體，本發(fā)明還設(shè)想了用抗微生物組合物治療個(gè)體，所述抗微生物組合物的存在已知會(huì)引起對(duì)試劑的不耐受。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“抗生素試劑”指從天然來(lái)源中分離或來(lái)源于從天然來(lái)源分離的抗生素試劑的一組化學(xué)物質(zhì)，具有抑制細(xì)菌及其他微生物生長(zhǎng)或破壞細(xì)菌及其他微生物的能力，主要用于治療傳染病?？股卦噭┑膶?shí)例包括但不限于：阿米卡星；阿莫西林；氨芐青霉素；阿奇霉素；阿洛西林；氨曲南；氨曲南；羧芐青霉素；頭孢克洛；頭孢吡肟；頭孢他美；頭孢美唑（Cefinetazole）；頭孢克肟；頭孢尼西；頭孢哌酮；頭孢噻肟；頭孢替坦；頭孢西?。活^孢泊肟；頭孢丙烯；頭孢磺啶；頭孢他啶；頭孢唑肟；頭孢曲松；頭孢呋辛；頭孢氨芐；頭孢噻吩；喹紅霉素；氯霉素；西諾沙星；環(huán)丙沙星；克拉霉素；克林霉素；氯唑西林；輔阿莫氟酸鹽（Co-amoxiclavuanate）；達(dá)巴凡星；達(dá)托霉素；雙氯西林；多西環(huán)素；依諾沙星；依托紅霉素；琥乙紅霉素；葡庚糖酸紅霉素；乳糖酸紅霉素；硬脂酸紅霉素；紅霉素；非達(dá)霉素；氟羅沙星；慶大霉素；亞胺培南；卡那霉素；洛美沙星；勞拉卡帕；甲氧西林；甲硝唑；美洛西林；米諾環(huán)素；莫匹羅星；奈夫西林；萘啶酸；奈替米星；呋喃妥因；諾氟沙星；氧氟沙星；苯唑西林；青霉素G；哌拉西林；瑞他莫林；利福昔明（Rifaxamin），利福平；羅紅霉素；鏈霉素；磺胺甲噁唑；替考拉寧；四環(huán)素；替卡西林；替加環(huán)素；妥布霉素；甲氧芐啶；萬(wàn)古霉素；哌拉西林和他唑巴坦的組合；以及它們的各種鹽、酸、堿和其他衍生物?？咕股卦噭┌ǖ幌抻诎被擒铡⑻碱^孢烯、碳青霉烯、頭孢菌素、頭霉素、氟喹諾酮、糖肽、林可酰胺、大環(huán)內(nèi)酯、單環(huán)內(nèi)酰胺、青霉素、喹諾酮、磺胺和四環(huán)素。

抗菌劑還包括抗菌肽。實(shí)例包括但不限于abaecin；果蠅抗菌肽（andropin）；蜜蜂抗菌肽（apidaecins）；鈴蟾抗菌肽；brevinins；buforin II；CAP18；天蠶素；ceratotoxin；防御素；皮抑菌肽；皮離蛋白（dermcidin）；果蠅霉素（drosomycin）；esculentins；indolicidin；LL37；蛙皮素；最大H5；蜂毒素；moricin；prophenin；抗菌肽Protegrin；和或tachyplesins。

根據(jù)一個(gè)特定實(shí)施方案，抗生素是無(wú)法吸收的抗生素。

因此，例如，本發(fā)明設(shè)想了用抗生素治療個(gè)體，所述抗生素減少RF32目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目和/或彎曲菌目的微生物，以便增強(qiáng)個(gè)體對(duì)人造甜味劑的耐受。優(yōu)選地，抗生素對(duì)擬桿菌目、梭菌目、Bactobacillales目和/或YS2目的微生物不具有功效（或具有更少的功效）。

本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)微生物組的振蕩模式影響宿主的每日局部和全身轉(zhuǎn)錄組振蕩。本發(fā)明人證明：通過(guò)抗生素處理破壞微生物叢或在無(wú)菌小鼠中重新編程腸道和肝臟宿主轉(zhuǎn)錄組以同時(shí)表征振蕩的大量喪失和從頭發(fā)生，導(dǎo)致代謝途徑的時(shí)間再組構(gòu)。相應(yīng)地，本發(fā)明人提出：對(duì)一天中微生物組節(jié)律的分析可以透露關(guān)于抗生素或益生菌試劑的施用劑量或方案的重要信息。因此，例如，如果微生物組的節(jié)律分析顯示特定微生物在早晨時(shí)間處于峰，并且在晚上時(shí)間處于谷，則可以推薦在早晨而不是晚上施用包含這種微生物的益生菌試劑，以便不改變微生物組的天然晝夜節(jié)律。如果微生物組的節(jié)律分析顯示特定微生物在早晨時(shí)間處于峰，并且在晚上時(shí)間處于谷，則推薦在晚上而不是早晨施用下調(diào)這種微生物的抗生素試劑，以便不改變微生物組的天然晝夜節(jié)律。

微生物組的分析可以通過(guò)分析微生物自身或其產(chǎn)物（例如代謝產(chǎn)物）的水平來(lái)進(jìn)行。微生物組的分析在本文上文進(jìn)一步描述。

為了分析微生物組的節(jié)律，在24小時(shí)期間應(yīng)測(cè)量至少兩個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)或更多個(gè)微生物組樣品。

應(yīng)理解，雖然單獨(dú)描述了上述類型的另外信息，但本文實(shí)施方案設(shè)想了數(shù)據(jù)庫(kù)的兩種或更多種類型的信息的任何組合。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“約”指± 10%。

單詞“示例性的”在本文中用于意指“充當(dāng)實(shí)例、實(shí)例或舉例說(shuō)明”。描述為“示例性的”任何實(shí)施方案不一定要解釋為優(yōu)選或優(yōu)于其他實(shí)施方案和/或排除結(jié)合其他實(shí)施方案的特征。

單詞“任選地”在本文中用于意指“在一些實(shí)施方案中提供而在其他實(shí)施方案中不提供”。本發(fā)明的任何特定實(shí)施方案可以包括多個(gè)“任選”特點(diǎn)，除非此類特點(diǎn)沖突。

術(shù)語(yǔ)“包含（comprises）”、“包含（comprising）”、“包括（includes）”、“包括（including）”、“具有”及其綴合物意指“包括但不限于”。

術(shù)語(yǔ)“由……組成”意指“包括且限于”。

術(shù)語(yǔ)“主要由……組成”意指組合物、方法或結(jié)構(gòu)可以包括另外的成分、步驟和/或部分，但僅在另外的成分、步驟和/或部分不會(huì)在材料上改變請(qǐng)求保護(hù)的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)和新型特征時(shí)。

如本文使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該/所述”包括復(fù)數(shù)參考，除非上下文另有明確說(shuō)明。例如，術(shù)語(yǔ)“化合物”或“至少一種化合物”可以包括多種化合物，包括其混合物。

本申請(qǐng)自始至終，本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案可以以范圍形式呈現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解以范圍形式的描述僅為了方便和簡(jiǎn)潔起見(jiàn)，并且不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的范圍的硬性限制。相應(yīng)地，范圍的描述應(yīng)視為已具體公開在該范圍內(nèi)的所有可能的子范圍以及個(gè)別數(shù)值。例如，范圍的描述例如1至6應(yīng)視為已具體公開在該范圍內(nèi)的子范圍例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在該范圍內(nèi)的個(gè)別數(shù)目，例如1、2、3、4、5和6。這與范圍的寬度無(wú)關(guān)應(yīng)用。

每當(dāng)本文指出數(shù)目范圍時(shí)，它意欲包括在所述范圍內(nèi)的任何引用數(shù)目（分?jǐn)?shù)或整數(shù)）。短語(yǔ)“范圍在第一指出數(shù)目和第二指出數(shù)目……之間/在第一指出數(shù)目和第二指出數(shù)目……之間的范圍”和“范圍從第一指出數(shù)目到第二指出數(shù)目/從第一指出數(shù)目到第二指出數(shù)目的范圍”在本文中可互換使用，并且意欲包括第一和第二指出數(shù)目，以及兩者之間的所有分?jǐn)?shù)和整數(shù)數(shù)目。

應(yīng)當(dāng)理解，為了明確起見(jiàn)，在單獨(dú)的實(shí)施方案的上下文中描述的本發(fā)明的某些特征也可以在單個(gè)實(shí)施方案中組合提供。相反，為了簡(jiǎn)潔起見(jiàn)，在單個(gè)實(shí)施方案的上下文中描述的本發(fā)明的各種特征也可以單獨(dú)或以任何合適的子組合或如本發(fā)明的任何其他所述實(shí)施方案中合適的提供。在各個(gè)實(shí)施方案的上下文中描述的某些特征不視為這些實(shí)施方案的基本特征，除非實(shí)施方案沒(méi)有那些要素則不起作用。

如在上文描繪和如下文權(quán)利要求部分中請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案和方面可在下述實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。

應(yīng)當(dāng)理解，為了明確起見(jiàn)，在單獨(dú)的實(shí)施方案的上下文中描述的本發(fā)明的某些特征也可以在單個(gè)實(shí)施方案中組合提供。相反，為了簡(jiǎn)潔起見(jiàn)，在單個(gè)實(shí)施方案的上下文中描述的本發(fā)明的各種特征也可以單獨(dú)或以任何合適的子組合或如本發(fā)明的任何其他所述實(shí)施方案中合適的提供。在各個(gè)實(shí)施方案的上下文中描述的某些特征不視為這些實(shí)施方案的基本特征，除非實(shí)施方案沒(méi)有那些要素則不起作用。

如在上文描繪和如下文權(quán)利要求部分中請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案和方面可在下述實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。

實(shí)施例

現(xiàn)在參考下述實(shí)施例，所述實(shí)施例連同上文說(shuō)明書一起以非限制性方式舉例說(shuō)明本發(fā)明的一些實(shí)施方案。

一般地，本文使用的命名法和本發(fā)明中利用的實(shí)驗(yàn)室程序包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中充分說(shuō)明。參見(jiàn)例如"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook等人，（1989）；"Current Protocols in Molecular Biology"第I-III卷Ausubel，R. M.編輯（1994）；Ausubel等人，"Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland（1989）；Perbal，"A Practical Guide to Molecular Cloning"，John Wiley & Sons，New York（1988）；Watson等人，"Recombinant DNA"，Scientific American Books，New York；Birren等人（編輯）"Genome Analysis: A Laboratory Manual Series"，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York（1998）；如美國(guó)專利號(hào)4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所示的方法；"Cell Biology: A Laboratory Handbook"，第I-III卷Cellis，J. E.編輯（1994）；"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney，Wiley-Liss，N. Y.（1994），Third Edition；"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E.編輯（1994）；Stites等人（編輯），"Basic and Clinical Immunology"（第8版），Appleton & Lange，Norwalk，CT（1994）；Mishell和Shiigi（編輯），"Selected Methods in Cellular Immunology"，W. H. Freeman和Co.，New York（1980）；可用的免疫測(cè)定在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中廣泛描述，參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait，M. J.編輯（1984）；“Nucleic Acid Hybridization" Hames，B. D.和Higgins S. J.編輯（1985）；"Transcription and Translation" Hames，B. D.和Higgins S. J.編輯（1984）；"Animal Cell Culture" Freshney，R. I.編輯（1986）；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press,（1986）；"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal，B.,（1984）和"Methods in Enzymology"第1-317卷，Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications"，Academic Press，San Diego，CA（1990）；Marshak等人，"Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press（1996）；所有這些參考文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入，如同它在本文中完全闡述。其他一般參考貫穿本文件提供。其中的程序被認(rèn)為是本領(lǐng)域眾所周知的，并且為了讀者的方便而提供。其中含有的所有信息通過(guò)引用并入本文。

實(shí)施例1

微生物叢日間振蕩的跨界控制促進(jìn)代謝穩(wěn)態(tài)

材料與方法

小鼠– C57Bl/6小鼠購(gòu)自Harlan，并且在用于實(shí)驗(yàn)之前，允許適應(yīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物設(shè)施兩周。除非另有說(shuō)明，否則小鼠保持在嚴(yán)格的光暗周期下，其中光在6am時(shí)打開，并且在6pm時(shí)關(guān)閉。在所有實(shí)驗(yàn)中，使用年齡和性別匹配的小鼠。小鼠在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)為8-9周齡。對(duì)于涉及高脂肪飲食的實(shí)驗(yàn)，僅使用雄性小鼠。對(duì)于所有其他實(shí)驗(yàn)，同時(shí)使用雄性和雌性小鼠。大便樣品新鮮且在小鼠個(gè)體的基礎(chǔ)上進(jìn)行收集。新鮮團(tuán)塊收集在管中，在收集后在液氮中立即冷凍，并且貯存于-80℃下直至分離DNA時(shí)。除非另有說(shuō)明，否則10只小鼠/實(shí)驗(yàn)組用于從每只小鼠個(gè)體收集糞便材料。對(duì)于時(shí)差的誘導(dǎo)，小鼠每三天在控制光條件（光在6am時(shí)打開且在6pm時(shí)關(guān)閉）和8小時(shí)時(shí)間差異（光在10pm時(shí)打開且在10am時(shí)關(guān)閉）之間轉(zhuǎn)變。當(dāng)這些小鼠處于與對(duì)照小鼠相同的光暗周期時(shí)，完成對(duì)時(shí)差小鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，并且使授時(shí)因子時(shí)間（ZT）同步（即時(shí)差小鼠的ZT0對(duì)應(yīng)于對(duì)照小鼠的ZT0，就如同所有小鼠在樣品收集開始時(shí)均暴露于相同的光暗條件下）。在食物限制實(shí)驗(yàn)中，小鼠在標(biāo)準(zhǔn)光暗條件（6am至6pm）下飼養(yǎng)，但分別僅在光或暗階段期間獲得食物，持續(xù)兩周。對(duì)于抗生素處理，在小鼠的飲用水中給予萬(wàn)古霉素（1 g/l）、氨芐青霉素（1 g/l）、卡那霉素（1 g/l）和甲硝唑（1 g/l）的組合（Rakoff-Nahoum等人，2004）。所有抗生素均得自Sigma Aldrich。在實(shí)驗(yàn)的整個(gè)持續(xù)時(shí)間，即在時(shí)差誘導(dǎo)開始時(shí)起始直至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，給予抗生素。對(duì)于涉及限菌小鼠的實(shí)驗(yàn)，在無(wú)菌隔離器中飼養(yǎng)無(wú)菌Swiss Webster小鼠。對(duì)于糞便移植實(shí)驗(yàn)，將100mg大便重懸浮于1ml PBS中，勻漿化且通過(guò)70μm濾過(guò)器過(guò)濾。接受者小鼠用200μl濾液進(jìn)行管飼。所有實(shí)驗(yàn)程序均由當(dāng)?shù)豂ACUC批準(zhǔn)。

人樣品 - 來(lái)自人的大便收集使用無(wú)菌棉簽進(jìn)行，并且貯存于室溫下直至到達(dá)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，DNA提取在所述實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。人大便的收集由Tel Aviv Sourasky Medical Center Institutional Review Board批準(zhǔn)。在涉及一天多次收集人大便的實(shí)驗(yàn)中，個(gè)體每天吃四餐，并且在食物攝入后收集糞便樣品。

分類學(xué)微生物叢分析 - 根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用MoBio PowerSoil試劑盒，將冷凍的糞便樣品加工用于DNA提取。1ng純化的糞便DNA用于細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序。涵蓋16S rRNA基因的可變區(qū)2（V2）的擴(kuò)增子通過(guò)使用下述帶條形碼引物來(lái)生成：Fwd 5’-NNNNNNNNAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO: 1），Rev 5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’（SEQ ID NO: 2），其中N代表?xiàng)l形碼基礎(chǔ)。反應(yīng)隨后以等摩爾比合并，純化（PCR清潔試劑盒，Promega）且用于Illumina MiSeq測(cè)序。采用500 bp配對(duì)末端測(cè)序。隨后如所述的（Caporaso等人，2010；Elinav等人，2011），使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，wwwdotqiimedotorg）分析流水線來(lái)處理讀數(shù)。簡(jiǎn)言之，指示對(duì)應(yīng)于每種樣品的條形碼序列的fasta質(zhì)量文件和映射文件用作輸入，讀數(shù)通過(guò)樣品根據(jù)條形碼進(jìn)行拆分，使用RDP分類器執(zhí)行分類學(xué)分類，基于序列相似性構(gòu)建序列的從頭分類樹，并且制備OTU表。在去除嵌合體后，平均讀數(shù)數(shù)目/糞便樣品是34,847。在V2區(qū)中共享97%核苷酸序列同一性的序列使用uclust框并成操作分類單位（97% ID OTU），并且使用ChimeraSlayer去除嵌合序列。

宏基因組序列映射。Illumina測(cè)序讀數(shù)使用GEM映射器[23103880]對(duì)腸微生物基因目錄[20203603]進(jìn)行映射，使用下述參數(shù)：

-m 0.08 –s 0 –q offset-33 –gem-quality-threshold 26

功能指定。根據(jù)伴隨這些數(shù)據(jù)庫(kù)各自的基因?qū)ΨN類的映射，為映射到腸微生物基因目錄的讀數(shù)指定KEGG [10592173，24214961]標(biāo)識(shí)號(hào)。隨后將基因映射到KEGG模塊和途徑。對(duì)于KEGG途徑分析，僅包括其基因覆蓋超過(guò)0.2的途徑。KEGG途徑隨后通過(guò)日間振蕩的JTK_周期進(jìn)行測(cè)試。

葡萄糖耐量測(cè)試 - 小鼠禁食6小時(shí)，并且隨后通過(guò)口服管飼法給予200μl 0.2g/ml葡萄糖溶液（JT Baker）。在葡萄糖攻擊后0、15、30、60、90和120分鐘時(shí)測(cè)定血糖（Contour^TM血糖儀，Bayer，瑞士）。

磁共振成像 - 小鼠用與氧（1升/分鐘）混合的異氟烷（5%用于誘導(dǎo)，1-2%用于維持）進(jìn)行麻醉，并且通過(guò)鼻罩遞送。一旦麻醉，即將動(dòng)物置于頭部固定器中，以確保在磁體內(nèi)的可重復(fù)定位。監(jiān)測(cè)呼吸率并且在實(shí)驗(yàn)期間自始至終保持在60–80次呼吸/分鐘左右。MRI實(shí)驗(yàn)在9.4 Tesla BioSpec Magnet 94/20 USR系統(tǒng)（Bruker，德國(guó)）上進(jìn)行，所述系統(tǒng)配備在三個(gè)方向各自上能夠產(chǎn)生最高達(dá)40高斯/cm的脈沖梯度的梯度線圈系統(tǒng)。所有MR圖像均已用正交諧振器線圈（Bruker）獲得。MRI方案包括兩組冠狀和軸向多層面T2加權(quán)MR圖像。使用多層面RARE序列獲得T2加權(quán)圖像（TR = 2500 ms，TE = 35 ms，RARE因子 = 8），并且矩陣大小為256 x 256，四個(gè)平均值，對(duì)應(yīng)于2分40秒/組的圖像采集時(shí)間。第一組用于獲得具有1.00mm層面厚度的21個(gè)軸向?qū)用妫o(wú)間隙）。視野選擇為4.2 x 4.2 cm²。第二組用于采集1.00mm層面厚度的17個(gè)冠狀層面（無(wú)間隙）。視野選擇為7.0 x 5.0 cm²。

小鼠的總脂肪量和瘦體重通過(guò)EchoMRI-100^TM（Echo Medical Systems，Houston，TX）進(jìn)行測(cè)量。

代謝研究 - 使用PhenoMaster系統(tǒng)（TSE-Systems，Bad Homburg，德國(guó)）測(cè)量食物攝入和自發(fā)活動(dòng)，所述PhenoMaster系統(tǒng)由用于自動(dòng)化測(cè)量的靈敏飼喂傳感器的組合組成，并且基于光子束的活動(dòng)監(jiān)視系統(tǒng)檢測(cè)且記錄動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)，包括在每個(gè)籠中的后腿站立和攀爬。所有參數(shù)均連續(xù)且同時(shí)進(jìn)行測(cè)量。小鼠在數(shù)據(jù)采集之前在相同籠中單獨(dú)飼養(yǎng)訓(xùn)練。

