本發(fā)明涉及具有抗菌活性和改良生理穩(wěn)定性的試劑及用于其生產(chǎn)的方法和中間體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述試劑用于治療包括人在內(nèi)的動(dòng)物的細(xì)菌感染的用途。
背景技術(shù):
因細(xì)菌感染引起的疾病在人類和其他哺乳動(dòng)物中有顯著發(fā)病率和死亡率。革蘭氏陽(yáng)性菌具有由剛性細(xì)胞壁包圍的典型脂雙層胞質(zhì)膜。細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成,肽聚糖是一種由n-乙酰葡糖胺和n-乙酰胞壁酸經(jīng)包含交替的d-氨基酸和l-氨基酸的肽交聯(lián)而成的聚合物。
抗生素,最常見的代表是萬古霉素,其糖肽基團(tuán)通過在細(xì)菌細(xì)胞壁的合成過程中阻斷肽聚糖的糖組分和肽組分的交聯(lián),從而抑制敏感細(xì)菌的細(xì)胞壁合成。沒有足夠的交聯(lián),細(xì)胞壁變得物理上脆弱,且細(xì)菌在經(jīng)受滲透壓變化時(shí)裂解。萬古霉素以高親和力在交聯(lián)前與肽聚糖前體的五肽部分的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)端結(jié)合。d-ala-d-ala二肽與萬古霉素的肽骨架形成互補(bǔ)氫鍵。據(jù)認(rèn)為,萬古霉素-肽聚糖復(fù)合物物理性地阻斷轉(zhuǎn)肽酶的作用,從而抑制可令肽聚糖加強(qiáng)的肽交聯(lián)橋的形成。此活動(dòng)也導(dǎo)致肽聚糖前體在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的積累。
關(guān)于抗生素耐性有大量記載,抗性菌株對(duì)人類健康是一個(gè)潛在的重大威脅。已有對(duì)萬古霉素的幾種耐性的記載,源于對(duì)脂類ⅱ肽結(jié)構(gòu)的修飾或細(xì)菌細(xì)胞壁組成的改變。
已用于對(duì)抗抗生素抗性菌株的出現(xiàn)的方法,包括改進(jìn)現(xiàn)有抗生素以提高其對(duì)抗耐性微生物的效力,或發(fā)現(xiàn)新的肽類抗生素,用其通過透化細(xì)菌質(zhì)膜來殺死目標(biāo)。第一種方法的示例最近集中于創(chuàng)造糖肽類衍生物如萬古霉素。
使用偶聯(lián)劑2-(1-羥基苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)進(jìn)行萬古霉素羧基端的功能化,已在溶液和固相的情形下連接短肽序列中取得了成功(sundram,u.n.andgriffin,j.h.(1995)generalandefficientmethodforthesolution-andsolid-phasesynthesisofvancomycincarboxamidederivativesj.org.chem.601102-1103)。萬古霉素和相關(guān)抗生素的氨基糖和末端胺部分也已派生得到。在還原性烷基化方法中,創(chuàng)造了一系列在萬古胺糖(vancosaminesugar)上進(jìn)行烷基化的化合物,其中一些對(duì)耐萬古霉素的細(xì)菌菌株的活性顯示出大幅提高(cooperrdg,snydernj,zweifelmj,staszakma,wilkiesc,nicasti,mullendl,butlertf,rodriguezmj,huffbe,thompsonrc.reductivealkylationofglycopeptideantibiotics:synthesisandantibacterialactivity.jantibiot49(1996):575–581;androdriguez,m.j.,n.j.snyder,m.j.zweifel,s.c.wilkie,d.r.stack,r.d.cooper,t.i.nicas,d.l.mullen,t.f.butler,andr.c.thompson.1998.novelglycopeptideantibiotics:n-alkylatedderivativesactiveagainstvancomycin-resistantenterococcij.antibiot.(tokyo),51,560-569)。
一種修飾糖肽衍生物特拉萬星(telavancin),2009年被批準(zhǔn)臨床使用,而其他兩種衍生物,達(dá)巴萬星(dalbavancin)和奧利萬星(oritavancin),已經(jīng)經(jīng)過大規(guī)模臨床試驗(yàn)(zhanelgg,calicd,schweizerf,zelenitskys,adamh,lagacé-wienspr,rubinsteine,ginas,hobandj,karlowskyja.newlipoglycopeptides:acomparativereviewofdalbavancin,oritavancinandtelavancin.drugs.201070:859-886)。另一種修飾糖肽,td-1792,將糖肽類抗生素連接到頭孢菌素(blais,j;staceyr.lewis,kevinm.krauseandbretm.bentonantistaphylococcalactivityoftd-1792,amultivalentglycopeptide-cephalosporinantibioticantimicrob.agentschemother.2012561584-1587)。
wo-a-98/02454描述了多肽衍生物,其中的一種可溶性治療性多肽以具有如下通用結(jié)構(gòu)的實(shí)體進(jìn)行修飾:
-(l-[w])nbx(i)
其中,每個(gè)l是獨(dú)立的柔性連接基團(tuán),每個(gè)w是獨(dú)立的肽性膜結(jié)合元件,n是大于或等于一的整數(shù),并且x是肽性或非肽性的膜結(jié)合或插入元件。
(i)型的結(jié)構(gòu)表示了一種膜相互作用元件的組合陣列,其與可溶性多肽的連接被發(fā)現(xiàn)可介導(dǎo)所述多肽與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的外細(xì)胞膜的結(jié)合。這帶來了治療效果,特別是在補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)劑作為細(xì)胞保護(hù)劑和消炎劑起作用的情況下(例如j.dong,jrpratt,rasmith,i.doddandshsacks,strategiesfortargetingcomplementinhibitorsinischaemia/reperfusioninjury.mol.immunol.36(1999),pp.957–963)。
wo02/36612描述了通用結(jié)構(gòu):
v-l–w-x(ii)
其中,
v是一種抑制細(xì)菌中的肽聚糖生物合成的糖肽部分;
l為連接基團(tuán);
w是肽性膜締合元件;和
x是氫或膜插入元件。
wo02/36612中,連接基團(tuán)l寬泛定義為包括“c1-c3烯烴基、c1-c6的-o-烯烴基、c1-c6-o-的烯烴基、-o-、n(h或c1-c3的低級(jí)烷基)-、-s-、-so-、-so2、-xh-c(o)-、-c(o)-nh-、-ch=ch-、-c≡c-、-n=n-、-o-c(o)-和–c(o)-o-”,其中例示在50-51頁(yè)上的結(jié)構(gòu)1
此外,wo02/36612中,w寬泛定義為“肽性膜締合元件”,其后則定義為包含2至10個(gè)選擇賴氨酸或精氨酸的連續(xù)殘基的膜結(jié)合肽,包括7至30個(gè)氨基酸的結(jié)合肽本身,或膜插入肽,其中例示在50-51頁(yè)上的結(jié)構(gòu)1~16僅限于seqidno:4至seqidno:8,其含有14、16或20個(gè)氨基酸,其中每一個(gè)包括6個(gè)連續(xù)的賴氨酸和/或精氨酸殘基。
wo04/022101描述了包含三個(gè)或更多個(gè)膜結(jié)合元件的改進(jìn)治療劑,其中至少有兩個(gè)是親脂性元件且第三個(gè)通常是包含堿性氨基酸的氨基酸序列,并與可溶性劑(例如蛋白、抗癌劑或抗菌劑)共價(jià)連接。該抗菌劑可以是萬古霉素,且在此情況下,所述氨基酸序列通常含有6至20個(gè)氨基酸,并通過包含二硫鍵的連接基團(tuán)與萬古霉素的n或c端連接。
基于所述通用結(jié)構(gòu)的化合物表現(xiàn)出針對(duì)一系列生物體的改良抗菌活性。
鑒于革蘭氏陽(yáng)性菌發(fā)展糖肽抗生素抗性的能力,仍然需要具有良好生理穩(wěn)定性的新抗菌劑和用于控制細(xì)菌感染的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn),現(xiàn)有技術(shù)中的結(jié)構(gòu),在糖肽和膜結(jié)合元件之間所含的包括二硫鍵的連接,例如在如上結(jié)構(gòu)ⅱ中,在生理?xiàng)l件下可能與其他硫醇之間發(fā)生二硫化物交換,從而導(dǎo)致化合物降解和活性損失的后果。此外,現(xiàn)有技術(shù)中描述的長(zhǎng)肽序列都難以在商業(yè)抗生素所需的規(guī)模上合成,并有可能在生理?xiàng)l件下水解。
因此,本發(fā)明人著眼于具有類似如上式ii結(jié)構(gòu)的新型糖肽類衍生物的生產(chǎn),但其中連接基團(tuán)l經(jīng)過特別選擇,以提供在生理?xiàng)l件下顯示出更好的穩(wěn)定性且同時(shí)保持抗微生物活性的化合物。對(duì)基團(tuán)w的進(jìn)一步選擇,有利于化合物的容易合成,以及降低蛋白水解可能性。
因此,本發(fā)明的第一方面中,提供具有通式(iii)的抗菌化合物:
x–w–l-v(iii)
其中:
x是與w的n端連接的親脂性基團(tuán),其基于碳原子且具有如下參數(shù):
具有3至60個(gè)碳原子,若存在任何芳環(huán),則所述芳環(huán)的碳原子亦包含在內(nèi);
直鏈或支鏈,且在其為支鏈時(shí),包含1至6個(gè)分支點(diǎn);
飽和或不飽和,且在其不飽和時(shí),包含1至8個(gè)雙鍵或三鍵;
可選地具有最多6個(gè)獨(dú)立地選自s、o或n且不包含在酸性取代基中的雜原子(若存在芳環(huán)且若該芳環(huán)中存在雜原子,則該芳環(huán)中的雜原子不包含在內(nèi));
可選地包含一個(gè)或多個(gè)芳環(huán),例如2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或6個(gè),所述芳環(huán)可以是稠環(huán),且每個(gè)所述芳環(huán)可以包含1、2或3個(gè)雜原子,所述雜原子若存在時(shí)獨(dú)立地選自s、o或n;和
可選地具有1至6個(gè)選自羥基、氨基、甲基、甲氨基和鹵素的取代基;
w是堿性氨基酸或由2至10個(gè)氨基酸組成的堿性肽,其中w不是或不含任何具有含硫側(cè)鏈的氨基酸;
l是通式為–nh-(cr1r2)m-z-(cr3r4)n-nh-的連接基團(tuán),其中:
z是氧或選自如下各項(xiàng)的、任選取代的基團(tuán):-nh-、-conh-、-nhco-,-(och2ch2)p-、c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c1-c12雜烷基、c1-c10雜烯基、c3-c12環(huán)烷基、c1-c12雜環(huán)、c6-c18芳基或c1-c18雜芳基;且
r1、r2、r3和r4分別獨(dú)立選自以下各項(xiàng):h、鹵素、任選取代的c1-c12烷基、任選取代的c2-c12烯基、任選取代的c2-c12炔基、任選取代的c1-c12雜烷基、任選取代的c1-c10雜烯基、任選取代的c3-c12環(huán)烷基、任選取代的c1-c12雜環(huán)、任選地被取代的c6-c18芳基、任選取代的c1-c18雜芳基、任選取代的羧基、任選取代的羧酰胺;且
m是選自0、1、2和3的整數(shù);且
n是選自0、1、2和3的整數(shù);
其中m和n不同時(shí)為0;且
p是選自1至10的整數(shù);或
l選自以下通式之一:
其中c和d是選自0、1、2的整數(shù);且
通式中的虛線代表與v和w的連接點(diǎn);
和
v是抑制細(xì)菌中的肽聚糖生物合成的糖肽部分,或其藥學(xué)上可接受的鹽或前藥。
本發(fā)明還提供如上所述通式(iii)化合物的藥學(xué)可接受的鹽或前藥。
在又一方面中,本發(fā)明還提供一種包含如上所述通式(iii)化合物和藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的組合物。
在又一方面中,本發(fā)明還提供如上所述通式(iii)化合物在治療人體或動(dòng)物體治療方法中的用途。
在又一方面中,本發(fā)明還提供一種用于在對(duì)象中治療細(xì)菌感染的方法,所述方法包括:以有效劑量的如上所述通式(iii)化合物或有效劑量的包含所述化合物的組合物向?qū)ο蠼o藥。
術(shù)語定義
在本發(fā)明進(jìn)一步描述前,應(yīng)當(dāng)理解,本發(fā)明不局限于所述的具體實(shí)施例,而是當(dāng)然可以變化的。也應(yīng)當(dāng)理解,本申請(qǐng)所使用的術(shù)語僅用于描述具體實(shí)施例,并不旨在進(jìn)行限制,因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將由所附的權(quán)利要求書來限定。
當(dāng)提供數(shù)值范圍時(shí),應(yīng)理解的是,除非上下文另有說明,否則,介于該范圍的上限和下限值之間、到下限值單元的十分之一的每個(gè)中間值,以及在該規(guī)定范圍中的任何其它所述值或中間值,均包含在本發(fā)明之內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括在所述較小范圍中,并且也包括在本發(fā)明內(nèi),服從于該規(guī)定范圍內(nèi)的任何明確排除的限值。當(dāng)所述范圍具有一個(gè)或兩個(gè)所述限值時(shí),不包括所述兩個(gè)限值或其中之一的范圍也包含在本發(fā)明中。
除非另有定義,本申請(qǐng)使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬的領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。下面將對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選方法和材料進(jìn)行說明,但任何類似或等同于本申請(qǐng)描述的方法和材料,也可以使用在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中。本申請(qǐng)?zhí)峒暗乃谐霭嫖锞ㄟ^援引方式并入本申請(qǐng),并描述與所引用出版物相關(guān)的方法和/或材料。
必須指出,如本申請(qǐng)和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一”,“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)對(duì)象,除非上下文另有明文說明。因此,例如,對(duì)“一種抗細(xì)菌劑”的提及包括多個(gè)所述制劑,而對(duì)“該藥物組合物”的提及包括一種或多種藥物組合物及其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的等同物,等等。進(jìn)一步指出,權(quán)利要求書可以撰寫成排除任何可選元素。因此,本聲明旨在為在列舉權(quán)利要求元件時(shí)使用此類如“僅”、“只”等的排除性術(shù)語,或使用“否定”限制,充當(dāng)先行基礎(chǔ)。對(duì)病癥或疾病的“治療”或“療法”包括:(1)預(yù)防病癥的至少一種癥狀,即,使臨床癥狀在可能暴露于該疾病下或易患該疾病但尚未經(jīng)歷或顯示出該疾病癥狀的哺乳動(dòng)物中不產(chǎn)生顯著發(fā)展,(2)抑制該疾病,即,阻止或減少該疾病或其癥狀的發(fā)展,或(3)緩解疾病,即,使該疾病或其臨床癥狀減退。
