本申請要求享有2014年提交的美國臨時申請?zhí)?1/938,646的申請、2014年6月27日提交的美國臨時申請?zhí)?2/017,970的申請、以及2014年9月5日提交的美國臨時申請?zhí)?2/046,379的申請的優(yōu)先權(quán)。在先申請的公開內(nèi)容被認(rèn)為是本申請的公開內(nèi)容的一部分(并且全部以引用的方式結(jié)合到本文中作為參考)。

序列表

本申請包含一個序列表，所述序列表是以ASCII格式進(jìn)行電子提交，并且其在此一杯全部引入到本發(fā)明中作為參考。所述ASCII副本，創(chuàng)建于2015年1月7日，被命名為P2029-7002WO_SL.txt，并且文件大小為75，052字節(jié)。

發(fā)明背景

登革病毒是一種正義RNA病毒，屬于黃病毒科(Fkaviviridae)的黃病毒屬。登革病毒廣泛分布于全世界的熱帶和亞熱帶地區(qū)，并且是通過蚊蟲載體傳播給人類。在至少8個熱帶亞洲國家登革病毒是兒童住院治療和死亡的主要原因(WHO，1997.Dengue haem或者rhagic fever:diagnosis，treatment prevention and control--2nd ed.Geneva:WHO)。目前存在四種登革病毒的血清型(DV-1、DV-2、DV-3和DV-4)，它們每年估計造成50萬-100萬例登革熱病例以及500，000例情況更為嚴(yán)重的登革病毒感染、登革出血熱/登革休克綜合癥(DHF/DSS)(Gubler，D.J.&Meltzer，M.1999Adv Virus Res 53:35-70)。DHF/DSS主要發(fā)生在兒童和成年人中，他們將經(jīng)歷與第一次登革病毒感染所不同的血清型的第二次登革病毒感染，并且重要的是其仍然感染具有循環(huán)登革特異性母體抗體的嬰兒(Burke，D.S.et al.1988Am J Trop Med Hyg 38:172-80；Halstead，S.B.et al.1969Am J Trop Med Hyg 18:997-1021；Thein，S.et al.1997Am J Trop Med Hyg 56:566-72)。

血清型不同的登革病毒在氨基酸水平上大約有25-40％的不同，并且具有抗原性差異，而且這種變化還會妨礙針對全部血清型產(chǎn)生的有效治療。

全部四種登革病毒血清型都顯示在病毒表面上的E(包膜)蛋白質(zhì)。所述E蛋白質(zhì)有助于病毒附著到宿主細(xì)胞上。所述E蛋白包括DI區(qū)域(一種九鏈的β桶)、DII區(qū)域(一種涉及與宿主細(xì)胞融合的區(qū)域)、以及DIII區(qū)域(免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域)。在人類中對于E蛋白質(zhì)的體液應(yīng)答通常靶向DI區(qū)域和DII區(qū)域，其中大部分的抗體表現(xiàn)出高交叉血清型反應(yīng)性及低中和活性。

因此，在本領(lǐng)域中針對登革病毒有必要尋找一種新的預(yù)防性及治療性處理方式，并且特別是針對全部四種血清型的病毒的有效治療方式。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供，至少部分地提供了，與登革病毒連接的抗體分子，例如，登革病毒E蛋白，并且本發(fā)明還包括在這里所公開的功能和結(jié)構(gòu)特性。在某些實施方案中，所述抗體分子連接到EDIII(E蛋白DIII區(qū)域)的“A”β鏈。在某些實施方案中，所述抗體分子連接和/或中和至少1，2，3或者4種登革病毒血清型(例如，DV-1，DV-2，DV-3和DV-4)。在某些實施方案中，所述抗體分子選自表1。在某些實施方案中，所述抗體分子與抗體A11項目包括一種VH S26的缺失和/或一種VH T33V取代。在某些實施方案中，這些突變可以改善一種或多種特性，例如，改善針對一種或多種登革病毒血清型(例如血清型DV-4)的抗體親和力。在某些實施方案中，所述抗體分子靶向在EDIII上的位點，其在所有四種登革病毒之間是保守的。在這里還提供了編碼所述抗體分子的核苷酸分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、藥物組合物以及用于產(chǎn)生所述抗體分子的方法。在這里所公開的抗-登革抗體分子可被用于(單獨或者與其它試劑或者治療方式聯(lián)合)治療、預(yù)防和/或診斷登革病毒，例如DV-1、DV-2、DV-3或者DV-4。

綜上所述，在一些方面，本發(fā)明公開了一種抗體分子(例如，一種分離抗體分子、重組抗體分子或者人源化抗體分子)，其具有一種或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或者所有)選自下述目錄1的特性：

a)以高親和力與EDIII(例如，獲自任意登革病毒血清型的一種或多種EDIII，例如獲自DV-1、DV-1、DV-3或DV-4，例如，獲自DV-1、DV-1、DV-3或DV-4的所有四種EDIII)連接，例如，具有少于大約100nM的解離常數(shù)(KD)，典型地約為10nM，并且更為典型地，大約10-0.01nM，大約5-0.01nM，大約3-0.05nM，大約1-0.1nM，或者更強，例如少于大約80、70、60、50、40、30、20、10、8、6、4、3、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05或者0.01nM，

b)以高親和力與DV-4EDIII連接，例如，具有少于大約100nM的解離常數(shù)(KD)，例如，大約10nM，例如大約10-1nM或更強，例如，小于大約10、8、6、5、4或者3nM，

c)以比抗體A11(在這里也被稱為4E5A)和/或抗體4E11更高的親和力與DV-4和/或DV-3EDIII區(qū)域結(jié)合，例如，至少2、3、4、5、6、8、10、12、15、100、1,000、5，000、或者10，000倍更、高的親和力，

d)登革病毒(例如，DV-1、DV-2、DV-3和DV-4的一種或多種，例如，全部DV-1、DV-2、DV-1、DV-3和DV-4)，例如，在一種聚焦還原中和試驗或者一種用于評估病毒活性的中和作用的相關(guān)試驗中，

e)與抗體A11和/或抗體4E11相比中和具有增加的IC50的DV-4，例如，至少2、3、4、5、6、8、10、12、25、50、75、100或者1，000倍增加的IC50，例如，在一種聚焦還原中和試驗或者一種用于評估病毒活性的中和作用的相關(guān)試驗中，

f)在相對于A11的一個或多個位點上具有一種突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代，例如，一種保守取代)，例如，在VH和/或VL中，例如，在一個或多個CDR或者框架區(qū)域內(nèi)，

g)相對于A11在重鏈CDR1區(qū)域中具有一種突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代，比方說保守取代)，例如，一種取代比方說T33V取代，

h)相對于A11在重鏈FW1中的位點26上，具有一種突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代，比方說保守取代)，例如一種缺失，

i)相對于A11在重鏈CDR1區(qū)域中具有一種突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代，比方說保守取代)例如一種取代比方說T33V突變，同時相對于A11在重鏈FW1中的位點26上具有一種突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代，比方說保守取代)，例如一種缺失，

j)相對于A11在重鏈CDR1區(qū)域中具有一種突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代，比方說保守取代)，例如一種取代比方說T33V突變，并且具有改善的(例如相對于A11)于至登革病毒連接和/或改善的登革病毒中和性，例如針對一種或多種(例如所有血清型)DV-1、DV-2、DV-3和DV-4，

k)相對于A11在重鏈FW1中的位點26上具有一種突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代，比方說保守取代)，例如一種缺失，并且具有例如相對于A11)與登革病毒改善的連接和/或登革病毒改善的中和性，例如針對一種或多種(例如所有血清型)DV-1、DV-2、DV-3和DV-4，比方說針對DV-4，

l)同時相對于A11在重鏈CDR1區(qū)域中具有一種突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代，比方說保守取代)，例如一種取代比方說T33V取代，以及相對于A11在重鏈FW1中的位點26上有一種突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代，比方說保守取代)，例如一種缺失，并且具有例如相對于A11)與登革病毒改善的連接和/或登革病毒改善的中和性，例如針對一種或多種(例如所有血清型)DV-1、DV-2、DV-3和DV-4，比方說針對DV-4，

m)針對在附圖10A-10B、11和19-21中所列的一種或多種(例如所有的)登革病毒菌株的EDIII顯示出改善的結(jié)合性，例如一種或多種DV-2菌株、一種或多種DV-3菌株、一種或多種DV-4菌株，例如DENV-4BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4NewCal09、DENV-4Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3Nic10、DENV-3H87、DENV-2Peru95、DENV-2Sing08、DENV-2NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2New Guinea/1944(NGC)、DENV-3Philippines/1956(H87)、DENV-4Mexico/1997(BC287/97)、以及DENV-4H241中的一種或多種，例如，具有至少2、3、4、5、6、8、10、12、25、50、75、100或者1,000倍高的親和力，

n)破壞在病毒體表面上的E蛋白的天然結(jié)構(gòu)，例如其會引起病毒的失活，

o)特異性結(jié)合至EDIII上的表位，例如與通過A11或者B11單克隆抗體識別的表位相同或者相似的表位，

p)顯示出與表1中的抗體(例如，D88、A48、F38、F108或者C88)相同或者相似的結(jié)合親和力或者特異性，或者它們二者，

q)顯示出與表1中所描述的抗體分子(例如，一種重鏈可變區(qū)域以及輕鏈可變區(qū)域)相同或者相似的結(jié)合親和力或者特異性，或者它們二者，例如，D88、A48、F38、F108或者C88，

r)顯示出與包括表2中所示氨基酸序列的抗體分子(例如，一種重鏈可變區(qū)域以及輕鏈可變區(qū)域)相同或者相似的結(jié)合親和力或者特異性，或者它們二者，

s)抑制(例如完全抑制)第二抗體分子與EDIII的結(jié)合，其中所述第二抗體分子指的是在這里所描述的一種抗體分子，例如一種從表1中選擇的抗體分子，比方說D88、A48、F38、F108或者C88，

t)用第二抗體分子將相同或者重疊的表位結(jié)合至EDIII，其中所述第二抗體分子指的是在這里所描述的一種抗體分子，例如一種從表1中選擇的抗體分子，比方說D88、A48、F38、F108或者C88，

u)用一種第二抗體分子競爭結(jié)合并且結(jié)合相同表位至EDIII，其中所述第二抗體分子指的是在本發(fā)明中所描述的一種抗體分子，例如一種從表1中選擇的抗體分子，比方說D88、A48、F38、F108或者C88，

v)具備本發(fā)明所描述的抗體分子的一種或多種生物學(xué)特性，例如，選自表1的抗體分子，比方說D88、A48、F38、F108或者C88，

w)具有本發(fā)明所描述的抗體分子的一種或多種藥代動力學(xué)特性，例如，選自表1的抗體分子，比方說D88、A48、F38、F108或者C88，或者

x)抑制登革病毒的一種或多種活性，例如中和所述病毒(舉例來說，在一種聚焦還原中和試驗或者一種用于評估病毒活性的中和作用的相關(guān)試驗中進(jìn)行測量)。