基因表達(dá)分析 - 組織保存在RNAlater溶液（Ambion）中且隨后在Trizol試劑（Invitrogen）中勻漿化。將通過(guò)FACS分選的細(xì)胞重懸浮于Trizol試劑中。根據(jù)制造商的說(shuō)明書來(lái)純化RNA。一微克總RNA用于生成cDNA（HighCapacity cDNA Reverse Transcription試劑盒；Applied Biosystems）。使用基因特異性引物/探針組（Applied Biosystems）和Kapa Probe Fast qPCR試劑盒（Kapa Biosystems），在Viia7儀器（Applied Biosystems）上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。PCR條件是95℃20秒，隨后為95℃3秒和60℃30秒的40個(gè)循環(huán)。使用deltaCt方法分析數(shù)據(jù)，其中hprt1充當(dāng)參考管家基因。

統(tǒng)計(jì)分析 - 數(shù)據(jù)以平均值± SEM表示。對(duì)于節(jié)律振蕩及其幅度的分析，使用非參數(shù)測(cè)試JTK_周期（Hughes等人，2010），結(jié)合18-24小時(shí)的窗口用于測(cè)定晝夜節(jié)律周期性。P值< 0.05被視為顯著的。Benjamini-Hochberg程序用于控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。JTK_周期結(jié)果在補(bǔ)充表中提供。代謝數(shù)據(jù)中的差異通過(guò)ANOVA進(jìn)行分析，并且進(jìn)行用于多組比較的事后分析。使用斯氏t檢驗(yàn)進(jìn)行宿主轉(zhuǎn)錄物數(shù)據(jù)之間的配對(duì)比較。ANOVA和t檢驗(yàn)使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行。

結(jié)果

為了測(cè)定經(jīng)過(guò)一天的過(guò)程微生物叢組成的縱向變化，對(duì)于兩個(gè)光暗周期，每6小時(shí)對(duì)小鼠的糞便微生物叢的進(jìn)行分類學(xué)分析（圖1A）。所有小鼠自由進(jìn)食，飼養(yǎng)在嚴(yán)格的24小時(shí)暗光條件下，其中光保持打開共12小時(shí)。在改變光條件的時(shí)間點(diǎn)（授時(shí)因子時(shí)間（ZT）12和0，即分別為“黃昏”和“黎明”）以及在暗和光階段的中點(diǎn)（分別為ZT 18和6）時(shí)獲取樣品。常用的非參數(shù)算法JTK_周期用于檢測(cè)分類數(shù)據(jù)集中的節(jié)律元素（Hughes等人，2010）。引人注目的是，檢測(cè)到在所有細(xì)菌操作分類單位（OTU）的超過(guò)15%的豐度中的顯著（p<0.05）日間波動(dòng)（圖1B）。波動(dòng)細(xì)菌組的特征在于具有24小時(shí)時(shí)期的獨(dú)特峰相位和底值期時(shí)間。在24小時(shí)周期中節(jié)律振蕩的細(xì)菌屬屬于豐富的分類學(xué)目，即梭菌目、乳桿菌目和擬桿菌目，使得節(jié)律振蕩的OTU占微生物叢組成的約60%，并且導(dǎo)致日特異性分類學(xué)配置的時(shí)間（圖1C和1D）。例如，在羅伊乳桿菌和Dehalobacterium屬物種中發(fā)現(xiàn)高度穩(wěn)健的晝夜節(jié)律波動(dòng)（圖1E和1F）。節(jié)律性的重現(xiàn)與飼養(yǎng)條件或籠效應(yīng)無(wú)關(guān)（數(shù)據(jù)未示出）。這些結(jié)果證實(shí)：取樣時(shí)期越長(zhǎng)，取樣分辨率越精細(xì)，其中連續(xù)4天每4小時(shí)收集一次糞便樣品（圖2A-D）。

本發(fā)明人接下來(lái)分析微生物叢組成中的這些日間振蕩是否在一天中對(duì)腸道微生物群落的功能有影響。經(jīng)過(guò)兩個(gè)光暗周期的過(guò)程，對(duì)每6小時(shí)收集的糞便樣品的進(jìn)行鳥槍法宏基因組測(cè)序，并且將宏基因組讀數(shù)映射到腸微生物基因目錄（Qin等人，2010）。雖然大多數(shù)基因顯示在一天的過(guò)程中具有穩(wěn)定的水平，但某些組的基因（例如涉及鞭毛裝配和糖胺聚糖降解的基因，圖1G和1H）表現(xiàn)出更強(qiáng)的豐度變化。為了測(cè)試此類基因波動(dòng)是否屬于日間節(jié)律后的功能實(shí)體，基因分組成KEGG途徑（Kanehisa和Goto，2000；Kanehisa等人，2014），并將JTK_周期算法用于檢測(cè)伴隨24小時(shí)節(jié)律發(fā)生的振蕩。有趣的是，具有基因覆蓋超過(guò)0.2的所有途徑中的23%表現(xiàn)出日間節(jié)律性（圖1I）。在這些中有涉及核酸穩(wěn)態(tài)的途徑，包括核苷酸代謝（圖2E）、氨基酸代謝（圖2F）和粘液降解（圖2G）。這些結(jié)果表明微生物叢功能的日時(shí)間特異性概況的存在。有趣的是，看起來(lái)不同的官能團(tuán)顯示出協(xié)調(diào)的反相波動(dòng)（圖1J）。例如，涉及能量代謝、DNA修復(fù)和細(xì)胞生長(zhǎng)的功能有利地在暗階段期間執(zhí)行（圖1K），而光階段的特征在于更高豐度的涉及解毒、運(yùn)動(dòng)性和環(huán)境感知的“維持”途徑。例如，執(zhí)行鞭毛裝配、細(xì)菌趨化性和III型分泌中的功能的基因在光階段時(shí)期最豐富（圖2H）。

總之，這些結(jié)果揭示在小時(shí)規(guī)模上的微生物叢組成和功能的波動(dòng)，其遵循24小時(shí)節(jié)律性，并且導(dǎo)致穩(wěn)健振蕩和日特異性配置的時(shí)間。

宿主的功能晝夜節(jié)律鐘是日間微生物叢振蕩所需的

重要的是，盡管缺乏對(duì)環(huán)境光暗改變的直接微生物暴露，依然存在所觀察到的腸微生物叢日間節(jié)律性。本發(fā)明人因此尋求測(cè)定微生物叢組成中的這些節(jié)律波動(dòng)如何在24小時(shí)時(shí)期生成。宿主的生物鐘通過(guò)晝夜節(jié)律鐘的分子組分與環(huán)境日夜變化同步。為了測(cè)試宿主的晝夜節(jié)律鐘是否是微生物叢組成中的日間節(jié)律性所需的，使用Per1/2^-/-小鼠，其在功能宿主鐘上有缺陷（Adamovich等人，2014）。經(jīng)過(guò)48小時(shí)，在暗光周期的每個(gè)階段時(shí)，進(jìn)行野生型和Per1/2^-/-小鼠的微生物叢之間的分類學(xué)比較，并隨后將JTK_周期算法用于鑒定節(jié)律要素。值得注意的是，Per1/2^-/-小鼠證實(shí)共生細(xì)菌豐度中的節(jié)律波動(dòng)幾乎完全喪失（圖3A），如由擬桿菌目例示的（圖3B）。在野生型小鼠中觀察到的節(jié)律模式被替換為鐘缺陷小鼠中的隨機(jī)豐度波動(dòng)，伴隨振蕩細(xì)菌分類單位數(shù)目的減少（圖3C）。

為了測(cè)定組成振蕩的喪失是否對(duì)日間宏基因組概況有影響，對(duì)Per1/2^-/-小鼠的微生物叢的進(jìn)行鳥槍法測(cè)序，并且將結(jié)果在一天的每個(gè)階段時(shí)與野生型小鼠相比較。在野生型小鼠中觀察到的宏基因組途徑中的日間模式在Per1/2缺陷小鼠中不存在（圖3D和3E），而是被替換為途徑活性水平在光暗周期自始至終大多不變。在光或暗階段期間的某些功能的優(yōu)先活性因此在Per1/2^-/-小鼠中喪失。例如，涉及維生素代謝（圖3F）、核苷酸代謝（圖3G）、雙組分以及分泌系統(tǒng)（圖3H）、DNA修復(fù)（圖4A）、細(xì)胞壁合成（圖4B）和運(yùn)動(dòng)性（圖4C）的途徑在Per1/2^-/-小鼠中喪失其日間節(jié)律性。總之，這些數(shù)據(jù)表明宿主的功能晝夜節(jié)律鐘是生成腸道微生物叢的組成和功能的日間波動(dòng)所需的。

重要的是，本發(fā)明人還注意到Per1/2缺陷小鼠中的生態(tài)失調(diào)，證據(jù)是更低的α多樣性（圖4D），并且當(dāng)與對(duì)照相比較時(shí)，其具有獨(dú)特的腸道群落組成（圖4E）。在細(xì)菌屬中發(fā)現(xiàn)了野生型和Per1/2缺陷小鼠之間的微生物叢組成的一些最大差異，所述細(xì)菌屬在野生型小鼠中經(jīng)歷日間波動(dòng)（圖4F）。為了排除生態(tài)失調(diào)與日間微生物叢振蕩的喪失固有地互聯(lián)的可能性，分析了其他遺傳修飾的生態(tài)失調(diào)的小鼠的日間微生物叢振蕩的存在。選擇炎性體銜接子ASC缺陷的小鼠，在近期已描述了該模型以表征功能上重要并已明確定義的生態(tài)失調(diào)（Elinav等人，2011；Henao-Mejia等人，2012）。確實(shí)，野生型和ASC^-/-小鼠的糞便群落通過(guò)α和β多樣性區(qū)分（圖4G和4H）。然而，正如通過(guò)JTK_周期鑒定的：來(lái)自ASC^-/-小鼠的細(xì)菌OTU展示出顯著的組成振蕩（圖4I和4J）。因此，可以得出結(jié)論微生物叢日間振蕩以不同的微生物叢配置存在，并且組成生態(tài)失調(diào)和日間節(jié)律性的喪失可以彼此獨(dú)立地發(fā)生。

微生物叢日間振蕩由飼喂時(shí)間控制

本發(fā)明人接下來(lái)著手確定宿主的晝夜節(jié)律鐘所涉及的機(jī)制，該機(jī)制生成腸道中的微生物組成振蕩。宿主晝夜節(jié)律鐘控制許多生理功能包括進(jìn)食（Turek等人，2005）的節(jié)律性。相反，飼喂時(shí)間在引導(dǎo)和同步外圍鐘中是關(guān)鍵的（Asher等人，2010；Hoogerwerf等人，2007；Stokkan等人，2001）。嚙齒類動(dòng)物是優(yōu)先在暗階段期間進(jìn)食的夜行動(dòng)物（圖4K）。相比之下，Per1/2^-/-小鼠的特征在于極大減弱的日間飼喂節(jié)律，并且全天連續(xù)進(jìn)食（圖4L）。因此似乎合理的是正常野生型宿主中的微生物叢節(jié)律性通過(guò)其日間進(jìn)食習(xí)慣驅(qū)動(dòng)，而Per1/2^-/-小鼠中減弱的微生物叢節(jié)律性是繼發(fā)于其完全改變的進(jìn)食時(shí)間。為此，進(jìn)行定時(shí)飼喂實(shí)驗(yàn)，其中野生型小鼠僅在光階段期間或僅在暗階段期間獲得食物（圖5A、6A和6B）。與預(yù)定的飼喂引導(dǎo)外周鐘的能力一致，進(jìn)食習(xí)慣的這種逆轉(zhuǎn)顛倒了腸道鐘基因的表達(dá)模式（圖6C）。在兩周的連續(xù)計(jì)劃飼喂后，兩個(gè)連續(xù)的光暗周期，每6小時(shí)收集一次糞便微生物叢樣品。使用JTK_周期算法，發(fā)現(xiàn)暗階段飼喂組中的微生物叢振蕩類似于自由進(jìn)食的小鼠，反映出嚙齒類動(dòng)物的正常的主要夜間食性，圖5B-5F、6D）。相比之下，循環(huán)OTU通常在暗階段飼喂組和光階段飼喂組之間表現(xiàn)出不同階段（圖5C-5F和6D）。大多數(shù)循環(huán)OTU看起來(lái)在改變飼喂時(shí)間后表現(xiàn)出約12小時(shí)的階段偏移，表明微生物叢節(jié)律由飼喂時(shí)間直接控制。此類階段偏移例如在Bacteroides acidifaciens（圖5C）、羅伊乳桿菌（圖5D）和消化球菌科（Peptococcaceae）（圖5E）的情況下觀察到。本發(fā)明人還在光階段飼喂組中觀察到了從頭或增強(qiáng)的節(jié)律性的情況，如通過(guò)分節(jié)絲狀菌（圖5F）例示的。這些結(jié)果表明，飼喂時(shí)間影響微生物叢組成的日間波動(dòng)，并且共生細(xì)菌的豐度的振蕩可以由計(jì)劃飼喂控制。

因而，如果飼喂時(shí)間直接控制微生物叢組成的日間波動(dòng)，則定時(shí)飼喂應(yīng)當(dāng)拯救晝夜節(jié)律鐘缺陷的小鼠中的此類波動(dòng)的喪失。本發(fā)明人因此對(duì)Per1/2^-/-小鼠進(jìn)行了相似的食物限制實(shí)驗(yàn)，并且在兩周的計(jì)劃飼喂后，在兩個(gè)光暗周期，每6小時(shí)分析一次微生物叢樣品。確實(shí)，光階段飼喂和暗階段飼喂的Per1/2^-/-小鼠均具有顯著振蕩的細(xì)菌OUT，而自由進(jìn)食的Per1/2^-/-小鼠則沒(méi)有，表現(xiàn)出之前的無(wú)節(jié)律性群落組成中的從頭節(jié)律性生成（圖5G和6E）。

類似于經(jīng)歷定時(shí)飼喂的野生型小鼠，在Per1/2^-/-小鼠中微生物叢振蕩階段在飼喂時(shí)間之后，并且振蕩OTU顯示出暗階段飼喂小鼠和光階段飼喂小鼠之間的階段偏移（圖6E）。例如，在暗階段飼喂的Per1/2^-/-小鼠中觀察到的羅伊乳桿菌（圖5H）和擬桿菌屬（圖5I）的振蕩遵循在自由進(jìn)食或暗階段飼喂的野生型小鼠中觀察到的模式，而光階段飼喂組顯示出相反循環(huán)。這些結(jié)果證實(shí)節(jié)律飼喂可以重構(gòu)Per1/2^-/-小鼠中的OTU振蕩（圖5J）。

為了進(jìn)一步確證宿主飼喂節(jié)律性在控制微生物叢振蕩中的中心性，將來(lái)自Per1/2^-/-小鼠的微生物叢（缺乏日間波動(dòng)）移植到無(wú)菌小鼠內(nèi)，所述無(wú)菌小鼠在正常光暗條件下飼養(yǎng)（圖5K）。在糞便移植后，定植的無(wú)菌小鼠表現(xiàn)出規(guī)則的夜行活動(dòng)和代謝模式（圖6F和6G）。當(dāng)用來(lái)自野生型小鼠的微生物叢進(jìn)行對(duì)照移植時(shí)，也觀察到這點(diǎn)（圖6H）。值得注意的是，在移植到無(wú)菌宿主內(nèi)一周后，來(lái)自Per1/2^-/-小鼠的糞便微生物叢表現(xiàn)出標(biāo)準(zhǔn)化的日間節(jié)律性（圖5L）。綜上，這些結(jié)果顯示食物攝入的節(jié)律性支配微生物叢組成中的每日振蕩，并且微生物叢節(jié)律性是可以響應(yīng)于改變的飼喂行為而喪失或再獲得的靈活過(guò)程。由此，飼喂時(shí)間將宿主行為的晝夜節(jié)律模式與微生物叢組成和功能的日間波動(dòng)相關(guān)聯(lián)。

正常睡眠模式的環(huán)境破壞誘導(dǎo)微生物叢日間節(jié)律性的喪失和生態(tài)失調(diào)

本發(fā)明人接下來(lái)尋求測(cè)試微生物叢日間節(jié)律性的生理學(xué)相關(guān)性。在人中，晝夜節(jié)律鐘的擾亂通常發(fā)生在輪班工作和長(zhǎng)期時(shí)差的背景下，其中外部光條件頻繁改變并削弱分子鐘調(diào)整至穩(wěn)定節(jié)律的能力。通過(guò)使用其中小鼠每三天暴露于8小時(shí)時(shí)移的時(shí)差模型，在小鼠中模擬這種情況（圖7A）。這種模型模擬通過(guò)在具有8小時(shí)時(shí)間差異的國(guó)家之間頻繁飛行誘導(dǎo)的時(shí)差情況，并且同樣地模仿在日夜輪班工作之間的定期轉(zhuǎn)換的情況（Huang等人，2011；Yamaguchi等人，2013）。在四周的時(shí)差誘導(dǎo)后，小鼠返回起始光周期條件，并且在最后一次時(shí)移一天后進(jìn)行分析。時(shí)差的誘導(dǎo)導(dǎo)致宿主節(jié)律性身體活動(dòng)的喪失（圖8A和8B）。類似于人，時(shí)差還導(dǎo)致不規(guī)則模式的食物攝入節(jié)律，導(dǎo)致進(jìn)食的日夜變化的喪失（圖7B和8C）。然而，食物攝入的日總量在對(duì)照和時(shí)差小鼠間未受影響（圖7B）。時(shí)差的成功誘導(dǎo)還通過(guò)外周鐘轉(zhuǎn)錄物振蕩的偏移得到確認(rèn)（圖8D-8F）。

考慮到節(jié)律性食物攝入誘導(dǎo)微生物叢的日間波動(dòng)的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人檢查了由時(shí)差帶來(lái)的對(duì)節(jié)律性行為這些破壞是否還損害微生物叢組成的日間振蕩。為此，在時(shí)差小鼠中每6小時(shí)進(jìn)行一次微生物叢組成的分類學(xué)分析，并且通過(guò)JTK_周期測(cè)試節(jié)律性。類似于晝夜節(jié)律鐘缺陷的小鼠，時(shí)差小鼠表現(xiàn)出細(xì)菌節(jié)律的廢除，伴隨振蕩細(xì)菌分類單位的數(shù)目減少（圖7C-E）?？傊愃朴跁円构?jié)律鐘的基因破壞，環(huán)境誘導(dǎo)的每日振蕩模式的廢除與微生物叢組成的日間節(jié)律性的喪失相關(guān)。

因?yàn)樵诨蛏乡娙毕莸男∈笾杏^察到生態(tài)失調(diào)，所以在時(shí)移4周后分析了“時(shí)差”小鼠的群落組成。實(shí)際上，微生物叢組成在對(duì)照和時(shí)差小鼠之間略微不同（圖7F）。當(dāng)小鼠經(jīng)過(guò)為期16周的連續(xù)時(shí)移后，生態(tài)失調(diào)得到增強(qiáng)（圖7G），并且那些在野生型小鼠中振蕩的分類單位受到影響（圖7H），總而言之，這些數(shù)據(jù)表明哺乳動(dòng)物暗光周期的慢性環(huán)境或基因破壞表現(xiàn)為飼喂節(jié)律的顯著改變，以及無(wú)法維持微生物叢的節(jié)律性和組成。

與環(huán)境鐘破壞相關(guān)的生態(tài)失調(diào)驅(qū)動(dòng)代謝疾病

長(zhǎng)期時(shí)差和輪班工作是在工業(yè)革命后僅最近才在人類中變得普遍的行為模式。這些新近引入的行為模式與肥胖、糖尿病和心血管疾病（在現(xiàn)代人群中平行出現(xiàn)的所有疾病狀態(tài)）的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)（Archer等人，2014；Buxton等人，2012；Fonken等人，2010；Scheer等人，2009；Suwazono等人，2008）。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)微生物叢振蕩的喪失和生態(tài)失調(diào)與小鼠中的時(shí)差相關(guān)，所以本發(fā)明人著手測(cè)試涉及代謝失衡的微生物叢是否與改變的晝夜節(jié)律相關(guān)。他們首先確定了時(shí)差與代謝綜合征的表現(xiàn)相關(guān)。給時(shí)差小鼠和對(duì)照小鼠飼喂高脂肪飲食，其中60%的熱量能量來(lái)自脂肪，從而模仿易患代謝綜合征的人類飲食習(xí)慣。確實(shí)，早在高脂肪飲食實(shí)行6周后，與維持在正常晝夜節(jié)律節(jié)律性上的小鼠相比較，時(shí)移小鼠就顯示出增強(qiáng)的重量增加和惡化的葡萄糖耐受不良（圖9A-9C）。

