本發(fā)明涉及免疫疾病的治療及預(yù)防效果優(yōu)異的新型化合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：免疫疾病是哺乳類免疫系的組成成分導(dǎo)致或介導(dǎo)哺乳類的病理狀態(tài)，或者對(duì)哺乳類的病理狀態(tài)作出其它貢獻(xiàn)的疾病，尤其，炎癥性疾病是在全世界最為重要的健康問題中的一種。通常，炎癥是對(duì)根據(jù)外部物質(zhì)或有害刺激的宿主侵入作出的身體組織的局部化的保護(hù)反應(yīng)。炎癥的原因有諸如細(xì)菌、病毒及寄生蟲的感染性原因；諸如燒傷或放射線照射的物理性原因；諸如毒素、藥物或產(chǎn)業(yè)型制劑的化學(xué)藥品；諸如過敏及自身免疫反應(yīng)的免疫性反應(yīng)，或者與氧化應(yīng)激關(guān)聯(lián)的狀態(tài)。炎癥的特征在于，疼痛、泛紅現(xiàn)象、浮腫、發(fā)燒及被感染的區(qū)域的終極功能損失。這些癥狀為在免疫系的細(xì)胞之間產(chǎn)生的一系列復(fù)雜的相互作用的結(jié)果。由于細(xì)胞的反應(yīng)最終形成多個(gè)組的炎癥介質(zhì)的相互作用網(wǎng)。蛋白質(zhì)(例如，細(xì)胞因子、酶(例如，蛋白酶、過氧物酶)、主要堿性蛋白質(zhì)、粘附分子(ICAM,VCAM)、脂質(zhì)介質(zhì)(例如，類二十烷酸、前列腺素、白三烯、血小板活化因子(PAF))、活性氧(例如，過氧化氫、超氧陰離子O2-、一氧化氮(NO)等)。然而，炎癥的這些介質(zhì)中的大部分也是正常的細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)者。因此，由于炎癥反應(yīng)的缺乏，宿主會(huì)不受控制地受到損傷(即，感染)，因此，由于慢性炎癥而部分地導(dǎo)致炎癥性疾病，所述炎癥性疾病是因上面提及的介質(zhì)中的多個(gè)過多生成而介導(dǎo)的。并且，作為免疫疾病中的一種的自身免疫疾病，其特征在于，免疫體系攻擊其自身的器官，從而產(chǎn)生自發(fā)性反應(yīng)。這些反應(yīng)是根據(jù)T淋巴細(xì)胞的自身抗原(auto-antigen)的認(rèn)知所引起的，由此誘發(fā)體液(生成自身抗原)及細(xì)胞(淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性得到增加)免疫反應(yīng)。自身免疫疾病可以例舉如下：類風(fēng)濕性疾病，銀屑病，全身性皮肌炎，多發(fā)性硬化癥，紅斑狼瘡，或者根據(jù)抗原的免疫反應(yīng)惡化，即哮喘，對(duì)藥物或食物的過敏等。這些疾病均為限制性且慢性的疾病，根據(jù)情況會(huì)是致命的，目前為止沒有能夠治療上述疾病的有效的治療方法。因此，在這些疾病的進(jìn)行過程中，只要是能夠減輕或緩解的藥物、醫(yī)藥或介質(zhì)，為了患者的健康，將會(huì)成為重要的解決手段。為了探索自身免疫疾病的治療方法從而找到適當(dāng)?shù)乃幬锖头椒?，一直進(jìn)行了集中的努力。如今，自身免疫疾病的治療主要是根據(jù)免疫抑制藥物的使用，例如，根據(jù)糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑(calcineurininhibitors)及抗增殖-抗代謝藥物(antiproliferatives-antimetabolites)的使用。然而，如上所述的藥理療法將對(duì)多種靶起到作用，因此整體上可能會(huì)降低免疫功能。另一方面，長時(shí)間使用這些藥理療法的情況下，多種細(xì)胞毒性作用將成為問題，因此通過非特異性的方式來抑制免疫體系，從而會(huì)使患者暴露在得感染癥及癌的危險(xiǎn)中。就鈣調(diào)磷酸酶和糖皮質(zhì)激素而言，因它們的腎毒性和糖尿病誘發(fā)特性而顯示出另一種問題，因此在幾種臨床癥狀的情況(例：腎功能不全、糖尿病等)中的使用會(huì)受到限制。因此，目前需要開發(fā)出作為能夠治療諸如自身免疫疾病、炎癥性疾病等免疫疾病的物質(zhì)的沒有副作用且治療效果優(yōu)異的新免疫疾病治療劑。對(duì)此，本發(fā)明人在摸索既對(duì)人體副作用小且能夠有效地預(yù)防或治療免疫疾病的材料時(shí)，確認(rèn)了新合成的新型化合物能夠有效地治療免疫疾病，從而完成了本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：要解決的技術(shù)問題因此，本發(fā)明的目的在于，提供新型化合物。此外，本發(fā)明的另一目的在于，提供用于預(yù)防或治療免疫疾病的藥學(xué)組合物，其包含所述新型化合物作為有效成分。此外，本發(fā)明的另一目的在于，提供免疫調(diào)節(jié)劑，其包含所述新型化合物作為有效成分。此外，本發(fā)明的另一目的在于，提供減少由未分化T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞、以及減少Th17細(xì)胞活性的方法，其通過在試管內(nèi)用所述本發(fā)明的新型化合物對(duì)未分化T細(xì)胞進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)。此外，本發(fā)明的另一目的在于，提供增加由未分化T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞、以及增加Treg細(xì)胞活性的方法，其通過在試管內(nèi)用所述本發(fā)明的新型化合物對(duì)未分化T細(xì)胞進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供新型雙胍衍生物化合物。此外，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療免疫疾病的藥學(xué)組合物，其包含所述本發(fā)明的新型化合物作為有效成分。本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述化合物能夠減少或抑制炎癥性細(xì)胞因子的生成，抑制自身抗體的生產(chǎn)，抑制破骨細(xì)胞的分化。本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述炎癥性細(xì)胞因子可以為IL-17、IL-6、TNF-a、IFN-r、MMP-9或STAT-3。本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述抗體可以為IgG、IgG1或IgG2a。本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述化合物可以為促進(jìn)或增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(RegulatoryTcell)的活性且減少或抑制作為病原細(xì)胞的Th17細(xì)胞的活性的化合物。本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述化合物可以以0.1mM～10mM的濃度包含在組合物中。本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述免疫疾病可以選自自身免疫疾?。谎装Y性疾??；以及細(xì)胞、組織或器官的移植排斥(transplantationrejection)疾病。本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述免疫疾病可以選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、白塞氏病、多發(fā)性肌炎或皮肌炎、自身免疫性血細(xì)胞減少癥、自身免疫性心肌炎、特應(yīng)性皮炎、哮喘、原發(fā)性肝硬化、皮肌炎、肺出血腎炎綜合征、自身免疫性腦膜炎、干燥綜合征、狼瘡、愛迪生氏病、斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克羅恩病、胰島素依賴型糖尿病、營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥、附睪炎、腎小球腎炎、格雷夫斯病(Graves’disease)、格林-巴利綜合征、橋本氏病、溶血性貧血、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力癥、尋常型天皰瘡、銀屑病、風(fēng)濕熱、結(jié)節(jié)病、硬皮癥、脊柱關(guān)節(jié)病、甲狀腺炎、血管炎、白癜風(fēng)、粘液性水腫、惡性貧血、線粒體相關(guān)綜合征及潰瘍性結(jié)腸炎。