在一些實施方案中，所述抗體分子具有一種突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代比如保守取代)，例如相對于A11在重鏈CDR1區(qū)域洪的T33V突變，其與上述目錄1的一種或多種功能特性結(jié)合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種、十三種、十四種、十五種、十六種或者全部特性)。在一些實施方案中，所述抗體分子同時具有相對于A11在重鏈CDR1區(qū)域中的突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代比方說保守取代)比方說T33V突變，以及相對于A11在重鏈FW1中位點26上的突變(例如，一種或多種缺失、插入、取代比方說保守取代)比方說缺失，其與上述目錄1的一種或多種功能特性結(jié)合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種、十三種、十四種、十五種、十六種或者全部特性)。

在一些實施方案中，所述抗體分子具有相對于A11在重鏈CDR1區(qū)域中的T33V突變，其與上述目錄1的一種或多種功能特性結(jié)合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種、十三種、十四種、十五種、十六種或者全部特性)。在某些實施方案中，所述抗體分子相對于A11在重鏈FW1中位點26上具有一種缺失，其與上述目錄1的一種或多種功能特性結(jié)合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種、十三種、十四種、十五種、十六種或者全部特性)。在一些實施方案中，所述抗體分子同時具有相對于A11在重鏈CDR1區(qū)域中的T33V突變以及相對于A11在重鏈FW1中的位點26上的缺失，其與上述目錄1中的一種或多種功能特性結(jié)合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種、十三種、十四種、十五種、十六種或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗體分子同時具有一種在相對于A11的重鏈CDR1區(qū)域中的T33V突變以及一種相對于A11在重鏈FW1中的位點26上的缺失，其與上述目錄1中的一種或多種功能特性結(jié)合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種、十三種、十四種、十五種、十六種或者全部特性)。舉例來說，所述抗體分子以高親和性結(jié)合EDIII(例如是DV-1、DV-2、DV-3、或者DV-4的)，具有小于大約100nM的解離常數(shù)(KD)，代表性地大約10nM，并且更為代表性地，大約10-0.01nM、大約5-0.01nM、大約3-0.05nM、或者大約1-0.1nM或更高，例如小于大約80、70、60、50、40、30、20、10、8、6、4、3、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05或者0.01nM。作為進(jìn)一步的實例，所述抗體分子可以高親和性結(jié)合DV-4EDIII，例如具有小于大約100nM的解離常數(shù)，例如大約10nM，例如大約10-1nM或更高，例如小于大約10、8、6、5、4或3nM。此外，所述抗體分子可以與抗體A11和/或抗體4E11相比增加的IC50來中和DV-4，例如，以至少2、3、4、5、6、8、10、12、100、1，000倍增加的IC50，例如在一種聚焦還原中和試驗或者一種用于評估病毒活性的中和作用的相關(guān)試驗中。

在某些實施方案中，親和性是通過競爭ELISA或者SPR進(jìn)行測量。在一些實施方案中，親和性是通過BIAc或者e、ELISA或者流式細(xì)胞計數(shù)的一種或多種進(jìn)行測量。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子是一種人源化抗體分子，并且具有上述目錄1中的一種或多種特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在一些實施方案中，所述抗體分子以高親和性與EDIII結(jié)合，例如，具有比鼠科的抗-登革抗體分子(例如，4E11、A11或B11)的KD低至少大約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者90％的KD。

在一些實施方案中，所述抗體分子的表達(dá)水平比鼠科的抗體分子(例如在本發(fā)明中所描述的鼠科的抗-登革抗體分子)的表達(dá)水平高，例如高至少大約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10倍。在一些實施方案中，所述抗體分子在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，例如人或嚙齒動物細(xì)胞。

在一些實施方案中，所述抗體分子使一種或多種登革病毒活性降低，所述登革病毒活性具有的IC50(在50％抑制時的濃度)低于鼠科的抗-登革抗體分子(例如在本發(fā)明中所描述的鼠科的抗-登革抗體分子)的IC50。在一些實施方案中，所述登革病毒活性被中和，例如，在Tharakaramana等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2013Apr 23；110(17):E1555-64.doi:10.1073/pnas.1303645110.Epub 2013Apr 8中所述的聚焦還原中和試驗中，其已通過引證的方式全部并入本發(fā)明作為參考，包括所有補充材料。其它能夠被用于評估病毒活性的中和作用的相關(guān)試驗包括，例如，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)為基礎(chǔ)的微量中和(MN)測定(例如在V或者ndam等人，Am J Trop Med Hyg 2002；66:208-212中所描述的)以及熒光抗體細(xì)胞分選為基礎(chǔ)的DC-SIGN表達(dá)樹突細(xì)胞(DC)測定(例如，在Martin等人，J Virol Methods 2006；134:74-85中所描述的)。

在某些實施方案中，所述抗體分子使登革病毒的傳播(例如，降低了宿主(例如人類)和蚊蟲之間的傳播)降低，例如降低如通過本發(fā)明所描述的蚊蟲模型測量的至少大約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者90％。

在另一些實施方案中，所述抗體分子具有提升的降低登革病毒傳播的能力(例如，具有降低宿主(例如人類)和蚊蟲之間登革病毒傳播的改善的能力)，例如比蚊蟲抗-登革抗體分子(比方說在本發(fā)明中所描述的蚊蟲抗-登革抗體分子，例如4E11、A11或者B11)高至少大約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10倍，例如，根據(jù)通過本發(fā)明所描述的蚊蟲模型進(jìn)行測量。

在另一些實施方案中，所述抗體分子使蚊蟲病毒載量(例如，蚊蟲攜帶的病毒數(shù)量、和/或傳染性)降低，例如降低如通過本發(fā)明所描述的蚊蟲模型測量的至少大約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者90％。