因?yàn)榭傮w食物攝入在野生型和時(shí)差小鼠之間并無(wú)不同（圖7B），所以猜測(cè)微生物叢組成中的改變可以促成這種代謝表型。確實(shí)，在時(shí)差誘導(dǎo)期間用廣譜抗生素處理（飲用水中的萬(wàn)古霉素、氨芐青霉素、卡那霉素和甲硝唑（Fagarasan等人，2002；Rakoff-Nahoum等人，2004））消除了時(shí)差小鼠中的肥胖和葡萄糖耐受不良（圖9A-9C）。時(shí)移小鼠中的肥胖與更高的脂肪量相關(guān)，所述更高的脂肪量通過(guò)抗生素處理挽救（圖9D和9E）。磁共振成像（MRI）揭示脂肪量的這種累積導(dǎo)致經(jīng)歷慢性時(shí)移的小鼠中增加的皮下和內(nèi)臟脂肪沉積（圖9J）。

值得注意的是，葡萄糖耐受自身即是晝夜節(jié)律變化的基礎(chǔ)（Kaasik等人，2013；So等人，2009）。然而，時(shí)差組和對(duì)照組之間的葡萄糖耐受不良的日間差異的持續(xù)存在與測(cè)量的每日時(shí)間無(wú)關(guān)（數(shù)據(jù)未示出）。時(shí)差小鼠的夜晚行為和飼喂模式的破壞不受高脂肪飲食或抗生素處理影響（圖10A-10F）。雖然高脂肪飼喂在一定程度上的確減少振蕩OTU的量（圖10G-I），但微生物叢振蕩在抗生素處理一周后持續(xù)存在（圖10J-K）。

為了進(jìn)一步突出顯示時(shí)差誘導(dǎo)對(duì)重量穩(wěn)態(tài)的不良作用不依賴于飲食組成，與其非時(shí)差對(duì)照相比較，維持了四個(gè)月常規(guī)食物飲食的時(shí)差小鼠表現(xiàn)出更高的體重和增加的體脂量（圖9F）。

為了進(jìn)一步確證在時(shí)差小鼠中觀察到的改變的微生物叢在代謝失衡中的作用，將具有對(duì)照或“時(shí)差”微生物叢配置的糞便轉(zhuǎn)移到無(wú)菌Swiss Webster小鼠內(nèi)。與對(duì)照微生物叢接受者相比較，時(shí)移微生物叢的接受者顯示出增強(qiáng)的重量增加和葡萄糖耐受不良（圖9G和9H）。

此外，類似于其相應(yīng)的供體，時(shí)移小鼠的微生物叢的接受者的特征在于身體肥胖的顯著增加（圖9I）。MRI掃描顯示接受來(lái)自時(shí)差供體的微生物叢的無(wú)菌小鼠的體脂增加（圖9K）。綜上，這些結(jié)果證實(shí)時(shí)差相關(guān)的代謝紊亂可通過(guò)微生物叢傳遞。

人微生物叢顯示出具有代謝后果的日間振蕩和時(shí)移相關(guān)的生態(tài)失調(diào)

最后，本發(fā)明人檢查了在動(dòng)物模型中的發(fā)現(xiàn)是否可以應(yīng)用于人。他們首先測(cè)定連續(xù)幾天在一天中的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)從兩名個(gè)體收集的人糞便樣品中的微生物叢群落變化（圖11A）。使用16S測(cè)序，發(fā)現(xiàn)占所有細(xì)菌OTU中最高達(dá)10%的豐度的日間波動(dòng)（圖11B和11C）。

類似于在小鼠中的發(fā)現(xiàn)，振蕩OTU在一天中具有不同的峰相位和底值期（圖11D）。例如，在紫單胞菌屬（圖11E）、毛螺菌屬（Lachnospira）（圖12A）和Bulleida屬（圖12B）中發(fā)現(xiàn)穩(wěn)健振蕩。OTU豐度的日間節(jié)律性導(dǎo)致日特異性微生物叢群落配置的時(shí)間，伴隨在觀察到的時(shí)間段上的重復(fù)模式（圖12C）。在一天的多個(gè)時(shí)間進(jìn)行了人樣品的宏基因組分析。發(fā)現(xiàn)具有基因覆蓋高于0.2的所有途徑中的約20%顯示出日間豐度模式（圖11F），如通過(guò)屬于二噁英降解途徑的基因例示的（圖12D）。類似于小鼠中的發(fā)現(xiàn)，不同的功能實(shí)體在一天的不同時(shí)間具有優(yōu)先豐度。例如，能量代謝和蛋白質(zhì)生產(chǎn)在光階段期間優(yōu)先進(jìn)行，而解毒途徑在晚上最活躍（圖11G和圖11H）。與小鼠微生物叢相比較，途徑活性的峰時(shí)期在一天的相反時(shí)間發(fā)生（圖11I），正如由宿主的日間相對(duì)于夜晚行為所預(yù)期的?？傊?，正如在小鼠中，這些數(shù)據(jù)表明，人腸道微生物叢的組分可以經(jīng)歷組成和功能的日間變化。

此外，小鼠的數(shù)據(jù)表明由異常的睡眠活動(dòng)周期造成的晝夜節(jié)律鐘的破壞導(dǎo)致異常的微生物叢組成。應(yīng)用在小鼠中的時(shí)移模型對(duì)應(yīng)于通過(guò)在具有8小時(shí)時(shí)間差異的國(guó)家之間飛行誘導(dǎo)的時(shí)差。本發(fā)明人因此收集來(lái)自兩名健康人供體的糞便樣品，所述健康人供體經(jīng)歷此類飛行誘導(dǎo)的8-10小時(shí)時(shí)移（從美國(guó)中部或西部時(shí)區(qū)飛往以色列），并且在旅行誘導(dǎo)的時(shí)差誘導(dǎo)前一天、在時(shí)差期間（著陸后一天）、以及從時(shí)差恢復(fù)后（著陸后兩周）進(jìn)行分類學(xué)分析（圖13A）。確實(shí)，微生物叢群落顯示出時(shí)移誘導(dǎo)的組成變化，其在進(jìn)入時(shí)差24小時(shí)內(nèi)被檢測(cè)到（圖13B以及表A和B）。在時(shí)差期間獲得的微生物叢樣品具有更高的相對(duì)量的厚壁菌門，其在時(shí)差恢復(fù)后逆轉(zhuǎn)。

有趣的是，厚壁菌門已與多項(xiàng)人研究中更高的肥胖和代謝疾病傾向相關(guān)（Ley等人，2006；Ridaura等人，2013）。為了分析時(shí)差個(gè)體中的微生物叢變化是否與對(duì)代謝疾病的敏感性增加相關(guān)，進(jìn)行了在時(shí)差前、時(shí)差24小時(shí)內(nèi)和時(shí)差恢復(fù)后從單獨(dú)個(gè)體獲得的人樣品進(jìn)入無(wú)菌小鼠內(nèi)的糞便轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（圖13C）。

由來(lái)自時(shí)差個(gè)體的微生物叢定植的無(wú)菌小鼠展示出增強(qiáng)的重量增加，并且與在時(shí)移前獲取的樣品相比較，在口服葡萄糖攻擊后表現(xiàn)出更高的血糖水平（圖13D和13E）。這種代謝效應(yīng)在時(shí)差恢復(fù)后消除（圖13D和13E）。

此外，來(lái)自時(shí)差狀態(tài)的微生物叢的無(wú)菌接受者比接受來(lái)自在時(shí)差之前或之后的相同個(gè)體的微生物叢的小鼠累積了更多的體脂（圖13F）。總之，盡管是初步性的，但這些數(shù)據(jù)表明人微生物叢的一些共生代表可以經(jīng)歷日間振蕩，人中的晝夜節(jié)律失調(diào)與生態(tài)失調(diào)相關(guān)，并且所得到的微生物群落可以促成代謝失衡。

表A

表B

討論

在本實(shí)施例中，本發(fā)明人描述了哺乳動(dòng)物腸微生物叢展示日間振蕩，其受進(jìn)食節(jié)律性的支配。如果節(jié)律飼喂時(shí)間扭曲，正如在遺傳鐘缺陷或時(shí)移誘導(dǎo)的時(shí)差的情況下，則微生物叢振蕩受損（圖14）。小鼠中的長(zhǎng)期晝夜節(jié)律失調(diào)和人中時(shí)移誘導(dǎo)的時(shí)差導(dǎo)致生態(tài)失調(diào)和可傳遞的代謝后果，包括肥胖和葡萄糖耐受不良。這些觀察提供了共生群落如何可以使其相互依賴的生理活動(dòng)與地球物理時(shí)鐘同步并且這如何促進(jìn)宏生物的穩(wěn)態(tài)的首個(gè)實(shí)例。

先前研究在關(guān)注微生物叢的時(shí)間波動(dòng)時(shí)已考慮到了更長(zhǎng)的時(shí)幀，并且發(fā)現(xiàn)了個(gè)體微生物組成隨時(shí)間推移的顯著穩(wěn)定性（Faith等人，2013；Lozupone等人，2012）。此處，本發(fā)明人進(jìn)行了具有更細(xì)微的時(shí)間分辨率的縱向微生物叢研究，并且發(fā)現(xiàn)具有日間節(jié)律的小時(shí)規(guī)模的波動(dòng)。值得注意的是，此分析集中于微生物群落組成和宏基因組途徑的日間波動(dòng)。因?yàn)榧?xì)菌晝夜節(jié)律鐘的分子組分還已被描述為作用于轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平（Lenz和Sogaard-Andersen，2011），所以共生微生物叢的一些成員可能擁有又另一個(gè)水平的時(shí)間依賴性活性控制，除相對(duì)豐度中的模式之外，其還可能以節(jié)律方式調(diào)節(jié)細(xì)菌活性。

這些結(jié)果具有若干意義。首先，它們表明與宿主晝夜節(jié)律的長(zhǎng)期擾亂相關(guān)的代謝失衡，例如在輪班工人和在時(shí)差期間發(fā)現(xiàn)的那種，具有取決于微生物叢的組成及其對(duì)宿主代謝的作用的可傳播組分。與宿主晝夜節(jié)律的破壞相關(guān)的高度多因子發(fā)病率是新出現(xiàn)的現(xiàn)代生活方式的疾病，并且基礎(chǔ)的病因?qū)W知之甚少。本研究將腸道微生物群落的改變鑒定為此類疾病表現(xiàn)的另外驅(qū)動(dòng)力，且認(rèn)為靶向益生菌或抗微生物療法可以作為潛在的新預(yù)防或治療方法在易感群體中進(jìn)行測(cè)試。另外，結(jié)果獲得關(guān)于具有晝夜節(jié)律鐘缺陷的小鼠的較早期研究的新認(rèn)識(shí)（Karatsoreos等人，2011；Rudic等人，2004；Turek等人，2005），因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)的表型中的一些可能不僅由基因缺陷介導(dǎo)，另外還可以受微生物叢的特征以及下游代謝和炎性后果變化的影響。此處提供的結(jié)果因此可以促進(jìn)未來(lái)的研究，以測(cè)定晝夜節(jié)律失調(diào)對(duì)微生物叢成形因素的影響，包括宿主的免疫和代謝途徑、進(jìn)食模式、應(yīng)激激素水平和腸運(yùn)動(dòng)。

其次，本研究揭示除了將飲食類型作為微生物叢組成的調(diào)節(jié)因子之外，食物攝入的時(shí)機(jī)也在腸道微生物叢生態(tài)學(xué)成形中起關(guān)鍵作用。當(dāng)食物攝入是節(jié)律性的時(shí)，發(fā)現(xiàn)最高達(dá)15%的共生細(xì)菌分類單位（和高得多百分比的豐度）在一天中波動(dòng)。在宿主外周組織例如肝中，所有轉(zhuǎn)錄物中的相似比例以節(jié)律方式振蕩（Akhtar等人，2002；McCarthy等人，2007；Panda等人，2002；Storch等人，2002；Vollmers等人，2009）。類似于外周鐘，微生物叢節(jié)律受宿主鐘影響，并且在調(diào)整代謝過(guò)程以適應(yīng)環(huán)境的日間波動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。確實(shí)，近期工作已顯示來(lái)自微生物叢的信號(hào)在腸道上皮細(xì)胞的晝夜節(jié)律生成中起重要作用（Mukherji等人，2013）。綜上，這項(xiàng)近期工作和本研究提出了新出現(xiàn)的新范例，其中在宿主的日間振蕩和微生物叢之間存在反饋回路，其具有對(duì)相互依存的功能的互相交叉調(diào)節(jié)。

本文觀察到的食物節(jié)律性指導(dǎo)微生物叢振蕩的在另一方面也可以是值得注意的。作為成熟的概念，外周鐘除與光敏中心振蕩器同步之外，其還通過(guò)飼喂節(jié)律引導(dǎo)?；谖⑸飬沧鳛樗拗骰虮磉_(dá)的調(diào)節(jié)因子的作用已被充分證明，這些結(jié)果提出了這樣的可能性：微生物叢可能涉及此食物引導(dǎo)過(guò)程，并且可能對(duì)較早期觀察到的與定時(shí)飼喂相關(guān)的有益代謝效應(yīng)提出另外的機(jī)制解釋（Adamovich等人，2014；Damiola等人，2000；Vollmers等人，2009）。在此類情況下，節(jié)律性食物攝入可能支配微生物叢振蕩，其繼而引起對(duì)宿主基因表達(dá)的節(jié)律誘導(dǎo)。因此，微生物叢及其振蕩對(duì)宿主晝夜節(jié)律行為和基因表達(dá)的影響展現(xiàn)出令人興奮的未來(lái)研究領(lǐng)域。

另外，在理解聚焦于人和動(dòng)物微生物叢組成的研究時(shí)，應(yīng)考慮到此處發(fā)現(xiàn)的腸道微生物生態(tài)學(xué)的日間波動(dòng)。例如，基于本結(jié)果，涉及微生物叢研究的人類個(gè)體在每天的標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)間提供其樣品可以是可取的，以便排除日間變化對(duì)飲食或處理模態(tài)的解釋的影響。本研究揭示生態(tài)失調(diào)具有時(shí)間維度，并且靜態(tài)微生物叢比較可能無(wú)法完全定論，除非針對(duì)此重要的附加變量以控制方式獲取樣品。微生物叢的短期節(jié)律振蕩，例如本研究中所述的那種，可以在各種疾病條件下被擴(kuò)大或破壞，而測(cè)定此類“時(shí)間生態(tài)失調(diào)”對(duì)微生物叢介導(dǎo)的疾病的影響將是有意思的，所述疾病在每天的不同時(shí)期具有不同表現(xiàn)或不同程度的嚴(yán)重性。

最后，由宿主及其固有的微生物叢進(jìn)化出的共同依賴性日間節(jié)律的網(wǎng)絡(luò)可能賦予宏生物若干生物學(xué)優(yōu)點(diǎn)。動(dòng)態(tài)微生物叢組成可能能夠比時(shí)間靜態(tài)組成更好地應(yīng)對(duì)由環(huán)境的日間波動(dòng)強(qiáng)加的挑戰(zhàn)。如本研究中證實(shí)的，宿主的食物攝入經(jīng)歷晝夜節(jié)律波動(dòng)，其誘發(fā)涉及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的細(xì)菌物種中的時(shí)間變化。因此，微生物叢組分的振蕩可以預(yù)料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可用性的這些時(shí)間變化。宏基因組分析表明某些種類的細(xì)菌功能在一天中具有時(shí)間偏好（圖14）。據(jù)發(fā)現(xiàn)，涉及生長(zhǎng)和能量代謝的途徑（例如核酸修復(fù)、核苷酸代謝、碳水化合物和氨基酸代謝）與運(yùn)動(dòng)性和解毒途徑（包括鞭毛裝配、趨化性和異生物質(zhì)降解）是反相的。由于分類學(xué)分析表明微生物叢振蕩是在節(jié)律食物攝入之后，所以此類宏基因組波動(dòng)可能是專門響應(yīng)于食物攝入/饑餓階段的途徑占據(jù)節(jié)律小生境的結(jié)果。此外，微生物叢提供了針對(duì)外來(lái)微生物元素包括腸病原體的定植抗性（Stecher和Hardt，2011），所述定植抗性可能通過(guò)在清醒期間進(jìn)食而引入。由此，將外來(lái)微生物元素引入腸道微生物叢構(gòu)成了每日波動(dòng)的基礎(chǔ)，產(chǎn)生對(duì)由共生微生物叢占據(jù)小生境的日間節(jié)律性的需要。弄清日間微生物叢振蕩的作用和調(diào)節(jié)因子可以對(duì)我們尋找健康和疾病中宿主與其微生物環(huán)境的共生共存原理的分子解釋添加重要的方面，并且因而可以在治療上利用對(duì)微生物叢節(jié)律性的調(diào)節(jié)。

實(shí)施例1的參考文獻(xiàn)

Adamovich，Y.，Rousso-Noori，L.，Zwighaft，Z.，Neufeld-Cohen，A.，Golik，M.，Kraut-Cohen，J.，Wang，M.，Han，X.和Asher，G.（2014）. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell metabolism 19，319-330.

Akhtar，R.A.，Reddy，A.B.，Maywood，E.S.，Clayton，J.D.，King，V.M.，Smith，A.G.，Gant，T.W.，Hastings，M.H.和Kyriacou，C.P.（2002）. Circadian cycling of the mouse liver transcriptome，as revealed by cDNA microarray，is driven by the suprachiasmatic nucleus. Current biology : CB 12，540-550.

Archer，S.N.，Laing，E.E.，Moller-Levet，C.S.，van der Veen，D.R.，Bucca，G.，Lazar，A.S.，Santhi，N.，Slak，A.，Kabiljo，R.，von Schantz，M.,等人（2014）. From the Cover: Mistimed sleep disrupts circadian regulation of the human transcriptome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111，E682-691.

Asher，G.，Reinke，H.，Altmeyer，M.，Gutierrez-Arcelus，M.，Hottiger，M.O.和Schibler，U.（2010）. Poly（ADP-ribose）polymerase 1 participates in the phase entrainment of circadian clocks to feeding. Cell 142，943-953.

Bass，J.（2012）. Circadian topology of metabolism. Nature 491，348-356.

Buxton，O.M.，Cain，S.W.，O'Connor，S.P.，Porter，J.H.，Duffy，J.F.，Wang，W.，Czeisler，C.A.和Shea，S.A.（2012）. Adverse metabolic consequences in humans of prolonged sleep restriction combined with circadian disruption. Science translational medicine 4，129ra143.

Caporaso，J.G.，Kuczynski，J.，Stombaugh，J.，Bittinger，K.，Bushman，F(xiàn).D.，Costello，E.K.，F(xiàn)ierer，N.，Pena，A.G.，Goodrich，J.K.，Gordon，J.I.,等人（2010）. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods7，335-336.

Clemente，J.C.，Ursell，L.K.，Parfrey，L.W.和Knight，R.（2012）. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. Cell 148，1258-1270.

Damiola，F(xiàn).，Le Minh，N.，Preitner，N.，Kornmann，B.，F(xiàn)leury-Olela，F(xiàn).和Schibler，U.（2000）. Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes & development 14，2950-2961.

Dibner，C.，Schibler，U.和Albrecht，U.（2010）. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annual review of physiology 72，517-549.

Edgar，R.S.，Green，E.W.，Zhao，Y.，van Ooijen，G.，Olmedo，M.，Qin，X.，Xu，Y.，Pan，M.，Valekunja，U.K.，F(xiàn)eeney，K.A.,等人（2012）. Peroxiredoxins are conserved markers of circadian rhythms. Nature 485，459-464.

Elinav，E.，Strowig，T.，Kau，A.L.，Henao-Mejia，J.，Thaiss，C.A.，Booth，C.J.，Peaper，D.R.，Bertin，J.，Eisenbarth，S.C.，Gordon，J.I.,等人（2011）. NLRP6 inflammasome regulates colonic microbial ecology and risk for colitis. Cell145，745-757.

Fagarasan，S.，Muramatsu，M.，Suzuki，K.，Nagaoka，H.，Hiai，H.和Honjo，T.（2002）. Critical roles of activation-induced cytidine deaminase in the homeostasis of gut flora. Science 298，1424-1427.

Faith，J.J.，Guruge，J.L.，Charbonneau，M.，Subramanian，S.，Seedorf，H.，Goodman，A.L.，Clemente，J.C.，Knight，R.，Heath，A.C.，Leibel，R.L.,等人（2013）. The long-term stability of the human gut microbiota. Science 341，1237439.

Fonken，L.K.，Workman，J.L.，Walton，J.C.，Weil，Z.M.，Morris，J.S.，Haim，A.和Nelson，R.J.（2010）. Light at night increases body mass by shifting the time of food intake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107，18664-18669.