本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述移植排斥疾病可以為移植物抗宿主病(Graftversushostdisease)。此外，本發(fā)明提供免疫調(diào)節(jié)劑，其包含所述本發(fā)明的新型化合物作為有效成分。此外，本發(fā)明提供減少由未分化T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞、以及減少Th17細(xì)胞活性的方法，其通過在試管內(nèi)用所述本發(fā)明的新型化合物對(duì)未分化T細(xì)胞進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)。此外，本發(fā)明提供增加由未分化T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞、以及增加Treg細(xì)胞活性的方法，其通過在試管內(nèi)用所述本發(fā)明的新型化合物對(duì)未分化T細(xì)胞進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)。發(fā)明效果本發(fā)明涉及能夠有效地預(yù)防及治療免疫疾病的新型化合物及其應(yīng)用。本發(fā)明的新型化合物不僅抑制炎癥性細(xì)胞因子的生成，增加具有免疫調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性，而且抑制自身抗體的生產(chǎn)，從而能夠控制過度的免疫反應(yīng)，并且具有能夠抑制破骨細(xì)胞的分化的效果，從而能夠以用于治療免疫疾病的用途使用，所述免疫疾病為因各種免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)異常所誘發(fā)的諸如自身免疫疾病、炎癥性疾病及移植排斥疾病。附圖說明圖1是示出將正常小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-281化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性、自身抗體生產(chǎn)程度、炎癥性細(xì)胞因子的生成及炎癥性基因的表達(dá)程度進(jìn)行分析的結(jié)果。此時(shí)，觀察用SD-281化合物處理后破骨細(xì)胞分化是否得到調(diào)節(jié)。圖2是示出將正常小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-281化合物進(jìn)行處理，對(duì)抑制Th17、促進(jìn)Treg活性、抑制過度活化的Th17的程度進(jìn)行分析的結(jié)果，以及對(duì)從小鼠骨髓細(xì)胞(BM)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的分化抑制能力進(jìn)行分析的結(jié)果。圖3是示出將被誘導(dǎo)出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-281化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性、自身抗體的生產(chǎn)程度、炎癥性細(xì)胞因子的生成及炎癥性基因的表達(dá)程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖4是示出將被誘導(dǎo)出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-281化合物進(jìn)行處理，對(duì)抑制Th17、促進(jìn)Treg活性、抑制破骨細(xì)胞分化的程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖5是示出將狼瘡發(fā)病的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-281化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性、自身抗體的生產(chǎn)程度、炎癥性細(xì)胞因子的生成及炎癥性基因的表達(dá)程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖6是示出將狼瘡發(fā)病的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-281化合物進(jìn)行處理，對(duì)抑制Th17及促進(jìn)Treg活性的程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖7是示出將從人外周血液分離的淋巴細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-281化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性及炎癥性細(xì)胞因子的生成程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖8是示出將正常小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-282化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性、自身抗體的生產(chǎn)程度、炎癥性細(xì)胞因子的生成及炎癥性基因的表達(dá)程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖9是示出將正常小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-282化合物進(jìn)行處理，對(duì)抑制Th17、促進(jìn)Treg活性、抑制破骨細(xì)胞分化及抑制過度活化的Th17的程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖10示出將被誘導(dǎo)出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-282化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性、自身抗體的生產(chǎn)程度、炎癥性細(xì)胞因子的生成及炎癥性基因的表達(dá)程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖11是示出將被誘導(dǎo)出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-282化合物進(jìn)行處理，對(duì)抑制Th17、促進(jìn)Treg活性、抑制破骨細(xì)胞分化的程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖12是示出將狼瘡發(fā)病的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-282化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性、自身抗體的生產(chǎn)程度、炎癥性細(xì)胞因子的生成及炎癥性基因的表達(dá)程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖13是示出將狼瘡發(fā)病的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-282化合物進(jìn)行處理，對(duì)抑制Th17及促進(jìn)Treg活性的程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖14是示出將從人外周血液分離的淋巴細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-282