“治療有效量”或“有效量”是指當(dāng)化合物向哺乳動(dòng)物或其它對(duì)象給藥以治療疾病時(shí),足以通過結(jié)合另一種藥劑或單獨(dú)以一劑或多劑以達(dá)成對(duì)該疾病的治療的化合物量。所述“治療有效量”將根據(jù)化合物、疾病及其嚴(yán)重性,以及待治療對(duì)象的年齡、體重等而變化。
術(shù)語“對(duì)象”、“個(gè)體”和“患者”在本申請(qǐng)中可互換使用,指可能需要本申請(qǐng)所述的藥學(xué)方法、組合物和治療的任何哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物物種的一個(gè)或多個(gè)成員。對(duì)象和患者因而包括,但不限于,靈長(zhǎng)類動(dòng)物(包括人類)、犬科、貓科、有蹄類(例如,馬、牛、豬(如家豬))、禽類和其他對(duì)象。人類和具有商業(yè)重要性的非人類哺乳動(dòng)物(例如,家畜和家養(yǎng)動(dòng)物)是尤為受到關(guān)注。
“哺乳動(dòng)物”指的是任何哺乳動(dòng)物物種的一個(gè)或多個(gè)成員,并且包括,舉例而言,犬科;貓科動(dòng)物;馬科;牛;綿羊;嚙齒目,等,和靈長(zhǎng)類,特別是人。非人動(dòng)物模型,特別是哺乳動(dòng)物,例如非人靈長(zhǎng)類、鼠科(如小鼠,大鼠)等,可用于實(shí)驗(yàn)研究。
化合物的“藥學(xué)上可接受的鹽”、是指藥學(xué)上可接受的并且具有母體化合物的期望藥理活性的鹽。所述鹽包括:(1)酸加成鹽,與無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成;或與有機(jī)酸如乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、葡庚糖酸、4,4'-亞甲基二(3-羥基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸等形成;或(2)當(dāng)母體化合物所含的酸性質(zhì)子被金屬離子(例如堿金屬離子、堿土離子或鋁離子)取代所形成的鹽;或與有機(jī)堿如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、n-甲基葡糖胺等配合形成的鹽。
“前藥”是指任何在給藥于哺乳動(dòng)物對(duì)象時(shí)體內(nèi)釋放入本申請(qǐng)所示通式iii的活性母體藥物的任何化合物。本申請(qǐng)通式iii化合物的前藥,是通過修飾存在于所述通式化合物中的官能團(tuán)來制備的,該修飾的方式使得修飾物可以在體內(nèi)切割以釋放母體化合物。前藥包括本申請(qǐng)所示通式iii的化合物,其中一種或多種如下通式中中的羥基、氨基或巰基結(jié)合到任何可在體內(nèi)切割以分別再生成游離羥基、氨基或巰基的基團(tuán)上。前藥的示例包括但不限于:一種或多種如下所示通式的化合物的羥基官能團(tuán)的酯類(例如,乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物),氨基甲酸酯類(如,n,n-二甲基氨基)等。
本發(fā)明的化合物或其組成部分,可以具有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心;因此,所述化合物可以被制成單獨(dú)的(r)-或(s)-立體異構(gòu)體,或其混合物。除非另有說明,說明書和權(quán)利要求書中對(duì)特定化合物的描述或命名旨在包括單獨(dú)的對(duì)映體及其混合物(外消旋或相反)。用于立體異構(gòu)體的立體化學(xué)確定和分離方法是本領(lǐng)域公知的(例如,參見在"advancedorganicchemistry",4theditionj.march,johnwileyandsons,newyork,1992第4章中的討論)。
本申請(qǐng)所討論的出版物僅提供為其現(xiàn)有本申請(qǐng)申請(qǐng)日前的公開內(nèi)容。本申請(qǐng)中的任何內(nèi)容均不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明沒有權(quán)利因在先發(fā)明而先于所述出版物的承認(rèn)。此外,所提供的出版物日期可能不同于其實(shí)際出版日期,從而可能需要獨(dú)立進(jìn)行確認(rèn)。
附圖說明
圖1:mcc223和mcc535在谷胱甘肽存在下的穩(wěn)定性:此圖說明了現(xiàn)有技術(shù)的一種化合物mcc535(其中v是萬古霉素,x為nc13co,w是-kkk-且l是(s)—nhch(co2h)ch2-ss-(ch2)2-nh—)與化合物mcc223的穩(wěn)定性比較,如下所述。
圖2:mcc174,mcc310,mcc455,mcc520,mcc939和mcc4815的藥代動(dòng)力學(xué)特征。該圖示出了幾種化合物在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性,通過靜脈內(nèi)(iv)和皮下(sc)給藥進(jìn)行測(cè)試(每條路線各為n=3,2mg/kgiv且10mg/kgsc)。
圖3:mcc080,mcc174,mcc310,mcc344,mcc455和mcc742在小鼠大腿感染模型中對(duì)mrsa的功效。該圖展示了在各大腿中注射有105cfu的mrsa(atcc34400)的免疫受損小鼠的各大腿中的logcfu的降低(cfu指菌落形成單位)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的化合物是通式(iii)的糖肽抗生素。這些化合物顯示出良好的抗菌活性,如下所示,以及在谷胱甘肽的存在下和在體內(nèi)比上述的現(xiàn)有技術(shù)中的通式(iii)化合物具有更好的穩(wěn)定性。
元件x
在本發(fā)明的化合物中,x是連接到w的n端的親脂性基團(tuán),其基于碳原子,并具有以下參數(shù):
具有3至60個(gè)碳原子,若存在任何脂環(huán)或芳環(huán),則所述脂環(huán)或芳環(huán)的碳原子亦包含在內(nèi);
直鏈或支鏈,且在其為支鏈時(shí),包含1個(gè)或多個(gè)分支點(diǎn),例如2、3、4、5或6個(gè)分支點(diǎn);
飽和或不飽和,且在其不飽和時(shí)包含1至8個(gè)雙鍵或三鍵,例如1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)雙鍵或三鍵;
可選地具有最多6個(gè),例如1、2、3、4、5或6個(gè),獨(dú)立地選自s、o或n且并非包含在酸性取代基中的雜原子(若存在芳環(huán),若芳環(huán)中存在雜原子,則芳環(huán)中的雜原子不包含在內(nèi));
可選地包含一個(gè)或多個(gè)芳環(huán),例如2、3、4、5或6個(gè),所述芳環(huán)可以是稠環(huán),且每個(gè)所述芳環(huán)可以包含1、2或3個(gè)雜原子,所述雜原子若存在時(shí)獨(dú)立地選自s、o或n;和
可選地具有1至6個(gè)(例如1、2、3、4、5或6個(gè))獨(dú)立選自羥基、氨基、甲基、甲氨基和鹵素的取代基。
如果需要的話,x可以包括允許連接到w的官能團(tuán)。適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)在本領(lǐng)域中是公知的,并且包括,例如:羰基,例如從活化的羧酸衍生;或從磺酰氯衍生的砜基團(tuán)。
在一個(gè)特定方面中,基團(tuán)x是親脂基團(tuán),含有羰基、ch2基團(tuán)或so2基團(tuán),最優(yōu)選為羰基,并通過所述基團(tuán)連接到w的n端。
在一個(gè)實(shí)施例中,x具有式(iv):
其中,每個(gè)r25和r26是具有如下參數(shù)的親脂基團(tuán):
具有3至30個(gè)碳原子,若存在任何脂環(huán)或芳環(huán),則所述脂環(huán)或芳環(huán)的碳原子亦包含在內(nèi);
直鏈或支鏈,且在其為支鏈時(shí),包含1至3個(gè)分支點(diǎn);
飽和或不飽和,且在其不飽和時(shí)包含1至4個(gè)雙鍵或三鍵;
可選地具有1、2或3個(gè)獨(dú)立地選自s、o或n的雜原子(若存在芳環(huán),若芳環(huán)中存在雜原子,則芳環(huán)中的雜原子不包含在內(nèi));
可選地包含一個(gè)或多個(gè)芳環(huán),例如2個(gè)或3個(gè),所述芳環(huán)可以是稠環(huán),且每個(gè)所述芳環(huán)可以包含1、2或3個(gè)雜原子,所述雜原子若存在時(shí)獨(dú)立地選自s、o或n;和
可選地具有1至3個(gè)選自羥基、氨基、甲基、甲氨基和鹵素的取代基;
t是選自0、1、2、3、4和5的整數(shù);且
u是選自0、1、2、3、4和5的整數(shù);
其中t或u中之一為0時(shí)則另一個(gè)不為0。
當(dāng)取代基是鹵素時(shí),其選自氟,氯,溴或碘。
在一個(gè)實(shí)施例中,基團(tuán)x具有3至30個(gè),優(yōu)選為3至24個(gè),更優(yōu)選為3至15個(gè)碳原子,包括那些包含在任何脂環(huán)或芳香環(huán)(若存在)中的碳原子。所述基團(tuán)是直鏈或支鏈的,并且在后者的情況下,含有一個(gè)或多個(gè)分支點(diǎn),例如兩個(gè)或三個(gè),且為飽和的或不飽和的,且在后者的情況下,含有1至4個(gè)雙鍵或三鍵,例如1,2,3或4個(gè)。
在一個(gè)實(shí)施例中,所述x的通式為r27co-,其中r27是具有3至15個(gè)碳原子的親脂性基團(tuán),其中所述親脂性基團(tuán)為:
直鏈或支鏈,且可以包括脂環(huán)或芳環(huán),所述基團(tuán)中的碳原子總數(shù)包含任一所述環(huán)中的碳原子;
飽和或不飽和,且在其不飽和時(shí)包含1至4個(gè)雙鍵或三鍵;
可選地具有1或2個(gè)獨(dú)立地選自o或n的雜原子(若存在芳環(huán),若芳環(huán)中存在雜原子,則芳環(huán)中的雜原子不包含在內(nèi));
可選地包含一個(gè)或兩個(gè)芳環(huán),所述芳環(huán)中的任一個(gè)或兩個(gè)都可以包含1個(gè)氮雜原子;和
可選地具有1至3個(gè)選自羥基、氨基、甲基、甲氨基和鹵素的取代基。
在一個(gè)實(shí)施例中,x是具有式cjh(2j+1)co-的烷酸,其中j選自7,8,9,10,11,12或13,所述基團(tuán)的示例為nc7co-(nc7h15co-);nc8co-(nc8h17co-);nc9co-(nc9h19co-);nc10co-(nc10h21co-);nc11co-(nc11h23co-),nc12co-(nc12h25co-)和nc13co-(nc13h27co-)。
在一個(gè)實(shí)施例中,x選自nc10co-;nc13co-;4-pho-phco-;[(4-pho-phco)lys(4—pho-phco)-;(nc10co)lys(conc10)-;nc10co-gly-;nc11co-;nc12co-;(4-pho-phco)-gly-;nc7co-;nc8co-;nc9co-;(2-bu-nc7co)-;[(2-bu-nc7co-)lys(2-bu-nc7co)]-;(9z-9,10-deyhdro-nc13co)-;c6phco-;c7phco-;c5ophco-;(c5ophco-)lys(c5ophco)-;c7ophco-;c9ophco-;phoc3co-;[phoc3co-lys(phoc3co)]-;phc5co-;[phc5co-lys(phc5co)]-;phc8co-;phc9co-;phc11co-;(4-ph-phc1co)-;[(4-ph-phc1co)-lys(4-ph-phc1co)]-;[4-(4—f-pho)-phco]-;{[4-(4-cl-pho)-phco-lys[4-(4-f-pho)-phco]}-;[4-(4-cl-phco)-phco]-;{[4-(4-cl-pho)-phco-lys[4-(4-cl-pho)-phco]}-;(4-bno-phco)-;[(4-bno-phco)-lys(4-bno-phco)]-;(nc9-pip-4-co)-;[nc7co-lys(conc7)]-;[(c9ophco)-lys(c9ophco)]-;[(phoc3co)-lys(phoc3co)]-;{[4-(4-f-pho)-phco-lys[4-(4-f-pho)-phco]}-;[phc11co-lys(phc11co)]-;nc10ch2-;4-pho-phch2-;ch3ph-so2-;[nc12co-lys(nc12co)]-;[nc13co-lys(nc13co)]-;(2-bu-c7co)-lys(2-bu-c7co)-;(nc9ch2)2-;nc13ch2-;phch2-;(nc11-pip-4-co)-;(nc7-pip-4-co)-;(1-nc9-pro)-;(nc9-pip-2-co)-;(4-nh2-phco)-;(4-menh-phco)-;(4-nc7nh-phco)-;(nc4ch2-)2;nc8ch2-;(2-nh2-nc9co)—,3,5—me2c7co—;3-oh-c9co-;(4-cl-phco)-;chexch2co—和4—nc5—chexco—。
元件w
在本發(fā)明的化合物中,w為堿性氨基酸或由2-10個(gè)氨基酸組成的堿性肽,其前提是w不是或不含任何具有含硫側(cè)鏈的氨基酸。
因此,w可以是單一堿性氨基酸或由2,3,4,5,6,7,8,9或10個(gè)氨基酸組成的堿性肽。在一個(gè)具體實(shí)施例中,w是堿性氨基酸或者由2至5個(gè)氨基酸的堿性肽,其前提是w不是或不含任何具有含硫側(cè)鏈的氨基酸,即w可以是單一堿性氨基酸或由2,3,4或5個(gè)氨基酸組成的堿性肽。
w不是或不含任何具有含硫側(cè)鏈的氨基酸。因此,w不包含任何蛋氨酸或半胱氨酸殘基。在具體的實(shí)施例中,w由1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸組成。
堿性肽是在生理?xiàng)l件下具有凈總正電荷(例如ph約為5-8)的含有側(cè)鏈的肽。氨基酸的確切性質(zhì)并不是必要的,只要其形成的肽在生理?xiàng)l件下的凈總電荷為正即可。這可容易地識(shí)別為含有至少一個(gè)堿性殘基(例如arg,lys,orn,dab,dap,his)的肽。所述肽可以含有其它氨基酸,例如gly或ser,或一種或多種酸性殘基(例如asp,glu),條件是任何所述酸性殘基均由一個(gè)額外的堿性殘基來抵消,即,使得肽中的酸性殘基總數(shù)小于堿性殘基的總數(shù),且所得的肽在生理?xiàng)l件下具有凈總正電荷。
在本發(fā)明的化合物中,w的n端被連接到x,且w的c端連接到l。
肽可以重組或合成來制備,例如通過逐步合成??蛇x地,肽可以從自然產(chǎn)生肽的細(xì)胞培養(yǎng)物中收集,例如在細(xì)菌產(chǎn)生的膜相關(guān)肽的情況下。
通過合成手段產(chǎn)生的肽通常由天然的l-氨基酸(即,由遺傳密碼編碼,即所謂的蛋白原氨基酸),但是也可以使用d-氨基酸或外消旋氨基酸。也可以使用從天然來源分離的或通過合成方法制備的非蛋白原氨基酸。在本發(fā)明中,基團(tuán)w可以是蛋白原氨基酸或非蛋白原氨基酸中的任一種或由其組成,或其混合物。