Gerhart-Hines，Z.，F(xiàn)eng，D.，Emmett，M.J.，Everett，L.J.，Loro，E.，Briggs，E.R.，Bugge，A.，Hou，C.，F(xiàn)errara，C.，Seale，P.,等人（2013）. The nuclear receptor Rev-erbalpha controls circadian thermogenic plasticity. Nature 503，410-413.

Gordon，J.I.（2012）. Honor thy gut symbionts redux. Science 336，1251-1253.

Henao-Mejia，J.，Elinav，E.，Jin，C.，Hao，L.，Mehal，W.Z.，Strowig，T.，Thaiss，C.A.，Kau，A.L.，Eisenbarth，S.C.，Jurczak，M.J.,等人（2012）. Inflammasome-mediated dysbiosis regulates progression of NAFLD and obesity. Nature 482，179-185.

Hogenesch，J.B.和Ueda，H.R.（2011）. Understanding systems-level properties: timely stories from the study of clocks. Nature reviews Genetics 12，407-416.

Hoogerwerf，W.A.，Hellmich，H.L.，Cornelissen，G.，Halberg，F(xiàn).，Shahinian，V.B.，Bostwick，J.，Savidge，T.C.和Cassone，V.M.（2007）. Clock gene expression in the murine gastrointestinal tract: endogenous rhythmicity and effects of a feeding regimen. Gastroenterology 133，1250-1260.

Hooper，L.V.，Littman，D.R.和Macpherson，A.J.（2012）. Interactions between the microbiota and the immune system. Science 336，1268-1273.

Hsiao，E.Y.，McBride，S.W.，Hsien，S.，Sharon，G.，Hyde，E.R.，McCue，T.，Codelli，J.A.，Chow，J.，Reisman，S.E.，Petrosino，J.F.,等人（2013）. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell 155，1451-1463.

Huang，W.，Ramsey，K.M.，Marcheva，B.和Bass，J.（2011）. Circadian rhythms，sleep，and metabolism. The Journal of clinical investigation 121，2133-2141.

Hughes，M.E.，Hogenesch，J.B.和Kornacker，K.（2010）. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of biological rhythms 25，372-380.

Human Microbiome Project，C.（2012）. Structure，function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 486，207-214.

Johnson，C.H.，Egli，M.和Stewart，P.L.（2008）. Structural insights into a circadian oscillator. Science 322，697-701.

Johnson，C.H.，Stewart，P.L.和Egli，M.（2011）. The cyanobacterial circadian system: from biophysics to bioevolution. Annual review of biophysics 40，143-167.

Kaasik，K.，Kivimae，S.，Allen，J.J.，Chalkley，R.J.，Huang，Y.，Baer，K.，Kissel，H.，Burlingame，A.L.，Shokat，K.M.，Ptacek，L.J.,等人（2013）. Glucose sensor O-GlcNAcylation coordinates with phosphorylation to regulate circadian clock. Cell metabolism 17，291-302.

Kanehisa，M.和Goto，S.（2000）. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic acids research 28，27-30.

Kanehisa，M.，Goto，S.，Sato，Y.，Kawashima，M.，F(xiàn)urumichi，M.和Tanabe，M.（2014）. Data，information，knowledge and principle: back to metabolism in KEGG. Nucleic acids research 42，D199-D205.

Karatsoreos，I.N.，Bhagat，S.，Bloss，E.B.，Morrison，J.H.和McEwen，B.S.（2011）. Disruption of circadian clocks has ramifications for metabolism，brain，and behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108，1657-1662.

Keller，M.，Mazuch，J.，Abraham，U.，Eom，G.D.，Herzog，E.D.，Volk，H.D.，Kramer，A.和Maier，B.（2009）. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106，21407-21412.

Lenz，P.和Sogaard-Andersen，L.（2011）. Temporal and spatial oscillations in bacteria. Nature reviews Microbiology 9，565-577.

Ley，R.E.，Turnbaugh，P.J.，Klein，S.和Gordon，J.I.（2006）. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature 444，1022-1023.

Lozupone，C.A.，Stombaugh，J.I.，Gordon，J.I.，Jansson，J.K.和Knight，R.（2012）. Diversity，stability and resilience of the human gut microbiota. Nature 489，220-230.

McCarthy，J.J.，Andrews，J.L.，McDearmon，E.L.，Campbell，K.S.，Barber，B.K.，Miller，B.H.，Walker，J.R.，Hogenesch，J.B.，Takahashi，J.S.和Esser，K.A.（2007）. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiological genomics 31，86-95.

Mohawk，J.A.，Green，C.B.和Takahashi，J.S.（2012）. Central and peripheral circadian clocks in mammals. Annual review of neuroscience 35，445-462.

Mukherji，A.，Kobiita，A.，Ye，T.和Chambon，P.（2013）. Homeostasis in intestinal epithelium is orchestrated by the circadian clock and microbiota cues transduced by TLRs. Cell 153，812-827.

Nguyen，K.D.，F(xiàn)entress，S.J.，Qiu，Y.，Yun，K.，Cox，J.S.和Chawla，A.（2013）. Circadian gene Bmal1 regulates diurnal oscillations of Ly6C（hi）inflammatory monocytes. Science 341，1483-1488.

Panda，S.，Antoch，M.P.，Miller，B.H.，Su，A.I.，Schook，A.B.，Straume，M.，Schultz，P.G.，Kay，S.A.，Takahashi，J.S.和Hogenesch，J.B.（2002）. Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell 109，307-320.

Qin，J.，Li，R.，Raes，J.，Arumugam，M.，Burgdorf，K.S.，Manichanh，C.，Nielsen，T.，Pons，N.，Levenez，F(xiàn).和Yamada，T.（2010）. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 464，59-65.

Rakoff-Nahoum，S.，Paglino，J.，Eslami-Varzaneh，F(xiàn).，Edberg，S.和Medzhitov，R.（2004）. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 118，229-241.

Ridaura，V.K.，F(xiàn)aith，J.J.，Rey，F(xiàn).E.，Cheng，J.，Duncan，A.E.，Kau，A.L.，Griffin，N.W.，Lombard，V.，Henrissat，B.，Bain，J.R.,等人（2013）. Gut microbiota from twins discordant for obesity modulate metabolism in mice. Science 341，1241214.

Rudic，R.D.，McNamara，P.，Curtis，A.M.，Boston，R.C.，Panda，S.，Hogenesch，J.B.和Fitzgerald，G.A.（2004）. BMAL1 and CLOCK，two essential components of the circadian clock，are involved in glucose homeostasis. PLoS biology 2，e377.

Rust，M.J.，Markson，J.S.，Lane，W.S.，F(xiàn)isher，D.S.和O'Shea，E.K.（2007）. Ordered phosphorylation governs oscillation of a three-protein circadian clock. Science 318，809-812.

Scheer，F(xiàn).A.，Hilton，M.F.，Mantzoros，C.S.和Shea，S.A.（2009）. Adverse metabolic and cardiovascular consequences of circadian misalignment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106，4453-4458.

Silver，A.C.，Arjona，A.，Walker，W.E.和Fikrig，E.（2012）. The circadian clock controls toll-like receptor 9-mediated innate and adaptive immunity. Immunity36，251-261.

So，A.Y.，Bernal，T.U.，Pillsbury，M.L.，Yamamoto，K.R.和Feldman，B.J.（2009）. Glucocorticoid regulation of the circadian clock modulates glucose homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106，17582-17587.

Sommer，F(xiàn).和Backhed，F(xiàn).（2013）. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nature reviews Microbiology 11，227-238.

Stecher，B.和Hardt，W.D.（2011）. Mechanisms controlling pathogen colonization of the gut. Current opinion in microbiology 14，82-91.

Stokkan，K.A.，Yamazaki，S.，Tei，H.，Sakaki，Y.和Menaker，M.（2001）. Entrainment of the circadian clock in the liver by feeding. Science 291，490-493.

Storch，K.F.，Lipan，O.，Leykin，I.，Viswanathan，N.，Davis，F(xiàn).C.，Wong，W.H.和Weitz，C.J.（2002）. Extensive and divergent circadian gene expression in liver and heart. Nature 417，78-83.

Suwazono，Y.，Dochi，M.，Sakata，K.，Okubo，Y.，Oishi，M.，Tanaka，K.，Kobayashi，E.，Kido，T.和Nogawa，K.（2008）. A longitudinal study on the effect of shift work on weight gain in male Japanese workers. Obesity 16，1887-1893.

Turek，F(xiàn).W.，Joshu，C.，Kohsaka，A.，Lin，E.，Ivanova，G.，McDearmon，E.，Laposky，A.，Losee-Olson，S.，Easton，A.，Jensen，D.R.,等人（2005）. Obesity and metabolic syndrome in circadian Clock mutant mice. Science 308，1043-1045.

Vollmers，C.，Gill，S.，DiTacchio，L.，Pulivarthy，S.R.，Le，H.D.和Panda，S.（2009）. Time of feeding and the intrinsic circadian clock drive rhythms in hepatic gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106，21453-21458.

Yamaguchi，Y.，Suzuki，T.，Mizoro，Y.，Kori，H.，Okada，K.，Chen，Y.，F(xiàn)ustin，J.M.，Yamazaki，F(xiàn).，Mizuguchi，N.，Zhang，J.,等人（2013）. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science 342，85-90.

Yu，X.，Rollins，D.，Ruhn，K.A.，Stubblefield，J.J.，Green，C.B.，Kashiwada，M.，Rothman，P.B.，Takahashi，J.S.和Hooper，L.V.（2013）. TH17 cell differentiation is regulated by the circadian clock. Science 342，727-730。

實(shí)施例2

人造甜味劑通過(guò)改變微生物叢誘導(dǎo)葡萄糖耐受不良

材料與方法

小鼠– 將C57Bl/6 WT成年雄性小鼠隨機(jī)分配（并非不知情）至處理組，并且在飲用水中給予商用人造甜味劑（基于糖精、三氯蔗糖或阿斯巴甜）或純糖精（Sigma Aldrich），并且飼喂高脂肪（HFD D12492， 60% Kcal來(lái)自脂肪，Research Diets）或標(biāo)準(zhǔn)多糖正常食物（NC）飲食（Harlan-Teklad）。比較組始終飼喂來(lái)自相同批次的飲食。對(duì)于抗生素處理，在小鼠的飲用水中給予環(huán)丙沙星（0.2gl^-1）和甲硝唑（1gl^-1）或萬(wàn)古霉素（0.5gl^-1）的組合。所有抗生素均得自Sigma Aldrich。成年雄性遠(yuǎn)交Swiss-Webster小鼠（無(wú)菌實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的小鼠品系）充當(dāng)糞便移植物的接受者，并且飼養(yǎng)在無(wú)菌隔離器（Park Biosciences）中。對(duì)于糞便抑制實(shí)驗(yàn)，在厭氧條件下，將200mg大便（來(lái)自小鼠團(tuán)塊或人拭子）重懸浮于5ml PBS中，渦旋3分鐘，且允許通過(guò)重力沉降2分鐘，接受者小鼠用200μl濾液進(jìn)行管飼，并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中維持標(biāo)準(zhǔn)NC飲食和水。

人造和熱量甜味劑-將下述商購(gòu)可得的NAS溶解于小鼠飲用水中，以獲得10%溶液：Sucrazit（5%糖精、95%葡萄糖）、Sucralite（5%三氯蔗糖）、Sweet’n Low Gold（4%阿斯巴甜）。10%葡萄糖（J.T. Baker）和10%蔗糖（Sigma Aldrich）溶液用作對(duì)照。所施用的溶解于水中的10%商用NAS的劑量大大低于其報(bào)告的毒性劑量（對(duì)于糖精、三氯蔗糖和阿斯巴甜分別為6.3gkg^{-1 51}、16gkg^{-1 52}和4gkg^{-1 53}）。對(duì)于用純糖精（Sigma Aldrich）進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)下述計(jì)算，使用1 mgml^-1溶液以便滿足FDA限定的糖精在人中的ADI（5 mgkg^-1）：

。

葡萄糖和胰島素耐量測(cè)試-小鼠在光階段期間禁食6小時(shí)，自由飲水。在飲用方案非水的所有小鼠組中，該方案在禁食期間和葡萄糖或胰島素耐量測(cè)試期間取代水。在用40mg葡萄糖（J.T. Baker）口服飼喂或用0.1Ukg^-1胰島素（Biological Industries）腹膜內(nèi)注射前一刻以及15、30、60、90和120分鐘后，將來(lái)自尾靜脈的血液用血糖計(jì)（Bayer）測(cè)量血糖水平。使用ELISA（Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit，Crystal Chem），在GTT起始前一刻收集的血清中測(cè)量血漿空腹胰島素水平。

代謝研究- 使用PhenoMaster系統(tǒng)（TSE-Systems，Bad Homburg，德國(guó)）測(cè)量食物和飲料攝入以及能量消耗，所述PhenoMaster系統(tǒng)由用于自動(dòng)化測(cè)量的靈敏飼喂傳感器的組合和基于光子束檢測(cè)并記錄動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)（包括在每個(gè)籠中的后腿站立和攀爬）的活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)組成。所有參數(shù)均連續(xù)且同時(shí)進(jìn)行測(cè)量。小鼠在數(shù)據(jù)采集之前在相同籠中單獨(dú)飼養(yǎng)訓(xùn)練。為了計(jì)算總熱量攝入，使用下述值：食物3kcalg^-1、蔗糖0.3938kcalml^-1、葡萄糖 0.4kcalml^-1、糖精 0.38kcalml^-1、三氯蔗糖 0.392kcalml^-1和阿斯巴甜 0.38kcalml^-1。

體外厭氧培養(yǎng)- 將來(lái)自未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的成年WT C57Bl/6雄性小鼠的合并糞便物在厭氧室（Coy Laboratory Products，75% N₂、20% CO₂、5% H₂）中重懸浮于5 ml PBS中，渦旋3分鐘，且允許通過(guò)重力沉降2分鐘。將500 ml上清液加入含有Chopped Meat Carbohydrate Broth，PR II（BD）和500 ml 5mgml-1糖精溶液或等體積PBS的管中。每3天，將500 ml培養(yǎng)物稀釋至含有糖精或PBS的新鮮培養(yǎng)基中。在9天后，將培養(yǎng)物用于無(wú)菌小鼠的接種。

分類學(xué)微生物叢分析 - 根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用MoBio PowerSoil試劑盒，處理冷凍的糞便樣品用于提取DNA。將1ng純化的糞便DNA用于細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序。涵蓋16S rRNA基因的可變區(qū)2（V2）的~365bp擴(kuò)增子通過(guò)使用下述帶條形碼引物來(lái)生成：Fwd 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO: 3），Rev 5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’（SEQ ID NO: 4）。隨后將反應(yīng)以等摩爾比合并，純化（PCR清潔試劑盒，Promega），并且用于Illumina MiSeq測(cè)序至至少18000個(gè)讀數(shù)/樣品的深度（平均讀數(shù)/樣品139148±5264（SEM））。隨后如所述的使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）分析流水線（版本1.8）來(lái)處理讀數(shù)。使用UCLUST算法和greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)將配對(duì)末端連接的序列分組成操作分類單位（OTU）。將在353bp的中值序列長(zhǎng)度上具有97%或更大的基于距離的相似性的序列指定至相同OTU。將樣品根據(jù)處理進(jìn)行分組。在每個(gè)分類水平（門-屬+ OTU水平）上分別進(jìn)行分析。對(duì)于每個(gè)分類群，在不同組之間進(jìn)行G測(cè)試。將P值針對(duì)多重假設(shè)檢驗(yàn)進(jìn)行FDR校正。

鳥槍法焦磷酸測(cè)序和測(cè)序映射- 如先前所述⁵⁷進(jìn)行，伴隨下述修飾：1ug DNA使用Covaris 5200系統(tǒng)（Covaris,Inc.，Woburn，MA，USA）進(jìn)行剪切，隨后為末端修復(fù)、與銜接子連接，8循環(huán)PCR擴(kuò)增（Kappa HiFi）和使用Illumina HiSeq測(cè)序至11773345個(gè)讀數(shù)/樣品的最低限度深度（平均讀數(shù)/樣品 20296086±637379（SEM），讀數(shù)長(zhǎng)度51 bp）。將Illumina序列讀數(shù)對(duì)人類微生物組項(xiàng)目（Human Microbiome Project）[www.hmpdacc.org/HMREFG/³²]的人微生物組參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行映射，并且使用GEM映射器⁵⁸與下述參數(shù)對(duì)腸微生物叢基因目錄³³進(jìn)行映射：

-m 3 –s 0 –q offset-33 –gem-quality-threshold 26

微生物物種豐度被測(cè)量為對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的單個(gè)物種映射的讀數(shù)分?jǐn)?shù)。由Pathoscope⁵⁹修改的EM算法用于測(cè)定對(duì)超過(guò)一個(gè)物種映射的讀數(shù)的正確指定。我們僅考慮對(duì)于其至少10%的基因組在至少一種生長(zhǎng)條件（糖精、水或葡萄糖）下被覆蓋（每個(gè)覆蓋框長(zhǎng)10,000-bp）的物種。根據(jù)可由目錄獲得的映射，對(duì)腸微生物基因目錄映射的讀數(shù)指定KEGG^34,35 ID?；螂S后對(duì)KEGG途徑映射，并且僅包括其基因覆蓋超過(guò)0.2的途徑。為了計(jì)算不同細(xì)菌對(duì)聚糖降解途徑的過(guò)度呈現(xiàn)的貢獻(xiàn)，，對(duì)腸微生物基因目錄中屬于聚糖降解途徑的基因映射的讀數(shù)被提取且再映射HMP參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找具有最高貢獻(xiàn)的病菌。

短鏈脂肪酸定量- 為了測(cè)定游離脂肪酸的水平，如先前所述⁶⁰執(zhí)行分析型HPLC（Agilent 1260）。簡(jiǎn)言之，以各種濃度（0.01-0.2 M）制備乙酸鹽、丁酸鹽和丙酸鹽（全部來(lái)自Sigma-Aldrich）的標(biāo)準(zhǔn)溶液。這些溶液使用HPLC進(jìn)行分析，相繼使用QTOF-Mass Spec，采用含0.1%甲酸的從0%到60% CH₃CN的不連續(xù)梯度的溶劑溶液，以獲得每種脂肪酸的校正曲線。以類似方式分析用0.1%甲酸溶解的糞便醫(yī)學(xué)樣品，以測(cè)量全部三種游離脂肪酸的總濃度。

分析人中的NAS消耗和臨床參數(shù)之間的關(guān)系：

將試驗(yàn)報(bào)告給臨床試驗(yàn)，標(biāo)識(shí)符NCT01892956。該研究并沒(méi)有必要或涉及隨機(jī)化。對(duì)于臨床營(yíng)養(yǎng)研究中的每名個(gè)體，在簽署知情同意書后，收集的參數(shù)包括BMI、身體周度、空腹血糖水平、一般性問(wèn)卷、全血細(xì)胞計(jì)數(shù)和一般的化學(xué)參數(shù)，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的長(zhǎng)期食物頻率問(wèn)卷^44,61,62。

長(zhǎng)期NAS消耗由對(duì)關(guān)于人造甜味劑的明確問(wèn)題的答案直接進(jìn)行定量，參與者在其食物頻率問(wèn)卷中填寫所述答案。隨后使用斯皮爾曼關(guān)聯(lián)（Spearman correlation）檢查NAS消耗和上述參數(shù)各自之間的關(guān)系，并且針對(duì)多重假設(shè)檢驗(yàn)進(jìn)行FDR校正。

統(tǒng)計(jì)學(xué)- 使用下述統(tǒng)計(jì)分析：在GTT中，分別地，雙因素ANOVA和Bonferroni事后分析用于不同時(shí)間點(diǎn)中的組間比較，并且單因素ANOVA和Tukey事后分析或不成對(duì)兩側(cè)斯氏t檢驗(yàn)用于多個(gè)或兩個(gè)組的AUC之間的比較。采用用于相等方差的Bartlett’s或F-檢驗(yàn)，并且在比較組的方差之間未觀察到顯著差異。對(duì)于分類數(shù)據(jù)的比較，使用G檢驗(yàn)并且P值對(duì)于多重假設(shè)檢驗(yàn)進(jìn)行FDR校正。在宏基因組學(xué)以及來(lái)自人的臨床和分類數(shù)據(jù)中，皮爾森和斯皮爾曼用于關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)，并且惠特尼U用于比較組間的臨床參數(shù)。p<0.05在所有分析中視為顯著的（*指示p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001）。在所有有關(guān)實(shí)驗(yàn)對(duì)象組中，符號(hào)或水平線代表平均值和誤差條S.E.M。對(duì)于小鼠實(shí)驗(yàn)，群組大小匹配所述實(shí)驗(yàn)的通常實(shí)踐。對(duì)于人實(shí)驗(yàn)，選擇樣品大小以驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)分析。不從分析中排除小鼠或數(shù)據(jù)點(diǎn)。在人研究中，包括注冊(cè)的所有年齡大于18歲的人。排除標(biāo)準(zhǔn)包括妊娠。