化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性及炎癥性細(xì)胞因子的生成程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖15是示出將正常小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-283化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性、自身抗體生產(chǎn)程度、炎癥性細(xì)胞因子的生成及炎癥性基因的表達(dá)程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖16是示出將正常小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-283化合物進(jìn)行處理，對(duì)抑制Th17、促進(jìn)Treg活性、抑制破骨細(xì)胞分化以及抑制過度活化的Th17的程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖17是示出將被誘導(dǎo)出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-283化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性、自身抗體的生產(chǎn)程度、炎癥性細(xì)胞因子的生成及炎癥性基因的表達(dá)程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖18是示出將被誘導(dǎo)出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-283化合物進(jìn)行處理，對(duì)抑制Th17、促進(jìn)Treg活性、抑制破骨細(xì)胞分化的程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖19是示出將狼瘡發(fā)病的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-283化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性、自身抗體的生產(chǎn)程度、炎癥性細(xì)胞因子的生成及炎癥性基因的表達(dá)程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖20是示出將狼瘡發(fā)病的小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-283化合物進(jìn)行處理，對(duì)抑制Th17及促進(jìn)Treg活性的程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖21是示出將從人外周血液分離的淋巴細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-283化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性及炎癥性細(xì)胞因子的生成程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖22是示出將正常小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-284化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性、炎癥性細(xì)胞因子的生成及抑制Th17及促進(jìn)Treg活性的程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖23是示出將從人外周血液分離的淋巴細(xì)胞作為對(duì)象，用不同濃度的SD-284化合物進(jìn)行處理，對(duì)細(xì)胞毒性及炎癥性細(xì)胞因子的生成程度進(jìn)行分析的結(jié)果。圖24是示出本發(fā)明的新型化合物對(duì)作為炎癥性細(xì)胞因子的TNF-a及IL-17生成的抑制活性進(jìn)行分析的結(jié)果。優(yōu)選實(shí)施方式本發(fā)明的特征為，最早查明可以使用下述新型化合物作為能夠有效預(yù)防或治療免疫疾病的新治療劑。因此，本發(fā)明可以提供以下述化學(xué)式表示的新型化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：所述式中，X為一個(gè)以上的F、Cl、Br或H；R為氫或烷基。更優(yōu)選地，所述化學(xué)式的化合物為選自下述表中記載的24個(gè)化合物中的任一種：本發(fā)明人進(jìn)行了用于確認(rèn)所述本發(fā)明中合成的新型化合物是否能夠治療免疫疾病的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，所述化合物均顯示出具有減少或抑制炎癥性細(xì)胞因子的生成的活性、抑制自身抗體的生產(chǎn)的活性、抑制破骨細(xì)胞的分化的活性，此時(shí)，所述炎癥性細(xì)胞因子并不限定于此，但可以為IL-17、IL-6、TNF-a、IFN-r、MMP-9或STAT-3。并且，本發(fā)明中可以得知所述化合物會(huì)抑制作為自身抗體的IgG、IgG1或IgG2a的生產(chǎn)，從而具有能夠抑制過度的免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)能力。進(jìn)而，可以確認(rèn)所述本發(fā)明的化合物具有促進(jìn)或增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(RegulatoryTcell)的活性，并且還具有減少或抑制作為病原細(xì)胞的Th17細(xì)胞活性的活性。因此，通過這些結(jié)果，本發(fā)明人可以確認(rèn)所述本發(fā)明的新合成的所述化合物作為能夠有效治療免疫疾病的新治療劑的可能性。另外，有在免疫體系中負(fù)責(zé)中心作用的細(xì)胞群的一種的T細(xì)胞作為對(duì)各種病原體的生物防護(hù)體系。就T細(xì)胞而言，在人體的胸腺生成，并經(jīng)過一系列分化過程而分化成具有固有特性的T細(xì)胞，完成分化的T細(xì)胞根據(jù)其功能大致分為1型輔助細(xì)胞(Th1)和2型輔助細(xì)胞(Th2)。其中，Th1細(xì)胞的主要功能是參與細(xì)胞介導(dǎo)免疫，Th2細(xì)胞參與體液性免疫，在免疫體系中這兩種細(xì)胞群體通過相互牽制，以使不得相互過度活化，從而維持免疫體系的均衡。因此，免疫疾病的大部分可以看作是由這兩種免疫細(xì)胞之間的不均衡引起的，例如，已知當(dāng)Th1細(xì)胞的活性非正常地增加時(shí)，會(huì)發(fā)生自身免疫疾病，當(dāng)Th2細(xì)胞的活性非正常地增加時(shí)，會(huì)發(fā)生由過敏反應(yīng)引起的免疫疾病。另外，根據(jù)對(duì)于Th1細(xì)胞分化的近期研究結(jié)果，隨著得知能夠調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞活性的、作為新群體的免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的存在，對(duì)于利用其治療免疫疾病的研究呈上升趨勢，Treg細(xì)胞具有會(huì)抑制非正常地活化的免疫細(xì)胞的功能而控制炎癥反應(yīng)的特性，因此，報(bào)告有很多通過增加Treg細(xì)胞活性的作用來治療免疫疾病的實(shí)驗(yàn)。并且，除了Treg細(xì)胞以外，還有在分化過程中形成的另一組Th17細(xì)胞，已知Th17細(xì)胞是在未分化T細(xì)胞的分化過程中經(jīng)過與Treg細(xì)胞的分化類似的過程而形成。即，Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分化是共同地在TGF-β的存在下進(jìn)行，但是Treg細(xì)胞不需要IL-6，而Th17細(xì)胞是在TGF-β和IL-6同時(shí)存在的狀況下進(jìn)行分化。并且，分化的Th17細(xì)胞的特征在于分泌IL-17。