在任何情況下,均可以進(jìn)行側(cè)鏈修飾,例如為了提高體內(nèi)半排出期或改善穩(wěn)定性。側(cè)鏈修飾包括,例如,氨基修飾,通過與醛反應(yīng)進(jìn)行還原性烷基化然后用硼氫化鈉進(jìn)行還原,用烷基溴的親核置換來進(jìn)行烷基化,用乙酰乙酸甲酯進(jìn)行脒基化,或以乙酸酐進(jìn)行酰化。
精氨酸殘基的胍基,可通過烷基化來修飾,或通過以試劑如2,3-丁二酮或乙二醛形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物來修飾。色氨酸殘基可通過吲哚環(huán)的氧化或烷基化來修飾,而組氨酸殘基的咪唑環(huán)可通過烷基化來修飾。
任何其他羧基側(cè)鏈可以被封閉為酯基形式,例如c1-6烷基酯,或酰胺形式。
上述實(shí)施例中的氨基酸修飾并非窮舉。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域中已知化學(xué)來根據(jù)需要修飾氨基酸側(cè)鏈。
從天然存在來源中收集的肽可以含有非蛋白原氨基酸,其是通過蛋白原氨基酸的翻譯后修飾或通過生物合成而產(chǎn)生的。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中,w由具有通式(v)的1個(gè)殘基,或2至10個(gè)連續(xù)殘基組成,最優(yōu)選為1個(gè)殘基或2至5個(gè)連續(xù)殘基:
其中:
y是通式為–(cr20r21)g-的基團(tuán);
r18a選自以下各項(xiàng):h、任選取代的c1-c12烷基、任選取代的c2-c12烯基、任選取代的c2-c12炔基、任選取代的c1-c12雜烷基、任選取代的c3-c12環(huán)烷基、任選取代的c2-c12雜環(huán)烷基、任選取代的c6-c18芳基、任選取代的c1-c18雜芳基、-c(=nr22)-nr23r24和or22;
r18b選自以下各項(xiàng):h、任選取代的c1-c12烷基、任選取代的c2-c12烯基、任選取代的c2-c12炔基、任選取代的c1-c12雜烷基、任選取代的c3-c12環(huán)烷基、任選取代的c2-c12雜環(huán)烷基、任選取代的c6-c18芳基和任選取代的c1-c18雜芳基,或
r18a和r18b連同與它們相連的氮原子共同形成任選取代的雜環(huán)部分,或
r18a和r18b之一與任一r20或r21以及與它們相連的原子形成任選取代的雜環(huán)部分;
r19選自以下各項(xiàng):h和任選取代的c1-c12烷基;
r20和r21分別獨(dú)立選自以下各項(xiàng):h,鹵素,oh,c1-c12烷基,c6-c18芳基,c1-c12鹵代烷基,c1-c12羥烷基,c1-c12烷氧基和c1-c12鹵代烷氧基,或
r20和r21與它們相連的的碳共同形成任選取代的c3-c12環(huán)烷基,或an任選取代的c1-c12雜環(huán)烷基基團(tuán),或
r20和r21之一與r18a和r18b之一以及與它們相連的原子共同形成任選取代的雜環(huán)部分;
每個(gè)r22,r23,和r24獨(dú)立選自以下各項(xiàng):h,任選取代的c1-c12烷基,任選取代的c1-c12雜烷基,任選取代的c3-c12環(huán)烷基,任選取代的c6-c18芳基,和任選取代的c1-c18雜芳基,或
r22,r23和r24中的任兩個(gè)和與它們相連的源自共同形成任選取代的環(huán)基團(tuán);
g是選自以下各項(xiàng)的整數(shù):1、2、3、4、和5;
r是選自以下各項(xiàng)的整數(shù):1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在一個(gè)具體實(shí)施例中,通式(v)中的y是(ch2)g,其中g(shù)的定義如上所述。
在一個(gè)具體實(shí)施例中,w是選自以下各項(xiàng)的氨基酸,或是包括選自以下各項(xiàng)的氨基酸或由其組成的肽:任選取代的d-或l-賴氨酸、鳥氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸和精氨酸。在一個(gè)具體實(shí)施例中,w選自以下各項(xiàng):–lys-、-lys-lys-、-lys-lys-lys-、-orn-、-orn-orn-、-orn-orn-orn-、-lys-orn-、-orn-lys、-dab-、-dab-dab-、-lys-dab-、-dab-lys-、-dab-orn-、-orn-dab-、-dap-、-dap-dap-、-dap-lys-、-lys-dap、-dap-orn、-orn-dap、-dap-dab-和-dab-dap-,其中任一所述氨基酸可以是–l-或–d-構(gòu)型。
應(yīng)該理解的是,除非有相反的指示,否則在本申請(qǐng)中的氨基酸序列使用標(biāo)準(zhǔn)符號(hào)并以n端至c端方向來表示。
連接基團(tuán)l
在本發(fā)明的化合物中,l為下式的連接基團(tuán):
–nh-(cr1r2)m-z-(cr3r4)n-nh-
其中:
z是氧或選自如下各項(xiàng)的、任選取代的基團(tuán):-nh-、-conh-、-nhco-,-(och2ch2)p-、c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c1-c12雜烷基、c1-c10雜烯基、c3-c12環(huán)烷基、c1-c12雜環(huán)、c6-c18芳基或c1-c18雜芳基;且
r1、r2、r3和r4分別獨(dú)立選自以下各項(xiàng):h、鹵素、任選取代的c1-c12烷基、任選取代的c2-c12烯基、任選取代的c2-c12炔基、任選取代的c1-c12雜烷基、任選取代的c1-c10雜烯基、任選取代的c3-c12環(huán)烷基、任選取代的c1-c12雜環(huán)、任選地被取代的c6-c18芳基、任選取代的c1-c18雜芳基、任選取代的羧基、任選取代的羧酰胺;且
m是選自0、1、2和3的整數(shù);且
n是選自0、1、2和3的整數(shù);
其中m和n不同時(shí)為0;且
p是選自1至10的整數(shù);或
l選自以下通式之一:
其中c和d是選自0、1、2的整數(shù);且
通式中的虛線代表與v和w的連接點(diǎn)。
當(dāng)l具有式–nh-(cr1r2)m-z-(cr3r4)n-nh-時(shí),一個(gè)胺通過酰胺鍵連接到w的c端羧基,且通過與糖肽自由羧基的酰胺鍵連接到v。
當(dāng)l選自如上所示通式之一時(shí),其具體化合物中的環(huán)胺連接基團(tuán)w且環(huán)外胺基團(tuán)連接基團(tuán)v。在一個(gè)具體方面中,-l-具有式–nh-(ch2)m-z-(ch2)n-nh-;其中z、m和n如上定義。
當(dāng)-l-具有式–nh-(ch2)m-z-(ch2)n-nh-時(shí),其具體化合物中的z選自c1-c12烷基、nh、o、c1-c12雜環(huán)、c6-c18芳基或c3-c12環(huán)烷基,更優(yōu)選為c1-c6烷基、nh、o、苯基或環(huán)己基。在此方面中,具體的-l-基團(tuán)的通式為:–nh-(ch2)2-nh-,–nh-(ch2)3-nh-,–nh-(ch2)4-nh-,–nh-(ch2)2-nh-(ch2)2-nh-,–nh-(ch2)2-o-(ch2)2-nh-,–nh-(ch2)3-o-(ch2)3-nh-,-nh-(1,4-ph)-ch2-nh-,-nh-(1,3-ph)-ch2-nh-,-nh-(1,4-chex)-ch2-nh-,或-nh-ch2-(1,4-chex)-ch2-nh-。
可選地,-l-基團(tuán)的通式為–nh-ch(r1)-z-(ch2)n-nh-,其中:
r1is–(co)oh,-(co)ome,-(co)nh2,-(co)nhnh2,-(co)nhme,-(co)nhet,-(co)n(me)2,–(co)nhbn或–(co)r5,或任選取代的c1-c12雜環(huán),或任選取代的c1-c18雜芳部分;和
r5是任選取代的c1-c12雜環(huán)或任選取代的c1-c18雜芳部分;和
z和n如上定義。
在此方面中,具體化合物中的-l-具有通式–nh-ch(r1)-(ch2)q-nh-,其中
q是選自0、1、2、3、4和5的整數(shù);和
r1是–(co)oh,-(co)ome,-(co)nh2,-(co)nhnh2,-(co)nhme,-(co)nhet,-(co)n(me)2,–(co)nhbn或–(co)r5或任選取代的任選取代的c1-c12雜環(huán)或任選取代的c-1-c18雜芳部分。
當(dāng)l選自如上所示通式之一時(shí),其具體化合物中的q是選自2、3或4的整數(shù),和/或r1選自–co(oh),-co(nh2)和–co(nhme)。
本發(fā)明的具體化合物中的-l-選自:
(r)-或(s)-nhch(cooh)(ch2)4nh-;
(r)-或(s)-nhch(conhme)(ch2)4nhcoch2nh-;
(r)-或(s)-nhch(cooh)(ch2)4nhcoch2nh-;
(r)-或(s)-nhch2co-nh(ch2)2nh-;
(r)-或(s)-nhch(conh2)-ch2-(1,3-triazole)-(ch2)3-nh-;
(r)-或(s)-nhch(conh2)(ch2)4nh-;
(r)-或(s)-nhch(conhme)(ch2)4nh-;
(r)-或(s)-nhch(coome)(ch2)4nh-;
(r)-或(s)-nhch(conhme)(ch2)3nh-;
(r)-或(s)-nhch(conhme)(ch2)2nh-;
(r)-或(s)-nhch(conh2)(ch2)3nh-;
(r)-或(s)-nhch(conh2)(ch2)2nh-;
(r)-或(s)-nhch(cooh)(ch2)3nh-;
(r)-或(s)-nhch(cooh)(ch2)2nh-;
(r)-或(s)-nhch2co-nh(ch2)3nh-;
(r)-或(s)-nhch(conhnc14)(ch2)4nh-;
(r)-或(s)-nhch(conhet)(ch2)4nh-;
(r)-或(s)-nhch(conhbn)(ch2)4nh-;
-nh(ch2)2nh-;
-nh(ch2)3nh-;
-nh(ch2)4nh-;
-nh(ch2)5nh-;
-nh(ch2)6nh-;
-nh(ch2)2nh(ch2)2nh-;
-nh(ch2)2o(ch2)2nh-;
-nh(ch2)2o(ch2)2o(ch2)2nh-;
-nhch2(1,3-ph)ch2nh-;
-nhch2(1,4-ph)ch2nh-;
-nh(1,4-chex)nh-;
-nhch2(1,4-chex)ch2nh-;
-1-哌啶-4-ch2nh-;
-1-哌啶-2-ch2nh-;和
-1-哌啶-2-nh-。
更具體而言,–l-選自:
(r)-或(s)-nhch(conhme)(ch2)4nh-;
(r)-或(s)-nhch(conh2)(ch2)4nh-;
(r)-或(s)-nhch(cooh)(ch2)4nh-;
-nh(ch2)2nh-;和
-nh(ch2)3nh-。
元件v
在本發(fā)明的化合物中,v是抑制細(xì)菌的肽聚糖合成的糖肽部分。
肽聚糖的前兩個(gè)階段在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生。第一階段涉及n-乙酰胞壁酸基脂類與連接五肽的結(jié)合,所述肽為:
l-丙氨酸-γ-d-谷氨酸酯-間-xaa-d-丙氨酸-d-丙氨酸,其中xaa通常是d-氨基酸-庚酸,但在某些物種(例如金黃色葡萄球菌)中是l-賴氨酸。γ-d-谷氨酸殘基也可以由ɑ-酸基團(tuán)的酰胺化來修飾。
在第二階段中,所述脂類由n-乙酰葡糖胺延長(zhǎng)。此脂類隨后跨細(xì)胞膜運(yùn)輸。
第三階段,其發(fā)生在細(xì)菌膜的外表面上,涉及到脂類連接的glcnac-murnac二糖由轉(zhuǎn)苷酶聚合化并由轉(zhuǎn)肽酶進(jìn)行肽側(cè)鏈的交聯(lián)。
此類生物合成途徑的抑制劑種類中最知名的化合物是萬古霉素,如上所討論,其已知可通過與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖前體的五肽的d-丙氨酸-d-丙氨酸二肽端結(jié)合,防止其進(jìn)一步加工成肽聚糖,從而抑制肽聚糖生物合成。
萬古霉素的衍生物也起到抑制肽聚糖的生物合成的作用。一系列萬古胺糖烷基化化合物已被證實(shí)具有針對(duì)耐萬古霉素細(xì)菌的活性,以及以另一種糖衍生的類似化合物(cooper,r.d.g.etal.1996,supra;rodriguez,m.j.etal.,1998,supra;andge,m.,chen,z.,onishi,h.r.,kohler,j.,silver,l.l.,kerns,r.,fukuzawa,s.,thompson,c.,andkahne,d.(1999)vancomycinderivativesthatinhibitpeptidoglycanbiosynthesiswithoutbindingd-ala-d-ala,science284,507–511)。
概括地說,本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉抑制細(xì)菌肽聚糖生物合成的糖胎,并且可以選擇合適的糖肽以用于本發(fā)明。此類糖肽通常具有1000到3000道爾頓(da)的分子量,能夠與脂類ii或細(xì)菌肽聚糖結(jié)構(gòu)的單個(gè)組分(如lys-d-ala-d-ala肽,lys-d-ala-d-ala-乳酸縮酚酸肽)以及脂類glcnac-murnac-五肽的組分相互作用,并具有對(duì)萬古霉素易感參照菌株的活性(例如,所述參照菌株選自金黃葡萄球菌nctc(模式培養(yǎng)國(guó)家保藏中心)6571,金黃葡萄球菌atcc25923(nctc12981),金黃葡萄球菌atcc29213(nctc12973),肺炎雙球菌atcc49619(nctc12977)和糞腸球菌atcc29212(nctc12697)),其mic小于或等于4微克/ml。用于mic測(cè)試的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)方法包括瓊脂稀釋法或肉湯稀釋法,這兩種方法均包含在臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(clsi)參考標(biāo)準(zhǔn)文檔m07-a9(methodsfordilutionantimicrobialsusceptibilitytestsforbacteriathatgrowaerobically;approvedstandard第九版)中,并發(fā)表在j.antimicrob.chemother.(2001)48(suppl1):5-16中。
在本申請(qǐng)的一個(gè)特定實(shí)施例中,元素v是萬古霉素的衍生物??醋髟虿糠講的特定萬古霉素衍生物包括基于wo96/30401和wo98/00153所公開的糖肽及其鹽,其公開內(nèi)容通過引用方式并入本申請(qǐng)。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中,v選自萬古霉素、糖苷配基萬古霉素、脫胺基萬古霉素(vancomycindesvancosamine)、去甲萬古霉素、氯伊瑞霉素(chloroeremomycin)、替考拉寧(teicoplanain)-a2-2、利托菌素a、伊瑞霉素(eremomycin)、博萊霉素、類放線菌素a、complestatin、chloropeptin1、kistamycina、阿伏霉素、特拉萬星、a40926和奧利萬星,及其中任一種在伯氨基上以r17任選取代,其中r17是選自以下各項(xiàng)的有機(jī)側(cè)鏈部分:任選取代的c1-c12烷基、任選取代的c2-c12烯基、任選取代的c2-c12炔基、任選取代的c1-c12雜烷基、任選取代的c1-c10雜烯基、任選取代的c3-c12環(huán)烷基、任選取代的c2-c12雜環(huán)烷基、任選取代的c6-c18芳基和任選取代的c1-c18雜芳基。。