結(jié)果

長(zhǎng)期食用無(wú)熱量人造甜味劑加劇葡萄糖耐受不良

為了測(cè)定NAS對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的作用，我們將糖精、三氯蔗糖或阿斯巴甜的商用制劑加入消瘦的10周齡C57Bl/6小鼠的飲用水中（圖15A）。因?yàn)樗腥N商用NAS均含有~5%甜味劑和~95%葡萄糖，所以我們使用僅飲用水或者補(bǔ)充有葡萄糖或蔗糖的水的小鼠作為對(duì)照。值得注意的是，在第11周時(shí)，消耗水、葡萄糖和蔗糖的三個(gè)小鼠組表現(xiàn)出可比較的葡萄糖耐量曲線，而所有三個(gè)NAS消耗小鼠組發(fā)生明顯的葡萄糖耐受不良（p<0.001，圖16A-B）。

因?yàn)樘蔷哂凶畲笮?yīng)，所以我們進(jìn)一步研究其作為原型人造甜味劑的作用。為了確證在肥胖背景下的發(fā)現(xiàn)，我們給C57Bl/6小鼠飼喂高脂肪飲食（HFD，60% Kcal來(lái)自脂肪），而將食用商用糖精或純葡萄糖的作為對(duì)照（圖15B）。如在消瘦狀態(tài)中，與對(duì)照小鼠組相比較，飼喂HFD和商用糖精的小鼠發(fā)生葡萄糖耐受不良（p<0.03，圖16C和17A）。為了檢查純糖精對(duì)葡萄糖耐受不良的影響，我們跟蹤10周齡C57Bl/6小鼠的群組，所述小鼠飼喂HFD且通過(guò)向其飲用水中加入0.1mgml^-1純糖精提供營(yíng)養(yǎng)（圖15C）。這個(gè)劑量對(duì)應(yīng)于在人中的FDA每日容許攝入量（ADI）（5mgkg^-1，調(diào)整至小鼠重量，參見(jiàn)方法）。與商用糖精一樣，這個(gè)更低的純糖精劑量與早在HFD起始后5周開始的葡萄糖耐量受損相關(guān)（p<0.0002，圖16D和17B）。類似地，與對(duì)照相比較，用或不用0.1mgml^-1純糖精提供營(yíng)養(yǎng)的HFD飼喂的遠(yuǎn)交Swiss Webster小鼠（圖15D）在5周糖精暴露后表現(xiàn)出顯著的葡萄糖耐受不良（p<0.03，圖17C-D）。

在代謝籠中NC-或HFD-飼喂的小鼠的代謝概況分析包括液體和進(jìn)食、氧消耗、步行距離和能量消耗，顯示了在NAS和對(duì)照飲用小鼠之間的相似測(cè)量結(jié)果（圖18和19）。在正常食物（NC）和HFD背景下，空腹血清胰島素水平和胰島素耐量在食用NAS或熱量甜味劑的所有小鼠組中也是相似的（圖20）。綜上，這些結(jié)果表明在消瘦和肥胖兩種狀態(tài)下，NAS在一系列制劑、劑量、小鼠品系和平行人條件的飲食中均促進(jìn)代謝紊亂。

NAS誘導(dǎo)的葡萄糖耐受不良由腸微生物叢介導(dǎo)

因?yàn)轱嬍痴{(diào)節(jié)腸微生物叢¹⁵，并且微生物叢改變對(duì)宿主生理學(xué)和代謝具有極大影響，所以本發(fā)明人測(cè)試了微生物叢是否可以調(diào)節(jié)觀察到的NAS效應(yīng)。為此，他們用含環(huán)丙沙星（0.2gl^-1）和甲硝唑（1gl^-1）的革蘭氏陰性靶向的廣譜抗生素方案（指定為‘抗生素A’）處理在消瘦和HFD狀態(tài)下食用商用或純NAS的小鼠組（圖15A、C），同時(shí)將小鼠維持在其飲食和甜味劑補(bǔ)充方案上。值得注意的是，在抗生素處理4周后，飲用NAS的小鼠和對(duì)照之間的葡萄糖耐受不良中的差異在消瘦（圖16A-B）和肥胖（圖16D和圖17B）兩種狀態(tài)下均被消除。用革蘭氏陽(yáng)性靶向抗生素萬(wàn)古霉素（‘抗生素B’，0.5gl^-1，圖15A-B）觀察到類似效應(yīng)。這些結(jié)果提示NAS誘導(dǎo)的葡萄糖耐受不良由對(duì)共生微生物叢的改變介導(dǎo)，其中包含來(lái)自多樣細(xì)菌分類群的貢獻(xiàn)。

為了測(cè)試微生物叢作用是否是原因性的，通過(guò)將來(lái)自飲用商用糖精或葡萄糖（對(duì)照）的NC飲食的小鼠的微生物叢配置轉(zhuǎn)移到食用NC的無(wú)菌小鼠內(nèi)，進(jìn)行糞便移植實(shí)驗(yàn)（圖15E）。值得注意的是，在轉(zhuǎn)移后6天的測(cè)定中，與對(duì)照（葡萄糖）微生物叢接受者相比較，商用糖精相關(guān)微生物叢的接受者顯示出葡萄糖耐量受損（p<0.03，圖16E和17E）。轉(zhuǎn)移飲用水或純糖精的HFD消耗小鼠的微生物叢組合物再現(xiàn)了葡萄糖耐受不良表型（p<0.004，圖16F和17F）。總之，這些結(jié)果確定通過(guò)NAS消耗誘導(dǎo)的代謝紊亂由腸道微生物叢介導(dǎo)。

NAS消耗介導(dǎo)對(duì)微生物叢的不同的組成和功能改變

本發(fā)明人接下來(lái)通過(guò)測(cè)序其16S rRNA基因檢查各個(gè)小鼠組的糞便微生物叢組成。飲用糖精的小鼠具有不同的微生物叢組成，其與其起始微生物叢配置和在第11周時(shí)的所有對(duì)照組分開聚簇（圖16G）。同樣地，來(lái)自食用糖精的供體小鼠的大便的GF接受者的微生物叢與飲用葡萄糖的供體大便的GF接受者分開聚簇（圖16H）。與所有對(duì)照組相比較，食用糖精小鼠的微生物叢展示相當(dāng)大的生態(tài)失調(diào)，其中>40個(gè)操作分類單位（OTU）的豐度顯著改變（對(duì)于每個(gè)OTU，F(xiàn)DR校正的p值< 0.05，圖21）。許多相對(duì)豐度增加的分類群屬于擬桿菌屬和梭菌目，而梭菌目的其他成員連同羅伊乳桿菌構(gòu)成了呈現(xiàn)不足的分類群中的大多數(shù)，并且反映在來(lái)自食用糖精的供體大便的GF接受者中（圖21，右列）。同樣地，在食用純糖精和HFD的小鼠中觀察到生態(tài)失調(diào)?？傊?，這些結(jié)果證實(shí)在各種制劑、劑量和飲食中的糖精消耗誘導(dǎo)具有總體相似的配置的生態(tài)失調(diào)。

為了研究NAS消耗的功能后果，與消耗葡萄糖或水的對(duì)照小鼠相比較，在商用糖精消耗之前和11周之后進(jìn)行糞便樣品的鳥槍法宏基因組測(cè)序。為了比較相對(duì)物種豐度，測(cè)序讀數(shù)對(duì)人微生物組參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行映射¹⁶。與16S rRNA分析一致，糖精處理誘導(dǎo)微生物相對(duì)物種豐度中的最大變化（圖22A，本文下文的表1；F檢驗(yàn)p值<10^-10）。這些變化不太可能是水平基因轉(zhuǎn)移或弱覆蓋的基因組的人為現(xiàn)象，因?yàn)樵谡麄€(gè)細(xì)菌基因組長(zhǎng)度的大部分中觀察到相對(duì)豐度的變化，如通過(guò)一種過(guò)度呈現(xiàn)的物種（脆弱擬桿菌，圖23A）和一種呈現(xiàn)不足的物種（A. muciniphila，圖23B）例示的。

表1

本發(fā)明人接下來(lái)將宏基因組讀數(shù)對(duì)腸微生物基因目錄進(jìn)行映射，將讀數(shù)映射平均地劃分至不止一種基因，并且隨后將基因分組至KEGG途徑中。檢查具有基因覆蓋超過(guò)0.2的途徑（115個(gè)途徑），途徑豐度的變化在食用商用糖精和食用葡萄糖的小鼠之間呈負(fù)相關(guān)（R=-0.45，p<10^-6，圖22B）。因?yàn)樯逃锰蔷?5%葡萄糖組成，所以這些結(jié)果表明糖精極大地影響微生物叢功能。值得注意的是，在食用糖精小鼠中過(guò)度表現(xiàn)的途徑包括聚糖降解途徑的劇烈增加（圖22C-D），在該途徑中聚糖發(fā)酵以形成各種化合物包括短鏈脂肪酸（SCFA）¹⁷。這些途徑顯著增強(qiáng)能量收獲并且其富集先前已與小鼠¹¹和人¹⁸中的肥胖相關(guān)聯(lián)，其中SCFA可能充當(dāng)宿主中的從頭葡萄糖和脂肪合成的前體和/或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子¹⁹。為了鑒定作為基礎(chǔ)的細(xì)菌，本發(fā)明人通過(guò)其起源細(xì)菌注釋對(duì)聚糖降解途徑映射的每一個(gè)讀數(shù)。這些途徑中的許多增加可歸于源自5個(gè)革蘭氏陰性和陽(yáng)性物種的讀數(shù)，其中兩個(gè)屬于擬桿菌屬（圖22E），與16S rRNA分析中觀察到的食用糖精小鼠中的這個(gè)屬的豐度急劇增加一致（圖21）。因而，與對(duì)照失用葡萄糖小鼠相比較，在大便中測(cè)量的SCFA丙酸鹽和乙酸鹽的水平在食用商用糖精小鼠中明顯更高（圖22F-G），反映出通過(guò)具有和不具有NAS暴露的長(zhǎng)期葡萄糖消耗介導(dǎo)的差異效應(yīng)。丁酸鹽水平在組間是相似的（數(shù)據(jù)未示出）。

除聚糖降解之外，并且與用T2DM對(duì)人的先前研究一致^13,20，其他途徑在食用糖精小鼠的微生物組中富集，包括淀粉和蔗糖代謝，果糖和甘露糖代謝，以及葉酸、甘油酯和脂肪酸生物合成（本文下文表2），而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑在食用糖精小鼠中表現(xiàn)不足（圖23C）。消耗HFD和純糖精的小鼠的特征在于多重富集途徑（圖23D），包括抗壞血酸和醛糖二酸鹽代謝（先前報(bào)告為在瘦素受體缺陷的糖尿病小鼠中富集²¹）、脂多糖生物合成（與代謝內(nèi)毒素血癥有關(guān)²²）和細(xì)菌趨化性（先前報(bào)告為在肥胖小鼠中富集¹¹）。

表2

總之，糖精消耗導(dǎo)致微生物叢中的不同飲食依賴性功能改變，包括由若干增加的分類群促成的聚糖降解中的NC相關(guān)擴(kuò)張，最終導(dǎo)致升高的大便SCFA水平，這是微生物能量收獲增加的特征¹¹。

葡萄糖耐受不良直接由糖精誘導(dǎo)的腸微生物叢調(diào)節(jié)介導(dǎo)

為了測(cè)定糖精是否直接影響腸微生物叢，在糖精（5mgml^-1）或?qū)φ丈L(zhǎng)培養(yǎng)基的存在下，本發(fā)明人在嚴(yán)格厭氧條件下（75% N₂、20% CO₂、5% H₂）培養(yǎng)來(lái)自未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的小鼠的糞便物。通過(guò)管飼將來(lái)自溫育第9天的培養(yǎng)物施用給無(wú)菌小鼠（圖24A）。含糖精的體外大便培養(yǎng)物誘導(dǎo)擬桿菌門的增加和厚壁菌門中的減少（擬桿菌門89%相對(duì)于70%，厚壁菌門6%相對(duì)于22%，圖24B）。與接受對(duì)照培養(yǎng)物的無(wú)菌小鼠相比較，將這種體外糖精處理的微生物叢配置轉(zhuǎn)移到無(wú)菌小鼠內(nèi)導(dǎo)致顯著更高的葡萄糖耐受不良（p<0.002）（圖25A和24C。類似于補(bǔ)充有糖精的厭氧培養(yǎng)的組成，這種培養(yǎng)配置的無(wú)菌接受者的特征在于擬桿菌屬成員的過(guò)度表現(xiàn)，以及幾個(gè)梭菌目的表現(xiàn)不足（圖25B和表3）。

表3

鳥槍法宏基因組測(cè)序分析揭示體外糖精處理誘導(dǎo)與食用商用糖精的小鼠中發(fā)現(xiàn)的那些相似的功能改變（圖21C，p<10^-4），其中聚糖降解途徑在兩個(gè)背景下均為高度富集的。在兩個(gè)背景下均高度富集的其他途徑包括涉及鞘脂代謝的先前顯示為在非肥胖糖尿病小鼠的微生物組中過(guò)度表現(xiàn)的那些²³，以及常見(jiàn)的表現(xiàn)不足的途徑包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)（圖25C和圖23C，右列）。

綜上，這些結(jié)果證實(shí)糖精直接調(diào)節(jié)微生物組的組成和功能且誘導(dǎo)生態(tài)失調(diào)，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物宿主中的下游葡萄糖耐受不良表型。

在人中的NAS消耗與葡萄糖耐量受損相關(guān)

為了研究NAS在人中的效應(yīng)，比較在進(jìn)行中的臨床營(yíng)養(yǎng)研究中從381個(gè)非糖尿病個(gè)體（44%男性和56%女性；年齡43.3±13.2）收集的數(shù)據(jù)中的長(zhǎng)期NAS消耗（基于經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的食物頻率問(wèn)卷，參見(jiàn)方法）和各種臨床參數(shù)之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)在NAS消耗和幾種代謝綜合征相關(guān)臨床參數(shù)之間的顯著正相關(guān)（本文下文表4），包括增加的重量和腰臀比（向心性肥胖的量度）；更高的空腹血糖、糖基化血紅蛋白（HbA1C%）和葡萄糖耐量測(cè)試（GTT，葡萄糖耐量受損的量度）和升高的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，其是肝臟損傷的量度，所述肝臟損傷在這個(gè)背景下可能是繼發(fā)于非酒精性脂肪肝?。４送?，當(dāng)比較高NAS消費(fèi)者（40名個(gè)體）與非NAS消費(fèi)者（236名個(gè)體，圖26A，秩和p<0.002）的亞組時(shí)，指示經(jīng)過(guò)前3個(gè)月的葡萄糖濃度的糖基化血紅蛋白（HbA1C%）的水平顯著增加。當(dāng)針對(duì)BMI水平進(jìn)行校正時(shí)，這種增加保持顯著（秩和p<0.015）。在這個(gè)群組中，表征172名隨機(jī)選擇的個(gè)體中的16S rRNA。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)在多重分類學(xué)實(shí)體和NAS消耗之間的統(tǒng)計(jì)上顯著的正相關(guān)，包括腸桿菌科（皮爾森r=0.36，F(xiàn)DR校正的p<10^-6）、δ變形球菌綱（皮爾森r=0.33，F(xiàn)DR校正的p<10^-5）和放線菌門（皮爾森r=0.27，F(xiàn)DR校正的p<0.0003，表5）。重要的是，未檢測(cè)到OTU豐度和BMI之間的統(tǒng)計(jì)上顯著的關(guān)聯(lián)，說(shuō)明上述關(guān)聯(lián)不是由于NAS消費(fèi)者的不同BMI所造成的。

表4

表5

最后，作為對(duì)人NAS消耗和血糖控制之間的關(guān)系是否有因果關(guān)系的初始評(píng)價(jià)，對(duì)通常不食用NAS或含NAS食物的七名健康志愿者（5名男性和2名女性，年齡28-36）隨訪一周。在這周期間，參與者在第2-7天時(shí)食用FDA的每日最大容許攝入量（ADI）的商用糖精（5mgkg^-1）作為等價(jià)于120mg的3個(gè)分份日劑量，并且通過(guò)連續(xù)血糖測(cè)量和每日GTT進(jìn)行監(jiān)測(cè)（圖27A）。值得注意的是，即使在這個(gè)短期7天暴露期中，在食用NAS后5-7天，大多數(shù)個(gè)體（7個(gè)中的4個(gè)）也發(fā)生顯著更弱的升糖反應(yīng)（下文稱為‘NAS應(yīng)答者’），與其在第1-4天時(shí)的個(gè)體升糖反應(yīng)相比較（圖26B-C和27B，p<0.001）。3名NAS無(wú)應(yīng)答者無(wú)一表現(xiàn)出改善的葡萄糖耐受（圖26B、D和27C）。

如通過(guò)16S rRNA分析評(píng)價(jià)的，在食用NAS之前和之后（分別為圖26E和27D），NAS應(yīng)答者的微生物組配置與無(wú)應(yīng)答者均不同地聚簇。此外，來(lái)自無(wú)應(yīng)答者的微生物組的特征在于在研究周期間組成很少變化，而在NAS應(yīng)答者中觀察到巨大的組成變化（圖26F和27E）。為了研究這種NAS誘導(dǎo)的生態(tài)失調(diào)是否是產(chǎn)生葡萄糖耐受不良的原因，將來(lái)自NAS暴露之前（第1天，D1）或之后（第7天，D7）的大便從兩個(gè)NAS應(yīng)答者和兩個(gè)NAS無(wú)應(yīng)答者轉(zhuǎn)移到飼喂NC的無(wú)菌小鼠的組內(nèi)。實(shí)際上，與注明使用由相同的NAS應(yīng)答個(gè)體轉(zhuǎn)移的D1大便的應(yīng)答相比較，來(lái)自NAS應(yīng)答者的NAS暴露后（D7）大便的轉(zhuǎn)移在接受者GF小鼠中誘導(dǎo)顯著的葡萄糖耐受不良（圖26G和27F，P<0.004和27G-H，P<0.02）。相比之下，從兩個(gè)NAS無(wú)應(yīng)答者轉(zhuǎn)移到GF小鼠內(nèi)的D7大便誘導(dǎo)正常葡萄糖耐受，這與用來(lái)自相同‘無(wú)應(yīng)答’個(gè)體的D1大便轉(zhuǎn)移的小鼠無(wú)法區(qū)別（圖26H和圖27I-K）。用‘應(yīng)答者’微生物組移植的GF小鼠再現(xiàn)了部分供體糖精誘導(dǎo)的生態(tài)失調(diào)，包括擬桿菌屬脆弱擬桿菌（擬桿菌目）和魏斯氏菌屬食物魏斯氏菌（乳桿菌目）相對(duì)增加20倍，以及分節(jié)絲狀菌（梭菌目）增加~10倍（圖27I）。

結(jié)論

概括起來(lái)，我們的結(jié)果表明在小鼠和人兩者中的NAS消耗均增強(qiáng)葡萄糖耐受不良的風(fēng)險(xiǎn)，并且這些不利的代謝效應(yīng)由微生物叢的組成和功能的調(diào)節(jié)介導(dǎo)。值得注意的是，在食用NAS后改變的細(xì)菌分類群中的幾個(gè)先前與人中的T2DM相關(guān)^13,20，包括擬桿菌屬的過(guò)度表現(xiàn)和梭菌目的表現(xiàn)不足。革蘭氏陽(yáng)性和陰性分類群兩者均促成NAS誘導(dǎo)的表型（圖16A-B），并且富含聚糖降解途徑（圖21），先前與增強(qiáng)的能量收獲聯(lián)系（圖22C-D）^11,24。這表明精細(xì)的種間微生物協(xié)作可以在功能上協(xié)調(diào)腸生態(tài)系統(tǒng)，且促成在趨異的環(huán)境條件（例如正常食物相對(duì)于高脂肪飲食條件）下重要的群落活性。另外，我們證明食用糖精小鼠的宏基因組富含先前顯示在小鼠和人中與糖尿病²³或肥胖¹¹相關(guān)的多重另外途徑，包括鞘脂代謝和脂多糖生物合成²⁵。

來(lái)自短期和長(zhǎng)期人類NAS消費(fèi)者群組的結(jié)果（圖26、圖27和表4-5）表明人類個(gè)體表現(xiàn)出對(duì)NAS的個(gè)人化應(yīng)答，這可能起源于其微生物叢組成和功能中的差異。我們的研究中注意到的變化可以進(jìn)一步在食用不同人飲食的小鼠中得到證明²⁶。人造甜味劑被廣泛引入我們的飲食內(nèi)，目的在于減少熱量攝入且使血糖水平標(biāo)準(zhǔn)化，而不犧牲人的‘甜食喜好’。連同在人營(yíng)養(yǎng)中出現(xiàn)的其他主要轉(zhuǎn)變，NAS消耗的增加與肥胖和糖尿病流行的急劇增加一致。我們的發(fā)現(xiàn)表明NAS可能已直接促成增強(qiáng)它們自身所旨在對(duì)抗的那些流行病。此外，我們的結(jié)果指出需要開發(fā)針對(duì)個(gè)體定制的新營(yíng)養(yǎng)策略，同時(shí)綜合腸微生物叢的組成和功能的個(gè)人化差異。

實(shí)施例2的參考文獻(xiàn)

1　Gardner，C.等人Nonnutritive Sweeteners: Current Use and Health Perspectives A Scientific Statement from the American Heart Association and the American Diabetes Association. Diabetes care 35，1798-1808（2012）.