已發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞不同于Treg細(xì)胞，Th17細(xì)胞會(huì)參與免疫疾病中顯示的炎癥反應(yīng)的最前方，使炎癥反應(yīng)的信號(hào)最大化，從而使疾病的進(jìn)行加速化。因此，在自身免疫疾病中不能通過Treg細(xì)胞來控制的自身免疫疾病的情況下，將抑制Th17細(xì)胞活性作為靶的自身免疫疾病的治療劑的開發(fā)日益突出。然而，目前所使用的免疫疾病治療劑中使用最多的有阻斷T細(xì)胞中的信號(hào)變換路徑的免疫抑制劑，這些免疫抑制劑有產(chǎn)生毒性、感染、淋巴瘤、糖尿病、震顫(tremor)、頭痛、腹瀉、高血壓、惡心、腎功能障礙等副作用的問題。并且，除了通過抑制T細(xì)胞的活化來治療免疫疾病的方法以外，還有調(diào)節(jié)從免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的量的治療法及利用將從免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子作為靶的抗體的治療法正在開發(fā)中。然而，實(shí)質(zhì)上這些方法經(jīng)過臨床實(shí)驗(yàn)到適用于患者需要很長的時(shí)間，利用抗體的方法在抗體制備過程中需要太多的費(fèi)用?？紤]到這一點(diǎn)，本發(fā)明中提供的新型化合物具有炎癥性細(xì)胞因子生成抑制和Th17細(xì)胞抑制及Treg細(xì)胞活性作用能夠同時(shí)起作用的功能，從而與現(xiàn)有的治療劑相比，預(yù)期能夠更有效地治療免疫疾病。進(jìn)而，從本發(fā)明的一實(shí)施例的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的化合物還具有抑制STAT3基因表達(dá)的活性，近來，在多種癌種中發(fā)現(xiàn)有STAT1、STAT3及STAT5的被活化的形態(tài)，STAT3不僅在諸如白血病的血癌中被活化，而且在諸如乳腺癌、頭頸癌、黑素瘤、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌的多種實(shí)體癌中也被活化，從而成為重要的抗癌目標(biāo)物(HuaYuandRichardJove，NatureReviewCancer.，2004，8，945)。并且，已知STAT3的活性會(huì)抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)血管生成(angiogenesis)，并且誘導(dǎo)免疫赦免(WangT.etal.，NatureMedicine.，2004，10，48)。因此，STAT3活性抑制具有通過復(fù)合的抗癌機(jī)制來控制腫瘤的效果，STAT3蛋白質(zhì)不僅參與腫瘤的功能，而且還參與多種細(xì)胞內(nèi)功能，因此，其的阻礙劑也可以作為免疫抑制劑來開發(fā)。并且，作為參考，免疫體系在正常狀態(tài)下控制對(duì)自身抗原的特異性免疫反應(yīng)，并且也有抑制對(duì)外部抗原的免疫反應(yīng)的情況，可以例舉如孕婦對(duì)胎兒的反應(yīng)及對(duì)處于慢性感染狀態(tài)的微生物的免疫反應(yīng)。這些現(xiàn)象為能夠誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受的機(jī)制，已知是由克隆缺失(clonaldeletion)、克隆無能(anergy)及通過免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的能動(dòng)性管制所誘導(dǎo)的。對(duì)偶然獲得對(duì)移植抗原的免疫耐受的部分患者或?qū)嶒?yàn)性地誘導(dǎo)免疫耐受的動(dòng)物模型進(jìn)行調(diào)查，可以確認(rèn)上述三種機(jī)制均參與移植免疫耐受的事實(shí)，尤其，最近免疫調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞作為重要的細(xì)胞備受矚目，該細(xì)胞不僅參與管制移植免疫反應(yīng)，而且還參與管制自身免疫、腫瘤免疫、感染免疫反應(yīng)等活體的幾乎所有的免疫反應(yīng)。最近被發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，即免疫調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)可以大致分為自然性(natural)Treg和適應(yīng)性(adaptive)Treg細(xì)胞，作為自然性Treg的CD4+CD25+T細(xì)胞自該細(xì)胞在胸腺新形成時(shí)開始具有免疫抑制功能，在正常個(gè)體的外周CD4+T淋巴細(xì)胞中以5～10％的頻度存在。到目前為止，還沒有正確掌握該細(xì)胞的免疫抑制機(jī)制，但是最近發(fā)現(xiàn)稱作Foxp3的基因的表達(dá)控制因子對(duì)該細(xì)胞的分化和活性起到重要作用。并且，當(dāng)外周自然性T細(xì)胞在特定環(huán)境下受到自身抗原或外部抗原的刺激時(shí)，能夠分化成顯示免疫抑制效果的細(xì)胞，將其稱為適應(yīng)性(adaptive)或誘導(dǎo)性(inducible)Treg，分泌IL-10的Tr1、分泌TGF-β的Th3及CD8Ts等屬于其中。并且，就T細(xì)胞而言，除了Treg細(xì)胞以外，通過分化過程還分化成Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞共同地在TGF-β的存在下形成，但是Treg不需要IL-6，而Th17細(xì)胞是在TGF-β和IL-6同時(shí)存在的狀況下進(jìn)行分化，并且其特征在于分泌IL-17。并且，Th17細(xì)胞具有以下特性，即，使炎癥反應(yīng)的信號(hào)最大化，從而具有使疾病的進(jìn)行加速化的細(xì)胞毒性。因此，分化成Th17細(xì)胞或抑制活性是能夠治療免疫疾病的方法中的一種。并且，Treg細(xì)胞表達(dá)Foxp3，F(xiàn)oxp3主要存在于源自胸腺(thymus)的免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(RegulatoryTcell)，F(xiàn)oxp3是存在于具有CD4+CD25+表面抗原的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(transcriptionalfactor)，F(xiàn)oxp3的功能在于，當(dāng)識(shí)別出對(duì)表達(dá)Foxp3的T細(xì)胞的抗原時(shí)，對(duì)抗原具有低反應(yīng)性，并同時(shí)在不表達(dá)從胸腺分化出來的Foxp3的CD4+CD25-T細(xì)胞中，對(duì)潛在的能夠誘發(fā)自身免疫癥的T細(xì)胞起到作為抑制IL-2的生成和細(xì)胞分裂現(xiàn)象的抑制性T細(xì)胞(suppressorTcell)的作用。并且，已發(fā)現(xiàn)Foxp3通過表達(dá)Foxp3的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及與其細(xì)胞-細(xì)胞之間接觸(cell-cellcontact)，對(duì)于CD25-T細(xì)胞不僅起到抑制IL-2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的功能，還起到受作為轉(zhuǎn)錄因子的NFAT的影響的IL-4、IFN-γ等的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的功能。因此，就表達(dá)起到如上所述的作用的Foxp3的T細(xì)胞而言，通過抑制或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用來應(yīng)用于免疫疾病的治療。并且，一直試圖將表達(dá)存在于人的Foxp3的CD4T細(xì)胞的自身抗原特異性T細(xì)胞(self-antigenspecificTcellclone)，通過高濃度的IL-2細(xì)胞因子處理及與抗-CD3、抗-CD28抗體的組合處理來增加其數(shù)量，并用作細(xì)胞治療方法。