在一些實施方案中，所述抗體分子具有增加的穩(wěn)定性，例如比蚊蟲抗-登革抗體分子(例如在本發(fā)明中所描述的蚊蟲抗-登革抗體分子，例如4E11、A11或者B11)在體外或體內(nèi)更為穩(wěn)定至少大約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10倍。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少一種抗原結(jié)合區(qū)，例如一種可變區(qū)域或其抗原結(jié)合片段，其來自本發(fā)明所描述的抗體，例如選自表1的抗體，例如D88、A48、F38、F108或C88，或者一種與任意前述序列基本上相同的序列(例如，一種與其至少大約85％、90％、95％、99％或更為相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或更多的取代、插入或者缺失，比方說保守取代)。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括來自本發(fā)明所描述的抗體(例如一種表1的抗體，例如D88、A48、F38、F108或C88)的至少一種、兩種、三種、或者四種可變區(qū)域，或者一種與任意前述序列基本上相同的序列(例如，一種與其至少大約85％、90％、95％、99％或更為相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或更多的取代、插入或者缺失，比方說保守取代)。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括來自本發(fā)明所描述的抗體(例如一種表1的抗體，例如D88、A48、F38、F108或C88)的至少一種或者兩種重鏈可變區(qū)，或者一種與任意前述序列基本上相同的序列(例如，一種與其至少大約85％、90％、95％、99％或更為相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或更多的取代、插入或者缺失，比方說保守取代)。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括來自本發(fā)明所描述的抗體(例如一種表1的抗體，例如D88、A48、F38、F108或C88)的至少一種或者兩種輕鏈可變區(qū)，或者一種與任意前述序列基本上相同的序列(例如，一種與其至少大約85％、90％、95％、99％或更加相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或更多的取代、插入或者缺失，比方說保守取代)。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括一種在VH區(qū)域中的位點33(例如，一種T33V突變)上的纈氨酸，例如相對于4E5A和/或4E11，或者表1中的抗體。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體包括在VH區(qū)域中的del26(在位點26上的缺失)，例如相對于4E5A或者表1中的抗體。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子同時包括在位點33上的纈氨酸(例如一種T33V突變)以及在VH區(qū)域的del26突變，例如相對于4E5A或者表一中的抗體。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少一種、兩種或者三種互補決定區(qū)(CDRs)，來自本發(fā)明所描述的抗體(例如一種表1的抗體，例如D88、A48、F38、F108或C88)的重鏈可變區(qū)，或者一種與任意前述序列基本上相同的序列(例如，一種與其至少大約85％、90％、95％、99％或更為相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或更多的取代、插入或者缺失，比方說保守取代)。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少一種、兩種或者三種CDRs(或者集體所有的CDRs)，其來自包含表3中所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，一種或者多種的CDRs(或者集體所有的CDRs)具有一種、兩種、三種、四種、五種、六種或者更多變化，例如，氨基酸取代、插入或者缺失，相對于在表3中所示的CDRs。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少一種、兩種或者三種CDRs(或者集體所有的CDRs)，其來自包含表3中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，一種或者多種的CDRs(或者集體所有的CDRs)具有一種、兩種、三種、四種、五種、六種或者更多變化，例如，氨基酸取代、插入或者缺失，相對于在表3中所示的CDRs。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種CDRs(或者集體所有的CDRs)，其來自包含表3中所示的氨基酸序列的重鏈和輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，一種或者多種的CDRs(或者集體所有的CDRs)具有一種、兩種、三種、四種、五種、六種或者更多變化，例如，氨基酸取代、插入或者缺失，相對于在表3中所示的CDRs。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括來自本發(fā)明所描述抗體的所有六種CDRs，例如，表1中所述的抗體，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者與之相似的CDRs，例如，所述CDR是相同的或者其具有至少一種氨基酸改變，但是不超過兩種、三種或者四種改變(例如，取代比如保守取代、缺失或者插入)。在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子可包括在本發(fā)明中所述的任意的CDR。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括來自本發(fā)明所描述抗體的重鏈可變區(qū)的至少一種、兩種或者三種Chothia高度可變環(huán)，所述抗體例如表1中所述的抗體，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少來自與EDIII接觸的那些高度可變環(huán)的氨基酸。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明提供的抗體分子具有SEQ ID NO:9的HCDR1、SEQ ID NO:10的VHCDR2以及SEQ ID NO:5的VHCDR3。本發(fā)明提供的抗體分子還可能具有SEQ ID NO:22，24，26，28或30的VHCDR1；SEQ ID NO:10的VHCDR2；以及SEQ ID NO:5的VHCDR3。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在一些實施方案中，并且任選地與本發(fā)明所描述的重鏈CDR結(jié)合，所述抗-登革抗體分子包括來自本發(fā)明所描述抗體的輕鏈可變區(qū)的至少一種、兩種或者三種Chothia高度可變環(huán)，所述抗體例如表1中所述的抗體，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少來自接觸EDIII的這些高度可變環(huán)的氨基酸。例如，在某些實施方案中，在這里所給出的抗體分子具有SEQ ID NO:6的VHCDR1、SEQ ID NO:7的VHCDR2、以及SEQ ID NO:8的VHCDR3。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括來自本發(fā)明所描述抗體的重鏈可變區(qū)的至少一種、兩種或者三種Kabat高度可變環(huán)，所述抗體例如表1中所述的抗體，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少來自接觸EDIII的這些高度可變環(huán)的氨基酸。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括來自本發(fā)明所描述抗體的輕鏈可變區(qū)的至少一種、兩種或者三種Kabat高度可變環(huán)，所述抗體例如表1中所述的抗體，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少來自接觸EDIII的這些高度可變環(huán)的氨基酸。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括來自本發(fā)明所描述抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的至少一種、兩種、三種、四種、五種或者六種高度可變環(huán)，所述抗體例如表1中所述的抗體，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少來自接觸EDIII的這些高度可變環(huán)的氨基酸。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括來自本發(fā)明所描述抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的全部六種高度可變環(huán)，所述抗體例如表1中所述的抗體，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少來自接觸EDIII的這些高度可變環(huán)的氨基酸，或者密切相關(guān)的高度可變環(huán)，例如所述高度可變環(huán)是相同的或者其具有至少一種氨基酸改變，但是不超過兩種、三種或者四種改變(例如，取代比如保守取代、缺失或者插入)。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少一種、兩種或者三種高度可變環(huán)，其具有與本發(fā)明所述抗體的相應(yīng)的高度可變環(huán)相同的規(guī)范結(jié)構(gòu)，所述抗體例如是表1中所列的抗體，例如，D88、A48、F38、F108或C88，例如，與本發(fā)明所述抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的至少環(huán)1和/或環(huán)2相同的規(guī)范結(jié)構(gòu)。例如，參見Chothia et al.，(1992)J.Mol.Biol.227:799-817；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227:776-798中對于高度可變環(huán)規(guī)范結(jié)構(gòu)的描述。這些結(jié)構(gòu)可通過在上述文獻(xiàn)中所述的表中分析進(jìn)行確定。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少一種、兩種、或者三種(例如全部)CDR，其來自具有如前述表3中所列的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，或者與其基本相同的序列(例如，與其至少大約85％、90％、95％、99％或更加相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或者多種取代、插入或缺失，比方說保守取代)。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少一種、兩種、或者三種(例如全部)CDR，其來自具有如前表3中所列的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，或者與其基本相同的序列(例如，與其至少大約85％、90％、95％、99％或更為相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或者多種取代、插入或缺失，比方說保守取代)。在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少一種、兩種、三種、四種、五種或者六種(例如全部)CDR，其來自具有如前表3中所列的氨基酸序列的重鏈和輕鏈可變區(qū)，或者與其基本相同的序列(例如，與其至少大約85％、90％、95％、99％或更為相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或者多種取代、插入或缺失，比方說保守取代)。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少一種、兩種、或者三種(例如全部)CDR，其來自具有本發(fā)明所述抗體的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，例如表1中所述的抗體，比方說D88、A48、F38、F108或C88，或者與其基本相同的序列(例如，與其至少大約85％、90％、95％、99％或更為相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或者多種取代、插入或缺失，比方說保守取代)。在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少噢一種、兩種或者三種(例如全部)CDR，其來自具有這里所描述的抗體的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，例如表1中所述的抗體，比方說D88、A48、F38、F108或C88，或者與其基本相同的序列(例如，與其至少大約85％、90％、95％、99％或更為相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或者多種取代、插入或缺失，比方說保守取代)。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少這里所描述的6種CDR，例如在表2的VL和VH序列中。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在實施方案方面，所述抗體分子具有選自表3的VHCDR1，VHCDR2，VHCDR3，VLCDR1，VLCDR2和VLCDR3。所述六種CDR可以全部是Kabat-定義、全部是Chothia-定義、或者一些是Kabat-定義且另一些是Chothia-定義。舉例來說，VHCDR1可以選自SEQ ID NO:3，9，14，15，22，24，26，28或30；VHCDR2可以選自SEQ ID NO:4，10或35；VHCDR3可以是SEQ ID NO:5；VLCDR1可以是SEQ ID NO:6；VLCDR2可以是SEQ ID NO:7；并且VLCDR3可以是SEQ ID NO:8。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體的輕鏈或者重鏈可變框架可以選自：(a)一種包括來自人輕鏈或者重鏈可變框架的至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或者優(yōu)選100％的氨基酸殘基的輕鏈或者重鏈可變框架，例如來自人成熟的抗體、人種系序列或者人共有序列的一種輕鏈或者重鏈可變框架；(b)一種包括來自人輕鏈或者重鏈可變框架的20％到80％、40％到60％、60％到90％、或者70％到95％的氨基酸殘基的輕鏈或者重鏈可變框架，例如來自人成熟的抗體、人種系序列或者人共有序列的一種輕鏈或者重鏈可變框架；(c)一種非人框架(例如，一種嚙齒類動物框架)；或者(d)一種非人框架，其被修飾例如從而去除了抗原或細(xì)胞毒素的決定因素，例如，免疫的、或者部分人源化的。在一些實施方案中，所述輕鏈或者重鏈可變框架區(qū)域包括一種輕鏈或者重鏈可變框架序列，其至少70，75，80，85，87，88，90，92，94，95，96，97，98，99％相同或者與人種系基因的VH或VL部分的框架相同。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體的VH區(qū)域(例如其中框架區(qū)域)包括來自人VH區(qū)域的一種或多種位點，例如，人重鏈種系-編碼的氨基酸序列，例如在一種或多種(例如全部)的FW1、FW2、FW3、和FW4中發(fā)現(xiàn)的位點。在某些實施方案中，優(yōu)選與在之前段落中討論的VH殘基結(jié)合，所述抗-登革抗體的VL區(qū)域(例如，其中框架區(qū)域)包括來自人VL區(qū)域的一種或多種位點，例如，人重鏈種系-編碼的氨基酸序列，例如在一種或多種(例如兩種、三種、四種、五種或者全部)的FW1、FW2、FW3和FW4中發(fā)現(xiàn)的位點。

例如，在一些實施方案中，所述抗體分子包括一種或多種(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或者全部)殘基，依據(jù)來自表5的人種系序列的重鏈或者輕鏈FW1、FW2、FW3或FW4殘基。更為具體的，在一些實施方案中，所述抗體分子具有表6的VH種系序列的一種或多種(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VH FW1殘基；所述抗體分子具有表6的VH種系序列的一種或多種(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VH FW2殘基；在一些實施方案中，所述抗體分子具有表6的VH種系序列的一種或多種(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VH FW3殘基；并且，在一些實施方案中，所述抗體分子具有表6的VH種系序列的一種或多種(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VH FW4殘基。此外，并且任選與在前文段落中討論的重鏈殘基結(jié)合，在一些實施方案中，所述抗體分子具有表6的VL種系序列的一種或多種(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VL FW1殘基；在一些實施方案中，所述抗體分子具有表6的VL種系序列的一種或多種(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VL FW2殘基；在一些實施方案中，所述抗體分子具有表6的VL種系序列的一種或多種(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VL FW3殘基；并且，在一些實施方案中，所述抗體分子具有表6的VL種系序列的一種或多種(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VL FW4殘基。在某些實施方案中，所述抗體分子具有一種重鏈框架VH1-18*01、JH4*01和/或輕鏈框架Vk4-1*01、Jk2*02。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括一種重鏈可變區(qū)域，其具有至少一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、十種、十五種、二十種或者更多改變，例如氨基酸取代、插入或者缺失，來自表1的氨基酸序列，例如B11，D88，A48，F(xiàn)38，F(xiàn)108或C88，如在完整可變區(qū)中的FR區(qū)域的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括一種重鏈可變區(qū)域，其具有一種或多種(例如至少5、10、15或20，或者全部)：表1中抗體(例如A11)的氨基酸序列的在位點3上的Q、在位點5上的V、在位點6上的E的缺失、在位點12上的V、在位點13上的K、在位點20上的K、在位點21上的V、在位點24上的K、在位點26上的S的缺失、在位點33上的V、在位點39上的R、在位點41上的A、在位點43上的G、在位點49上的M、在位點65上的L、在位點68上的R、在位點69上的V、在位點7上的M、在位點77上的T、在位點82上的M、在位點83上的E、在位點85上的R、在位點88上的R、在位點90上的D、在位點98上的A或V或S、以及在位點117上的S。具有一種或多種(例如全部)這些突變的抗體的例子包括A48、B48、C88、F38、F108以及D48。在一些實施方案中，所述人源化的重鏈包含一種或多種：表1中抗體(例如A11)的氨基酸序列的在位點3上的Q、在位點5上的V、在位點6上的E的缺失、在位點12上的V、在位點13上的K、在位點20上的K、在位點21上的V、在位點24上的K、在位點26上的S的缺失、在位點33上的V、在位點39上的R、在位點41上的A、在位點43上的G、在位點49上的M、在位點65上的L、在位點68上的R、在位點69上的V、在位點7上的M、在位點77上的T、在位點82上的M、在位點83上的E、在位點85上的R、在位點88上的R、在位點90上的D、在位點98上的A或V或S、以及在位點117上的S。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案(以及任選與本發(fā)明所述的重鏈取代基結(jié)合，例如在前段落中所述)中，所述抗-登革抗體分子包括一種輕鏈可變區(qū)域，其具有至少一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、十種、十五種、二十種或者多種氨基酸改變，例如氨基酸取代、插入、或者缺失，來自表1中的氨基酸序列，例如B11、D88、A48、F38、F108或C88，例如，在完整可變區(qū)中的FR區(qū)域的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述抗-登革抗體包括一種輕鏈可變區(qū)域，其具有一種或多種(例如，至少5、10、15、或者全部)：表1中一種抗體(例如B11、D88、A48、F38、F108或C88)的氨基酸序列的位點1上的D、位點2上的I、位點7上的S、位點17上的E、位點44上的P、位點62上的V、位點64上的D、位點72上的G、位點80上的S、位點81上的S、位點82上的L、位點83上的Q、位點85上的E、位點89上的V、位點91上的Y、位點104上的Q。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子的重鏈或者輕鏈可變區(qū)域或它們二者包括一種氨基酸序列，其余本發(fā)明所公開的氨基酸基本上相同，例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或者更加的與本發(fā)明所述的抗體的可變區(qū)域相同，所述抗體例如是表1中的抗體，比方說D88、A48、F38、F108或C88，或者相差只殺1、2、3、4、或5個殘基，但不超過40、30、20或10個殘基，其來自本發(fā)明所述抗體的可變區(qū)域。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子的重鏈或者輕鏈可變區(qū)域或它們二者包括一種氨基酸序列，其通過本發(fā)明所述的核苷酸編碼，或者一種編碼表1中的抗體的核苷酸序列雜交的核苷酸，所述抗體例如D88、A48、F38、F108或C88，或其互補序列，例如在低嚴(yán)謹(jǐn)、中嚴(yán)謹(jǐn)、或者高嚴(yán)謹(jǐn)、或其它在本發(fā)明描述的雜交條件下進(jìn)行。本發(fā)明還公開了所述抗-登革抗體分子的重鏈或者輕鏈可變區(qū)域或者它們二者包括一種通過表4的核苷酸序列編碼的氨基酸、或其互補序列，例如，在低嚴(yán)謹(jǐn)、中嚴(yán)謹(jǐn)、或者高嚴(yán)謹(jǐn)、或其它在本發(fā)明描述的雜交條件下進(jìn)行。在一些實施方案中，所述核苷酸的至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多與表4中的序列或其部分相同。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括至少一種、兩種、三種、或者四種抗原結(jié)合區(qū)，例如可變區(qū)域，具有在表2中所述的氨基酸序列，或者一種預(yù)期基本相同的序列(例如，一種至少大約85％、90％、95％、99％或更高與其相同的序列，或者與表2中所示的序列相差不超過1、2、5、10或15個氨基酸殘基)。在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括一種核苷酸編碼的VH和/或VL區(qū)域，其中所述核苷酸具有一種編碼表1中抗體的核苷酸序列，所述抗體例如是D88，A48、F38、F108或者C88，或者一種與任意一種所述核苷酸序列基本上相同的序列(例如，一種至少大約85％、90％、95％、99％或更高與其相同的序列，或者與表2中所示的序列相差不超過1、2、5、10或15個氨基酸殘基)。在一些實施方案中，抗體分子具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征，以及一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些方面，本發(fā)明提供了一種抗體分子，任選地具有結(jié)合登革病毒的能力，包括：