在一個(gè)更具體的實(shí)施例中,v選自萬古霉素,糖苷配基萬古霉素,脫胺基萬古霉素,或特拉萬星。最具體地,v是萬古霉素。
在本發(fā)明中,式(iii)的化合物的xw-l-組分經(jīng)由基團(tuán)l和糖肽游離羧基之間的酰胺鍵連接。所述x-w-l-v具有通式(vi):
(vi)
其中:
x、w和l如上所述;
r7是氫、碳水化合物或氨基碳水化合物;
r8是氫、oh或-o-甘露糖;
r9是-nh2、-nhch3或-n(ch3)2;
r10是-ch2ch(ch3)2、[對(duì)-羥基,間氯]苯基、對(duì)-鼠李糖-苯基、[對(duì)-鼠李糖-半乳糖]苯基、[對(duì)-半乳糖-半乳糖]苯基、[對(duì)-ch3o-鼠李糖]苯基,或通過[對(duì)-羥基,間-(o-{間-oh,間-r11}苯基)]苯基連接到r11而形成環(huán)系;
r11是-ch2-(co)nh2、芐基、[對(duì)-羥基]苯基、[對(duì)-羥基,間氯]苯基、[對(duì)-羥基,間氯]苯基,或通過[間-羥基,m-(o-{o-oh,m-r10}苯基)]苯基連接到r10而形成環(huán)系;
r12是氫或甘露糖;
r13是氫、oh或ch2nhch2po3h2;
r14是氫、β-d-吡喃葡萄糖、β-d-葡糖胺、2-o-(α-l-vancosaminyl)-β-d-吡喃葡萄糖、2-o-(α-1-4-表-vancosaminyl)-β-d-吡喃葡萄糖、(α-actinosaminyl)-β-d-glucopyranose,(α-ristosaminyl)-β-d-吡喃葡萄糖,或(α-acosaminyl)-β-d-吡喃葡萄糖,或其中任一項(xiàng)所述葡糖胺或吡喃葡萄糖基團(tuán)在其伯氨基上由r17任選取代,其中r17如上所述;且
r15和r16獨(dú)立選自氫或氯。
在一個(gè)特定方面中,通式(vi)化合物中的r7為h、4-表-萬古胺基(4-epi-vancosaminyl)、actinosaminyl或ristosaminyl。
本發(fā)明化合物的一個(gè)特定種類是如上通式(iii)的化合物,其中:
所述x的通式為r27co-,其中r27是具有3至15個(gè)碳原子的親脂性基團(tuán),其中所述親脂性基團(tuán)為:
直鏈或支鏈,且可以包括脂環(huán)或芳環(huán),所述基團(tuán)中的碳原子總數(shù)包含任一所述環(huán)中的碳原子;
飽和或不飽和,且在其不飽和時(shí)包含1至4個(gè)雙鍵或三鍵;
可選地具有1或2個(gè)獨(dú)立地選自o或n的雜原子(若存在芳環(huán),若芳環(huán)中存在雜原子,則芳環(huán)中的雜原子不包含在內(nèi));
可選地包含一個(gè)或兩個(gè)芳環(huán),所述芳環(huán)中的任一個(gè)或兩個(gè)都可以包含1個(gè)氮雜原子;和
可選地具有1至3個(gè)選自羥基、氨基、甲基、甲氨基和鹵素的取代基;
w是選自任選取代的d-或l-賴氨酸、鳥氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丁酸和精氨酸的氨基酸,或由選自任選取代的d-或l-賴氨酸、鳥氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丁酸和精氨酸的2至5個(gè)蛋白原或非蛋白原氨基酸組成的肽;
l的通式為“–nh-(ch2)m-z-(ch2)n-nh-”,其中z、m和n如上所述。
v選自萬古霉素、萬古霉素糖苷配基、脫胺基萬古霉素、去甲萬古霉素、氯伊瑞霉素、替考拉寧(-a2-2、利托菌素a、伊瑞霉素(eremomycin)、博萊霉素、類放線菌素a、complestatin、chloropeptin1、kistamycina、阿伏霉素、特拉萬星、a40926和奧利萬星,及其中任一種在伯氨基上以r17任選取代,其中r17是選自以下各項(xiàng)的有機(jī)側(cè)鏈部分:任選取代的c1-c12烷基、任選取代的c2-c12烯基、任選取代的c2-c12炔基、任選取代的c1-c12雜烷基、任選取代的c1-c10雜烯基、任選取代的c3-c12環(huán)烷基、任選取代的c2-c12雜環(huán)烷基、任選取代的c6-c18芳基和任選取代的c1-c18雜芳基。
本發(fā)明化合物的又一特定種類是如上通式(iii)的化合物,其中:
x是通式為cjh(2j+1)co-的烷酸,其中j選自7、8、9、10、11、12或13;
w是堿性氨基酸或由2個(gè)或3個(gè)氨基酸殘基組成的堿性肽,其中每個(gè)作為w的氨基酸或w中的每個(gè)氨基酸選自l-賴氨酸、d-賴氨酸、鳥氨酸、2,4-二氨基丁酸和2,3-二氨基丁酸;
l選自:
(r)-或(s)-nhch(conhme)(ch2)4nh-;
(r)-或(s)-nhch(conh2)(ch2)4nh-;
(r)-或(s)-nhch(cooh)(ch2)4nh-;
-nh(ch2)2nh-;或
-nh(ch2)3nh-;和
v選自萬古霉素、萬古霉素糖苷配基、脫胺基萬古霉素和去甲萬古霉素。
特定化合物可以是如下表2中所示的一種或多種化合物。
本發(fā)明的化合物中,涉及任選取代基。當(dāng)存在任選取代基時(shí),每個(gè)任選取代基獨(dú)立選自以下各項(xiàng):鹵素(例如氯、氟、溴或碘)、=o、=s、-cn、-no2、-cf3、-ocf3、烷基、烯基、炔基、鹵代烷基、鹵代烯基、鹵代炔基、雜烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基烷基、雜芳烷基、芳烷基、環(huán)烷基烯基、雜環(huán)烷基烯基、芳烯基、雜芳烯基、環(huán)烷基雜烷基、雜環(huán)烷基雜烷基、芳基雜烷基、雜芳基雜烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基環(huán)烷基、烷氧基雜環(huán)烷基、烷氧基芳基、烷氧基雜芳基、烷氧基羰基、烷基氨基羰基、烯氧基、炔氧基、環(huán)烷氧基、環(huán)烯氧基、雜環(huán)烷氧基、雜環(huán)烯氧基、芳氧基、苯氧基、芐氧基、雜芳氧基、芳基烷氧基、氨基、烷基氨基、酰氨基、氨基烷基、芳基氨基、磺?;被?、亞磺?;被?、磺?;?、烷基磺酰基、芳基磺?;?、氨基磺酰基、亞磺酰基、烷基亞磺?;?、芳基亞磺酰基、氨基亞磺酰基氨基烷基、-c(=o)oh、-c(=o)ra、c(=o)ora、c(=o)nrarb、c(=noh)ra、c(=nra)nrbrc、nrarb、nrac(=o)rb、nrac(=o)orb、nrac(=o)nrbrc、nrac(=nrb)nrcrd、nraso2rb、-sra、so2nrarb、-ora、oc(=o)nrarb、oc(=o)ra和酰基;
其中ra、rb、rc和rd分別獨(dú)立選自:h、c1-c12烷基、c1-c12鹵代烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c1-c10雜烷基、c3-c12環(huán)烷基、c3-c12環(huán)烯基、c1-c12雜環(huán)烷基、c1-c12雜環(huán)烯基、c6-c18芳基、c1-c18雜芳基和?;?,或ra、rb、rc和rd中的任意兩個(gè)和與它們相連的原子共同形成具有3至12個(gè)環(huán)原子的雜環(huán)系。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是c1-c12烷基時(shí),其為飽和的直鏈或支鏈烴基或鏈,包括,例如,甲基,乙基,異丙基,叔丁基,庚基,異丙基,正辛基,十二烷基,十八烷基,戊基,2-乙基己基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是c2-c12烷基時(shí),其為有一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵的不飽和直鏈或支鏈烴基,如乙烯基,丙烯基,丁烯基,1-甲基-2-丁烯基,辛烯基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是c2-c12烷基時(shí),其為有一個(gè)或多個(gè)碳-碳三鍵的不飽和的直鏈或支鏈烴基,例如乙炔基,1-丙炔基,1-丁炔基,庚炔基,辛炔基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是鹵代烷基、鹵代烯基或鹵代炔基時(shí),其可以是如上所定義的烷基、鏈烯基或炔基,其由鹵素原子取代1至3次,如氟,氯,溴或碘。當(dāng)存在多個(gè)鹵原子時(shí),其可以相同或不同。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是c1-c10雜烷基時(shí),其為上述烷基,且其中一個(gè)或多個(gè)特別是1至3個(gè)碳原子數(shù)替換為選自n,s和o的雜原子,如甲氧基乙基,乙氧基乙基,n-乙基丙胺等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是c1-c10雜烯基時(shí),其為上述烯基,且其中一個(gè)或多個(gè)特別是1至3個(gè)碳原子數(shù)替換為選自n,s和o的雜原子,如甲基乙烯基,乙氧基乙烯基,n-乙基丙烯基胺等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是c3-c12環(huán)烷基時(shí),其為閉環(huán)烴基,如環(huán)丙基,環(huán)丁基,環(huán)戊基,環(huán)己基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是c3-c12環(huán)烯基時(shí),其為具有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的閉環(huán)烴環(huán),如環(huán)丙烯基,環(huán)丁烯基,環(huán)戊烯基,環(huán)己烯基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是c1-c12雜環(huán)時(shí),其特別為如上述所定義的環(huán)烷基,且其中一個(gè)或多個(gè)特別是1至3的環(huán)碳原子替換為選自n,s和o的雜原子,例如哌啶基,嗎啉基,四氫吡喃基,四氫呋喃基等。在本申請(qǐng)中,術(shù)語“雜環(huán)(heterocycle)”和“雜環(huán)基(heterocycloalkyl)”可以互換使用。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是c1-c12雜環(huán)烯基時(shí),其為如上定義的環(huán)烯基,且其中一個(gè)或多個(gè)特別是1至3個(gè)環(huán)碳原子替換為選自n,s和o的雜原子,如1,2,3,4-四氫吡啶,1,2-二氫吡啶基,2-吡咯,2-咪唑啉基,2-吡唑啉基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是c6-c18芳基時(shí),其為具有一個(gè)或兩個(gè)芳環(huán)的單、雙或三環(huán)的碳環(huán)系統(tǒng),如苯基,萘基,四氫茚基,二氫茚基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是c1-c18雜芳基時(shí),其為如上定義的芳基,且其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)碳原子替換為一個(gè)或多個(gè)特別是1至3個(gè)選自n、s和o的雜原子,如噻吩基,呋喃基,吡咯基,吡咯烷基,咪唑基,異惡唑基,三唑基,噻二唑,惡二唑基,四唑基,硫雜三唑,氧雜三唑,吡啶基,嘧啶基,吡嗪基,噠嗪基,惡嗪基,三嗪基,硫雜二嗪,1,5-[b]噠嗪基和嘌呤基,以及苯并稠合衍生物,例如苯并惡唑基,苯并噻唑基,苯并咪唑基和吲哚基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是環(huán)烷基烷基時(shí),其為以至少一個(gè)環(huán)烷基(如上述定義)取代的如上定義的烷基,如正丁基環(huán)己基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是雜環(huán)基時(shí),其為以至少一個(gè)雜環(huán)基團(tuán)(如上述定義)取代的如上定義的雜環(huán)烷基烷基,例如正丁基哌啶基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是雜芳基時(shí),其為以至少一個(gè)雜芳基(如上述定義)取代的如上定義的雜芳基烷基,如4-吡啶基丁基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是芳基時(shí),其為以至少一個(gè)芳基(如上述定義)取代的如上定義的芳烷基,如4-苯基丁基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是環(huán)烷基烯基時(shí),其為以至少一個(gè)環(huán)烷基(如上述定義)取代的如上定義的烯基,如4-環(huán)己基-2-丁烯基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是雜環(huán)烷基烯基時(shí),其為以至少一個(gè)雜環(huán)基團(tuán)(如上述定義)取代的如上定義的烯基,如4-呋喃基-2-丁烯基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是芳基烯基時(shí),其為以至少一個(gè)芳基(如上述定義)取代的如上定義的烯基,如4-苯基-2-丁烯基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是雜芳基時(shí),其為以至少一個(gè)雜芳基(如上述定義)取代的如上定義的雜芳基烯基,如4-吡啶基-2-丁烯基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是環(huán)烷基雜烷基時(shí),其為以至少一個(gè)環(huán)烷基(如上述定義)取代的如上定義的雜烷基,例如2-環(huán)己基-2-乙氧基乙基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是雜環(huán)烷基雜烷基時(shí),其為以至少一個(gè)雜環(huán)烷基基團(tuán)(如上述定義)取代的如上定義的雜烷基,例如2-哌啶基-2-乙氧基乙基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是芳基雜烷基時(shí),其為以至少一個(gè)芳基(如上述定義)取代的如上定義的雜烷基,例如2-苯基-2-乙氧基乙基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是雜芳基雜烷基時(shí),其為以至少一個(gè)雜芳基(如上述定義)取代的如上定義的雜烷基,例如2-吡啶基-2-乙氧基乙基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是羥烷基時(shí),其為以至少一個(gè)羥基基團(tuán)取代的如上定義的烷基,如4-羥基戊基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烷氧基時(shí),其為氧代的如上定義的烷基,如甲氧基,乙氧基,丙氧基,丁氧基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烷氧基烷基時(shí),其為以至少一個(gè)烷氧基(如上述定義)取代的如上定義的烷基氧烷基,如4-甲氧基戊基