因此，當(dāng)觀察這些現(xiàn)有的與免疫疾病治療有關(guān)的技術(shù)開發(fā)現(xiàn)狀時(shí)，本發(fā)明中提供的新型化合物解決了現(xiàn)有技術(shù)中未能解決的問題，并同時(shí)顯示出有效的藥理效果，從而能夠作為免疫疾病治療劑而非常有效地使用。因此，本發(fā)明中提供的所述用于預(yù)防或治療免疫疾病的藥學(xué)組合物可以包含本發(fā)明的所述新型化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。所述鹽優(yōu)選為由藥學(xué)上可接受的游離酸(freeacid)形成的酸加成鹽，所述游離酸可以使用有機(jī)酸和無機(jī)酸。所述有機(jī)酸包含檸檬酸、醋酸、乳酸、酒石酸、馬來酸、富馬酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、間位磺酸乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、谷氨酸及天冬氨酸，但并不限于此。并且，所述無機(jī)酸包含鹽酸、溴酸、硫酸和磷酸，但并不限于此。根據(jù)本發(fā)明的化合物可以使用天然分離的，或者通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)合成方法制備的，本發(fā)明人通過下述實(shí)施例中記載的方法來合成制備了這些化合物。本發(fā)明中，所述“免疫疾病”表示哺乳類免疫體系的組成成分導(dǎo)致或介導(dǎo)哺乳類的病理狀態(tài)，或者作出其他貢獻(xiàn)的疾病。并且，可以包含免疫反應(yīng)的刺激或中斷對(duì)該疾病的進(jìn)行有補(bǔ)償效應(yīng)的所有疾病，本發(fā)明中可以包含由過敏性免疫反應(yīng)導(dǎo)致的疾病。這些免疫疾病例如可以包含自身免疫疾?。谎装Y性疾??；以及細(xì)胞、組織或器官的移植排斥(transplantationrejection)疾病等，但并不限定于此。并且，就所有正常個(gè)體來說，最重要的特性中之一為，對(duì)組成自身(self)的抗原物質(zhì)不會(huì)產(chǎn)生有害的反應(yīng)，而對(duì)非自身(non-self)抗原具有能夠識(shí)別并進(jìn)行反應(yīng)而去除的能力。像這種對(duì)自身抗原的活體的無應(yīng)答稱作免疫無應(yīng)答性(immunologicunresponsiveness)或耐受(tolerance)。然而，當(dāng)誘導(dǎo)或繼續(xù)維持這種自身耐受方面發(fā)生問題時(shí)，則會(huì)對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，由此會(huì)產(chǎn)生攻擊自身組織的現(xiàn)象，由這種過程所產(chǎn)生的疾病稱作“自身免疫疾病”。并且，“炎癥性疾病”是指因炎癥誘發(fā)因子或放射線照射等有害的刺激，使人體免疫體系過度亢進(jìn)，從而由炎癥誘發(fā)物質(zhì)(炎癥性細(xì)胞因子)所誘發(fā)的疾病，其中所述炎癥誘發(fā)物質(zhì)為諸如巨噬細(xì)胞的免疫細(xì)胞分泌的TNF-α(tumornecrosisfactor-α(腫瘤壞死因子-α))、IL-1(interleukin-1(白介素-1))、IL-6、前列腺素(prostagladin)、白三烯(leukotriene)或一氧化氮(nitricoxide，NO)等。并且，為了器官移植的成功，需要克服要移植的細(xì)胞及接受者對(duì)器官的免疫排斥反應(yīng)。移植免疫排斥反應(yīng)的主要介質(zhì)為T細(xì)胞，T細(xì)胞受體(Tcellreceptor)識(shí)別移植物(graft)上表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生移植排斥反應(yīng)。主要組織相容性復(fù)合體由糖蛋白抗原的種類所決定，組織相容性抗原不一致所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)成為阻礙移植成功的障礙，因此組織相容性抗原檢查的正確性和一致與否的調(diào)查是非常重要的因素。人有多種組織相容性抗原，其中有包含HLA-A、-B、-C的I類抗原，還有包含HLA-DR、-DP、-DQ的Ⅱ類抗原。這些抗原的生物學(xué)功能是向淋巴細(xì)胞傳遞抗原，I類抗原是在大部分的有核細(xì)胞中表達(dá)，并通過其傳遞的抗原是通過CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞來識(shí)別。Ⅱ類抗原是在已知為抗原呈遞細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、活化的T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等中表達(dá)，并起到向CD4+T淋巴細(xì)胞傳遞抗原的功能。傳遞到T淋巴細(xì)胞的抗原結(jié)合于T淋巴細(xì)胞受體，從而使T淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原，在移植過程中，與自己的抗原相比，會(huì)以高的頻度識(shí)別源自其他人的組織相容性抗原。捐贈(zèng)者或患者的整體T淋巴細(xì)胞中的1～10％左右將識(shí)別源自患者或捐贈(zèng)者的組織相容性抗原，并通過對(duì)其的反應(yīng)進(jìn)行增殖，并產(chǎn)生一系列的免疫反應(yīng)，這稱作“同種異體反應(yīng)(Alloresponse)”。并且，捐贈(zèng)者的T淋巴細(xì)胞對(duì)患者的組織相容性抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的現(xiàn)象稱作“移植物抗宿主病(GVDH)”，另一方面，患者的T淋巴細(xì)胞對(duì)捐贈(zèng)者的組織相容性抗原產(chǎn)生的反應(yīng)稱作“移植排斥反應(yīng)(graftrejection)”。因此，為了減少在移植過程中發(fā)生的免疫反應(yīng)引起的非正常反應(yīng)而在使用免疫抑制劑，這些免疫抑制劑的共同目的是抑制對(duì)移植物的T細(xì)胞-介導(dǎo)免疫反應(yīng)。最近，正試圖利用調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來抑制免疫反應(yīng)，從而治療移植排斥疾病。并且，本發(fā)明中能夠預(yù)防或治療的所述免疫疾病的種類可以包含類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、白塞氏病、多發(fā)性肌炎或皮肌炎、自身免疫性血細(xì)胞減少癥、自身免疫性心肌炎、特應(yīng)性皮炎、哮喘、原發(fā)性肝硬化、皮肌炎、肺出血腎炎綜合征、自身免疫性腦膜炎、干燥綜合征、狼瘡、愛迪生氏病、斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克羅恩病、胰島素依賴型糖尿病、營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥、附睪炎、腎小球腎炎、格雷夫斯病、格林-巴利綜合征、橋本氏病、溶血性貧血、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力癥、尋常型天皰瘡、銀屑病、風(fēng)濕熱、結(jié)節(jié)病、硬皮癥、脊柱關(guān)節(jié)病、甲狀腺炎、血管炎、白癜風(fēng)、粘液性水腫、惡性貧血、線粒體相關(guān)綜合征及潰瘍性結(jié)腸炎等，但并不限定于此。因此，本發(fā)明的所述組合物可以用作能夠預(yù)防或治療免疫疾病的藥學(xué)組合物。就所述“治療”而言，在沒有提及其它意思的情況下，是指適用所述術(shù)語的疾病或病癥，或者使所述疾病或病癥中的一種以上的癥狀逆轉(zhuǎn)或緩解，或者抑制或預(yù)防其進(jìn)行，本文中所使用的所述術(shù)語治療是指“進(jìn)行治療”被定義為如上所述的情況下進(jìn)行治療的行為。因此，對(duì)于哺乳動(dòng)物，免疫疾病的“治療”或“治療療法”可以包含下述中的一種以上。