(a)一種重鏈免疫球蛋白可變區(qū)域片段，包括：

CDR1，包括序列DVYMS(SEQ ID NO:3)(或者一種與其相差不超過1、2或3個氨基酸的序列，任選地條件是V是不可變的)，

CDR2，包括序列RIDPENGDTKYDPKLQG(SEQ ID NO:4)(或者一種與其相差不超過1、2、3、4或5個氨基酸的序列，任選地條件是L是不可變的)，以及

CDR3，包括序列GWEGFAY(SEQ ID NO:5)(或者一種與其相差不超過1、2或3個氨基酸的序列)；

(b)一種輕鏈可變區(qū)域片段，包括：

CDR1，包括序列RASENVDKYGNSFMH(SEQ ID NO:6)(或者一種與其相差不超過1、2、3、4或5個氨基酸的序列)，

CDR2，包括序列RASELQW(SEQ ID NO:7)(或者一種與其相差不超過1、2或3個氨基酸的序列)，以及

CDR3，包括序列QRSNEVPWT(SEQ ID NO:8)(或者一種與其相差不超過1、2或3個氨基酸的序列)。

在一些實施方案中，HCDR1的V是不可變的；在一些實施方案中，HCDR2的L是不可變的；并且，在一些實施方案中，HCDR1的V和HCDR2的L都是不可變的。

在某些實施方案中，所述抗體分子包括VH FW1，其具有序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIK(SEQ ID NO:11)，或者具有相對于SEQ ID NO:11不超過1、2、3、4、或5個突變的氨基酸的序列。

在某些實施方案中，所述抗體分子包括具有序列WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO:84)的VH FW2，或者一種相對于SEQ ID NO:84具有不超過1、2、3、4、或5個突變的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述抗體分子包括具有序列WVRQAPEQGLEWMG(SEQ ID NO:85)的VH FW2，或者一種相對于SEQ ID NO:85具有不超過1、2、3、4或5個突變的氨基酸序列。

在某些方面，本發(fā)明提供了一種抗體分子，其具備結(jié)合登革病毒的能力，包括：

(a)一種重鏈免疫球蛋白可變區(qū)域片段，包括：

FW1，包括相對于SEQ ID NO:33的位點26的缺失；

CDR1，包括序列DTYMS(SEQ ID NO:14)(或者一種與其相差不超過1、2、或3個氨基酸的序列，任選地條件是T是不可變的)，或者CDR1，包括序列DVYMS(SEQ ID NO:3)(或者一種與其相差不超過1、2、或3個氨基酸的序列，任選地條件是V是不可變的)；

CDR2，包括序列RIDPENGDTKYDPKLQG(SEQ ID NO:4)(或者一種與其相差不超過1、2、3、4或5個氨基酸的序列，任選地條件是L是不可變的)，以及

CDR3，包括序列GWEGFAY(SEQ ID NO:5)(或者一種與其相差不超過1、2、或3個氨基酸的序列)；以及

(b)一種輕鏈可變區(qū)域片段，包括：

CDR1，包括序列RASENVDKYGNSFMH(SEQ ID NO:6)(或者一種與其相差不超過1、2、3、4或5個氨基酸的序列)，

CDR2，包括序列RASELQW(SEQ ID NO:7)(或者一種與其相差不超過1、2、或3個氨基酸的序列)，以及

CDR3，包括序列QRSNEVPWT(SEQ ID NO:8)(或者一種與其相差不超過1、2、或3個氨基酸的序列)。

在某些實施方案中，所述抗體分子包括具有序列WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO:84)的VH FW2，或者一種相對于SEQ ID NO:84具有不超過1、2、3、4、或5個突變的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述抗體分子包括具有序列WVRQAPEQGLEWMG(SEQ ID NO:85)的VH FW2，或者一種相對于SEQ ID NO:85具有不超過1、2、3、4、或5個突變的氨基酸序列。

在某些方面，本發(fā)明提供了一種抗體分子，其任選具有結(jié)合登革病毒的能力，包括：

(a)一種重鏈免疫球蛋白可變區(qū)域片段，包括：

CDR1，包括序列DVYMS(SEQ ID NO:3)(或者一種與其相差不超過1、2或3個氨基酸的序列，任選地條件是V是不可變的)，

CDR2，包括序列RIDPENGDTKYDPKLQG(SEQ ID NO:4)(或者一種與其相差不超過1、2、3、4或5個氨基酸的序列，任選地條件是L是不可變的)，以及

CDR3，包括序列GWEGFAY(SEQ ID NO:5)或者一種與其相差不超過1、2或3個氨基酸的序列)，任選地條件是A可用I、K、D或E替換；

(b)一種輕鏈可變區(qū)片段，包括：

CDR1，包括序列RASENVDKYGNSFMH(SEQ ID NO:6)(或者一種與其相差不超過1、2、3、4或5個氨基酸的序列)，任選地條件是Y可用F替換；

CDR2，包括序列RASELQW(SEQ ID NO:7)(或者一種與其相差不超過1、2或3個氨基酸的序列)，以及

CDR3，包括序列QRSNEVPWT(SEQ ID NO:8)(或者一種與其相差不超過1、2或3個氨基酸的序列)。

綜上所述，在一些實施方案中，重鏈CDR3為GWEGFIY(SEQ ID NO:90)、GWEGFKY(SEQ ID NO:91)、GWEGFDY(SEQ ID NO:92)或者GWEGFEY(SEQ ID NO:93)。在一些實施方案中，輕鏈CDR1為RASENVDKFGNSFMH(SEQ ID NO:94)。換言之，在一些實施方案中，重鏈的位點105，其為抗體A11中的丙氨酸，可被改變?yōu)槠渌臍埢?，例如，I、K、D或E。在某些實施方案中，輕鏈的位點32，其為抗體A11中的酪氨酸，被改變?yōu)槠渌鼩埢?，例如F。在一些實施方案中，在這一段落中所描述的突變提高了抗體分子低于EDIII的親和性和/或其針對一種或多種(或者全部)登革病毒菌株或血清型的中和活性。

在某些實施方案中，所述抗體分子包括具有序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIK(SEQ ID NO:11)的VH FW1，或者一種具有相對于SEQ ID NO:11不超過1、2、3、4、或5個突變的氨基酸序列。

在某些實施方案中，所述抗體分子包括具有序列WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO:84)的VH FW2，或者一種具有相對于SEQ ID NO:84不超過1、2、3、4、或5個突變的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述抗體分子包括具有序列WVRQAPEQGLEWMG(SEQ ID NO:85)的VH FW2，或者一種具有相對于SEQ ID NO:85不超過1、2、3、4、或5個突變的氨基酸序列。

在這些方面的一些實施方案中，所述抗體分子具有結(jié)合登革病毒EDIII(E蛋白結(jié)構(gòu)域III)的能力。在某些實施方案中，所述抗體分子包括一種或多種CDR，其中所述CDR具有任意的SEQ ID NOS:3-8，14和35的序列(或者一種與其相差不超過1、2或3個氨基酸的序列)。舉例來說，所述抗體分子可包括至少兩種、三種、四種、五種或六種CDR，其具備任意的SEQ ID NOS:3-8，14和35序列。

在一些實施方案中，所述抗體分子包括SEQ ID NO:3或14的VH CDR1、SEQ ID NO:4或35的VH CDR2、SEQ ID NO:5的VH CDR3、SEQ ID NO:6的VL CDR1、SEQ ID NO:7的VL CDR2、以及SEQ ID NO:8的VL CDR3。例如，所述抗體分子可包括SEQ ID NO:3的VH CDR1、SEQ ID NO:4的VH CDR2、SEQ ID NO:5的VH CDR3、SEQ ID NO:6的VL CDR1、SEQ ID NO:7的VL CDR2、以及SEQ ID NO:8的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體分子包括一種VH氨基酸序列，其至少70％、80％、85％、90％、95％、99％或者100％與SEQ ID NO:1相同。

在一些實施方案中，所述抗體分子包括一種VH氨基酸序列，其至少70％、80％、85％、90％、95％、99％或者100％與SEQ ID NO:80相同。

在一些實施方案中，所述抗體分子包括一種VH氨基酸序列，其至少70％、80％、85％、90％、95％、99％或者100％與SEQ ID NO:16-21，24，25，27，29，31，32，33，36，80或81任意其中之一相同。在一些實施方案中，所述抗體分子包括一種VL氨基酸序列，其至少70％、80％、85％、90％、95％、99％或者100％與SEQ ID NO:2或34相同。