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烷基氧環(huán)烷基時(shí),其為以至少一個(gè)烷氧基(如上述定義)取代的如上定義的環(huán)烷基,如4-甲氧環(huán)己基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烷基氧雜環(huán)烷基時(shí),其為以至少一個(gè)烷氧基(如上述定義)取代的如上定義的雜環(huán)基,例如3-甲基哌啶等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烷氧基時(shí),其為以至少一個(gè)烷氧基(如上述定義)取代的如上定義的芳基,例如4-甲氧基苯基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烷氧雜芳基時(shí),其為以至少一個(gè)烷氧基(如上述定義)取代的如上定義的雜芳基,如4-甲基吡啶等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烷氧基羰基時(shí),其為以如上定義的烷氧基取代的羰基,如甲氧羰基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烷基氨基羰基時(shí),其為以烷基氨基取代的羰基,如n-丁基甲酰胺等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烯氧基時(shí),其為如上述定義的烯基取代的氧,例如丁-2-烯基氧基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是炔氧基時(shí),其為如上述所定義的炔基取代的氧,例如丁-2-炔基氧基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是環(huán)烷氧基時(shí),其為如上述所定義的環(huán)烷基取代的氧,如環(huán)己氧基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是環(huán)烯氧基時(shí),其為如上述所定義的環(huán)烯基取代的氧,如環(huán)己-3-烯基氧基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是雜環(huán)烷氧基時(shí),其為以如上述定義的雜環(huán)烷基取代的氧,例如3-哌啶基氧基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是雜環(huán)烯氧基時(shí),其為以如上述定義的雜環(huán)烯基取代的氧,如4,5-脫氫-3-哌啶基氧基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是芳氧基時(shí),其為以如上述定義的芳基取代的氧,如苯氧基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是雜芳氧基時(shí),其為以如上述定義的雜芳基取代的氧,如3-吡啶氧基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是芳烷氧基時(shí),其為以如上述定義的芳烷基取代的如上所定義的氧,如4-苯基丁氧基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烷氨基時(shí),其為以如上述定義的烷基取代的如上定義的胺,如4-丁基氨基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是酰氨基時(shí),其為以如上述定義的酰基取代的胺,如乙酰胺等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是氨基烷基時(shí),其為以如上述定義的胺取代的烷基,如4-氨基丁基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是芳基氨基時(shí),其為以如上述定義的芳基取代的胺,如甲氧基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烷基磺?;鶗r(shí),其為以如上述定義的烷基取代的磺?;?,如丁基磺?;?。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是芳基磺?;鶗r(shí),其為以如上述定義芳基取代的磺?;?,如苯基磺?;?。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是烷基亞磺?;鶗r(shí),其為以如上述定義的烷基取代的亞磺?;缍』鶃喕酋;?。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是芳基亞磺?;鶗r(shí),其為以如上述定義的芳基取代的磺?;?,如苯基亞磺?;?。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是氨基磺酰氨基時(shí),其為以氨基磺?;〈陌被榛?,如氨基磺酰氨丙基等。
在本發(fā)明中,當(dāng)基團(tuán)是酰基時(shí),其為通式為rco-的一類,其中r表示以單鍵連接到co的烷基或芳族基團(tuán),如甲酰基,乙?;;郊柞;?。
藥物給藥
本發(fā)明的再一個(gè)方面包含式(iii)化合物及其藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
所述制劑可選地包含其它治療成分或稀釋劑。所述一種或多種載體必須是在與制劑的其他成分相容且對(duì)其接受者無害的意義上“可接受”。
適合于腸胃外或肌內(nèi)給藥的制劑包括:水性和非水性無菌注射溶液,其可含有抗氧化劑,緩沖劑和允許制劑與預(yù)期接受者血液等滲的溶質(zhì);以及水性和非水性無菌混懸劑,其可包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可以在單位劑量或多劑量容器中,例如密封的安瓿和小瓶,并且可以存儲(chǔ)在冷凍干燥(凍干)條件下,僅需要在使用前立即加入無菌液體載體,例如水,即可用于注射。注射溶液和懸浮液可以隨時(shí)用無菌粉末、顆粒和片劑制備。
應(yīng)當(dāng)理解的是,除了上述特別提到的成分之外,所述制劑還可以包括本領(lǐng)域中針對(duì)所涉制劑類型的其它常規(guī)試劑。在可能的制劑中,無菌無熱原的水性和非水性溶液是優(yōu)選的。
可選地,所述組合物可以配制為外用,例如軟膏劑、霜?jiǎng)⑾磩?、眼膏劑、滴眼劑、滴耳劑、漱口水、浸漬敷料和縫合線,以及氣霧劑的形式,還可以含有適當(dāng)?shù)某R?guī)添加劑,包括,例如,防腐劑、溶劑,以幫助藥物滲透,以及軟膏和乳膏作為潤(rùn)膚劑。這種外用制劑也可含有相容的常規(guī)載體,例如霜?jiǎng)┗蜍浉嗷|(zhì),以及乙醇或油醇以作為洗劑。這樣的載體可構(gòu)成所述制劑重量的約1%至約98%(按重量);更通常地,其構(gòu)成所述制劑的約80%(按重量)??蛇x地,所述組合物可以配制為用于吸入途徑給藥(例如鼻內(nèi),肺內(nèi)等)。這種裝置包括本發(fā)明的氣霧劑的吸入或其化合物的吹入。適于將本發(fā)明的化合物遞送至鼻粘膜、氣管和支氣管的噴霧器裝置、計(jì)量吸入器等在本領(lǐng)域中是公知的,因此將不進(jìn)行詳細(xì)描述。包含含有本發(fā)明化合物的微粉化組合物的可吸入干顆粒的固體顆粒組合物可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。固體顆粒組合物可選地含有用于促進(jìn)氣溶膠形成的分散劑。合適的分散劑為乳糖,其可以與所述化合物以任何合適的比例混合,例如1:1的重量比例?;钚猿煞挚梢宰鳛閼腋∫夯蛉芤褐苿﹣斫o藥,并可以涉及使用液化推進(jìn)劑,例如氯氟烴化合物,如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。氣霧劑制劑可以另外含有一種或多種共溶劑(例如乙醇),乳化劑和其它制劑表面活性劑(例如油酸或脫水山梨醇三油酸酯),抗氧化劑和合適的調(diào)味劑。
可選地,所述組合物可以配制用于口服給藥??诜o藥可以使用含有配制成片劑、錠劑、水性或油性混懸劑、可分散粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊,或糖漿劑或酏劑的本發(fā)明化合物的藥物組合物來實(shí)現(xiàn)。這種口服組合物可以含有用于提供藥學(xué)上的美觀性和可口性的制劑的一種或多種增甜劑、調(diào)味劑、著色劑或防腐劑。片劑,可以包覆或未包覆,其可以配制成含有添加了無毒的藥學(xué)上可接受賦形劑的活性成分,所述無毒的藥學(xué)上可接受賦形劑例如是:惰性稀釋劑,如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉;制粒劑或崩解劑,例如玉米淀粉或藻酸;結(jié)合劑,如淀粉、明膠或阿拉伯膠;以及,潤(rùn)滑劑,例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。當(dāng)使用包覆層時(shí),該包覆層延遲在胃腸道中的崩解和吸收,從而在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)提供持續(xù)作用。當(dāng)該制劑是含水懸浮液時(shí),其可以包含所述活性劑與合適賦形劑的混合物。視情況而定,所述賦形劑可以是懸浮劑(例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基-甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠);分散劑或濕潤(rùn)劑;防腐劑;著色劑和/或調(diào)味劑。本發(fā)明的組合物可以通過注射進(jìn)行給藥,以在留置裝置插入前不久實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)細(xì)菌的全身作用。在該裝置在體內(nèi)期間,可以在手術(shù)后繼續(xù)進(jìn)行治療。此外,該組合物還可以用來擴(kuò)大任何手術(shù)技術(shù)的圍手術(shù)期覆蓋,以防止傷口細(xì)菌感染。
很多骨科醫(yī)生認(rèn)為,具有人工關(guān)節(jié)的患者在可能產(chǎn)生菌血癥的牙科治療前,應(yīng)考慮對(duì)其進(jìn)行抗生素預(yù)防性治療。后期深部感染是一種嚴(yán)重的并發(fā)癥,有時(shí)會(huì)導(dǎo)致假體關(guān)節(jié)損失,并伴有顯著的發(fā)病率和死亡率。因此,在這種情況下,有可能將所述肽或肽/藥物偶聯(lián)物擴(kuò)展應(yīng)用為預(yù)防性抗生素的替代品。
細(xì)菌感染會(huì)導(dǎo)致臨床使用植入材料和留置裝置相關(guān)的主要并發(fā)癥之一。尤其是醫(yī)療器械相關(guān)性感染還經(jīng)常牽連到葡萄球菌(dankertetal1986,crcrevbiocompatability2,219-301)。感染一旦建立,幾乎不可能治療,而導(dǎo)致植入失敗。制止葡萄球菌粘附到植入物的嘗試包括對(duì)假體材料的表面進(jìn)行修飾,以降低蛋白質(zhì)粘附;例如涂覆“非粘性”材料,例如聚四氟乙烯(ptfe),或?qū)⒖股卣澈系剿霰砻?kamaletal.,1991,j.amer.med.assoc.265,2364-2368)。此外,還有的設(shè)想使用非類固醇抗炎藥,以防止葡萄球菌對(duì)醫(yī)療聚合物的粘附(farberandwolff1992,j.infect.dis.166:861-865)。
對(duì)于向人類患者的給藥,根據(jù)預(yù)期,該活性劑的每日劑量水平為0.01至50mg/kg,通常約1mg/kg。醫(yī)師能夠在任何情況下確定最適于個(gè)體患者的實(shí)際劑量,并隨特定患者的年齡、體重和反應(yīng)而變化。上述劑量是一般情況的示例。顯然,個(gè)別情況下,可能需要使用較高或較低劑量范圍,而這些都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
除了上述的治療之外,本發(fā)明的組合物通常還可以用作傷口治療劑,以防止細(xì)菌粘附到傷口組織暴露的基質(zhì)蛋白,特別是纖連蛋白上,以及作為抗生素預(yù)防的替代形式或與其相結(jié)合地用于牙科治療預(yù)防用途。
可選地,本發(fā)明的組合物可用于在留置裝置插入前對(duì)其進(jìn)行洗浴。所述活性劑對(duì)傷口或留置裝置進(jìn)行洗浴的濃度優(yōu)選為0.1微克/ml至10mg/ml。
本發(fā)明組合物可以用于,但不限于,下列生物體所引起的細(xì)菌感染的治療:分枝桿菌(mycobacteriumsp);腸球菌(enterococcussp.);葡萄球菌(staphylococcussp.);鏈球菌(streptococcussp);伯氏菌(borreliasp.);梭菌(clostridiumsp.);放線菌(actinomycessp.);和肺炎球菌(pneumococcussp.)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中,式(iii)的化合物可以用作藥物,或用于治療動(dòng)物或人體的方法中,特別是用于治療由上面列出的生物體引起的細(xì)菌感染。式(iii)的化合物也可用于制備用于治療細(xì)菌感染,特別是由上面列出的生物體引起的細(xì)菌感染的藥物。
化合物的合成
可以合成本發(fā)明化合物的路線是本領(lǐng)域公知的。通常來說,化合物可以通過將保護(hù)元件w連接至元件l,然后將元件x連接于此來合成。最后,x-w-l連接至v,并除去所有保護(hù)基團(tuán)。所得化合物可以進(jìn)行修飾,例如修飾l基團(tuán),來得到進(jìn)一步的化合物。在一種可選的合成路線中,作為最后一步,l連接至v,且x連接到w,x-w連接到l-v。
實(shí)施例
現(xiàn)在將以舉例的方式詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式。
實(shí)施例1:具有l(wèi)ys-oh、lys-ome或lys-nhme連接基團(tuán)的化合物的通用合成途徑:帶溶液相糖肽偶聯(lián)的固相合成
方案a:i)fmoc-l-lys(ivdde)-oh,dic,hobt,dmap,dmf;ii)含20%哌啶的dmf;iii)fmoc-lys(mtt)-oh,hbtu,dipea,dmf;iv)rcooh,hbtu,dipea,dmf或rso2cl,diea;v)meoh,dipea,dmf,50℃,過夜;vi)menh2,dipea,thf,過夜;vii)含2%h2nnh2·h2o的dmf,1h;viii)萬古霉素·hcl,hbtu,dipea,dmso,dmf,過夜;ix)含2%tfa,5%et3sih的dcm,30min;x)lioh,二惡烷/h2o(1:1),室溫,過夜。
i)將fmoc-l-lys(ivdde)-oh加載到hmbahypogel樹脂上:
用無水dmf洗滌(3次)hypogelhmba樹脂(1.0克,加載0.81mmol/g,0.81mmol)。向fmoc-l-lys(ivdde)-oh(2.33g,mw574.7,4.05mmol,5eq)的無水dmf(10ml)溶液中加入羥基苯并三唑(hobt,547mg,mw135,4.05mmol,5eq),隨后加入1,3-二異丙基二酰亞胺(dic)(627微升,d0.815,mw126.2,4.05mmol,5eq),然后加入4-二甲基氨基吡啶(dmap,30mg,mw122.17,0.3eq)。將所得溶液加入到樹脂,令樹脂在室溫下振搖過夜。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),并在真空中干燥。為了以乙酰殘基封閉樹脂,在手套箱中用無水dmf(3次)和dipea(848微升)洗滌該樹脂,然后加入乙酸酐(307微升,d1.08,mw102.09)并搖動(dòng)1小時(shí),然后排液,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),并在真空中干燥。