(1)阻礙免疫疾病的成長，即阻止其發(fā)展，(2)預(yù)防免疫疾病的擴(kuò)撒，即，預(yù)防轉(zhuǎn)移，(3)減輕免疫疾病，(4)預(yù)防免疫疾病的復(fù)發(fā)，以及(5)緩解(palliating)免疫疾病的癥狀。本發(fā)明的用于預(yù)防或治療免疫疾病的組合物可以單獨(dú)包含藥學(xué)上有效量的本文的所述新型化合物中的一種以上的化合物或其鹽，或者可以包含一種以上的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。所述藥學(xué)上有效的量是指能夠預(yù)防、改善及治療免疫疾病的癥狀的充分的量。本發(fā)明的所述新型化合物或其鹽的藥學(xué)上有效的量可以根據(jù)免疫疾病癥狀的程度、患者的年齡、體重、健康狀態(tài)、性別、施用途徑及治療時(shí)間等來適當(dāng)?shù)刈兓?。并且，所述“藥學(xué)上可接受”是指生理學(xué)上可接受且向人施用時(shí)通常不會(huì)引起諸如胃腸障礙、眩暈癥的過敏反應(yīng)或與其類似的反應(yīng)的組合物。所述的載體、賦形劑和稀釋劑的實(shí)例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。此外，可以進(jìn)一步包括填充劑、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、香料、乳化劑及防腐劑等。并且，本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域中公知的方法來進(jìn)行劑型化，以向哺乳動(dòng)物施用后，能夠提供活性成分的迅速、持續(xù)或延遲的釋放。劑型可以是粉末、顆粒、片劑、乳劑、糖漿、氣霧劑、軟質(zhì)或硬質(zhì)明膠膠囊、無菌注射溶液、無菌粉末的形式。并且，本發(fā)明的用于預(yù)防或治療免疫疾病的組合物可以通過各種途徑進(jìn)行施用，所述途徑包括口服、經(jīng)皮、皮下，靜脈或肌肉，活性成分的施用量可以根據(jù)施用途徑、患者的年齡、性別、體重及患者的嚴(yán)重程度等各種因素來適當(dāng)?shù)剡x擇，本發(fā)明的用于預(yù)防或治療免疫疾病的組合物可以與公知的具有預(yù)防、改善或治療免疫疾病癥狀效果的化合物并行施用。此外，本發(fā)明提供包含所述化合物作為有效成分的組合物的應(yīng)用，所述化合物用于制備用于預(yù)防或治療免疫疾病的醫(yī)藥。包含本發(fā)明的化合物作為有效成分的本發(fā)明的組合物可以用于制備用于預(yù)防或治療免疫疾病的藥物。此外，本發(fā)明提供預(yù)防或治療免疫疾病的方法，所述方法包括向哺乳動(dòng)物施用治療上有效量的本發(fā)明的藥學(xué)組合物。這里使用的術(shù)語“哺乳動(dòng)物”是指作為治療、觀察或?qū)嶒?yàn)的對(duì)象的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是指人。這里使用的術(shù)語“治療上有效量”是指研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)生或其他臨床醫(yī)師所想到的從組織體系、動(dòng)物或人中誘導(dǎo)生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的有效成分或藥學(xué)組合物的量，其包含能夠誘導(dǎo)所治療的疾病或障礙癥狀緩解的量。本發(fā)明的對(duì)有效成分的治療上有效施用量及施用次數(shù)是根據(jù)希望的效果會(huì)有變化，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地決定最適當(dāng)?shù)氖┯昧?，并且可以根?jù)疾病的種類、疾病的嚴(yán)重程度、組合物中含有的有效成分或其它成分的含量、劑型的種類及患者的年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別及飲食、施用時(shí)間、施用途徑及組合物的分泌率、治療時(shí)間、同時(shí)使用的藥物等多種因素來進(jìn)行調(diào)節(jié)。進(jìn)而，本發(fā)明可以提供免疫調(diào)節(jié)劑，其包含上述本發(fā)明中提供的化合物作為有效成分。此外，本發(fā)明可以提供在細(xì)胞中減少Th17細(xì)胞活性的方法，其通過在試管內(nèi)用所述本發(fā)明的化合物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)，，還可以提供在細(xì)胞中增加Treg細(xì)胞活性的方法，其通過在試管內(nèi)用本發(fā)明的新型化合物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)。具體實(shí)施方式以下，通過實(shí)施例來更詳細(xì)說明本發(fā)明。這些實(shí)施例是用于更加具體說明本發(fā)明的，本發(fā)明的范圍并不限定于這些實(shí)施例。<實(shí)施例1>本發(fā)明的具有免疫疾病治療效果的新型化合物的合成通過下述反應(yīng)式的方法制備了以下述表1的化學(xué)式表示的新型化合物。具體地，首先在密封反應(yīng)器中分別將苯胺化合物(1.0mmol)溶解在乙腈溶劑中，然后添加雙氰胺(1.0mmol)和濃硫酸(1.0mmol)并密封，然后在175℃下攪拌1個(gè)小時(shí)。然后冷卻至室溫，從而生成白色固體，并且去除溶劑后用己烷和異丙醇進(jìn)行洗滌，從而合成白色固體形態(tài)的下述化合物。就總24個(gè)化合物的合成過程而言，除了苯胺化合物不同以外，均在相同的條件下進(jìn)行了合成，各化合物的合成中使用的苯胺的種類及合成的化合物的化學(xué)式名稱和結(jié)構(gòu)式如下述表所示。為了合成所述化合物而使用的代表反應(yīng)式如下所示。雙氰胺苯胺上述式中R＝烷基，X＝一個(gè)以上的F、Cl或Br表1通過1H-NMR分析，對(duì)通過如上所述的方法合成的本發(fā)明的衍生物化合物進(jìn)行了鑒定，其結(jié)果如下述表所記載。表2<實(shí)驗(yàn)方法><1>分析對(duì)象細(xì)胞本發(fā)明人為了確認(rèn)本文中新合成的上述各化合物能否治療及預(yù)防免疫疾病，基于如下所述的實(shí)驗(yàn)組實(shí)施了下述實(shí)驗(yàn)。表3本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中實(shí)施的實(shí)驗(yàn)組更具體地，就所述正常小鼠組而言，以從DBA/1J系正常小鼠獲得的脾細(xì)胞作為對(duì)象，在用本發(fā)明的化合物進(jìn)行處理之前，在抗(anti)-CD30.5ug/ml刺激條件下培養(yǎng)72小時(shí)，使所述細(xì)胞活化后使用。此外，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠是使用DBA/1J系正常小鼠來制備的，對(duì)于所述正常小鼠，在0.1N乙酸溶液中溶解II型膠原(Cll)，使其達(dá)到4mg/ml，然后用透析緩沖液(dialysisbuffer，50mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)，0.2N氯化鈉(Nacl))進(jìn)行透析，并與含結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的完全弗氏佐劑(completeFreund'sadjuvant，CFA，Chondrex)以相同的量混合，然后向小鼠的尾巴基底部進(jìn)行皮下注射，每只注射100μl(即，100μl/100μg)的免疫原(第一次注射)。然后在兩周后，將相同的Cll與相同量的不完全弗氏佐劑(incompleteFreud'sadjuvant，IFA，Chondrex)混合，然后以100μl(即，100μl/100μg)的量對(duì)一條后退(腳底(footpad))進(jìn)行第二次注射，由此制備了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的小鼠，并且從制備的關(guān)節(jié)炎小鼠獲得脾細(xì)胞并使用，同樣在抗-CD30.5ug/ml刺激條件下培養(yǎng)72小時(shí)，使所述細(xì)胞活化后使用。