在某些實施方案中，所述抗體分子指的是Fab、F(ab')2、Fv、或者一種單鏈Fv片段(scFv)。在一些實施方案中，所述抗體分子包括一種重鏈恒定區(qū)，其選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些實施方案中，所述抗體分子包括一種輕鏈恒定區(qū)，其選自kappa或者lambda的輕鏈恒定區(qū)。

所述抗體分子可以是一種分離的抗體分子和/或一種人源化的抗體分子。在一些實施方案中，所述抗體分子包含一種或多種來源于人框架種系序列的框架區(qū)域。

在一些實施方案中，所述抗體分子具有結(jié)合登革病毒EDIII的能力，以小于大約80、70、60、50、40、30、20、10、8、6、4、3、2、1、0.5、0.2、或0.1nM的解離常數(shù)(KD)。所述抗體分子可具備結(jié)合登革病毒血清型DV-4EDIII的能力，以小于大約10、8、6、5、4或3nM的解離常數(shù)(KD)。所述抗體分子可具備與DV-3或DV-4EDIII區(qū)域結(jié)合的能力，其中以比抗體A11或抗體4E11高至少2、3、4、5、6、8、10、12、100、1000倍的親和力。所述抗體分子可具備與登革病毒菌株結(jié)合的能力，其中所述登革病毒菌株選自DENV-4BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4NewCal09、DENV-4Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3Nic10、DENV-3H87、DENV-2Peru95、DENV-2Sing08、DENV-2NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2New Guinea/1944(NGC)、DENV-3Philippines/1956(H87)、DENV-4Mexico/1997(BC287/97)和DENV-4H241的一種或多種，其中以比抗體A11或抗體4E11高至少2、3、4、5、6、8、10、12、125、50、75、100、1000倍的親和力。所述抗體分子可具備中和登革病毒的能力，其中在聚焦還原中和試驗或者一種用于評估病毒活性中和作用的相關(guān)試驗中。所述抗體分子可具備中和登革病毒的能力，其具備與抗體A11或抗體4E11相比低至少2、3、4、5、6、8、10、12、50、75或者100倍的IC50，其是在聚焦還原中和試驗或者一種用于評估病毒活性中和作用的相關(guān)試驗中。

在一些方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包括上述要求中任一項的抗體分子以及一種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或者穩(wěn)定劑。

本發(fā)明還提供了，例如，一種編碼這里所述的抗體分子的抗體重鏈或者輕鏈可變區(qū)域的核苷酸。本發(fā)明還提供了，例如，包括上述核苷酸的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了，例如，包含上述核苷酸的宿主細(xì)胞。此外本發(fā)明提供了，例如，一種制備如這里所述的的抗體分子或其片段的方法，包括在適用于基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。

在一些方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包括一種這里所述的抗體分子。所述試劑盒包括一種容器，并且所述容器可具有放置于其中的抗體分子。所述試劑盒還可包含一種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或者穩(wěn)定劑，任選地與所述抗體分子混合。所述試劑盒還可包括一種遞送裝置，例如，其包括一種注射劑或針。所述試劑盒還可包括用于使用的說明書。

在某些方面，本發(fā)明提供了一種中和登革病毒的方法，包括：使登革病毒與本發(fā)明所述的抗體分子相接觸。在一些實施方案中，所述登革病毒是血清型DV-1、DV-2、DV-3或DV-4的。

在一些方面，本發(fā)明提供了一種治療登革病毒感染的方法，包括向?qū)ζ溆行枰氖茉囌呤┯帽景l(fā)明所述的分離的抗體分子，以一種能夠有效治療所述病毒的量。所述方法可進(jìn)一步包括將一種抗-病毒試劑施用于受試者，例如選自巴洛沙星(balapiravir)、氯喹(chl或者oquine)、西戈斯韋(celgosivir)、伊維菌素(ivermectin)或者Carica folia的一種或多種的抗-病毒試劑。在某些實施方案中，所述抗病毒試劑是一種第二抗-登革抗體恩子，例如一種與第一抗-登革抗體分子不同的本發(fā)明所述的抗-登革抗體分子。在另一個實施方案中，所述抗病毒試劑選自α-葡糖苷酶I型抑制劑(例如，西戈斯韋(celgosivir))、腺苷核苷抑制劑(例如，NITD008)；RNA依賴性的RNA聚合酶(RdRp)抑制劑(例如，NITD107)、宿主嘧啶生物合成的抑制劑例如宿主二氫乳清酸脫氧酶(DHODH)(例如，NITD-982和布喹那(brequinar))、病毒NS4B蛋白的抑制劑(例如，NITD-618)以及亞氨基糖(例如，UV-4)。本發(fā)明可進(jìn)一步包括將一種疫苗施用于受試者，例如，一種登革病毒疫苗。在一些實施方案中，所述抗體分子的施用是腸胃外的或者靜脈內(nèi)的。

本發(fā)明還提供了預(yù)防方法。在一些實施方案中，一種通過將本發(fā)明所公開的抗體分子施用于此時沒有感染登革病毒的受試者來預(yù)防登革病毒感染的方法。例如，在某些方面，本發(fā)明提供了一種降低患者患染登革病毒風(fēng)險的方法，包括為有此需要的受試者施用本發(fā)明所述的分離的抗體分子，以一種有效降低患染病毒風(fēng)險的劑量。例如，患染登革病毒的風(fēng)險可被降低，例如，至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多。在一些實施方案中，所述抗體分子可被提供給沒有感染登革病毒的患者，帶來了感染出現(xiàn)的結(jié)果，所述疾病的過程有可能比沒有接受所述抗體分子的類似的患者的疾病過程更溫和。例如，所述抗體分子可降低登革熱癥發(fā)展(例如，患者更可能經(jīng)歷一種無癥狀感染)的風(fēng)險。與沒有接受抗體分子的患者相比，登革熱癥發(fā)展的風(fēng)險可被降低，例如，至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多。在一些實施方案中，與沒有接受抗體分子的患者相比，登革熱癥發(fā)展為登革出血熱癥的風(fēng)險可被降低，例如，至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多。

本發(fā)明還提供了用于降低或者預(yù)防登革病毒傳播(例如，降低或預(yù)防在受試者(例如人)和蚊蟲之間的傳輸)的方法。在某些實施方案中，所述受試者是感染了登革病毒。在另一些實施方案中，所述受試者此時并沒有感染登革病毒，但是在登革病毒感染的風(fēng)險。例如，在某些方面，本發(fā)明提供了一種降低或者預(yù)防登革病毒傳播(例如，降低或者預(yù)防登革病毒在受試者(例如人)和蚊蟲之間的傳播)的方法，包括向受試者施用本發(fā)明所述的分離的抗體分子，以一種可有效降低登革病毒傳播的劑量。例如，登革病毒的傳播，例如，與經(jīng)由沒有接受抗體分子的受試者進(jìn)行的傳播相比，從受試者傳播至蚊蟲可被降低例如至少大約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％，例如通過本發(fā)明所述的蚊蟲模型進(jìn)行測量。因此，在一些實施方案中，登革病毒從感染的蚊蟲到未感染的受試者(例如人)的傳播可以被進(jìn)一步降低例如至少大約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。

在某些方面，本發(fā)明提供了一種檢測生物樣本中登革病毒的方法，包括(i)使樣本或受試者(以及可選地，一種參考樣本或受試者)與本發(fā)明所述的抗體分子接觸，在允許產(chǎn)生抗體分子與多肽相互作用的條件下；以及(ii)檢測抗體分子和樣本或受試者(以及可選地，一種參考樣本或受試者)之間的復(fù)合體的形態(tài)。

在一些方面，本發(fā)明提供了一種抗-登革抗體分子，包括一種VH區(qū)域，其相對于抗體A11的VH具有一種位點26的缺失。例如，所要求保護(hù)的抗-登革抗體分子相對于抗體A11的VH具有大約1-30、5-30、10-30、15-30、或者20-25之間突變的VH區(qū)域。

在一些方面，本發(fā)明提供了一種具有結(jié)合登革病毒能力的抗體分子，其包括一種具有SEQ ID NO:3序列的VH CDR1，或者一種具有相對于SEQ ID NO:3不超過1、2、3、4、5、10或15個突變的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述突變指的是取代，比方說保守取代。

在某些方面，本發(fā)明提供了一種具有結(jié)合登革病毒能力的抗體分子，其包括一種具有序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIK(SEQ ID NO:11)的VH FW1，或者一種相對于SEQ ID NO:11具備不超過1、2、3、4、5、10或15個突變的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述突變各自獨立地選自缺失和取代比方說保守取代。本段中所述的抗體分子也可以具備本發(fā)明所述的特征，例如在在前段落中所述的特征。

在一些方面，本發(fā)明提供了一種具有結(jié)合登革病毒能力的抗體分子，其包括一種具有序列SEQ ID NO:4的VH FW2，或者一種相對于SEQ ID NO:4具備不超過1、2、3、4、5、10或15個突變的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述突變是取代，比方說保守取代。本段中所述的抗體分子也可以具備本發(fā)明所述的特征，例如在在前段落中所述的特征。

在某些方面，本發(fā)明提供了一種具有結(jié)合登革病毒能力的抗體分子，其包括一種具有序列WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO:84)或WVRQAPEQGLEWMG(SEQ ID NO:85)的VH FW2，或者一種相對于SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:85具備不超過1、2、3、4、5或10個突變的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述突變各自獨立地選自缺失和取代比方說保守取代。本段中所述的抗體分子也可以具備本發(fā)明所述的特征，例如在在前段落中所述的特征。

在一些實施方案中，所述抗體分子具有結(jié)合兩種或多種(例如三種或四種)登革病毒血清型(例如，選自DV-1，DV-2，DV-3和DV-4)的EDIII的能力，具有一種針對所述兩種或多種血清型的每一種具有小于大約80，70，60，50，40，30，20，10，8，6，4，3，2，1，0.5，0.2，0.1，0.05或者0.01nM的解離常數(shù)(KD)。

在一些實施方案中，所述抗體分子具有一種可變區(qū)域，其在序列方面是相同的，或者其具有與本發(fā)明所描述的可變區(qū)域(例如，這里所公開的FR區(qū)域)相差1、2、3或4種氨基酸。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子是一種完整抗體或其片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab')2、Fv或者單鏈Fv片段(scFv))。在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子是一種單克隆看題或者一種具有單一特異性的抗體。所述抗-登革抗體分子還能夠是一種人源化的、嵌合的、駱駝科的(camelid)、鯊魚(shark)、或者體外生成的抗體分子。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子是一種人源化的抗體分子?？?登革抗體分子的重鏈和輕鏈可以是全長(例如，一種抗體可以包括至少一種或者至少兩種完整的重鏈，以及至少一種或至少兩種完整的輕鏈)，或者可以包括一種抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab')2、Fv、單鏈Fv片段、單結(jié)構(gòu)域抗體、雙特異性抗體(dAb)、二價或者雙特異性抗體或其片段、其單一結(jié)構(gòu)域變體、或者一種camelid抗體)。