ⅱ)fmoc去保護(hù):
用含20%哌啶的dmf(14.5ml)溶液處理樹脂(1.45g,0.56mmol/g)并在室溫下振蕩1小時(shí)。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),并在真空中干燥。
ⅲ)與fmoc-l-lys(mtt)-oh的肽偶聯(lián):
用dmf洗滌(3次)樹脂(1.27g,0.64mmol/g)。向fmoc-l-lys(mtt)-oh(995mg,mw624.8,1.59mmol,2.0eq)的dmf(9.5ml)溶液中加入含hbtu的dmf溶液(3.2ml,0.5m,1.59mmol),接著加入dipea(1107微升,d0.742,mw129.25,6.35mmol,7.8eq)。將溶液靜置10分鐘,然后加入到已洗滌的樹脂中。所述樹脂在室溫下振蕩3小時(shí),排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),并在真空中干燥。
iv-a)與多種酸的肽偶聯(lián):
用dmf洗滌(3次)樹脂(100mg,0.043mmol)。向酸的dmf溶液(1ml)中加入含hbtu的dmf(0.2ml,0.5m)溶液、dipea(34.9微升,d0.742,mw129.25,0.5m終濃度)。將溶液靜置10分鐘,然后加入到經(jīng)dmf洗滌的樹脂中。所述樹脂在室溫下振蕩過夜,排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),并在真空中干燥。
iv-b)磺酰胺的形成:
用dmf洗滌(3次)樹脂(100mg,0.43mmol/g)。向樹脂中加入含十二烷基磺酰氯(17.3mg,mw268.84,1.5eq)的dmf(2ml)溶液,dipea(8.9微升,d0.742,mw129.25,1.2eq),并在室溫下振蕩過夜,排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),并在真空中干燥。
iv-c)與fmoc-l-lys(fmoc)-oh的肽偶聯(lián):
用dmf洗滌(3次)樹脂(1.89g,0.43mmol/g)。向fmoc-l-lys(fmoc)-oh(1400mg,mw624.8,1.59mmol,2.9eq)的dmf(14.2ml)溶液中,加入含hbtu的dmf溶液(4.73ml,0.5m,2.37mmol,2.9eq),隨后加入dipea(1650微升,d0.742,mw129.25,6.35mmol,11.7eq)。將溶液靜置10分鐘,然后加入洗滌樹脂。所述樹脂在室溫下振蕩3小時(shí),排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),并在真空中干燥。然后,在步驟(ii)后除去fmoc基團(tuán),并通過步驟(iv-a)衍生化游離胺。
v)從樹脂上切割肽以得到甲酯:
用無水甲醇(2.5ml/100mg樹脂)無水dmf(2.5ml/100mg樹脂)和無水dipea((0.5ml/100mg樹脂)處理該樹脂,并在油浴中50℃加熱過夜。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次)和meoh洗滌(3次),并在減壓下除去溶劑。
vi)從樹脂上切割肽以得到甲酰胺:
用thf(3次)和dipea(×2)洗滌樹脂,然后以含甲胺2m的thf(2ml/100mg樹脂)處理,并在室溫下?lián)u動(dòng)過夜。樹脂通過減壓抽干,然后用thf洗滌(×2),dcm洗滌(×2)和acn洗滌(×2)。使用n2氣吹去溶劑,并通過lcms對(duì)式樣進(jìn)行質(zhì)量控制分析。
vii)ivdde保護(hù)基團(tuán)的去保護(hù):
將肽(40mg)溶解在含2%水合肼的dmf(2.0ml)溶液中。將所得溶液在室溫下攪拌30分鐘,并在減壓下除去溶劑。部分樣品通過lcms進(jìn)行質(zhì)量控制分析。
viii)與萬古霉素的溶液相偶聯(lián):
用鹽酸萬古霉素(89mg,fw1485.71,59.9微摩爾,1.2eq.)的無水dmf溶液(0.86ml)處理肽7(50微摩爾)的干燥dmf溶液(0.86ml)。向該溶液中加入含hbtu的無水dmf溶液(120微升,0.5m,60微摩爾,1.2eq),然后加入dipea36微升,d0.742,fw129.25,0.207微摩爾,4.1eq)。將所得溶液在室溫下攪拌過夜。將試樣通過lcms分析,以確保偶聯(lián)的完成,并根據(jù)需要加入額外的偶聯(lián)試劑。在真空中除去溶劑。
ix)4-甲基三苯甲基的去保護(hù):
用含2%tfa和5%tes的dcm溶液(2ml)處理萬古霉素偶聯(lián)化合物(50mg),并靜置30分鐘。減壓除去溶劑,并且通過lcms分析樣品,以確保完全去保護(hù)。根據(jù)需要重復(fù)該過程。最終化合物溶解在h2o/acn(1:1,1.0ml)中,通過0.45微米注射過濾器過濾,并通過lcms進(jìn)行分析。
x)甲酯的切割:
為了獲得在c端具有羧酸的化合物,該化合物用二惡烷/水(1:1)和lioh的水溶液(10eq.)(0.1ml,0.5m,50微摩爾)處理,并在室溫下攪拌過夜。將樣品冷凍干燥并溶解于h2o/acn(1:1,1.0ml)中,通過0.45微米注射過濾器過濾,并通過lcms進(jìn)行分析。
用hplc進(jìn)行最終的純化:將粗產(chǎn)物溶解在水/乙腈(1:1體積比)中,過濾,并用制備型hplc以含0.1%tfa的水/乙腈梯度洗脫液進(jìn)行純化(agilentzorbaxsb-phenyl,9.4x250mm,5微米粒徑,流速5ml/min,含0~100%ch3cn+0.1%tfa的h2o+0.1%tfa,經(jīng)15分鐘(酸衍生物)或agilentzorbaxsb-c18,9.4x100mm,5微米粒徑,流速5ml/min,含0~100%ch3cn+0.1%tfa的h2o+0.1%tfa經(jīng)30分鐘(酰胺衍生物))純化。通過lcms分析的經(jīng)elsd具有>95%純度的餾分合并及冷凍干燥。(下面給出的分析型hplc為agilenteclipsexdb-phenyl,4.6x150mm,5微米粒徑,流速0.5ml/min,含0~100%ch3cn+0.1%fa的h2o+0.1%fa,經(jīng)13分鐘)。
該化合物的種類使用高分辨率質(zhì)譜(hrms)和ms-ms分析加以證實(shí)。
實(shí)施例2.mcc000310的合成:帶溶液相糖肽偶聯(lián)的固相合成
實(shí)施例1中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法應(yīng)用到mcc000310的合成中。
方案1:試劑和條件:a)fmoc-l-lys(ivdde)-oh,dic,hobt,dmap,dmf,室溫,16h;b)乙酸酐,dipea,dmf,rt,16h;c)含20%哌啶的dmf,室溫,2×30min,fmoc-lys(mtt)-oh,hbtu,dipea,dmf,室溫,3h;d)含20%哌啶的dmf,室溫,2×30min,fmoc-lys(mtt)-oh,hbtu,dipea,dmf,室溫,3h。
方案2:試劑和條件:a)含20%哌啶的dmf,室溫,2×30min,fmoc-lys(fmoc)-oh,hbtu,dipea,dmf,室溫,16h;b)含20%哌啶的dmf,室溫,2×30min,4-苯氧基苯甲酸,hbtu,dipea,dmf,室溫,16h。
方案3:試劑和條件:a)含2mnh2me的thf,室溫,16h;b)含2%肼的dmf,室溫,1小時(shí);c)萬古霉素·hcl,hbtu,dipea,dmf,室溫,16小時(shí);d)含2%tfa,5%tes的dcm,室溫,3×1小時(shí)。
實(shí)施例3:mcc000635的合成:帶溶液相糖肽偶聯(lián)的固相合成
對(duì)于mcc000635的制備,用fmoc-l-lys(mtt)-oh在標(biāo)準(zhǔn)條件下處理來自實(shí)施例2中的共同中間體三肽4,得到肽10。肽10用肉豆蔻酸處理,得到烷基尾肽11,將其從樹脂上切割下來,用于后續(xù)與萬古霉素的溶液相偶聯(lián)。
方案4:試劑和條件:a)含20%哌啶的dmf,室溫,2×30分鐘,fmoc-lys(mtt)-oh,hbtu,dipea,dmf,室溫,16小時(shí);b)含20%哌啶的dmf,室溫,2×30分鐘,肉豆蔻酸,hbtu,dipea,dmf,室溫,16小時(shí)。
方案5:試劑和條件:a)甲醇,dmf,dipea,50℃,16小時(shí);b)含2%肼的dmf,室溫,1小時(shí);c)萬古霉素·hcl,hbtu,dipea,dmf,室溫,16小時(shí);d)含2%tfa和5%tes的dcm,室溫,2×1小時(shí)。
實(shí)施例4:mcc000223的合成:mcc000635的轉(zhuǎn)化
已純化的甲酯mcc000635(20mg),用含過量lioh(10eq.)的二惡烷:h2o(50:50)進(jìn)行處理(方案6),并用lcms監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度。該酯在稀釋條件和5℃下在24小時(shí)內(nèi)完全水解,以提供mcc000223。hplc純化產(chǎn)生了良好的mcc223產(chǎn)量(10mg)。
方案6:試劑和條件:a)lioh,二惡烷:h2o(50:50)。
實(shí)施例5:mcc000223的合成:帶固相糖肽偶聯(lián)的固相合成
制備mcc223的固相路線利用了hmpb樹脂(方案6)。使用酸敏感性樹脂的吸引力在于,最終步驟同時(shí)移除mtt基團(tuán)并從樹脂上切割最終產(chǎn)物。使用了alloc保護(hù)基團(tuán)來代替ivdde基團(tuán)。固相路線經(jīng)8個(gè)步驟產(chǎn)出mcc223,其在hplc純化后的總產(chǎn)率可觀,為11%(>95%純度)。
方案7:試劑和條件:a)fmoc-l-lys(alloc)-oh,dic,hobt,dmap,dmf,室溫,16小時(shí);漂洗然后是醋酸酐,dipea,dmf,室溫,1小時(shí);b)含20%哌啶的dmf,室溫,30分鐘,漂洗然后是fmoc-lys(mtt)-oh,hbtu,hbtu,dipea,dmf,室溫,1小時(shí)進(jìn)行3個(gè)循環(huán);c)含20%哌啶的dmf,室溫,2×30分鐘,漂洗,然后是肉豆蔻酸,hbtu,dipea,dmf,室溫,1小時(shí);d)pd(pph3)4,苯基硅烷,dcm,20小時(shí);e)萬古霉素,hbtu,dipea,dmf,18小時(shí);f)含2%tfa、5%tes的dcm,30分鐘。
實(shí)施例6:mcc000455的合成:帶溶液相糖肽偶聯(lián)的固相合成以產(chǎn)生具有l(wèi)ys-nh2連接基團(tuán)的化合物
方案8:試劑和條件:a)含20%哌啶的dmf,室溫,30分鐘,漂洗,然后是fmoc-l-lys(boc)-oh,hbtu,dipea,dmf,室溫;b)含20%哌啶的dmf,室溫,30分鐘,漂洗,然后是fmoc-lys(ivdde)-oh,hbtu,dipea,dmf,室溫;c)含20%哌啶的dmf,室溫,2×30分鐘,漂洗,然后十一酸,hbtu,dipea,dmf,室溫,1小時(shí);d)20%tfa,5%tes,dcm;e)萬古霉素,pybop/hbtu,dipea,dmf/dmso;e)含2%肼的dcm。
rinkamideam樹脂的fmoc去保護(hù):
rinkamideam樹脂(負(fù)載0.94mmol/g,300mg)用含20%哌啶的dmf(6.0ml)處理,并在室溫下振蕩30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次),和dcm洗滌(3次)。
rinkamideam樹脂裝載fmoc-l-lys(boc)-oh:
將fmoc-l-lys(boc)-oh(703mg)溶解在dmf(3.0ml,0.5m)中。加入hbtu的dmf溶液(3.0ml,0.5m),然后加入dipea(523微升)。該溶液在室溫下靜置10分鐘,然后加入到已經(jīng)用dmf事先洗滌三次的樹脂上。然后將樹脂在室溫下振蕩1小時(shí),排干并用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次)。
fmoc去保護(hù):
該樹脂用在dmf中的20%哌啶(6.0ml)處理,并在室溫下振蕩30分鐘。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次),和dcm洗滌(3次)。
與fmoc-l-lys(ivdde)-oh的肽偶聯(lián):
制備含fmoc-l-lys(ivdde)-oh(423mg)的dmf(4.5ml,0.167m)。向其中加入含hbtu的dmf溶液(1.5ml,0.5m),然后加入dipea(261微升)。該溶液在室溫下靜置10分鐘,然后加入到已用dmf先洗滌三次的樹脂中。然后將樹脂在室溫下振蕩2小時(shí),排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次)。重復(fù)此步驟。
重復(fù)fmoc去保護(hù)和與fmoc-l-lys(ivdde)-oh偶聯(lián)的步驟,然后是又一fmoc去保護(hù)。
與十一酸偶聯(lián):
將含十一酸(279mg)的dmf(3.0ml)溶液與含hbtu的dmf溶液(3.0ml,0.5m)和dipea(523微升)混合。該溶液在室溫下攪拌10分鐘,然后加入到預(yù)先用dmf洗滌三次的樹脂中靜置。樹脂在室溫下振蕩1小時(shí),排出并用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次)洗滌。將樹脂在真空中干燥。對(duì)5mg樹脂進(jìn)行切割反應(yīng)來檢查反應(yīng)程度。將樹脂溶解于1.0ml乙腈中,通過0.45微米的注射器式過濾器過濾,并通過lcms進(jìn)行分析。lcms分析:t9.088min,elsd測(cè)定為80%,(m+h)+982.5,(m+2+)2+491.9,(m+3h)3+328.3。
rinkamideam樹脂的切割反應(yīng)和boc去保護(hù):
制備含20%tfa、5%三乙基硅烷的dcm(6.0ml)溶液并加入到樹脂(300mg)中30分鐘。通過過濾除去樹脂,并用dcm洗滌(3次)和乙腈洗滌(3次)。在真空中除去溶劑。該樹脂溶解于1:1acn/h2o并冷凍干燥。
與萬古霉素的溶液相偶聯(lián):
在手套箱中,將肽(40mg,40.7微摩爾)溶解在無水dmf(0.7ml,58.1mm)中。含萬古霉素·hcl(72mg,fw1485.71,48.8微摩爾,1.2eq.)的無水dmso(0.7ml,69.7毫摩爾)加熱直至溶解,溶液澄清。將溶液冷卻至室溫,并加入到該肽。加入98微升含hbtu(95mg,fw379.3)的無水dmf(0.5ml,0.5m)溶液,隨后加入dipea(29微升,4.1eq.)并攪拌過夜。lcms分析:rt7.189分鐘,elsd測(cè)定為25%,(m+2h)2+1207.4,(m+3h)3+805.3,(m+4h)4+604.4。
ivdde去保護(hù):
萬古霉素衍生物用1.0ml含2%一水合肼的1:1dmf/dmso進(jìn)行處理,并在室溫下攪拌過夜。為了檢查反應(yīng)程度,在30分鐘、2小時(shí)和過夜后,將20微升溶液溶解在0.8ml1:1acn/h2o中并通過lcms分析。lcms分析:期望產(chǎn)物的保留時(shí)間(rt)為5.388分鐘,elsd測(cè)定為50%,(m+2h)2+1000,(m+3h)3+667.8,(m+4h)4+501;僅除去了一個(gè)ivdde,rt6.376min,elsd測(cè)定為20%,(m+2h)2+1103,(m+3h)3+736.5,(m+4h)4+552.6。然后在35℃和高真空下過夜除去溶劑。