2　Fitch，C. & Keim，K. S. Position of the academy of nutrition and dietetics: use of nutritive and nonnutritive sweeteners. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics 112，739-758（2012）.

3　Tordoff，M. G. & Alleva，A. M. Effect of drinking soda sweetened with aspartame or high-fructose corn syrup on food intake and body weight. The American journal of clinical nutrition 51，963-969（1990）.

4　Horwitz，D. L.，McLane，M. & Kobe，P. Response to single dose of aspartame or saccharin by NIDDM patients. Diabetes Care 11，230-234（1988）.

5　Nettleton，J. A.等人Diet soda intake and risk of incident metabolic syndrome and type 2 diabetes in the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis（MESA）. Diabetes Care 32，688-694（2009）.

6　Roberts，A.，Renwick，A. G.，Sims，J. & Snodin，D. J. Sucralose metabolism and pharmacokinetics in man. Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association 38 Suppl 2，S31-41（2000）.

7　Byard，J. L. & Goldberg，L. The metabolism of saccharin in laboratory animals. Food and cosmetics toxicology 11，391-402（1973）.

8　Clemente，J. C.，Ursell，L. K.，Parfrey，L. W. & Knight，R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. Cell 148，1258-1270，doi:10.1016/j.cell.2012.01.035（2012）.

9　Claesson，M. J.等人Gut microbiota composition correlates with diet and health in the elderly. Nature 488，178-184，doi:10.1038/nature11319（2012）.

10　Muegge，B. D.等人Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science 332，970-974（2011）.

11　Turnbaugh，P. J.等人An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 444，1027-1131（2006）.

12　Ley，R. E.，Turnbaugh，P. J.，Klein，S. & Gordon，J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature 444，1022-1023（2006）.

13　Qin，J.等人A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes. Nature 490，55-60（2012）.

14　Henao-Mejia，J.等人Inflammasome-mediated dysbiosis regulates progression of NAFLD and obesity. Nature 482，179-185（2012）.

15　David，L. A.等人Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Nature（2013）.

16　Peterson，J.等人The NIH human microbiome project. Genome research 19，2317-2323（2009）.

17　Koropatkin，N. M.，Cameron，E. A. & Martens，E. C. How glycan metabolism shapes the human gut microbiota. Nature reviews. Microbiology 10，323-335，doi:10.1038/nrmicro2746（2012）.

18　Schwiertz，A.等人Microbiota and SCFA in lean and overweight healthy subjects. Obesity（Silver Spring）18，190-195，doi:10.1038/oby.2009.167（2010）.

19　Bergman，E. N. Energy contributions of volatile fatty acids from the gastrointestinal tract in various species. Physiological reviews 70，567-590（1990）.

20　Karlsson，F(xiàn). H.等人Gut metagenome in European women with normal，impaired and diabetic glucose control. Nature 498，99-103（2013）.

21　Connor，S. C.，Hansen，M. K.，Corner，A.，Smith，R. F. & Ryan，T. E. Integration of metabolomics and transcriptomics data to aid biomarker discovery in type 2 diabetes. Molecular bioSystems 6，909-921，doi:10.1039/b914182k（2010）.

22　Cani，P. D.等人Changes in gut microbiota control metabolic endotoxemia-induced inflammation in high-fat diet-induced obesity and diabetes in mice. Diabetes 57，1470-1481，doi:10.2337/db07-1403（2008）.

23　Markle，J. G.等人Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science 339，1084-1088，doi:10.1126/science.1233521（2013）.

24　Sonnenburg，J. L.等人Glycan foraging in vivo by an intestine-adapted bacterial symbiont. Science 307，1955-1959（2005）.

25　Cani，P. D.等人Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance. Diabetes 56，1761-1772，doi:10.2337/db06-1491（2007）.

26　Smith，M. I.等人Gut microbiomes of Malawian twin pairs discordant for kwashiorkor. Science 339，548-554，doi:10.1126/science.1229000（2013）。

實(shí)施例3

腸微生物叢生物地理學(xué)和功能的日間波動(dòng)全面編程宿主晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄組

材料與方法

小鼠：C57Bl/6小鼠購(gòu)自Harlan，并且在用于實(shí)驗(yàn)之前，允許適應(yīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物設(shè)施2周。小鼠保持在嚴(yán)格的光暗周期下，其中光在6am時(shí)打開，并且在6pm時(shí)關(guān)閉。在所有實(shí)驗(yàn)中，使用年齡和性別匹配的小鼠。小鼠在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)為8-9周齡。一般地，同時(shí)使用雄性和雌性小鼠。大便樣品、糞便內(nèi)容物和組織樣品新鮮且在小鼠個(gè)體的基礎(chǔ)上進(jìn)行收集。新鮮樣品收集在管中，在收集后在液氮中立即冷凍，并且貯存于-80℃下直至分離RNA或DNA時(shí)。在食物定時(shí)實(shí)驗(yàn)中，小鼠在標(biāo)準(zhǔn)光暗條件（6am至6pm）下飼養(yǎng)，但分別僅在光或暗階段期間獲得食物，持續(xù)2周。對(duì)于抗生素處理，在小鼠的飲用水中給予萬(wàn)古霉素（0.5 g/l）、氨芐青霉素（1 g/l）、卡那霉素（1 g/l）和甲硝唑（1 g/l）的組合。所有抗生素均得自Sigma Aldrich?？股剡B續(xù)給予共一周。對(duì)于涉及限菌小鼠的實(shí)驗(yàn)，將無(wú)菌Swiss Webster小鼠飼養(yǎng)在無(wú)菌隔離器中。所有實(shí)驗(yàn)程序均由當(dāng)?shù)豂ACUC批準(zhǔn)。

RNA-seq：將組織保存在RNAlater溶液（Ambion）中，且隨后在Trizol試劑（Invitrogen）中勻漿化。RNA根據(jù)制造商的說(shuō)明書進(jìn)行純化。將400 ng總RNA用于文庫(kù)制備。mRNA用12 μl Dynabeads寡核苷酸（dT）（Life technologies）進(jìn)行捕獲，并且根據(jù)制造商的指導(dǎo)進(jìn)行洗滌。純化的信使RNA在70℃下用10 μl 10 mM Tris-Cl pH 7.5進(jìn)行洗脫。cDNA由每種樣品的1μl mRNA生成。每種樣品的cDNA數(shù)量通過(guò)肌動(dòng)蛋白B基因的qPCR進(jìn)行評(píng)估，并且隨后獲取每種樣品的等價(jià)量的mRNA用于RNAseq文庫(kù)構(gòu)建。文庫(kù)構(gòu)建在96孔板形式中執(zhí)行。首先，為了打開二級(jí)RNA結(jié)構(gòu)且允許RT引物的退火，樣品在72℃下溫育3分鐘，并且立即轉(zhuǎn)移至4℃。隨后，RT反應(yīng)混合物（10 mM DTT、4 mM dNTP、在50 mM Tris-HCl（pH 8.3）中的2.5 U/μl Superscript III RT酶、75 mM KCl、3 mM MgCl₂）加入96孔板的每個(gè)孔內(nèi)，并且將反應(yīng)混合。96孔板隨后向下旋轉(zhuǎn)且移動(dòng)到循環(huán)儀（Eppendorf）內(nèi)用于下述溫育：在42℃下2分鐘、在50℃下50分鐘、在85℃下5分鐘。將索引樣品與等價(jià)量的cDNA合并，并且用1.4x體積的SPRI珠純化產(chǎn)物。文庫(kù)完成且通過(guò)12循環(huán)PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，使用0.5 μM P5_Rd1和P7_Rd2引物和PCR預(yù)混合物（Kapa Biosystems）。正向引物含有Illumina P5-Read1序列，并且反向引物含有P7-Read2序列。擴(kuò)增的合并文庫(kù)用0.7x體積的SPRI微珠進(jìn)行純化，以去除引物剩余物。文庫(kù)濃度用Qubit熒光計(jì)（Life Technologies）進(jìn)行測(cè)量，并且平均分子大小用2200 TapeStation儀器（Agilent）進(jìn)行測(cè)定。文庫(kù)使用Illumina HiSeq 1500進(jìn)行測(cè)序。讀數(shù)如先前所述（Lavin等人，2014）進(jìn)行分析，并且針對(duì)總讀數(shù)數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化用于在所有樣品間的相等覆蓋。僅考慮分析具有超過(guò)10個(gè)讀數(shù)/樣品的基因。

細(xì)菌DNA的定量：通過(guò)充分沖洗腸道管腔以去除非粘附共生細(xì)菌收獲管腔和粘膜粘附群落。使用MoBio PowerSoil試劑盒從管腔和粘膜部分中提取DNA。使用來(lái)自大腸桿菌（E.coli）K12的已知DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DNA濃度。使用SYBR快速混合物（Kapa Biosystems），使用鑒定V6 16S基因的不同區(qū)域的引物進(jìn)行16S qPCR。隨后將樣品中的細(xì)菌的絕對(duì)數(shù)目約計(jì)為細(xì)菌的樣品/DNA分子量中的DNA量。

掃描電子顯微鏡檢查：用含有在0.1 M二甲胂酸鈉中的2%戊二醛和3% PFA的固定劑灌注小鼠。結(jié)腸樣品充分洗滌掉糞便物且固定1-2小時(shí)。樣品在二甲胂酸鈉緩沖液中清洗三次，并且在1%四氧化鋨中后固定1小時(shí)，在1%乙酸雙氧鈾中染色再一小時(shí)，隨后清洗，脫水且使用臨界點(diǎn)干燥進(jìn)行干燥。樣品隨后進(jìn)行金包被且在ULTRA 55 FEG（ZEISS）中察看。對(duì)于圖像定量，計(jì)數(shù)在10個(gè)隨機(jī)選擇的視野/樣品上的細(xì)菌數(shù)目且求平均值。

代謝組學(xué)：代謝組學(xué)分析通過(guò)Metabolon，Inc（Morrisville，NC）進(jìn)行。樣品通過(guò)超高性能液相層析-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）和氣相層析-質(zhì)譜法（GC-MS）進(jìn)行分析。平臺(tái)的LC/MS部分基于Waters ACQUITY超高效液相層析（UPLC）和Thermo Scientific Q-Exactive高分辨率/精準(zhǔn)質(zhì)譜儀，其與加熱電噴霧電離（HESI-II）源和在35,000質(zhì)量分辨率下操作的Orbitrap質(zhì)量分析器接口。使樣品提取物干燥，隨后在酸性或堿性LC-相容溶劑中重構(gòu)，所述溶劑各自含有固定濃度的8個(gè)或更多個(gè)注射標(biāo)準(zhǔn)，以確保注射和層析一致性。使用單獨(dú)的專用柱（Waters UPLC BEH C18-2.1x100 mm，1.7 μm），在兩次獨(dú)立注射中，使用酸性陽(yáng)離子最佳化條件分析一個(gè)等分試樣，并且使用堿性陰離子最佳化條件分析另一等分試樣。使用水和含有0.1%甲酸的甲醇，從C18柱中梯度洗脫在酸性條件下重構(gòu)的提取物。使用甲醇和水，然而，連同6.5mM碳酸氫銨，從C18中類似地洗脫堿性提取物。使用由水和乙腈與10mM甲酸銨組成的梯度，在從HILIC柱（Waters UPLC BEH Amide 2.1x150 mm，1.7 μm）中洗脫后，第三等分試樣經(jīng)由負(fù)電離進(jìn)行分析。MS分析使用動(dòng)態(tài)洗脫在MS和數(shù)據(jù)依賴性MS2掃描之間交替，并且掃描范圍為80-1000 m/z。在干燥氮下使用雙三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺衍生之前，將用于GC-MS分析的樣品在真空下干燥至少18小時(shí)。將衍生的樣品在5%二苯基/ 95%二甲基聚硅氧烷熔融石英柱（20 m x 0.18 mm ID；0.18 um薄膜厚度）上分離，使用氦作為載氣和在17.5分鐘時(shí)期內(nèi)從60°到340℃的溫度速變。樣品在Thermo-Finnigan Trace DSQ快速掃描單四極桿質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，使用電子碰撞電離（EI）且在單位重量分辨力下操作。掃描范圍為50–750 m/z。將原始數(shù)據(jù)提取，鑒定峰且進(jìn)行QC加工?；衔锿ㄟ^(guò)與純化標(biāo)準(zhǔn)的文庫(kù)條目或重現(xiàn)性未知適體比較進(jìn)行鑒定。此外，生物化學(xué)鑒定基于三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：在所提出的鑒定的窄RI窗內(nèi)的保留指數(shù)，與文庫(kù)準(zhǔn)確質(zhì)量匹配至+/- 0.005 amu，以及在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)之間的MS/MS正向和反向得分。MS/MS得分基于實(shí)驗(yàn)譜中存在的離子與文庫(kù)譜中存在的離子的比較。使用曲線下面積鑒定峰。對(duì)于跨越多天的研究，進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化步驟以校正由儀器日間調(diào)諧差異所造成的變化。對(duì)于分析，依據(jù)原始面積計(jì)數(shù)對(duì)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并且其后重新標(biāo)定以將中值設(shè)為等于1。

分類學(xué)微生物叢分析：通過(guò)將結(jié)腸連續(xù)洗滌除掉其管腔內(nèi)容物，隨后將粘膜層在液氮中速凍，來(lái)獲得粘附細(xì)菌群落。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用MoBio PowerSoil試劑盒，處理冷凍樣品用于提取DNA。將1ng純化的糞便DNA用于細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序。涵蓋16S rRNA基因的可變區(qū)1/2（V1/2）的擴(kuò)增子通過(guò)使用下述帶條形碼引物來(lái)生成：Fwd 5’-NNNNNNNNAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO: 1），Rev 5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’（SEQ ID NO: 2），其中N代表?xiàng)l形碼基礎(chǔ)。隨后將反應(yīng)以等摩爾比合并，純化（PCR清潔試劑盒，Promega）且用于Illumina MiSeq測(cè)序。采用500 bp配對(duì)末端測(cè)序。內(nèi)部腳本用于裝配配對(duì)末端對(duì)數(shù)。在所有實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)90%的裝配率。隨后使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，www.qiime.org）分析流水線來(lái)處理讀數(shù)（Caporaso等人，2010）。簡(jiǎn)言之，將指示對(duì)應(yīng)于每種樣品的條形碼序列的fasta質(zhì)量文件和映射文件用作輸入，讀數(shù)通過(guò)樣品根據(jù)條形碼進(jìn)行拆分，使用RDP分類器執(zhí)行分類學(xué)分類，并且制備OTU表。我們采用使用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)的開放參考OTU映射。在359bp總配對(duì)末端裝配的讀數(shù)長(zhǎng)度上不允許非匹配核苷酸。進(jìn)行稀疏化以排除具有不足夠的讀數(shù)/樣品計(jì)數(shù)的樣品。在V2區(qū)中共享97%核苷酸序列同一性的序列框并成操作分類單位（97% ID OTU）。對(duì)于β多樣性，根據(jù)基于1,000個(gè)讀數(shù)/樣品的前兩個(gè)主要坐標(biāo)來(lái)標(biāo)繪未加權(quán)unifrac測(cè)量結(jié)果。

宏基因組序列映射：Illumina測(cè)序讀數(shù)使用GEM映射器（Marco-Sola等人，2012）對(duì)腸微生物基因目錄（Human Microbiome Jumpstart Reference Strains等人，2010）進(jìn)行映射，使用下述參數(shù)：-m 0.08 -s 0 -q offset-33 -gem-quality-threshold 26。

功能指定。根據(jù)伴隨基因目錄的基因?qū)ΨN類映射，為對(duì)腸微生物基因目錄映射的讀數(shù)指定KEGG（Kanehisa和Goto，2000）標(biāo)識(shí)號(hào)?；螂S后對(duì)KEGG模塊和途徑進(jìn)行映射。僅考慮具有超過(guò)10個(gè)指定讀數(shù)的基因。對(duì)于KEGG途徑分析，僅包括其基因覆蓋超過(guò)0.2的途徑。隨后通過(guò)日間振蕩的JTK_周期測(cè)試KEGG途徑。

統(tǒng)計(jì)分析 - 數(shù)據(jù)以平均值± SEM表示。對(duì)于節(jié)律振蕩及其幅度的分析，使用非參數(shù)測(cè)試JTK_周期（Hughes等人，2010），允許24小時(shí)用于測(cè)定晝夜節(jié)律周期性。對(duì)于節(jié)律代謝產(chǎn)物、宏基因組含量和轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)，p<0.05并且q<0.2被視為顯著的。使用Vennerable包在R中生成Chow-Ruskey圖解。關(guān)于KEGG途徑富集分析的超幾何測(cè)試使用DAVID（Huang da等人，2009）完成。

結(jié)果

微生物叢生物地理學(xué)定位的日間節(jié)律

腸道微生物叢經(jīng)歷組成和基因含量的節(jié)律振蕩，但這些功能微生物振蕩通過(guò)其影響宿主的機(jī)制仍然是難以捉摸的。因?yàn)樽顝?qiáng)地影響宿主的共生細(xì)菌被認(rèn)為定位在緊密接近于腸道微生物表面，所以本發(fā)明人尋求研究微生物組日間節(jié)律性的生物地理學(xué)方面。他們因此分析了在兩天的過(guò)程中，在上皮粘附共生細(xì)菌的豐度波動(dòng)（圖28A），并且用常用的非參數(shù)算法JTK_周期（JTK_）分析節(jié)律性（Hughes等人，2010）。所有小鼠均自由進(jìn)食且飼養(yǎng)在嚴(yán)格的24小時(shí)光暗條件下，其中光保持打開12小時(shí)（授時(shí)因子時(shí)間（ZT）0-12）。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，充分清潔近側(cè)結(jié)腸以除掉管腔內(nèi)容物，并且僅分離粘膜粘附細(xì)菌，隨后經(jīng)由qPCR的DNA定量。定植上皮小生境的細(xì)菌數(shù)目經(jīng)歷顯著的日間變化，其中共生上皮層粘附在暗階段中是最高的（圖28B，p=3x10^-7，JTK_周期），而細(xì)菌的管腔數(shù)目保持恒定（圖29A）。掃描電子顯微鏡檢查（SEM）成像證實(shí)了與腸道上皮緊密相關(guān)的共生體的量的每日波動(dòng)（圖28C、29B和29C）。SEM圖像提示粘附細(xì)菌的分類學(xué)組成在每天的不同時(shí)間是不均勻的（圖28C）。他們因此對(duì)在每天的不同時(shí)間收獲的上皮相關(guān)群落進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。確實(shí)，粘附細(xì)菌的組成經(jīng)歷顯著的日間波動(dòng)，使得上皮相關(guān)共生體的β多樣性在連續(xù)光暗周期過(guò)程中節(jié)律性改變（圖28D、28E和30A-C；關(guān)于UniFrac距離的振蕩p=4x10^-13）。因此，與在兩者之間的任何其他時(shí)間點(diǎn)相比較，在任何時(shí)間點(diǎn)定位至腸道粘膜的群落組成更類似于24小時(shí)后呈現(xiàn)的那種。某些共生體對(duì)于上皮附近的定位在一天中具有不同的優(yōu)先時(shí)間（圖28F），包括瘤胃球菌屬、Mucispirillum屬和乳桿菌屬（分別為p<10^-6和p<10^-5，圖28G）。因此，在相對(duì)豐度（圖28G-28I）和絕對(duì)豐度（圖30D-I）中，宿主粘膜均暴露于細(xì)菌的日間波動(dòng)數(shù)目和物種。值得注意的是，某些細(xì)菌物種的峰和谷豐度相差超過(guò)100倍，如通過(guò)Mucispirillum schaedleri例示的（圖30F），其為已知定植在小鼠粘膜層的共生體。總之，這些結(jié)果證實(shí)腸微生物叢經(jīng)歷生物地理學(xué)分布的振蕩，導(dǎo)致對(duì)于每天的不同時(shí)間粘膜相關(guān)共生體特征的周期概況。