在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子具有一種重鏈恒定區(qū)(Fc)，其選自，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD和IgE的重鏈恒定區(qū)；具體地，選自，例如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的重鏈恒定區(qū)；更為具體地，IgG1或者IgG2(例如，人IgG1或IgG2)的重鏈恒定區(qū)。在一些實施方案中，所述重鏈恒定區(qū)是人IgG1。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子具有一種輕鏈恒定區(qū)，其選自例如，kappa或lambda(κ，λ)的輕鏈恒定區(qū)，在一下實施方案中是kappa(例如人kappa(κ))。在一些實施方案中，所述恒定區(qū)域被改變，例如突變，用于修飾抗-登革抗體分子的特性(例如，用于增加或降低一種或多種：Fc受體結(jié)合、抗體糖基化、半胱氨酸殘基的數(shù)量、效應(yīng)細(xì)胞功能或者補體功能)。例如，所述恒定區(qū)域可以在位點234(例如L至A)、235(例如，L至A)、296(例如，M至Y)、297(例如，N至A或G至Q)、298(例如，S至T)、300(例如，T至E)、477(例如，H至K)和478(例如，N至F)上進(jìn)行突變從而改變Fc受體結(jié)合。

在一些實施方案中，所述抗體分子是一種人源化的抗體分子。

在一些實施方案中，所述抗體分子是分離的或重組體。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括人或人源化的片段區(qū)域與CDR(互補決定區(qū))的組合。

本發(fā)明還提供了包含核苷酸序列的核酸，其編碼本發(fā)明所述的抗-登革抗體分子的重鏈和輕鏈可變區(qū)域以及CDRs。例如，本發(fā)明提供了一種第一和第二核酸，其分別編碼了根據(jù)表1(例如D88、A48、F38、F108、或C88，或者基本與其相同的序列)的抗-登革抗體分子的重鏈和輕鏈可變區(qū)。例如，所述核酸可包括一種核苷酸序列，其編碼了根據(jù)表1所述的抗-登革抗體分子，例如，D88，A48，F(xiàn)38，F(xiàn)108或C88，或者一種基本與所述核苷酸序列相同的序列(例如，一種至少大約85％、90％、95％、99％或更多與其相同的序列，或者與來自上述核苷酸序列相差不超過3、6、15、30或45個核苷酸)。在某些實施方案中，所述核酸可包括一種核苷酸序列，其編碼至少一種、兩種、或者三種CDR，其中所述CDR來自一種具有表2所述的氨基酸序列或者一種基本與其同源的序列(例如，一種至少大約85％、90％、95％、99％或更多與其相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或取代、插入或缺失，比方說保守取代)的重鏈可變區(qū)。在某些實施方案中，所述核酸可包括一種編碼至少一種、兩種或三種CDR的核苷酸序列，其中所述CDR來自一種具有表2所述的氨基酸序列或者一種基本與其同源的序列(例如，一種至少大約85％、90％、95％、99％或更多與其相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或取代、插入或缺失，比方說保守取代)的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，所述和蘇三可包括一種編碼至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種CDR的核苷酸序列，其中所述CDR來自具有表2所述的氨基酸序列或者一種基本與其同源的序列(例如，一種至少大約85％、90％、95％、99％或更多與其相同的序列，和/或具有一種、兩種、三種或取代、插入或缺失，比方說保守取代)的重鏈和輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征的核酸編碼了一種抗體分子或其部分，其具有一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

本發(fā)明還提供了核酸序列，例如一種雜交核酸序列的核酸，所述核酸序列編碼表1中的抗體，例如D88、A48、F38、F108或C88或其補體，例如在低嚴(yán)謹(jǐn)、中嚴(yán)謹(jǐn)、高嚴(yán)謹(jǐn)、或這里所述的其它雜交條件下進(jìn)行。本發(fā)明還公開了表1所述的核酸序列，以及他們的補體，例如在低嚴(yán)謹(jǐn)、中嚴(yán)謹(jǐn)、高嚴(yán)謹(jǐn)、或這里所述的其它雜交條件下進(jìn)行。在一些實施方案中，所述核酸至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多與表4中的序列、其補體、或上述序列的任意部分相同。在一些實施方案中，具有在本段中所討論的結(jié)構(gòu)特征的核酸編碼了一種抗體分子或其部分，其具有一種或多種優(yōu)異特性，例如針對登革病毒(例如DV-4)的一種增加(例如相對于A11)的親和性或者中和活性。在一些實施方案中，所述優(yōu)異特性指的是上述目錄1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。

在某些方面，本發(fā)明的特征在于包含本發(fā)明所述核酸的宿主細(xì)胞和載體。所述核酸可存在于在相同的宿主細(xì)胞或單獨宿主細(xì)胞中出現(xiàn)的單一載體或單獨載體中。所述宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、或者原核細(xì)胞例如E.coli。例如，所述哺乳動物細(xì)胞可以是一種培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系。典型的哺乳動物細(xì)胞包括人細(xì)胞，例如HEK293細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系(例如NS0)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、COS細(xì)胞、卵母細(xì)胞、以及來自轉(zhuǎn)基因動物的細(xì)胞。

在一些方面，本發(fā)明提供了一種提供這里所述的抗體分子的方法。所述方法可包括：提供一種與EDIII抗原特異性結(jié)合的抗體分子；使所述抗體(例如，針對恒定區(qū)、框架、和/或CDR)產(chǎn)生一種或多種突變，并且評估所述抗體分子是否與EDIII抗原特異性結(jié)合，或者評估所述抗體分子在抑制登革病毒功能方面的效力。所述方法可進(jìn)一步包括純化所述抗體分子。例如，所述抗體分子可通過一種或多種色譜分析步驟進(jìn)行純化，所述色譜分析步驟包括例如親和色譜分析法，例如蛋白質(zhì)A色譜分析法。所述方法可進(jìn)一步包括向受試者施用所述抗體分子，其中受試者例如人或非人動物。

在某些方面，本發(fā)明提供了組合物，例如藥物組合物，其包括一種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，以及本發(fā)明所述的所述抗-登革抗體分子的至少其中之一。在一些實施方案中，所述抗體分子與標(biāo)記物或治療試劑共軛。在一些實施方案中，所述組合物，例如藥物組合物，包括一種抗體分子和第二試劑的組合，所述第二試劑例如一種治療試劑，或者如本發(fā)明所進(jìn)一步描述的兩種或多種前述抗體分子。

本發(fā)明所公開的抗體分子能夠抑制登革病毒的一種或多種活性。例如，所述抗體分子可破壞在病毒粒子表面上的E蛋白的天然結(jié)構(gòu)，例如引起病毒失活。因此，所述抗體分子可中和病毒，抑制其進(jìn)入到宿主細(xì)胞中的能力，或者降低病毒穩(wěn)定性。在一些實施方案中，抗體分子中和登革病毒(例如，在聚焦還原中和試驗中或者一種用于評估病毒活性的中和作用的相關(guān)試驗中)，其具有小于或者等于1400、1000、800、600、550、500、450、400、350、300、350、200、150、100、50或25ng/ml的EC50或者FRNT50。在一些實施方案中，所述抗體中和登革病毒(例如，在聚焦還原中和試驗中或者一種用于評估病毒活性的中和作用的相關(guān)試驗中)，其具有小于或者等于20、17.6、15、10、5、4、2、1.4、1或者0.50的IC50。在一些實施方案中，對DV-4的中和作用進(jìn)行測試，并且在一些實施方案中，對DV-1、DV-2或DV-3的其中之一的中和作用進(jìn)行測試。

所述受試者可以是哺乳動物，例如，猴子、靈長類動物優(yōu)選高等靈長類，例如人(例如，具有登革病毒或者具有登革病毒風(fēng)險的患者)。

本發(fā)明還提供了一種治療受試者中登革病毒的方法，包括對所述受試者施用本發(fā)明所述的抗-登革抗體分子，例如一種治療有效量的抗-登革抗體分子，或其抗原結(jié)合部分。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子被施用于患有登革病毒的患者，導(dǎo)致病毒載體的減少和/或至少一種癥狀的減少，例如選自突發(fā)性發(fā)熱、頭痛、肌肉和關(guān)節(jié)痛體重減輕、中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲入、和/或皮疹。在一些實施方案中，所述抗登革抗體分子被施用于具有感染登革病毒風(fēng)險的患者，導(dǎo)致受到感染的風(fēng)險降低或者感染(如果感染發(fā)生)嚴(yán)重程度降低。

所述抗-登革抗體分子可通過全身的(例如，口服、腸道外、皮下、靜脈、直腸、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)、透皮、或者通過吸入或腔內(nèi)裝置)、局部的、或者通過應(yīng)用于黏膜例如鼻子、喉嚨和支氣管施用于受試者。

本發(fā)明所述的方法和組合物可被用于與其它治療方形式組合。在一些實施方案中，本發(fā)明所述的方法包括給受試者施用本發(fā)明所述的抗-登革抗體分子，與一種第二治療劑或者用于登革病毒的預(yù)防藥聯(lián)合施用，以一種有效治療或預(yù)防所述失調(diào)的劑量。所述抗體分子和所述第二試劑可同時或順序施用。

可以應(yīng)用所述抗-登革抗體分子和其它治療形式的任意組合和順序。所述抗-登革抗體分子和/或其它治療形式可在活動性感染周期期間、或者在緩解或減少活動性疾病周期期間被進(jìn)行施用。所述抗-登革抗體分子和其它治療形式可在治療之前施用、與治療同時施用、在治療后施用、或者在感染緩解期間施用。

在一些方面，本發(fā)明提供了用于探測樣本中登革病毒存在的方法，例如體內(nèi)或體外(例如，一種生物樣本邊說血液或血清)。所述方法可被用于評估(例如，檢測在宿主中的這里所描述的失調(diào)例如登革病毒的診斷和/或階段的治療或進(jìn)程)。所述方法可包括：(i)使樣本(并且任選一種參照，例如一種對照樣本)與本發(fā)明所述的抗-登革抗體分子接觸，或者為受試者施用本發(fā)明所述的抗-登革抗體分子，其是在允許相互作用產(chǎn)生的條件下進(jìn)行，以及(ii)檢測是否在抗體分子和樣本(并且任選一種參照，例如一種對照樣本)之間有復(fù)合體的形成。復(fù)合體的形成表示登革病毒的存在，并且能夠表明對于這里所述的治療的適宜性和需求。所述方法能夠涉及，例如，免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、FACS、抗體分子-復(fù)合的磁性粒子、ELISA試驗、或者PCR技術(shù)(例如，RT-PCR)。