最終產(chǎn)物的純化:
將粗產(chǎn)物溶解于水/acn,并使用shimadzu制備型hplc純化。將純化產(chǎn)物冷凍干燥,得到白色粉末,19mg,為基于切割的肽量的19%。
實(shí)施例7:產(chǎn)生具有非支化二胺連接基團(tuán)的化合物的通用過程:帶溶液相糖肽偶聯(lián)的固相合成
方案9:試劑和條件:ⅰ)fmoc-l-lys(mtt)-oh,dic,hobt,dmap,dcm,dmf;ⅱ)含20%哌啶的dmf,室溫,30分鐘;ⅲ)fmoc-l-lys(mtt)-oh,hbtu,dipea,dmf,室溫;ⅳ)rcooh,hbtu,dipea,dmf或rso2cl,diea;ⅴ)nh2(ch2)mnh2,dipea,dmf,50℃;ⅵ)萬古霉素,hbtu,dipea,dmf/dmso;vii)2%tfa,5%tes,dcm。
1,3-二氨基丙烷和1,2-二氨基乙烷介導(dǎo)的hypogelhmba樹脂切割反應(yīng)的通用過程:
含1,3-二氨基丙烷或1,2-二氨基乙烷的dmf溶液(2.0m,2.0ml/100mg樹脂)加入到裝有樹脂的玻璃樣品瓶中。將樣品瓶良好密封,并加熱至50℃過夜。將樹脂和溶液轉(zhuǎn)移到固相反應(yīng)管。收集濾液,樹脂用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和乙腈洗滌(3次)。洗滌液與濾液合并并在減壓下除去溶劑,得到作為c端氨基酸烷基酰胺的粗脂肽。粗脂肽不經(jīng)進(jìn)一步純化,用于與萬古霉素的溶液相偶聯(lián)反應(yīng)。
實(shí)施例8:mcc000344的合成:帶溶液相糖肽偶聯(lián)的固相合成
fmoc-l-lys(mtt)-oh加載到hmbahypogel樹脂上:
1.5克hmbahypogel樹脂(負(fù)載:0.81mmol/g)用dmf洗滌(3次)。在15mldmf中制備fmoc-l-lys(mtt)-oh(3.8g,mw624.8g/mol,5eq)溶液。將羥基苯并三唑(hobt)(0.82g,mw135,5eq),n,n-二異丙基碳二亞胺(dic)(941微升,mw126.2g/mol,5eq.)和4-二甲基氨基吡啶(dmap)(44.5mg,mw122.17)加入到氨基酸溶液中。將該溶液加入到預(yù)先洗滌的樹脂中,并在室溫下振搖過夜。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),真空干燥。
fmoc保護(hù)基團(tuán)的去保護(hù):
250mg樹脂用dmf預(yù)洗滌(3次),用2.5ml含20%哌啶的dmf(1.0ml/100mg樹脂)處理,并在室溫下?lián)u動(dòng)一小時(shí)。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),真空干燥。
氨基酸與樹脂結(jié)合肽的偶聯(lián):
制備含fmoc-l-lys(mtt)-oh(1539mg,mw624.8g/mol,2eq)的14.75ml的dmf溶液(1539mg,分子量624.8克/摩爾,2eq.)。將hbtu的無水dmf溶液(0.5m,4.92ml)和dipea(1713微升,mw129.25)加入到氨基酸溶液中。將該溶液在室溫下靜置10分鐘,然后加入到預(yù)先洗滌的樹脂中,并在室溫下振搖過夜。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),真空干燥。
fmoc保護(hù)基團(tuán)的去保護(hù):
250mg樹脂用dmf預(yù)洗滌(3次),用2.5ml含20%哌啶的dmf(1.0ml/100mg樹脂)處理,并在室溫下?lián)u動(dòng)一小時(shí)。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),真空干燥。
可插入元件與樹脂結(jié)合肽的偶聯(lián):
制備以1.13mldmf制備十一酸(105mg,mw186.29g/mol5.1eq)溶液和以干燥dmf(1.13ml,0.5m,5.1eq.)制備hbtu溶液。將hbtu溶液加入到十一酸溶液中,隨后加入dipea(196微升,mw129.25g/mol,d0.742,10.2eq)。將該溶液在室溫下靜置10分鐘,然后加入預(yù)洗滌的樹脂(225mg)并在室溫下振搖過夜。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次)和dcm洗滌(3次),真空干燥。
用1,3-二氨基丙烷進(jìn)行樹脂切割反應(yīng):
25mg樹脂用0.75ml1,3-二氨基丙烷和0.15mldipea處理。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。收集切割的肽和樹脂的dcm(3次)、甲醇(3次)和acn(3次)洗液。在真空中蒸發(fā)并干燥溶劑。
肽和萬古霉素的溶液相偶聯(lián):
以1.05ml無水dmso制備萬古霉素·hcl的溶液(195.76mg,mw1485.7g/mol,0.125m,1.2eq)。需要進(jìn)行溫和加熱以充分溶解萬古霉素。所觀察到的顏色從粉紅色變成淡棕色。將含hbtu的無水dmf(0.26ml,mw379.3g/mol,0.5m1.2eq)加入到該萬古霉素溶液中,接著加入dipea(78.42微升,mw129.25g/mol,4.1eq)。將該溶液加入至肽,并在室溫下攪拌過夜。在高真空下將萬古霉素衍生物蒸干。
mtt保護(hù)基的去保護(hù)
將20ml含2%tfa、5%三乙基硅烷的干燥dcm溶液加入到萬古霉素衍生物(200mg)中。該溶液在室溫下攪拌30分鐘。在真空中蒸發(fā)并干燥溶劑,最終產(chǎn)物mcc000344通過制備型hplc進(jìn)行純化。
實(shí)施例9:用三唑連接的化合物的合成:用溶液相糖肽偶聯(lián)的固相合成,以產(chǎn)生mcc000453
方案10:試劑和條件:ⅰ)含20%哌啶的dmf,室溫;ⅱ)fmoc-l-propargylglycine-oh,hbtu,dipea,dmf,室溫;ⅲ)fmoc-l-lys(boc)-oh,hbtu,dipea,dmf,室溫;ⅳ)十一酸,hbtu,dipea,dmf,室溫;v)20%tfa、5%tes,dcm;ⅵ)cuso4,naasc,dmf,h2o。
rinkamideam樹脂的fmoc去保護(hù):
rinkamideam樹脂(負(fù)載0.81mmol/g,300mg)用含20%哌啶的dmf(6.0ml)處理,并在室溫下振蕩30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次),和dcm洗滌(3次)。
向rinkamideam樹脂裝載fmoc-l-炔丙基甘氨酸:
將fmoc-l-炔丙基甘氨酸溶解于dmf(4.5ml,0.5m)中。加入含hbtu的dmf(1.5ml,0.5m)溶液,然后加入dipea(0.5m終濃度)。該溶液在室溫下靜置10分鐘,然后加入到已經(jīng)用dmf預(yù)先洗滌三次的樹脂中。然后將樹脂在室溫下振蕩過夜,排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次),和dcm洗滌(3次)。
fmoc去保護(hù):
該樹脂用含20%哌啶的dmf(6.0ml)處理,并在室溫下振蕩30分鐘。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次),和dcm洗滌(3次)。
與fmoc-l-lys(boc)-oh的肽偶聯(lián):
制備含fmoc-l-lys(boc)-oh(703mg)的dmf溶液(3.0ml,0.5m)。向其中加入含hbtu的dmf溶液(3.0ml,0.5m),然后加入dipea(523微升)。該溶液在室溫下靜置10分鐘,然后加入到已經(jīng)用dmf預(yù)先洗滌三次的樹脂中。然后,將樹脂在室溫下振蕩1小時(shí),排干并用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次),和dcm洗滌(3次)。
fmoc去保護(hù):
該樹脂用含20%哌啶的dmf(6.0ml)處理,并在室溫下振蕩30分鐘。將樹脂排干,用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次),和dcm洗滌(3次)。
與十一酸偶聯(lián):
將十一酸(279mg)的dmf(3.0ml)溶液與含hbtu的dmf溶液(3.0ml,0.5m)和dipea(523微升)混合。該溶液在室溫下攪拌10分鐘,然后加入到預(yù)先用dmf洗滌三次的樹脂中靜置。樹脂在室溫下振蕩1小時(shí),排干并用dmf洗滌(3次),甲醇洗滌(3次),和dcm洗滌(3次)。將樹脂在真空中干燥。
rinkamideam樹脂的切割反應(yīng)和boc去保護(hù):
制備含20%tfa、5%三乙基硅烷的dcm(0.5ml)溶液并加入到樹脂中靜置30分鐘。通過過濾除去樹脂,并用dcm洗滌(3次)和乙腈洗滌(3次)。在真空中除去溶劑。該樹脂溶解于1:1acn/h2o并冷凍干燥。將1mg試樣溶解在1.0ml乙腈中,通過0.45微米注射過濾器過濾,并通過lcms進(jìn)行分析:–rt6.38min,90%byelsd,(m+h)+537.3,(m+2h)2+269.2。
疊氮烷胺萬古霉素的制備:
萬古霉素疊氮化物衍生物的溶液相偶聯(lián)(“點(diǎn)擊(click)”反應(yīng)):
將萬古霉素疊氮化物類似物(1.5mg,1微摩爾)溶解在h2o中。向該溶液中加入cuso4.5h2o(0.5mg,2微摩爾)和抗壞血酸鈉(1mg,5微摩爾)。將所得溶液加入到肽(0.5mg,1微摩爾)的dmf(250微升)溶液中,然后在微波下80℃加熱10分鐘。將0.125ml溶液與0.375ml的1:1acn/h2o混合,通過0.45微米的注射器式過濾器過濾,并通過lcms進(jìn)行分析:rt5.522min,elsd測(cè)定為70%,(m+2h)2+1034.3,(m+3h)3+690,(m+4h)4+517.7。將該粗產(chǎn)物溶解于水/can并使用shimadzu制備型hplc純化,通過冷凍干燥產(chǎn)生白色粉末,1.3mg,為基于切割的肽量的16%。lcms:rt5.5795%(elsd)[m+2h]2+1033.8,[m+3h]3+690.2,[m+4h]4+517.8。
實(shí)施例10:合成化合物總結(jié)
化合物通過一種或多種上述路線或其變型來合成。本合成領(lǐng)域的普通化學(xué)技術(shù)人員能夠理解,所述過程中的變化仍然會(huì)產(chǎn)生期望產(chǎn)物,無論是改變所用反應(yīng)試劑(例如替換用于酰胺鍵形成的替代性偶聯(lián)試劑),或通過改變保護(hù)基團(tuán)的放置、類型和去除順序,或者通過改變?cè)M裝順序。
表1:元件x的縮寫的對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)
表2:化合物結(jié)構(gòu)總結(jié)
*va=-co-萬古霉素,vb=-co-脫胺基萬古霉素,*vc=-co-萬古霉素糖苷配基,vd=-co-a40926(http://aac.asm.org/content/31/12/1961.abstract),ve=-co-特拉萬星。
表3:合成化合物的表征
抗菌活性的測(cè)定
針對(duì)若干細(xì)菌菌株測(cè)試了化合物的抗微生物活性,包括金黃色葡萄球菌(mrsaatcc43300,gisanrs17,visanrs1,mrsa臨床分離株,達(dá)托霉素抗性臨床分離株),肺炎鏈球菌(mdratcc700677),糞腸球菌(enterococcusfaecalis)(vana臨床分離株)和屎腸球菌(enterococcusfaecium)(mdrvanaatcc51559)。
所有化合物均是將1mm濃度的儲(chǔ)備溶液用水制備為160微克/ml溶液。
mic分析:
將化合物連同標(biāo)樣抗生素一起在96孔非結(jié)合表面板(nbs,corning)的孔中進(jìn)行兩倍連續(xù)稀釋。標(biāo)樣的范圍為從64微克/ml至0.03微克/ml,化合物則為8微克/ml至0.003微克/ml,每孔的最終體積為50微升。將革蘭氏陽(yáng)性菌在37℃下于mullerhinton肉湯(mhb)(bactolaboratories,cat.no.211443)中培養(yǎng)過夜。然后,各培養(yǎng)物的樣品用新鮮mhb肉湯稀釋40倍,并在37℃下培養(yǎng)2-3小時(shí)。所得對(duì)數(shù)中期培養(yǎng)物稀釋至5x10e5cfu/ml的最終濃度,然后取50微升加入到含有化合物的96孔板的每個(gè)孔中。所有的板均覆蓋并在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。mic表示無可見生長(zhǎng)的最低濃度。
mbc分析:
為測(cè)定最小殺菌濃度(mbc),在確定了mic值之后,取30微升刃天青(resazurin)(0.01%)添加至96孔板的每個(gè)孔中。然后將化合物在37℃下再培養(yǎng)18至24小時(shí)。藍(lán)色染色的孔表示微生物死亡,而粉紅色染色表示微生物存活。mbc值是通過藍(lán)色著色孔的最低濃度來確定的。
檢測(cè)與分析:
在培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)目視測(cè)定mic值,且mic定義為培養(yǎng)后無可見生長(zhǎng)的最低濃度。mic和mbc均僅通過目測(cè)來確定。
生物學(xué)結(jié)果總結(jié)
如上測(cè)定的對(duì)三個(gè)代表性細(xì)菌菌株的抗菌活性總結(jié)在下表中。
表4:化合物的最小抑制濃度(mic)
人血漿中的化合物穩(wěn)定性
人類血漿穩(wěn)定性測(cè)定,是根據(jù)改進(jìn)后的“di,l.;kerns,e.h.;hong,y.;chen,h.developmentandapplicationofhighthroughputplasmastabilityassayfordrugdiscovery(internationaljournalofpharmaceutics2005,297,110-119”所述方法進(jìn)行的。
簡(jiǎn)單而言,從1mm儲(chǔ)備溶液制備受試化合物(20μm)。使用前,人血漿樣品(200微升)用160微升磷酸鹽緩沖鹽水(pbs,ph7.4)稀釋至50%v/v的濃度。然后,將溶液渦旋振蕩并放置在37℃搖床上輕輕搖動(dòng)10分鐘。然后,取40微升受試化合物加入到血漿樣品中并渦旋。在反應(yīng)時(shí)間t=0小時(shí),加入,立即轉(zhuǎn)移50微升樣品到微量離心管中并用150微升冷乙腈猝滅。剩余的血漿溶液在37℃下振蕩培養(yǎng)。在0、1、3、6和24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)上收集其他樣品,由此取出50微升小份試樣并用150微升冷乙腈猝滅。所有樣品置于4℃冰箱中10分鐘,然后以3000rpm離心15分鐘。將上清液(100微升)轉(zhuǎn)移至玻璃樣品瓶?jī)?nèi)插管用于lcms分析,得到了各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上相對(duì)于時(shí)間點(diǎn)0小時(shí)的試樣的剩余測(cè)試化合物百分比。
實(shí)驗(yàn)方案:
化學(xué)品:dmso,乙腈和磷酸鹽緩沖鹽水(pbsph7.4,等滲)。
血漿:人血漿(合并正常人血漿肝素抗凝50ml(ipla-2n-04批次ir09-1001,源自innovativeresearch和biocore進(jìn)口)。