此外，作為狼瘡發(fā)病小鼠模型使用了本領(lǐng)域中作為狼瘡模型使用的sanroque小鼠，作為人P.B組使用了從人外周血液獲得的淋巴細(xì)胞。所述從各小鼠及人外周血液分離脾細(xì)胞及分離淋巴細(xì)胞是使用本領(lǐng)域已知的通常的方法來實(shí)施的，并且，獲得的細(xì)胞均在抗-CD30.5ug/ml刺激條件下培養(yǎng)72小時(shí)，使所述細(xì)胞活化后使用。<2>細(xì)胞毒性分析(MTT分析)為了確認(rèn)本發(fā)明中合成的化合物是否對(duì)細(xì)胞誘發(fā)毒性，實(shí)施了MTT分析，將對(duì)象細(xì)胞作為對(duì)象，將各細(xì)胞以每孔2×105個(gè)的細(xì)胞數(shù)添加到孔板(96wellplate(96孔板))中，用不同濃度的本發(fā)明的化合物進(jìn)行處理，并培養(yǎng)72小時(shí)，然后在細(xì)胞中添加MTT溶液(0.5％3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide))，并再培養(yǎng)4小時(shí)，然后用ELISA(enzymelinkedimmunospecificassay(酶聯(lián)免疫特異性測定))測定儀在540nm下測定了吸光度，并觀察有無細(xì)胞毒性。<3>根據(jù)自身抗體生產(chǎn)的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)分析為了確認(rèn)本發(fā)明的新型化合物是否影響血清內(nèi)總IgG和總IgG1及IgG2a抗體的生產(chǎn)，實(shí)施了酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)。因此，將用本發(fā)明的化合物處理的細(xì)胞作為對(duì)象，利用夾心(sandwich)ELISA測定了總(Total)IgG和抗體特異性IgG1及IgG2a。在96孔板(wellplate)中，在常溫下分別用單克隆性抗-小鼠(anti-mouse)IgG和CII進(jìn)行1小時(shí)反應(yīng)，然后用阻斷溶液(1％BSA/PBST)阻斷了非特異性結(jié)合。將小鼠對(duì)照血清(Mousecontorlserum)連續(xù)進(jìn)行稀釋，每次稀釋1/2，并將其用作標(biāo)準(zhǔn)(standard)，并且添加細(xì)胞培養(yǎng)上清液并在室溫反應(yīng)1小時(shí)。之后，使抗-小鼠IgG-HRP、抗-小鼠IgG2a-HRP在室溫反應(yīng)1小時(shí)，并洗滌4次，然后用TMB系統(tǒng)進(jìn)行顯色，并在450nm波長下測定了吸光度。<4>對(duì)炎癥性細(xì)胞因子生成帶來的影響分析本發(fā)明人為了確認(rèn)本文的新型化合物能否影響作為炎癥及免疫疾病原因物質(zhì)的炎癥性細(xì)胞因子的生成，將各實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)象，對(duì)IL-17、IL-6、TNF-a、IFN-r、MMP-9、STAT-3的生成程度及這些細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)程度進(jìn)行了分析，就炎癥性細(xì)胞因子的生成程度而言，將用本發(fā)明的化合物進(jìn)行處理并培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)象，獲得上清液，然后用酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)進(jìn)行了分析，具體地，使所述細(xì)胞與對(duì)各細(xì)胞因子的特異性抗體(抗-IL-17、抗-IL-6、抗-TNF-a、抗-IFN-r、抗-MMP-9、抗-STAT-3)在4℃下反應(yīng)一整夜，然后用阻斷溶液(1％BSA/PBST)阻斷了非特異性結(jié)合。之后，使生物素化(biotinylated)的所述各抗體在室溫反應(yīng)2小時(shí)后洗滌4次，然后將ExtraAvidin-堿性磷酸酶綴合物(ExtraAvidin-AlkalinePhosphataseconjugate)稀釋并添加，并在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。之后，添加PNPP/DEA溶液并進(jìn)行顯色，然后在405nm波長下測定了吸光度。并且，就炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)程度分析而言，從分析對(duì)象細(xì)胞獲得總RNA后，使用對(duì)IL-17、IL-6、TNF-a及IFN-r進(jìn)行特異性結(jié)合的引物，實(shí)施RT-PCR，并分析了mRNA的量。<5>Th17細(xì)胞抑制及Treg細(xì)胞誘導(dǎo)活性分析進(jìn)而，本發(fā)明人為了確認(rèn)本發(fā)明的新型化合物能否抑制與炎癥誘發(fā)相關(guān)的Th17細(xì)胞的分化及活性，以及能否促進(jìn)具有免疫調(diào)節(jié)能力的Treg細(xì)胞的活性，使用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行了分析。即，將T細(xì)胞作為對(duì)象，以Th17細(xì)胞或Treg細(xì)胞分化條件培養(yǎng)細(xì)胞，然后通過流式細(xì)胞分析儀分析了Foxp3+Treg細(xì)胞或Il-17+Th17的細(xì)胞數(shù)。<6>破骨細(xì)胞分化抑制效果為了調(diào)查在破骨細(xì)胞分化過程中的本發(fā)明的新型化合物的影響，獲得小鼠的骨髓細(xì)胞，并誘導(dǎo)該骨髓細(xì)胞在MCSF(macrophagecolony-stimulatingfactor(巨噬細(xì)胞集落刺激因子))及溶解性RANKL的存在下進(jìn)行分化(參照Sugatanietal.2003，J.Cell.Biochem.90，59-67方法)。從6周齡小鼠的股骨和脛骨準(zhǔn)備了骨髓細(xì)胞，在37℃下，在8孔腔室載玻片(3×105細(xì)胞/孔；NalgeNunc國際公司，內(nèi)珀維爾，伊利諾伊州)中在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)(30ng/ml：R&D系統(tǒng)，明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州)的存在下放置，3天后去除包括淋巴細(xì)胞的非粘附性細(xì)胞，然后在M-CSF(30ng/ml)及RANKL(30ng/ml，施特拉特曼，漢堡，德國)的存在下，進(jìn)一步培養(yǎng)粘附性破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞4天，從而獲得破骨細(xì)胞。這時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基在添加有M-CSF及RANKL的期間更換了一次。固定細(xì)胞并利用染色試劑盒(sigma)，根據(jù)制造商的協(xié)議，對(duì)TRAP(tartrate-resistantacidphosphatase(抗酒石酸酸性磷酸酶))實(shí)施了染色。在各腔室中用顯微鏡(40倍率)觀察的結(jié)果，包含三個(gè)以上的核的TRAP陽性多核細(xì)胞計(jì)數(shù)為破骨細(xì)胞(Sugatani.etal.2003，J.Cell.biochem.90，59-67)。并且，將骨髓細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，并在M-CSF及RANKL的存在下用本發(fā)明的新型化合物以各濃度進(jìn)行處理，然后培養(yǎng)48小時(shí)，之后將細(xì)胞對(duì)TRAP進(jìn)行染色，并對(duì)TRAP陽性多核細(xì)胞進(jìn)行了計(jì)數(shù)。<實(shí)驗(yàn)例1>本發(fā)明的新型化合物的細(xì)胞毒性分析結(jié)果為了確認(rèn)所述實(shí)施例1中合成的新型化合物是否具有細(xì)胞毒性，將上述表3中記載的各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞作為對(duì)象，通過MTT分析確認(rèn)了細(xì)胞生存率。