典型地，在體內(nèi)和體外治療方法中所使用的所述抗-登革抗體分子可用可檢測的物質(zhì)直接或間接地標(biāo)記，從而促進(jìn)結(jié)合或未結(jié)合的結(jié)合試劑的檢測。合適的可檢測物質(zhì)包括各種各樣的生物活性酶、酶活動基、熒光材料、發(fā)光材料、順磁性(例如，核磁共振活性)材料、以及放射性物質(zhì)。

在一些方面，本發(fā)明提供了診斷或治療試劑盒，其中包括本發(fā)明所述的抗-登革抗體分子以及使用說明書。

本發(fā)明預(yù)測了前文所述方面和/或?qū)嵤┓桨傅娜我馄渲幸环N或多種的所有組合，以及與在詳細(xì)的描述和實施例中闡述的實施方案的任意一種或多種的組合。

本發(fā)明所述的組合物和方法的其它特征、目的和優(yōu)勢將通過說明書和附圖以及從權(quán)利要求書中進(jìn)行展示。

在此提供了附圖和表。

附圖說明

這些附圖在本文中各自有更為詳細(xì)的描述。

附圖1A-1I顯示了多個抗-登革EDIII抗體的氨基酸和核苷酸序列。Kabat CDR以下劃線標(biāo)注，并且某些感興趣的殘基被加框(在優(yōu)先權(quán)文件中以一種灰色背景顯示)。

附圖2描述了一種使用活病毒的聚焦還原中和試驗的結(jié)果，顯示抗體B11改進(jìn)DV4的mAb A11中和作用。

附圖3顯示了抗體A11和B11中和DV4的重復(fù)分析。

附圖4是多個人源化的EDIII抗體框架的功能分析。

附圖5顯示了在抗-登革抗體N-端的回復(fù)突變上的抗體親和性。重鏈FW“04”涉及一種框架類型，其具有與例如mAb B48相同的重鏈框架氨基酸序列。輕鏈FW“08”涉及一種框架類型，其具有與例如mAb B48相同的輕鏈框架氨基酸序列。mAb B48的重鏈和輕鏈框架序列在表1和表2中列出。

附圖6顯示了結(jié)合某些點突變導(dǎo)致針對EDIII增加的親和性。輕鏈FW“08”涉及一種框架類型，其具有與例如mAb D88相同的輕鏈框架氨基酸序列。mAb D88的輕鏈框架序列在表1和表2中列出。

附圖7顯示了將位點98設(shè)置為與其它突變結(jié)合的A、V或S的結(jié)果。

附圖8顯示了競爭ELISA的結(jié)果，從而確定選定的抗體的EDIII結(jié)合親和性。

附圖9顯示了選定的抗-登革抗體與四種登革病毒血清型的EDIII的結(jié)合。

附圖10A概況了選定的登革病毒分離株的EDIII氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。“DENV”指的是登革病毒的縮寫，并且DENV-2代表血清型DV-2，DENV-23代表血清型DV-3，并且DENV-4代表血清型DV-4。

附圖10B顯示了抗體D88與多種登革病毒分離株的結(jié)合。*表示用于體外中和作用試驗的菌株。

附圖11顯示了選定的抗-登革抗體針對各種登革病毒菌株的親和性。

附圖12顯示了在聚焦還原中和試驗中多種抗-登革抗體中和登革病毒血清型DV-4的能力。

附圖13顯示了在聚焦還原中和試驗中多種抗-登革抗體中和登革病毒血清型DV-3的能力。在該試驗中使用的是DV-3H87。

附圖14顯示了在聚焦還原中和試驗中多種抗-登革抗體中和登革病毒血清型DV-4的能力。

附圖15A-15C顯示了依據(jù)熱變動分析試驗(Sypro或者ange)，選定的抗-登革抗體的熱穩(wěn)定性。

附圖16顯示了在AG129小鼠模型中，抗體D88在感染登革病毒的小鼠的生存方面的作用。

附圖17顯示了在AG129小鼠模型中，抗體D88在感染登革病毒的小鼠的體重變化方面的作用。

附圖18顯示了在AG129小鼠模型中，抗體D88在感染登革病毒血清型2(菌株NGC)的小鼠中病毒血癥方面的作用。

附圖19顯示了在聚焦還原中和試驗(FRNT)中，抗體D88中和在C6/36昆蟲細(xì)胞中傳播的登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的能力。

附圖20顯示了在聚焦還原中和試驗(FRNT)中，抗體D88中和在Vero(猴子)細(xì)胞中傳播的登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的能力。

附圖21顯示了在聚焦還原中和試驗(FRNT)中，抗體D88和A11中和在Vero(猴子)細(xì)胞中傳播的登革病毒DENV-4菌株H241的能力。

附圖22顯示了抗體A48、C88和D88的聚集傾向，通過高效分子排阻層析(HP-SEC)進(jìn)行評估。

附圖23描述了抗體D88對于DENV-4的親和性增益，具有與抗體4E11相比針對DENV-1、DENV-2和DENV-3同時增加的親和性。

列表說明

這些表在本文中各自有更為詳細(xì)的描述。

表1總結(jié)了示例性抗-登革抗體的序列。

表2描述的是表1中的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列。Kabat CDR以下劃線標(biāo)注，Chothia CDR以斜體表示，并且某些感興趣的殘基以一種灰色背景顯示。

表3描述的是表1中的CDR的氨基酸序列。

表4總結(jié)了用于編碼表1中抗體的核酸序列。

表5描述的是在表4中總結(jié)的核酸序列。

表6描述的是在本申請中所描述的其它氨基酸序列。

具體實施方式

本發(fā)明在這里公開了抗體分子，所述抗體分子以高親和力和特異性與登革病毒表位(例如EDIII)結(jié)合。更方便地，本文中所述的幾個抗體分子以高親和力結(jié)合登革病毒血清型DV-1、DV-2、DV-3以及DV-4的EDIII。本發(fā)明在這里提供了編碼抗體分子核酸分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞以及用于形成抗體分子的方法。本發(fā)明所公開的所述抗-登革抗體分子可被用于(單獨或者與其它試劑或者治療形式結(jié)合)治療、預(yù)防和/或診斷登革病毒，例如DV-1、DV-2、DV-3或DV-4。如在本發(fā)明所述使用的，DV-1、DV-2、DV-3以及DV-4有時分別被稱為DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。

定義

正如在這所使用的，冠詞“一個(a)”和“一種(an)”指的是一種或者多于一種(例如，至少一種)的所述冠詞的語法對象。

在這里所使用的術(shù)語“或”指的是，非在上下文中明確，否則指的是術(shù)語“和/或”，并且可以與術(shù)語“和/或”互換使用。

“約(about)”和“大約(approximately)”通常應(yīng)當(dāng)指的是對于測定的實際狀況或正確的測量結(jié)果發(fā)生誤差的可接受程度。示范性誤差程度為給定值或給定值范圍的20％之內(nèi)，典型的在10％之內(nèi)，并且更為典型的在5％之內(nèi)

本發(fā)明所公開的組合物和方法包含具有特定序列或疾病上與其相同或相似的序列的多肽和核苷酸，例如，其中所述序列至少85％、90％、95％或更高與特定序列相同。在氨基酸序列的情況中，本發(fā)明所在這里使用的術(shù)語“基本相同”指的是第一氨基酸含有足夠的或者最小數(shù)目的氨基酸殘基，其i)與第二氨基酸序列中的定向氨基酸殘基相同，或者ii)第二氨基酸序列中的定向氨基酸殘基的保守替換的，使得第一和第二氨基酸序列具有一個共同的結(jié)構(gòu)域和/或共同的功能活性。舉例來說，氨基酸序列具有一種共同的結(jié)構(gòu)域，其至少大約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％與參考序列(例如本發(fā)明所給定的序列)相同。

在核苷酸序列的環(huán)境中，本發(fā)明中所使用的術(shù)語“基本相同”指的是第一氨基酸含有足夠的或者最小數(shù)目的核苷酸，其與第二核苷酸序列中的定向核苷酸相同，使得第一和第二核苷酸序列編碼一種具有共同功能活性的多肽，或者編碼一種共同的結(jié)構(gòu)多肽域或者共同的功能多肽活性。舉例來說，核苷酸序列至少大約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％與參考序列(例如本發(fā)明所給定的序列)相同。

術(shù)語“功能性變體”涉及多肽，其具有一種與天然存在的序列基本相同的氨基酸序列，或者是通過一種基本相同的核苷酸序列進(jìn)行編碼，并且能夠具備一種或多種天然存在序列的活性。

為了確定兩種氨基酸序列的同一性百分比，或者為了確定兩種核苷酸序列的同一性百分比，以最佳比較目的對序列進(jìn)行比對(例如，為了最佳比對目的將缺口引入第一和第二氨基酸的其中之一或者二者內(nèi)，或者為了比較目的忽略非同源序列)。在優(yōu)選的實施方案中，用于比較目的而對其的參考序列的長度，至少是所述參考序列長度的30％，例如至少40％、50％、60％，例如至少70％、80％、90％、100％。然后，比較在對應(yīng)氨基酸位點或核苷酸位點上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)在第一序列中的位點與在第二序列的相應(yīng)位點被同樣的氨基酸殘基湖核苷酸所占據(jù)，那么所述分子在這一位點具有同一性。

在兩種序列之間的同一性百分比是所述序列共有的相同位點數(shù)的函數(shù)，考慮到空位數(shù)和每個空位的長度，需要引入它們進(jìn)行兩種序列的最佳比對。

兩種序列之間的序列的比較以及同一性百分比的確定能夠通過使用一種數(shù)學(xué)算法完成。在一些實施方案中，兩種氨基酸序列之間的同一性百分比是使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)的算法確定的，其已經(jīng)合并到GCG程序包(可在http://www.gcg.com中獲得)中的GAP程序中，其中使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣，并且空隙權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4以及長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。在某些實施方案中，兩種核苷酸序列之間的同一性百分比是使用在GCG程序包(可在http://www.gcg.com中獲得)中的GAP程序確定的，使用NWSgapdna.CMP矩陣，并且空隙權(quán)重為40、50、60、70或80以及長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。一組合適的參數(shù)(并且除非另做說明可以使用所述參數(shù))指的是Blossum 62評分的間隙記罰分12分、間隙延伸記罰分4分，移碼間隙記罰分5分。

在兩種氨基酸或核苷酸序列之間的同一性百分比可通過使用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，4:11-17)的算法進(jìn)行確定，所述算法已經(jīng)合并至ALIGN程序(2.0版)中，其中使用PAM120加權(quán)殘基表，缺口長度罰分為12且缺口罰分為4。