腸道代謝組的日間節(jié)律

為了測(cè)定日間節(jié)律性是否在宿主-微生物組相互作用內(nèi)發(fā)生，其中強(qiáng)烈和密切的通訊主要通過(guò)代謝產(chǎn)物的交換和感知發(fā)生，在兩個(gè)光暗周期的過(guò)程中，每6小時(shí)通過(guò)野生型小鼠的代謝產(chǎn)物概況分析來(lái)測(cè)定腸道代謝組的時(shí)間動(dòng)態(tài)（圖28A）。使用JTK_周期，當(dāng)使用p<0.05和q<0.2作為閾值時(shí)，發(fā)現(xiàn)所有檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物中的18%經(jīng)歷24小時(shí)節(jié)律中的波動(dòng)（圖31A）。振蕩代謝產(chǎn)物屬于多樣化學(xué)組，包括碳水化合物（圖31B和31C）、維生素（圖31D和31E）、氨基酸（圖31F和31G）、脂質(zhì)（圖31H）、核苷酸（圖32A和32B）、肽（圖32C和32D）、以及異生物質(zhì)（圖32E-32F）。高度穩(wěn)健的日間波動(dòng)例如在碳水化合物木糖、葡萄糖和乳酸鹽（p<0.007，圖31B和31C）、微生物叢依賴性必需維生素生物素（p<10^-5，圖31E）、以及氨基酸脯氨酸和天冬酰胺（p<0.0004，圖31F和31G）中發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明宿主-微生物叢相互作用具有由下述組成的多面性節(jié)律性：組成（Thaiss等人，2014b）、宏基因組（圖32I）和生物地理學(xué)（圖28A-I）微生物組節(jié)律性，如通過(guò)周期性RNA-seq定量的宿主轉(zhuǎn)錄組節(jié)律性（圖31J）和代謝組學(xué)節(jié)律性（圖31K），其整合宿主、其微生物組和飲食輸入的日間模式。在一些情況下，可以在這個(gè)多層節(jié)律環(huán)境的不同組分之間發(fā)現(xiàn)直接聯(lián)系。例如，編碼生物素生物合成中的最后兩個(gè)酶促步驟的微生物基因（bioD和bioB）的節(jié)律豐度伴隨著生物素的階段節(jié)律管腔豐度（圖32G和32H）。

微生物叢編程結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組振蕩。

為了全面測(cè)定微生物叢作用于宿主的振蕩過(guò)程的調(diào)節(jié)作用，給小鼠施用廣譜抗生素，測(cè)定微生物叢耗盡對(duì)宏生物日間波動(dòng)的影響（圖33A）。預(yù)期地，抗生素處理急劇減少了上皮粘附細(xì)菌的數(shù)目且消除了剩余群落中的任何節(jié)律性，如通過(guò)定量PCR和SEM測(cè)定的（圖33B、33C、34A和34B）。因此，上皮相關(guān)共生體的節(jié)律分類學(xué)組成通過(guò)抗生素處理被消除（圖3D和34C-34E）。例如，羅伊乳桿菌在飲用抗生素的小鼠中喪失其特征性相對(duì)豐度峰和谷階段（圖34E）。為了測(cè)定微生物耗盡和振蕩喪失對(duì)宿主的作用，在兩個(gè)光暗周期的過(guò)程中，每6小時(shí)進(jìn)行一次來(lái)自對(duì)照和抗生素處理小鼠的結(jié)腸組織的比較RNA測(cè)序，使用在每個(gè)組中的每個(gè)ZT時(shí)的5只小鼠（圖33A）。使用JTK_周期評(píng)估轉(zhuǎn)錄物概況中的節(jié)律性，其中閾值為p<0.05和q<0.2。兩個(gè)組的特征均在于可比較數(shù)目的振蕩宿主轉(zhuǎn)錄物（圖35A），表明總體腸道轉(zhuǎn)錄晝夜節(jié)律性不依賴于腸道微生物叢的存在。然而，與對(duì)照相比較，振蕩基因程序的鑒定在抗生素處理的小鼠中顯著不同（圖33F）。總的來(lái)說(shuō)，在定植小鼠中振蕩的總共3133種基因中的2102種在抗生素處理的小鼠中喪失其節(jié)律性。相比之下，1194種基因具有抗生素處理小鼠的從頭振蕩，而僅1031種節(jié)律轉(zhuǎn)錄物在兩個(gè)組之間共享（圖33F-3I）。在共享轉(zhuǎn)錄物中有涉及核心晝夜節(jié)律鐘和腸道管家功能的基因，表明宿主外周鐘機(jī)制的功能并非真正依賴于完整微生物叢的存在（圖33J、35B）。在不存在微生物叢的情況下喪失其振蕩的轉(zhuǎn)錄物主要屬于核苷酸代謝和細(xì)胞周期途徑，以及微生物叢代謝產(chǎn)物下游活化的宿主代謝途徑，例如代謝短鏈脂肪酸的途徑和粘液產(chǎn)生途徑（圖33K）。微生物組依賴性宿主振蕩轉(zhuǎn)錄物還包括涉及免疫受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因（圖33K和35C），這與腸道上皮細(xì)胞中關(guān)于節(jié)律TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的微生物控制的較早期報(bào)告一致（Mukherji等人，2013）。然而，最值得注意的是在微生物叢耗盡后獲得節(jié)律性的功能性，其包括主要代謝途徑如TCA循環(huán)和氧化磷酸化（圖33L），如通過(guò)細(xì)胞色素c氧化酶復(fù)合物的成員例示的（圖35D）。因此，結(jié)腸代謝活性的總體時(shí)間坐標(biāo)在微生物叢耗盡和對(duì)照小鼠之間不同，其中節(jié)律功能在每天的不同時(shí)間達(dá)到峰值（圖35E）。為了排除抗生素處理自身的潛在混淆效應(yīng)，這些結(jié)果在無(wú)菌條件下飼養(yǎng)的無(wú)菌小鼠中得到證實(shí)。實(shí)際上，類似于抗生素處理的小鼠，無(wú)菌小鼠表現(xiàn)出其周期轉(zhuǎn)錄組的大量改變，而循環(huán)元件的總數(shù)目與對(duì)照可比較（圖35F-35I）。因此，KEGG功能性喪失且獲得節(jié)律性，類似于抗生素處理的小鼠（數(shù)據(jù)未示出）。綜上，這些數(shù)據(jù)表明微生物叢重新編程節(jié)律宿主轉(zhuǎn)錄組，以改變代謝和免疫程序的時(shí)間順序，所述程序中的許多與其自身共生小生境功能直接有關(guān)。

協(xié)同的宏生物振蕩由飼喂時(shí)間驅(qū)動(dòng)

為了測(cè)定節(jié)律食物攝入是否控制共生體的節(jié)律性活動(dòng)，進(jìn)行了定時(shí)飼喂實(shí)驗(yàn)。在這些實(shí)驗(yàn)中，小鼠（其在暗階段期間優(yōu)先消耗食物，圖36A）僅在暗階段期間或僅在光階段期間隨意進(jìn)行飼喂（圖37A、36B和36C）。對(duì)不同預(yù)定飼喂組的小鼠，進(jìn)行鳥槍法宏基因組測(cè)序、生物地理學(xué)評(píng)價(jià)和宿主轉(zhuǎn)錄組定量（圖37A）。雖然總體微生物組節(jié)律性不受改變的飼喂時(shí)間影響（圖37B），但逆轉(zhuǎn)的飼喂時(shí)間造成了基因豐度振蕩的階段偏移（圖37C和37D），如通過(guò)細(xì)菌半乳糖胺硫酸酯酶例示的（圖36D）。因此，節(jié)律宏基因組模塊和途徑遵循食物攝入時(shí)間，且表現(xiàn)出自由進(jìn)食和光階段飼喂的小鼠之間的反相峰相位和底值期（圖36E和36F）。由飼喂時(shí)機(jī)緊密控制的功能元素包括細(xì)菌粘液降解（圖37E、37F和36G）和運(yùn)動(dòng)性（圖36H），潛在解釋了飼喂時(shí)間如何確定微生物叢易位和粘液代謝的節(jié)律，且從而調(diào)節(jié)上皮生物地理學(xué)粘附的日間波動(dòng)。實(shí)際上，逆轉(zhuǎn)的飼喂時(shí)間還顛倒節(jié)律性上皮粘附的模式（圖37G），如通過(guò)經(jīng)過(guò)一天過(guò)程的附著共生體的qPCR所測(cè)量的。

節(jié)律飼喂還重新編程結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組，如先前在肝臟注意到的（Vollmers等人，2009），同時(shí)保持振蕩元素的恒定總數(shù)目（圖37H和37I）。與微生物組中的階段偏移同步，結(jié)腸的節(jié)律轉(zhuǎn)錄組還遵循飼喂時(shí)間（圖37J-37L、36I和36J）?？傊?，這些結(jié)果提示節(jié)律營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可用性指導(dǎo)微生物叢活性和生物地理學(xué)定位中的功能日間振蕩，類似于其與宿主微生物叢互利共生有關(guān)的多重宿主途徑的節(jié)律性活動(dòng)的控制。

飼喂時(shí)間、微生物叢和宿主遺傳學(xué)共同協(xié)調(diào)循環(huán)轉(zhuǎn)錄組

考慮到微生物叢和飼喂時(shí)間兩者均能夠編程結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組振蕩，本發(fā)明人接下來(lái)解決對(duì)宿主晝夜節(jié)律功能的兩類環(huán)境影響之間的相互作用。為了測(cè)定飼喂節(jié)律性破壞誘導(dǎo)和微生物組耗盡誘導(dǎo)的宿主轉(zhuǎn)錄組重編程之間的相似性和相互依賴性，進(jìn)行連同和不連同另外的抗生素處理，在定時(shí)飼喂的小鼠之間獨(dú)特和共享的振蕩轉(zhuǎn)錄組的四重比較（圖37A）。一般地，振蕩轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目跨越所有條件均為穩(wěn)定的（數(shù)據(jù)未示出）。為了鑒定每個(gè)組中共享和獨(dú)特的循環(huán)元素，使用4階Chow-Ruskey比較（圖38A），其揭示幾個(gè)特點(diǎn)。首先，定時(shí)飼喂和微生物叢耗盡兩者均產(chǎn)生獨(dú)特和共享的宿主轉(zhuǎn)錄物的獨(dú)立模式（圖38A）。300種轉(zhuǎn)錄物僅是微生物叢依賴性的，因?yàn)槠溲h(huán)與飼喂條件無(wú)關(guān)（具有在顛倒飼喂時(shí)間之間的階段偏移），但在抗生素處理后喪失振蕩（圖38B）。這些基因包括免疫途徑的成員，例如干擾素-γ受體（圖38C和38D），以及涉及屏障功能的基因，例如封閉蛋白-2（圖38E和38F）。其次，轉(zhuǎn)錄物中僅少數(shù)涵蓋所有條件振蕩。事實(shí)上，根據(jù)JTK_周期算法顯示顯著振蕩的僅44種轉(zhuǎn)錄物在所有條件之間是共享的（圖38A）。這些轉(zhuǎn)錄物的KEGG途徑分析揭示這個(gè)組富含核心分子鐘的成員（圖38A和38G-38J），指出分子鐘自身維持穩(wěn)健的振蕩，與飼喂和微生物組可用性條件無(wú)關(guān)，而下游靶中的大多數(shù)僅在適當(dāng)?shù)娘曃购投ㄖ矖l件下振蕩。第三，在光階段飼喂、抗生素處理的小鼠中獨(dú)特循環(huán)的基因數(shù)目比所有其他組低約50%，指出微生物叢在響應(yīng)飼喂時(shí)間逆轉(zhuǎn)的循環(huán)轉(zhuǎn)錄組的重編程中具有作用。支持這一概念，在所有四個(gè)組中振蕩的典型鐘成員在暗階段和光階段飼喂小鼠之間階段偏移，但當(dāng)小鼠也用抗生素進(jìn)行處理時(shí)，這種階段偏移喪失。例如，當(dāng)兩個(gè)組中的微生物叢被抗生素處理破壞時(shí)，暗階段和光階段飼喂組之間的Cry1振蕩中的階段偏移在很大程度上減弱（圖38G和38H）。針對(duì)其他鐘基因觀察到了相同現(xiàn)象（圖38I和38J）。這些結(jié)果揭示微生物叢活性對(duì)腸中的節(jié)律轉(zhuǎn)錄維持具有出乎意料的大影響，包括循環(huán)元素的鑒定和階段分布兩者。

本結(jié)果指出微生物叢的存在對(duì)于結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組振蕩的維持是關(guān)鍵的。為了理解微生物叢在驅(qū)動(dòng)宿主晝夜節(jié)律活性的必要性是僅起源于其存在還是起源于其日間波動(dòng)活性，本發(fā)明人利用下述發(fā)現(xiàn)：不存在功能宿主晝夜節(jié)律鐘的情況下，組成微生物振蕩停止存在，但可以通過(guò)節(jié)律飼喂恢復(fù)（Thaiss等人，2014b）。他們因此對(duì)Per1/2缺陷小鼠進(jìn)行了計(jì)劃飼喂實(shí)驗(yàn)，所述Per1/2缺陷小鼠缺乏分子鐘的必需組分（圖39A），并且測(cè)試了在隨意和定時(shí)飼喂的條件下，這些小鼠的宏基因組和結(jié)腸轉(zhuǎn)錄組振蕩。雖然自由進(jìn)食的Per1/2^-/-小鼠缺乏在其宏基因組中的振蕩活性，但微生物組的日間節(jié)律通過(guò)定時(shí)飼喂誘導(dǎo)（圖39B-39D），如通過(guò)細(xì)菌氫化酶hyoA例示的（圖39E）。相應(yīng)地，在預(yù)定飼喂后，在Per1/2缺陷小鼠中，微生物組的功能模塊獲得24小時(shí)節(jié)律中的時(shí)間組構(gòu)（圖39F）。與在肝樣品中的先前發(fā)現(xiàn)一致（Vollmers等人，2009），定時(shí)飼喂還恢復(fù)Per1/2^-/-小鼠中的幾百種結(jié)腸轉(zhuǎn)錄物中的振蕩（圖39G）。然而，值得注意的是，這些轉(zhuǎn)錄物的日間活性的再獲得依賴于完整微生物叢，因?yàn)槎〞r(shí)飼喂的Per1/2^-/-小鼠的抗生素處理廢除了這些宿主振蕩的恢復(fù)（圖39G）。其飼喂誘導(dǎo)的節(jié)律性誘導(dǎo)依賴于微生物叢的轉(zhuǎn)錄物包括涉及粘膜免疫應(yīng)答的多重基因，包括細(xì)胞因子的IL-1家族及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成員（Il33、Il1r1、Myd88、Socs1）。這些數(shù)據(jù)表明微生物叢振蕩是維持大量結(jié)腸基因的轉(zhuǎn)錄物振蕩所必需的。

微生物叢編程肝臟鐘

最后，我們?cè)噲D確定通過(guò)日間波動(dòng)腸微生物組介導(dǎo)的對(duì)腸道振蕩轉(zhuǎn)錄組程序的作用是否可以系統(tǒng)性傳遞。此類遠(yuǎn)程微生物組誘導(dǎo)對(duì)宿主晝夜節(jié)律性的調(diào)節(jié)作用具有潛在的病理生理學(xué)關(guān)聯(lián)性。我們選擇集中于微生物組日間活性對(duì)肝晝夜節(jié)律性的影響，因?yàn)閷?duì)肝臟生理學(xué)和肝疾病的微生物組影響已在多項(xiàng)近期研究中得到證明，而關(guān)于此類遠(yuǎn)程效應(yīng)中的許多機(jī)制仍是難以捉摸的（Henao-Mejia等人，2012；Qin等人，2014）。為了評(píng)價(jià)肝臟轉(zhuǎn)錄組重編程是否受微生物叢破壞影響，用廣譜抗生素處理小鼠一周，未經(jīng)實(shí)驗(yàn)或抗生素處理的小鼠的肝臟節(jié)律轉(zhuǎn)錄使用JTK_周期進(jìn)行概況分析，使用p<0.05和q<0.2作為閾值（圖33A）。類似于結(jié)腸，抗生素介導(dǎo)的微生物叢破壞重編程肝臟轉(zhuǎn)錄物振蕩，而節(jié)律元素的總數(shù)目仍與對(duì)照具有可比性（圖40A和41A）。正如在腸中，典型鐘組分維持其節(jié)律（圖40B和41B-D），并且同樣地，肝臟管家功能、代謝功能和解毒功能在抗生素暴露后持續(xù)循環(huán)（圖41B、41E和41F）?？偣?796種轉(zhuǎn)錄物中的629種喪失振蕩概況（圖40C），包括涉及氧化磷酸化及其他分解代謝途徑的基因（圖40D）。例如，在抗生素處理一周后，編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶-1的基因喪失可檢測(cè)的節(jié)律性（圖41G）。相比之下，1825種轉(zhuǎn)錄物發(fā)生從頭節(jié)律性（圖40E），其中許多涉及脂肪酸、核酸和氨基酸代謝（圖40F）。由于在循環(huán)轉(zhuǎn)錄組中的這些大量改變，肝臟代謝活性的正常時(shí)間順序被部分?jǐn)_亂且被從頭振蕩程序所替換，其中峰活性與非抗生素處理?xiàng)l件下相比處于顯著不同的時(shí)間下（圖40G）。例如，涉及氨基酸代謝、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和PPAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑具有階段偏移的活性峰（圖40G）。因此，出乎意料的是，在局部腸道環(huán)境和全身兩者中，均發(fā)現(xiàn)微生物叢對(duì)于維持代謝活性的穩(wěn)態(tài)每日繼續(xù)是關(guān)鍵的。

在這個(gè)實(shí)例中，日間節(jié)律性被鑒定為宿主微生物叢共生的調(diào)節(jié)中的必需組分。微生物叢振蕩活性的兩種新元素已得到鑒定，其提供了關(guān)于其功能重要性的機(jī)理解釋：生物地理學(xué)定位中的振蕩和代謝產(chǎn)物分泌模式。節(jié)律協(xié)調(diào)的功能例如細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性和粘膜降解建立確定微生物叢成員的粘膜粘附的時(shí)間模式，誘導(dǎo)其中宿主在每天的不同時(shí)間定期暴露于不同的細(xì)菌數(shù)目、物種、功能和產(chǎn)物的穩(wěn)態(tài)狀態(tài)。在應(yīng)答中，宿主施加與相應(yīng)的微生物活性同步的節(jié)律代謝和免疫程序（圖40H）。一旦穩(wěn)態(tài)定植被取消，如在抗生素處理的情況下，微生物節(jié)律性就在其所有層包括組成和粘膜粘附中喪失，其導(dǎo)致相應(yīng)的宿主節(jié)律性的解偶聯(lián)。令人驚訝的是，這種微生物叢宿主晝夜節(jié)律解偶聯(lián)的整合部分涉及腸道和肝中的宿主轉(zhuǎn)錄振蕩的大量從頭發(fā)生，潛在滿足了由節(jié)律性食物攝入施加的需要，其通常通過(guò)日間微生物叢活性緩沖（圖40H）。共生微生物配偶體或其正常循環(huán)行為的喪失即使在遠(yuǎn)離微生物定植部位的位置處也會(huì)擾亂哺乳動(dòng)物宿主的瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄組協(xié)調(diào)。