耗材:微量離心管(尤卡托品和萬古霉素),低結(jié)合微量離心管(用于化合物)和agilenthplc玻璃樣品瓶和內(nèi)插管。
設(shè)備:37℃搖床,旋渦振蕩器,離心機(jī)和lc-ms。
儲(chǔ)備液:
所有化合物在100%水中(400微升化驗(yàn)體積中含40微升,相當(dāng)于20μm)
尤卡托品:在100%dmso中300微克/ml(400微升化驗(yàn)體積中含10微升,相當(dāng)于23μm)。血漿穩(wěn)定性分析流程
制備僅含緩沖液的對(duì)照樣:
化合物:將40微升萬古霉素衍生物溶液分別加到含160微升pbs(ph7.4)的微量離心管中。加入冷乙腈600微升,將管進(jìn)行渦旋振蕩并轉(zhuǎn)移至玻璃樣品瓶中用于lc-ms分析。
50%血漿和pbs緩沖液在時(shí)間0、1、3、6和24小時(shí)的血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方案:
尤卡托品:取血漿200微升和緩沖液190微升進(jìn)行渦旋,在37℃下振蕩10分鐘。然后加入尤卡托品溶液10微升并渦旋所述管。將50微升小份試樣立即轉(zhuǎn)移到微量離心管中,加入冷乙腈150微升并將管轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中10分鐘。然后將剩余的血漿溶液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中,并在37℃下振蕩。將管從冰箱中取出,以3000rpm離心15分鐘,取100微升上清液轉(zhuǎn)移到玻璃樣品瓶?jī)?nèi)插管中用于lc-ms分析。如上所述在1、2、3、6和24小時(shí)處理50微升小份試樣,并取5微升注入到三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)中進(jìn)行分析。
萬古霉素衍生物:取血漿200微升的和緩沖液160微升進(jìn)行渦旋,并在37℃振蕩10分鐘。然后加入化合物40微升,并如上所述處理樣品。
表5:與50%人血漿培養(yǎng)24小時(shí)后的剩余化合物
谷胱甘肽存在時(shí)的化合物穩(wěn)定性
根據(jù)如下實(shí)驗(yàn)方案評(píng)估存在生理濃度的谷胱甘肽時(shí)的化合物穩(wěn)定性:取20微升的1mm受試化合物儲(chǔ)備溶液加入到含180微升的谷胱甘肽(還原形式)pbs溶液的塑料hplc內(nèi)插管中,得到100μm的化合物終濃度,且谷胱甘肽為5mm或0.5mm。將樣品放置在hplc取樣架上,每隔一小時(shí)進(jìn)行取樣直至10小時(shí)。在注射前小心地即時(shí)制備樣品。然后,以u(píng)v面積作圖得到化合物隨時(shí)間的損失。相對(duì)于0小時(shí)的總?cè)f古霉素衍生物進(jìn)行百分比作圖。結(jié)果如圖1所示。
小鼠中的化合物藥代動(dòng)力學(xué)模式
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定:用于本研究的是體重25-35g的七到九周齡雄性cd1小鼠(slac實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,上海,中國(guó)),在使用前馴化大約3天。動(dòng)物在馴化及其生命研究期間分組安置,依照美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)(nationalresearchcouncil)“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照顧與使用指南(guideforthecareanduseoflaboratoryanimals)”的規(guī)定。動(dòng)物室環(huán)境受控(目標(biāo)條件:溫度18~26℃,相對(duì)濕度30~70%,12小時(shí)人造光和12小時(shí)黑暗),每天監(jiān)測(cè)溫度和相對(duì)濕度。在制劑給藥前,動(dòng)物禁食約16小時(shí),然后,在給藥經(jīng)過4小時(shí)之后,允許其任意進(jìn)食認(rèn)證嚙齒類動(dòng)物食物(certifiedrodentdiet,目錄號(hào)m-01f,上海slac實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。水在高壓滅菌之后方提供給所述動(dòng)物隨意飲用?;衔镏苿┰诮o藥當(dāng)天早上制備。iv組的制劑在給藥于動(dòng)物之前用0.22微米的過濾器過濾。劑量制劑配制后,從每個(gè)劑量制劑中取出重復(fù)的50微升小份用于劑量驗(yàn)證。
對(duì)于每一受試化合物,取每設(shè)施3只小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥(iv),每只動(dòng)物依標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(sops),通過尾靜脈給予以去離子水配置為1mg/ml的試驗(yàn)物質(zhì),其劑量體積為2ml/kg,提供的劑量為2mg/kg(基于游離堿濃度)。另取每設(shè)施3只小鼠進(jìn)行皮下給藥(sc),每只動(dòng)物依標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,在各動(dòng)物背部皮下推注以去離子水配置為2mg/ml的試驗(yàn)樣品,其劑量體積為5ml/kg,提供的劑量為10mg/kg
所有動(dòng)物均在最后一次研究時(shí)間點(diǎn)上安樂死(將100%co2引入動(dòng)物箱)。
樣品采集:各劑量施用后,在以下目標(biāo)時(shí)間收集血漿樣品:
iv采樣時(shí)間點(diǎn)(給藥后小時(shí)):0,0.083,0.25,0.5,1,2,4,8,24。
sc采樣時(shí)間點(diǎn)(給藥后小時(shí)):0,0.25,0.5,1,2,4,8,24。
對(duì)于前幾個(gè)時(shí)間點(diǎn),通過下頜下或隱靜脈獲得約30微升血液。對(duì)于最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn),在麻醉(將100%co2引入動(dòng)物箱)小鼠后,通過心臟穿刺收集樣品。所有血液樣品轉(zhuǎn)移到含有2微升作為抗凝血?jiǎng)┑膋2-edta(0.5m)的預(yù)冷塑料微離心管內(nèi),并置于濕冰上直至離心。收獲的血樣以7000rpm在采集后30分鐘內(nèi),以4℃離心約10分鐘。離心后,將血漿轉(zhuǎn)移到另一個(gè)預(yù)標(biāo)記且預(yù)冷的聚丙烯微離心管中,然后在干冰上速凍,并儲(chǔ)存在-70±10℃下,直到進(jìn)行l(wèi)c/msms分析。
樣品分析:
給藥制劑驗(yàn)證:在各劑量制劑的中間位置,采集制劑等分試樣一式兩份。制定lc-uv方法,使用由6個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)樣組成的校準(zhǔn)曲線。劑量制劑樣品中的試驗(yàn)化合物濃度通過lc-uv方法測(cè)定。對(duì)于分析測(cè)試的接受標(biāo)準(zhǔn):6個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)樣中至少5個(gè)應(yīng)該在標(biāo)稱值的20%以內(nèi)。
血漿樣品:使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)制定了用于定量測(cè)定研究所用動(dòng)物血漿中的試驗(yàn)物質(zhì)的lc-ms/ms分析方法。小鼠血漿中的化合物的實(shí)驗(yàn)臺(tái)穩(wěn)定性,以qc中間濃度一式三份,在0、2小時(shí)處,室溫下進(jìn)行測(cè)定。使用t2/t0樣品的平均峰面積比率來測(cè)定穩(wěn)定性。如果平均峰面積比率在80%~120%內(nèi),則認(rèn)為血漿中的試驗(yàn)物質(zhì)在室溫下2小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。用于lc-ms/ms方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線由8個(gè)非零校準(zhǔn)標(biāo)樣組成,其目標(biāo)lloq≤3ng/ml。一組qc樣品由3個(gè)濃度水平(低,中,高)組成。使用lc-ms/ms方法,用一組校準(zhǔn)標(biāo)樣和兩組qc樣品同時(shí)進(jìn)行樣品分析。血漿生物分析試驗(yàn)的接受標(biāo)準(zhǔn):最少6個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)樣回溯計(jì)算為其標(biāo)稱濃度的±20%之內(nèi);且6個(gè)qc樣品中最少4個(gè)應(yīng)回溯計(jì)算為其標(biāo)稱濃度的±20%之內(nèi)。分析物干擾:的平均計(jì)算濃度應(yīng)≤0.5倍lloq。殘留:在最高標(biāo)樣注射后的單個(gè)空白基質(zhì)中的即刻平均計(jì)算殘留濃度應(yīng)當(dāng)≤lloq。
數(shù)據(jù)分析:使用winnonlin非房室模型(phoenixwinnonlin6.2.1,pharsight,mountainview,ca)分析了來自動(dòng)物個(gè)體的血漿濃度隨時(shí)間的數(shù)據(jù)。對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)c0,t1/2,cl,vdss,cmax,tmax,auc0-last,auc0-inf,%f,mrt0-last,mrt0-inf及血漿濃度的時(shí)間變化曲線進(jìn)行了推導(dǎo),如圖2所示。
小鼠大腿感染模型中的化合物療效
概述:成年(8周齡)雌性cd1小鼠在注射前4天和1天進(jìn)行兩次環(huán)磷酰胺注射以形成中性粒細(xì)胞減少。將105cfumrsa(菌株atcc43300)接種體肌內(nèi)注射到所有小鼠的左、右大腿。感染開始后兩小時(shí),將鹽水、萬古霉素或本發(fā)明化合物在后腰處皮下注射。又兩小時(shí)后,從尾出血獲得血液50微升樣品,以分析抗菌化合物的存在。在感染后24小時(shí),安樂處死小鼠并再次收集血液樣品用于化合物分析。然后取下大腿,稱重并在固定體積鹽水中勻漿。將勻漿溶液過濾、稀釋并接種到瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)過夜。使用菌落計(jì)數(shù)確定大腿勻漿物中的cfu、cfu/大腿和大腿的ccfu/g。
化合物制備:將環(huán)磷酰胺一水合物(sigma公司)溶于無菌生理鹽水至30mg/ml濃度。同樣地,將萬古霉素(sigma)和mcc化合物也溶于無菌鹽水中,分別得到60mg/ml和18.5mg/ml的最終濃度。所有化合物均在低結(jié)合微量離心管中制備,并保持在-20℃下直至使用。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定:八周齡雌性遠(yuǎn)交系cd1小鼠(uqbr-aibn)通過在實(shí)驗(yàn)感染前4天(150mg/kg)和1天(100mg/kg)腹膜內(nèi)注入兩劑環(huán)磷酰胺而使得中性粒細(xì)胞減少。通過肌肉注射含對(duì)數(shù)期早期mrsa菌懸液50微升(約2×106個(gè)/ml)的生理鹽水到兩大腿的肌肉中,建立使用mrsa的感染模型。兩小時(shí)后,用單劑量萬古霉素(200mg/kg)或本發(fā)明化合物(25mg/kg)通過皮下注射在肩胛間(后頸部區(qū)域)給藥。未處理動(dòng)物接受等效體積鹽水(baxter)。在給藥期間和給藥后,監(jiān)控小鼠的正常行為(即梳洗,吃,喝,睡和警覺性)跡象。鹽水/抗菌劑處理后兩小時(shí),通過尾切口收集0.05ml血液。mrsa感染后24小時(shí),對(duì)小鼠實(shí)施安樂死,并通過心臟穿刺從心臟采集血液(生理鹽水組)或從尾切口采集血液(萬古霉素和mcc化合物處理組),如圖1所示。對(duì)于每一小鼠,通過在髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)進(jìn)行腿部切割來采集兩大腿,置于10ml冷無菌鹽水中,并記錄各大腿的個(gè)體重量。
可注射mrsa溶液的制備:取出-80℃下儲(chǔ)藏的mrsa傳代培養(yǎng)細(xì)菌分離物(atcc43300),并在瓊脂平板上新鮮接種過夜(o/n)生長(zhǎng)。從過夜培養(yǎng)制備物中,取單菌落稀釋到10-12mlmuellerhinton肉湯(mhb)中,并在37℃下培養(yǎng)過夜。通過在10mlmhb中添加100微升過夜傳代培養(yǎng)物,得到對(duì)數(shù)期傳代培養(yǎng)物,并再培養(yǎng)2-3小時(shí)。最后,測(cè)定該細(xì)菌懸浮液的od600值,并外推每毫升菌落形成單元(cfu/ml)。通過洗滌(3220xg,10分鐘)獲得細(xì)菌細(xì)胞懸浮液在鹽水中的充分稀釋液,并測(cè)定在鹽水中的od600。然后相應(yīng)地稀釋懸浮液,以獲得2x106cfu/ml溶液(即105cfu每50微升/大腿)。
注射mrsa溶液的定量:為了能夠建立msra注射溶液中所含的實(shí)際cfu/ml與根據(jù)od600讀數(shù)的估算cfu/ml之間的相關(guān)性,進(jìn)行了該msra注射溶液的標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)。因此,將10微升可注射mrsa懸浮液稀釋至10~1000倍,每一稀釋液鋪板到瓊脂平板上,并37℃培養(yǎng)24小時(shí)。從估算為2x106cfu/ml的溶液,其1:1000稀釋液中發(fā)現(xiàn)了18cfu/10微升,由此得到實(shí)際注射mrsa溶液的終濃度為1.8x106cfu/ml。
血清樣品制備:用lithium-heparin
大腿勻漿物和cfu測(cè)定:使用polytronmr2500e用200mm探針(均為kinematica)將大腿以20000rpm勻漿15秒。使用100微米孔徑的過濾器(bd)過濾勻漿溶液,并取1ml濾液溶液置于冰上,迅速進(jìn)行連續(xù)稀釋(1:10和1:100),并接種到適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)瓊脂板(bactolaboratories)中,37℃下培養(yǎng)過夜。第二天,對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù),并基于所述平板計(jì)數(shù)和稀釋系數(shù)計(jì)算cfu/大腿和cfu/g。
代表性結(jié)果如圖3所示,且結(jié)果總結(jié)在如下表6中。
表6:小鼠大腿感染模型中的化合物療效
化合物在小鼠肺部感染生存模型(肺炎鏈球菌)中的療效
使用了各組各10只的重量為22±2g的雄性無特異病原體icr小鼠。通過用懸浮在20μlbhi中的ld90-100劑量(2.96x106cfu/小鼠)的肺炎鏈球菌(atcc6301)進(jìn)行氣管內(nèi)接種,來誘導(dǎo)急性肺炎。載體(10ml/kg)、萬古霉素和測(cè)試物質(zhì)(25mg/kg)分別在感染2小時(shí)后皮下給藥。接種后10天內(nèi),每天記錄死亡率。相對(duì)于載體對(duì)照組,存活率增加了50%或以上(≥50%),表明了顯著的抗感染活性。
結(jié)果如圖4中所示。