即，以每孔2×105個(gè)的細(xì)胞數(shù)添加各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，并用本發(fā)明的新型合成化合物以不同濃度進(jìn)行處理，然后分析了細(xì)胞生存率。其結(jié)果為，將SD-281、SD-282、SD-283、SD-284化合物與對(duì)照組或二甲雙胍處理組進(jìn)行比較時(shí)，沒有觀察到根據(jù)各細(xì)胞濃度處理的細(xì)胞毒性，由此可以知道這些化合物對(duì)正常細(xì)胞及病癥組細(xì)胞均沒有細(xì)胞毒性。<實(shí)驗(yàn)例2>本發(fā)明的新型化合物對(duì)根據(jù)自身抗體生產(chǎn)的免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)效果的結(jié)果為了調(diào)查在所述實(shí)施例1中合成的新型化合物是否影響根據(jù)自身抗體生產(chǎn)的免疫反應(yīng)，從上述的4個(gè)組的小鼠通過眼窩采血來從各小鼠組獲得血液，然后分離血清并測定了IgG、IgG1、IgG2a的量。分析結(jié)果為，本文的化合物均顯示出以下特征，即在病癥條件下處于自身抗體生產(chǎn)狀態(tài)的免疫球蛋白(總IgG、IgG1、IgG2)的量隨化合物的處理濃度減少，并且可以知道下述表4中記載的化合物的抑制過度的免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)功能優(yōu)異。表4單位：ng/mlA:正常小鼠，B：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞，C：狼瘡細(xì)胞，D：人外周血液的淋巴細(xì)胞<實(shí)驗(yàn)例3>炎癥性細(xì)胞因子的生成及基因表達(dá)抑制分析結(jié)果就用于確認(rèn)本發(fā)明的新型化合物是否抑制能夠誘導(dǎo)炎癥及免疫疾病的炎癥性細(xì)胞因子的生成，以及進(jìn)而確認(rèn)是否在基因水平上抑制這些因子的實(shí)驗(yàn)而言，通過在所述<4>中記載的對(duì)炎癥性細(xì)胞因子生成帶來的影響分析中記述的方法來實(shí)施了實(shí)驗(yàn)。分析結(jié)果顯示本發(fā)明中合成的新型化合物均在作為炎癥性細(xì)胞因子的IL-17、IL-6、TNF-a、IFN-r、MMP-9、STAT-3的生成及基因水平上的表達(dá)方面均依賴于處理濃度而進(jìn)行抑制。因此，通過這種結(jié)果可以得知本發(fā)明的新型化合物能夠通過抑制炎癥性細(xì)胞因子的生成來預(yù)防及治療免疫疾病。表5本發(fā)明的新型化合物對(duì)炎癥性細(xì)胞因子生成帶來的影響分析單位：ng/mlA:正常小鼠，B：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞，C：狼瘡細(xì)胞，D：人外周血液的淋巴細(xì)胞表6將正常小鼠細(xì)胞作為對(duì)象，SD-284化合物對(duì)炎癥性細(xì)胞因子的生成帶來的影響分析IL-17IL-6TNF-αIFN-γ對(duì)照組7.61.80.710SD-2846.50.70.54.9單位：ng/ml表7本發(fā)明的化合物抑制炎癥性因子活性的分析單位：基因表達(dá)A:正常小鼠，B：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞，C：狼瘡細(xì)胞<實(shí)驗(yàn)例4>Th17及Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)活性分析結(jié)果本發(fā)明人為了調(diào)查本文的新型化合物能否同時(shí)調(diào)節(jié)分泌作為炎癥性細(xì)胞因子的IL-17的Th17細(xì)胞的分化及活性和具有免疫調(diào)節(jié)能力的Treg細(xì)胞的分化及活性，實(shí)施了所述<5>中記載的Th17細(xì)胞抑制及Treg細(xì)胞誘導(dǎo)活性分析。分析結(jié)果為，本發(fā)明的新型化合物均顯示出在Th17分化條件下具有以下活性，即減少病癥細(xì)胞中的IL-17表達(dá)的活性，以及抑制分化成作為病癥細(xì)胞的Th17細(xì)胞的活性，并且在Treg條件下，作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的標(biāo)記的Foxp3的表達(dá)及Foxp3表達(dá)細(xì)胞數(shù)會(huì)增加。進(jìn)而，可以得知能夠有效地抑制過度活化的Th17細(xì)胞。表8本發(fā)明的化合物對(duì)Th17抑制及Treg活性帶來的影響分析A:正常小鼠，B：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞，C：狼瘡細(xì)胞表9本發(fā)明的化合物在Th17分化條件下對(duì)Th17帶來的影響分析因此，本發(fā)明人通過這些結(jié)果可以得知本發(fā)明的新型化合物不是對(duì)Th17及Treg進(jìn)行個(gè)別調(diào)節(jié)，而是能夠同時(shí)調(diào)節(jié)，從而能夠更有效地誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)能力，由此可以得知這些化合物可以用作更有效的免疫調(diào)節(jié)劑或免疫疾病治療劑。<實(shí)驗(yàn)例5>破骨細(xì)胞分化抑制分析結(jié)果本發(fā)明人為了確認(rèn)本發(fā)明的新型化合物能否有效治療免疫疾病，在用M-CSF及RANKL刺激的細(xì)胞中，通過作為破骨細(xì)胞分化因子的TRAP染色來確認(rèn)本發(fā)明的化合物對(duì)破骨細(xì)胞分化抑制程度。分析結(jié)果為，本發(fā)明的新型化合物均顯示出，表達(dá)作為破骨細(xì)胞分化標(biāo)記的TRAP的細(xì)胞數(shù)會(huì)減少。通過所述結(jié)果可以得知，本發(fā)明的新型化合物能夠有效地減少誘發(fā)關(guān)節(jié)破壞的破骨細(xì)胞的分化能力，從而能夠有效使用于由破骨細(xì)胞的分化所引起的疾病的預(yù)防及治療。表10本發(fā)明的化合物的破骨細(xì)胞分化抑制效果分析A:正常小鼠，B：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞<實(shí)驗(yàn)例6>將小鼠脾細(xì)胞作為對(duì)象，作為炎癥性細(xì)胞因子的TNF-a及IL-17的生成抑制效果進(jìn)而，本發(fā)明人為了將在所述本發(fā)明的實(shí)施例中合成的各化合物作為對(duì)象來對(duì)炎癥性細(xì)胞因子的抑制效果進(jìn)行有效性評(píng)價(jià)，對(duì)從DBA1/J正常小鼠組的脾臟獲得的細(xì)胞，用0.5ug/ml濃度的抗小鼠CD3進(jìn)行處理，并用200及500uM濃度的各化合物共同刺激，然后通過ELISA法來確認(rèn)了炎癥性細(xì)胞因子IL-17和TNFa的抑制程度。其結(jié)果如圖24所示，可以看出SD-563、SD-564、SD-566、SD-567、SD-573、SD-574、SD-580的化合物具有能夠同時(shí)抑制炎癥性細(xì)胞因子IL-17和TNFa的活性，并且這種抑制效果依賴于濃度而增加。對(duì)于本發(fā)明，以優(yōu)選實(shí)施例作為中心進(jìn)行了說明。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員應(yīng)能夠理解本發(fā)明可以在不超出本發(fā)明的本質(zhì)特性的范圍內(nèi)以變形的形態(tài)體現(xiàn)。因此，對(duì)于公開的實(shí)施例，不應(yīng)以限定的觀點(diǎn)考慮，而應(yīng)當(dāng)以說明的觀點(diǎn)考慮。本發(fā)明的范圍并不是體現(xiàn)在前述的說明中，而是體現(xiàn)在權(quán)利要求書中，并應(yīng)解釋為與其在同等范圍內(nèi)的所有不同點(diǎn)均包括在本發(fā)明中。當(dāng)前第1頁1 2 3