這些發(fā)現(xiàn)具有許多重要的意義。首先，代謝產(chǎn)物的交換越來(lái)越多地識(shí)別為微生物叢和宿主之間的主要通訊手段，從而產(chǎn)生代謝和免疫串?dāng)_和相互依賴性的全宏生物網(wǎng)絡(luò)。這通過(guò)代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)的宿主生理學(xué)調(diào)節(jié)和通過(guò)先天性免疫系統(tǒng)受體的微生物存在的分子識(shí)別例證。所有此類功能關(guān)鍵地依賴于微生物叢的生物地理學(xué)定位，并且因此構(gòu)成腸道生態(tài)系統(tǒng)中的微生物叢分層基礎(chǔ)的調(diào)節(jié)機(jī)制可能是理解宿主內(nèi)的微生物定植如何建立且維持的關(guān)鍵。本發(fā)現(xiàn)證實(shí)每天的時(shí)間劇烈影響所有三種參數(shù)：每天的給定時(shí)間的特征在于代謝組、微生物組成和粘膜粘附的獨(dú)特概況，導(dǎo)致時(shí)間特異性宿主轉(zhuǎn)錄程序突出顯示在不同日間時(shí)期時(shí)的不同免疫和代謝功能。源自微生物的分子還可以成形系統(tǒng)晝夜節(jié)律代謝組學(xué)模式，其近期已發(fā)現(xiàn)具有節(jié)律行為，通過(guò)日間促成必須微生物生產(chǎn)或調(diào)節(jié)的化合物如必需氨基酸和維生素。

因而，本結(jié)果表明在目前視為靜態(tài)的穩(wěn)態(tài)中的宿主微生物組相互作用，事實(shí)上可以視為不斷改變的，仍緊密偶聯(lián)且高度調(diào)節(jié)‘波動(dòng)穩(wěn)態(tài)’的狀態(tài)。此外，可以說(shuō)明這些日間波動(dòng)和組成微生物特性在測(cè)定針對(duì)微生物叢穩(wěn)態(tài)喪失（例如在暴露于抗生素期間）的宿主應(yīng)答中也是重要的。因此，本結(jié)果表明，在解釋微生物叢調(diào)節(jié)飲食的下游效應(yīng)和醫(yī)學(xué)干預(yù)時(shí)，需要考慮微生物叢功能的動(dòng)力學(xué)。

其次，在相應(yīng)的宿主和微生物代謝活性之間協(xié)調(diào)的日間節(jié)律性的鑒定為我們對(duì)宿主微生物共同進(jìn)化的理解添加了出乎意料的方面。宿主轉(zhuǎn)錄物振蕩的微生物誘導(dǎo)可能以至少兩種方式對(duì)于宏生物生態(tài)系統(tǒng)在功能上是有利的。一方面，通過(guò)使其代謝活性與微生物組的日間波動(dòng)同步，宿主可以優(yōu)化必需的源自微生物叢的化合物例如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和維生素的攝取和處理。另一方面，協(xié)調(diào)的宏生物代謝和免疫活性可以理想地適合于滿足通過(guò)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、無(wú)毒異生物質(zhì)和病原體的引入對(duì)生態(tài)系統(tǒng)施加的波動(dòng)。此外，沿結(jié)腸粘膜在定植條件中的小時(shí)規(guī)模變化產(chǎn)生關(guān)于共生體的動(dòng)態(tài)小生境，并且可以通過(guò)在穩(wěn)定定植狀態(tài)周圍的短期振蕩支持長(zhǎng)期群落穩(wěn)定性。像這樣，在這項(xiàng)研究中鑒定的協(xié)調(diào)的宏生物活性可以提供關(guān)于通過(guò)微生物叢的活性小生境構(gòu)建的實(shí)例，其在24小時(shí)中周期性出現(xiàn)。

此外，本研究提供了關(guān)于下述概念的支持：外周鐘中的轉(zhuǎn)錄組振蕩的晝夜節(jié)律程序依賴于環(huán)境信號(hào)，并且提供了關(guān)于這些信號(hào)整合的新角度。先前研究已指出食物攝入的時(shí)機(jī)和飲食類型決定外周轉(zhuǎn)錄組的晝夜節(jié)律編程。目前已發(fā)現(xiàn)通過(guò)誘導(dǎo)且壓制轉(zhuǎn)錄組循環(huán)，微生物叢在轉(zhuǎn)錄組振蕩的協(xié)調(diào)中起同樣重要的作用，共同地且不依賴于飼喂時(shí)間（圖38A）。此外，定時(shí)飼喂已顯示恢復(fù)缺乏功能分子鐘的小鼠中的轉(zhuǎn)錄組振蕩。已確定微生物叢促成這種效應(yīng)，并且這種飼喂依賴性振蕩的再獲得至少部分依賴于微生物組振蕩。因此，本文有關(guān)宿主轉(zhuǎn)錄物振蕩的微生物編程的發(fā)現(xiàn)可能將許多迄今為止描述的通過(guò)食物重編程的外周轉(zhuǎn)錄組的實(shí)例聯(lián)系起來(lái)，提供了這樣的整合的理解：對(duì)宏生物的日間活性的飲食影響可以通過(guò)微生物叢組成和功能的調(diào)節(jié)間接發(fā)揮。值得注意的是，據(jù)發(fā)現(xiàn)，僅少量宿主轉(zhuǎn)錄物不依賴于飲食和微生物影響而振蕩（圖5A），其中大多數(shù)屬于晝夜節(jié)律鐘的核心成員。因此，本發(fā)現(xiàn)提出了這樣的模型：在該模型中，分子鐘經(jīng)歷自持續(xù)節(jié)律性，而轉(zhuǎn)錄組的大部分中的節(jié)律性的下游誘導(dǎo)可以依賴于環(huán)境信號(hào)的適當(dāng)整合（圖41H）。

最后，本研究提供了抗生素使用對(duì)哺乳動(dòng)物生理學(xué)的多面性作用的新認(rèn)識(shí)。大量抗生素暴露對(duì)微生物組的頻繁破壞已變成現(xiàn)代人類醫(yī)學(xué)實(shí)踐和工業(yè)化食物制備兩者的標(biāo)志。除充分說(shuō)明的對(duì)微生物組多樣性和對(duì)致病性感染的敏感性的直接不利影響之外，此類暴露也與各種不利的代謝紊亂相關(guān)（Ayres等人，2012；Cox等人，2014；Ng等人，2013；Zeissig和Blumberg，2014），然而，對(duì)于這些間接系統(tǒng)抗生素效應(yīng)仍知之甚少。發(fā)現(xiàn)抗生素介導(dǎo)的多個(gè)水平的微生物叢日間節(jié)律性的破壞與一天中結(jié)腸和肝臟宿主代謝活性兩者的正常時(shí)間順序的擾亂相關(guān)，生成與穩(wěn)態(tài)每日活性概況相比較的時(shí)間去同步化。此發(fā)現(xiàn)表明抗生素對(duì)宿主生理學(xué)的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)對(duì)微生物組直接發(fā)揮的那些（例如藥物抗性和機(jī)會(huì)致病菌感染的出現(xiàn)），以及直接的抗生素介導(dǎo)的不利效應(yīng)。相反，抗生素誘導(dǎo)的生態(tài)失調(diào)使微生物和宿主協(xié)調(diào)的節(jié)律性解偶聯(lián)，導(dǎo)致宿主轉(zhuǎn)錄活性的大量喪失和獲得。在腸和肝兩者中注意到的途徑活性的這種失調(diào)可以導(dǎo)致功能改變，其范圍從受損和不當(dāng)?shù)母闻K解毒、分解代謝和合成功能到改變的免疫，可能導(dǎo)致長(zhǎng)期后果例如兒童期抗生素治療和易肥胖之間的關(guān)聯(lián)（Cox等人，2014）。

參考文獻(xiàn)

Arpaia，N.，Campbell，C.，F(xiàn)an，X.，Dikiy，S.，van der Veeken，J.，deRoos，P.，Liu，H.，Cross，J.R.，Pfeffer，K.，Coffer，P.J.,等人（2013）. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature504，451-455.

Asher，G.和Sassone-Corsi，P.（2015）. Time for Food: The Intimate Interplay between Nutrition，Metabolism，and the Circadian Clock. Cell 161，84-92.

Ayres，J.S.，Trinidad，N.J.和Vance，R.E.（2012）. Lethal inflammasome activation by a multidrug-resistant pathobiont upon antibiotic disruption of the microbiota. Nature medicine 18，799-806.

Bass，J.（2012）. Circadian topology of metabolism. Nature 491，348-356.

Cox，L.M.，Yamanishi，S.，Sohn，J.，Alekseyenko，A.V.，Leung，J.M.，Cho，I.，Kim，S.G.，Li，H.，Gao，Z.，Mahana，D.,等人（2014）. Altering the intestinal microbiota during a critical developmental window has lasting metabolic consequences. Cell 158，705-721.

Damiola，F(xiàn).，Le Minh，N.，Preitner，N.，Kornmann，B.，F(xiàn)leury-Olela，F(xiàn).和Schibler，U.（2000）. Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes & development 14，2950-2961.

De Vadder，F(xiàn).，Kovatcheva-Datchary，P.，Goncalves，D.，Vinera，J.，Zitoun，C.，Duchampt，A.，Backhed，F(xiàn).，and Mithieux，G.（2014）. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell156，84-96.

Dibner，C.，Schibler，U.和Albrecht，U.（2010）. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annual review of physiology 72，517-549.

Eckel-Mahan，K.L.，Patel，V.R.，de Mateo，S.，Orozco-Solis，R.，Ceglia，N.J.，Sahar，S.，Dilag-Penilla，S.A.，Dyar，K.A.，Baldi，P.和Sassone-Corsi，P.（2013）. Reprogramming of the circadian clock by nutritional challenge. Cell 155，1464-1478.

Eckel-Mahan，K.L.，Patel，V.R.，Mohney，R.P.，Vignola，K.S.，Baldi，P.和Sassone-Corsi，P.（2012）. Coordination of the transcriptome and metabolome by the circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109，5541-5546.

Fung，T.C.，Artis，D.和Sonnenberg，G.F.（2014）. Anatomical localization of commensal bacteria in immune cell homeostasis and disease. Immunological reviews 260，35-49.

Henao-Mejia，J.，Elinav，E.，Jin，C.，Hao，L.，Mehal，W.Z.，Strowig，T.，Thaiss，C.A.，Kau，A.L.，Eisenbarth，S.C.，Jurczak，M.J.,等人（2012）. Inflammasome-mediated dysbiosis regulates progression of NAFLD and obesity. Nature 482，179-185.

Hsiao，E.Y.，McBride，S.W.，Hsien，S.，Sharon，G.，Hyde，E.R.，McCue，T.，Codelli，J.A.，Chow，J.，Reisman，S.E.，Petrosino，J.F.,等人（2013）. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell 155，1451-1463.

Huang da，W.，Sherman，B.T.和Lempicki，R.A.（2009）. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature protocols 4，44-57.

Hughes，M.E.，Hogenesch，J.B.和Kornacker，K.（2010）. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of biological rhythms 25，372-380.

Lavin，Y.，Winter，D.，Blecher-Gonen，R.，David，E.，Keren-Shaul，H.，Merad，M.，Jung，S.和Amit，I.（2014）. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell 159，1312-1326.

Lopez，C.A.，Kingsbury，D.D.，Velazquez，E.M.和Baumler，A.J.（2014）. Collateral damage: microbiota-derived metabolites and immune function in the antibiotic era. Cell host & microbe 16，156-163.

Minami，Y.，Kasukawa，T.，Kakazu，Y.，Iigo，M.，Sugimoto，M.，Ikeda，S.，Yasui，A.，van der Horst，G.T.，Soga，T.和Ueda，H.R.（2009）. Measurement of internal body time by blood metabolomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106，9890-9895.

Mukherji，A.，Kobiita，A.，Ye，T.和Chambon，P.（2013）. Homeostasis in intestinal epithelium is orchestrated by the circadian clock and microbiota cues transduced by TLRs. Cell 153，812-827.

Ng，K.M.，F(xiàn)erreyra，J.A.，Higginbottom，S.K.，Lynch，J.B.，Kashyap，P.C.，Gopinath，S.，Naidu，N.，Choudhury，B.，Weimer，B.C.，Monack，D.M.,等人（2013）. Microbiota-liberated host sugars facilitate post-antibiotic expansion of enteric pathogens. Nature 502，96-99.

Qin，N.，Yang，F(xiàn).，Li，A.，Prifti，E.，Chen，Y.，Shao，L.，Guo，J.，Le Chatelier，E.，Yao，J.，Wu，L.,等人（2014）. Alterations of the human gut microbiome in liver cirrhosis. Nature 513，59-64.

Robertson，B.R.，O'Rourke，J.L.，Neilan，B.A.，Vandamme，P.，On，S.L.，F(xiàn)ox，J.G.和Lee，A.（2005）. Mucispirillum schaedleri gen. nov.，sp. nov.，a spiral-shaped bacterium colonizing the mucus layer of the gastrointestinal tract of laboratory rodents. International journal of systematic and evolutionary microbiology 55，1199-1204.

Shapiro，H.，Thaiss，C.A.，Levy，M.和Elinav，E.（2014）. The cross talk between microbiota and the immune system: metabolites take center stage. Current opinion in immunology 30，54-62.

Sharon，G.，Garg，N.，Debelius，J.，Knight，R.，Dorrestein，P.C.和Mazmanian，S.K.（2014）. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Cell metabolism 20，719-730.

Smith，P.M.，Howitt，M.R.，Panikov，N.，Michaud，M.，Gallini，C.A.，Bohlooly，Y.M.，Glickman，J.N.和Garrett，W.S.（2013）. The microbial metabolites，short-chain fatty acids，regulate colonic Treg cell homeostasis. Science 341，569-573.

Thaiss，C.A.和Elinav，E.（2014）. Exploring new horizons in microbiome research. Cell host & microbe 15，662-667.

Thaiss，C.A.，Levy，M.，Suez，J.和Elinav，E.（2014a）. The interplay between the innate immune system and the microbiota. Current opinion in immunology 26，41-48.

Thaiss，C.A.，Zeevi，D.，Levy，M.，Zilberman-Schapira，G.，Suez，J.，Tengeler，A.C.，Abramson，L.，Katz，M.N.，Korem，T.，Zmora，N.,等人（2014b）. Transkingdom control of microbiota diurnal oscillations promotes metabolic homeostasis. Cell 159，514-529.

Voigt，R.M.，F(xiàn)orsyth，C.B.，Green，S.J.，Mutlu，E.，Engen，P.，Vitaterna，M.H.，Turek，F(xiàn).W.和Keshavarzian，A.（2014）. Circadian disorganization alters intestinal microbiota. PloS one 9，e97500.

Vollmers，C.，Gill，S.，DiTacchio，L.，Pulivarthy，S.R.，Le，H.D.和Panda，S.（2009）. Time of feeding and the intrinsic circadian clock drive rhythms in hepatic gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106，21453-21458.

Zarrinpar，A.，Chaix，A.，Yooseph，S.和Panda，S.（2014）. Diet and feeding pattern affect the diurnal dynamics of the gut microbiome. Cell metabolism20，1006-1017.

Zeissig，S.和Blumberg，R.S.（2014）. Life at the beginning: perturbation of the microbiota by antibiotics in early life and its role in health and disease. Nature immunology 15，307-310。

實(shí)施例4

食物攝入的定時(shí)對(duì)微生物組的影響

材料與方法

16名升糖反應(yīng)受損和健康參與者參與了為期三周的飲食干預(yù)實(shí)驗(yàn)。第一周是概況分析周，由其計(jì)算兩種個(gè)人化測(cè)試飲食：（1）一整周的預(yù)測(cè)具有“良好”（低）的餐后血糖應(yīng)答的個(gè)人化飲食；和（2）一整周的預(yù)測(cè)具有“糟糕”（高）的餐后血糖應(yīng)答的個(gè)人化飲食。本發(fā)明人評(píng)估與“糟糕”周給予的個(gè)人化飲食相比較，“良好”周的個(gè)人化飲食是否的確引發(fā)更低的血糖反應(yīng)。

在實(shí)驗(yàn)之前，飲食學(xué)家計(jì)劃如下共6天的個(gè)人定制的飲食：每個(gè)參與者決定他或她一天內(nèi)吃多少餐和多少熱量。6天內(nèi)的所有餐均為不同的，并且在每一天，消耗相同餐數(shù)和熱量，其中在兩餐之間具有至少3小時(shí)的間隙。餐的內(nèi)容物通過(guò)參與者決定，以匹配其味道和日常飲食。例如，參與者可以選擇如下一天吃5餐的熱量：300卡路里早晨、200卡路里早午餐、500卡路里午餐、200卡路里零食和800卡路里晚餐。參與者決定關(guān)于每餐類別的6個(gè)不同選項(xiàng)（實(shí)例中的5種餐食類別：早晨、早午餐、午餐、零食和晚餐），伴隨飲食學(xué)家的幫助，以確保所有早餐均是等熱量的，具有10%的最大限度偏差。

實(shí)驗(yàn)由從參與者獲取血樣和人體測(cè)量開始，將參與者與連續(xù)葡萄糖監(jiān)測(cè)儀連接且開始6天飲食，同時(shí)在研究時(shí)間期間記錄所有進(jìn)餐。在實(shí)驗(yàn)第7天時(shí)，參與者執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（50g）口服葡萄糖耐量測(cè)試，這之后他通常在那天全天正常吃飯。被稱為“混合周”的第一周使參與者暴露于各種食物，其后確定哪些餐是相對(duì)“良好”和“糟糕”的，即哪些餐分別導(dǎo)致低和高葡萄糖應(yīng)答。使用連續(xù)血糖監(jiān)測(cè)儀（Medtronic iPro2）監(jiān)測(cè)葡萄糖血液水平，具有高的5分鐘時(shí)間分辨率。對(duì)于每餐測(cè)量血糖上升和血糖增量曲線下面積（AUC）。選擇從低到高反應(yīng)的餐食，其中選擇每一餐種類中最佳和最糟的兩餐，且標(biāo)記為良好餐和糟糕餐。

在選擇良好和糟糕餐后，參與者繼續(xù)另外兩周實(shí)驗(yàn)，其為測(cè)試周?！傲己弥堋眱H包含良好餐，并且“糟糕周”僅包含預(yù)測(cè)為引發(fā)“糟糕”（高）的血糖反應(yīng)的餐。一周包含6天飲食和如上所述的一天50克葡萄糖耐量測(cè)試。周的次序隨機(jī)選擇，并且參與者和飲食學(xué)家均不知曉周的次序。在三周后，比較周之間的葡萄糖水平。

迄今為止，16名個(gè)體完成了實(shí)驗(yàn)，其中10名具有升糖反應(yīng)受損，而6名是健康的。

結(jié)果

將“良好”和“糟糕”餐正確分類：發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)測(cè)試周測(cè)試的絕大多數(shù)的餐顯示與預(yù)測(cè)一致的血糖反應(yīng)（低/高）。

與“糟糕”周相比較，在“良好”周中觀察到餐后平均AUC的顯著改善。這個(gè)結(jié)果對(duì)于健康和葡萄糖耐量受損的個(gè)體兩者均成立，其中在后面一組中，“良好”和“糟糕”周之間的差異更大（圖42）。

結(jié)果還表明在餐后的血糖反應(yīng)顯示出日間模式（圖43）。當(dāng)通過(guò)類別中的所有餐的平均AUC應(yīng)答進(jìn)行線性擬合時(shí)，可以看出早餐AUC趨勢(shì)相對(duì)低，隨后為午餐，并且晚餐具有AUC的最高趨勢(shì)。這個(gè)趨勢(shì)在通過(guò)一餐中的碳水化合物或熱量標(biāo)準(zhǔn)化后保持（圖44A-B）。

盡管本發(fā)明已與其具體實(shí)施方案結(jié)合描述，但顯而易見(jiàn)的是許多替代方案、修飾和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。相應(yīng)地，預(yù)期包含落入所附權(quán)利要求的精神和廣泛范圍內(nèi)的所有此類替代方案、修飾和變化。

在本說(shuō)明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過(guò)引用全文并入本文說(shuō)明書內(nèi)，其程度與每個(gè)個(gè)別出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e且個(gè)別指出通過(guò)引用并入本文相同。另外，在本申請(qǐng)中的任何參考文獻(xiàn)的引用或鑒定不應(yīng)解釋為承認(rèn)此類參考文獻(xiàn)可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。就使用部分標(biāo)題的程度而言，它們不應(yīng)解釋為必要的限制。

序列表

<110> Yeda Research And Development Co. Ltd.

ELINAV, Eran

SEGAL, Eran

<120> 針對(duì)試劑的微生物組應(yīng)答

<130> 62208

<150> US 62/048,065

<151> 2014-09-09

<150> US 62/050,939

<151> 2014-09-16

<150> US 61/984,944

<151> 2014-04-28

<160> 4

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈DNA寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(8)

<223> 條碼編碼的引物 n 表示條碼堿基

<400> 1

nnnnnnnnag agtttgatcc tggctcag 28

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈DNA寡核苷酸

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈DNA寡核苷酸

<400> 3

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<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 單鏈DNA寡核苷酸

<400> 4

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