在本發(fā)明中所述的核苷酸和蛋白質(zhì)序列可被用來做為“查詢序列”，用于進(jìn)行對公共數(shù)據(jù)庫的搜索，從而例如鑒定其它的家族成員或相關(guān)序列。這種搜索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(version 2.0)來進(jìn)行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序執(zhí)行，記分＝100，字長＝12，從而獲得與本發(fā)明的核苷酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可以用XBLAST程序執(zhí)行，記分＝50，字長＝3，從而獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)同源的氨基酸序列。為了獲得有間隙的排列以達(dá)到比較的目的，可以使用Gapped BLAST，該程序的詳細(xì)說明可參見Altschul等人所著的(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389。當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時，可以用各個程序(例如，XBLAST和BLAST)的缺省參數(shù)。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。

這里所述的術(shù)語“在低嚴(yán)謹(jǐn)、中嚴(yán)謹(jǐn)、高嚴(yán)謹(jǐn)或超高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”描述了雜交和洗滌的條件?？稍贑urrent Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons，N.Y.6.3.1.-6.3.6.，1989)一書中找到進(jìn)行雜交反應(yīng)的指導(dǎo)，而這里將其引入?yún)⒖?。在所述參考文獻(xiàn)中描述了水和非水兩種方法，并且任意一種都可以使用。本發(fā)明中所指的特異性雜交條件指的是如下條件：1)低嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為大約45℃時在6X的氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中進(jìn)行雜交，接著在50℃(低嚴(yán)謹(jǐn)條件總洗滌的溫度可增加到55℃)的條件下在0.2XSSC，0.1％SDS中洗滌兩次；2)中嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為，大約45℃時在6XSSC中進(jìn)行雜交，接著在60℃的條件下在0.2XSSC，0.1％SDS中洗滌一次或多次；3)高嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為，大約45℃時在6XSSC中進(jìn)行雜交，接著在65℃的條件下在0.2X SSC，0.1％SDS中洗滌一次或多次；4)超高嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為，65℃時在0.5M磷酸鈉，7％SDS中雜交，接著在65℃的條件下在0.2X SSC，0.1％SDS中洗滌一次或多次。超高嚴(yán)謹(jǐn)條件(4)是合適的條件，并且所使用的那些除非是特別指明的。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這里所描述的分子可具有另外的保守或者非必須氨基酸取代，這種取代對其功能不產(chǎn)生實質(zhì)性影響。

一種“保守的氨基酸取代”指的是其中所述氨基酸殘基被具有類似側(cè)臉的氨基酸殘基取代。具有類似側(cè)臉的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)被定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨基酸)、具有無電荷側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)以及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。

術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”(如果是單鏈)在本發(fā)明的使用中是可以互換的。

術(shù)語“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”或“多核苷酸序列”以及“多核苷酸”在本發(fā)明的使用中是可以互換的。

如在這里所使用的，術(shù)語“分離的”是指從其原有環(huán)境或者天然環(huán)境(例如，所述天然環(huán)境，例如它是天然存在的)中移出的物質(zhì)。例如，存在于活動物中的天然存在的多肽或者多核苷酸不是分離的，但是與自然系統(tǒng)中某些或者全部共存物質(zhì)分開的相同的多核苷酸或者多肽則是分離的。所述多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，而且它們?nèi)匀皇欠蛛x的，因為所述載體或這位并不是其在自然中所發(fā)現(xiàn)的環(huán)境的組成部分。

如在這里所使用的，術(shù)語“治療”，例如一種登革病毒感染，指的是，在實施方案中，當(dāng)所述的抗體分子被施用，與沒有施用抗體相比，被病毒感染的并且經(jīng)歷了所述病毒癥狀的受試者(例如，人)將經(jīng)受較輕的癥狀和/或?qū)⒒謴?fù)的比較快。在實施方案中，當(dāng)一種感染被治療時，在針對感染的有效治療之后，用于檢測受試者病毒的分析將檢測到較少的病毒。例如，一種使用抗體分子的診斷分析，例如本發(fā)明所述的抗體分子，在抗體分子施用用于感染的有效治療之后，將在患者的生物樣本之內(nèi)檢測到較少的病毒或者沒有病毒。其它的分析，例如PCR(例如qPCR)也可以被用于監(jiān)控患者的治療，從而在病毒感染治療之后檢測患者內(nèi)的存在，例如減少的存在(或者缺乏)。治療能夠，例如，部分地或者完全地減輕、改善、減除、抑制、減少具體疾病、失調(diào)和/或狀態(tài)(例如登革病毒)的嚴(yán)重程度和/或減少發(fā)病率，并且選擇地使具體疾病、失調(diào)和/或狀態(tài)(例如登革病毒)的一種或多種營銷或癥狀、特征和/或起因的臨床表現(xiàn)減緩。在實施方案中，治療指的是，沒有顯示相關(guān)疾病、失調(diào)和/或狀態(tài)的某些標(biāo)志的受試者的治療，和/或?qū)H顯示疾病、失調(diào)和/或狀態(tài)的早期標(biāo)志的受試者的治療。在實施方案中，治療指的是對表現(xiàn)出相關(guān)疾病、失調(diào)和/或狀態(tài)的一種或多種確定標(biāo)志的受試者的治療。在實施方案中，治療指的是確診為經(jīng)受登革病毒的受試者的治療。

正如在這里所使用的，術(shù)語“預(yù)防”，例如一種登革病毒感染，指的是如果受試者在被暴露于病毒中之前(例如，1天、2天、1周、2周、3周或者1月或更多)接受了所述的抗體，那么所述受試者(例如人)不太可能受到病毒(例如登革病毒)的感染。

正如在這里所使用的，術(shù)語“框架”、“FW”和“FR”在本發(fā)明的使用中是可以互換的，并且在本文及其優(yōu)先權(quán)文件中具有相同的意義。

在本發(fā)明中的組合物和方法的多種方面將在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述。另外的定義在本發(fā)明的實施方案的全文中提到。

抗-登革抗體分子

抗登革抗體的示例性序列如下文中的表1-表4中所述。

表1.示例性的抗-登革抗體的氨基酸序列中

A11和B11是小鼠抗體，并且表1中的其它抗體是人源化的抗體。

表2.表1中的重鏈可變區(qū)可輕鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列的描述。CDR，根據(jù)Kabat系統(tǒng)定義的，是下劃線的并且是粗體，但是根據(jù)Chothia系統(tǒng)定義的CDR是斜體的。某些感興趣的殘基示出為具有灰色背景。缺失是以一種插入符(^)來表示。

在本申請全文中，參照指的是根據(jù)小鼠抗體A11的可變區(qū)域的氨基酸位點。小鼠抗體B11的可變區(qū)域具有相對于A11的在位點26上的缺失。在表1中的人可變區(qū)域序列具有一種在A11的位點6上的谷氨基酸序列的缺失。因此，相對于A11攜帶有一種缺失的序列使用一種編號系統(tǒng)，其為偏置的。例如，A48重鏈具有相對于A11的位點6上的一種谷氨基酸序列的缺失。因此，A48VH的位點26(絲氨酸)實際上是A48VH序列(SEQ ID NO:16)的第二十到第五個氨基酸。在另一個實施例中，D88重鏈具有相對于A11的位點6上的一種谷氨基酸序列的缺失，以及相對于A11的位點26上的一種絲氨酸的缺失。因此，D88VH的位點33(纈氨酸)實際上是A88VH序列(SEQ ID NO:1)的第三十到第一個氨基酸。

所述抗體的某些結(jié)構(gòu)特征可根據(jù)表2中的VH和VL序列被注意到。B11具有一種相對于A11VH區(qū)域的位點26上的缺失。D88是一種人源化的抗體，其具有相對于A48VH區(qū)域(保持與A11編號一致)的一種在位點26上的缺失以及一種T33V突變。F38是一種人源化的抗體，其具有相對于A48VH區(qū)域的一種在位點26上的缺失以及T33V突變和E43G突變。A48是一種人源化的抗體，其具有與A11相同的CDR。C88是一種人源化的抗體，其具有相對于A48VH區(qū)域的一種T33V突變。F108是一種人源化的抗體，其具有相對于A48VH區(qū)域的一種T33V突變和E43G突變。B48是一種人源化的抗體，其具有相對于A48VH區(qū)域的位點26上的缺失。A68是一種人源化的抗體，其具有相對于A48VH區(qū)域的一種A98V突變。A100是一種人源化的抗體，其具有相對于A48VH區(qū)域的一種A98S突變。C58是一種人源化的抗體，其具有相對于A48VH區(qū)域的G27Y突變和F28W突變。C78是一種人源化的抗體，其具有相對于A48VH區(qū)域的K31Q突變和T33V突變。C68是一種人源化的抗體，其具有相對于A48VH區(qū)域的K31S突變和T33V突變。C98是一種人源化的抗體，其具有相對于A48VH區(qū)域的G27A突變。

可以預(yù)見表1和表2中的抗體的其它變體。例如，本發(fā)明提供了抗體B48+A98V，其具有相對于B48的A98V突變；A48+V2L，其相對于A48具有V2L突變；A48+InsE6，其相對于A48具有InsE6突變；B48+V2L，其相對于B48具有V2L突變；B48+InsE6，其相對于B48具有InsE6突變；D118，其相對于A48具有F28W和T33V突變；D128，其相對于A48具有G27A、F28W和T33V突變；D138，其相對于A48具有G27Y、F28A和T33V突變；D148，其相對于A48具有G27Y和T33V突變；D158，其相對于A48具有G27Y、F28G和T33V突變；D168，其相對于A48具有F28Y和T33V突變；C98，其相對于A48具有T33V和A98V突變；C128，其相對于A48具有T33V和A98S突變；D178，其相對于A48具有Del26、T33V和A98V突變；以及D188，其相對于A48具有Del26、T33V和A98S突變。

表3.表1中的CDR的氨基酸序列的描述。

表4.編碼表1中抗體的核苷酸序列的中。

表5.表4的核酸序列

表6.附加氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述抗體分子包括一種相對于A11的VH T33V突變。更為具體的，在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括表1(例如，D88、F38、F108或者C88)的抗體的VH區(qū)域的CDR1，使用CDR的Kabat或者Chothia定義。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括所述CDR1以及表1(例如，D88、A48、F38、F108或者C88)中抗體的VH區(qū)域的CDR2和CDR3的其中之一或兩者，使用CDR的Kabat或者Chothia定義。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括表1抗體的VH區(qū)域的CDR1(例如，D88、A48、F38、F108或C88)結(jié)合在表2的VH和/或VL區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的其它1、2、3、4或5(例如全部6種)種CDR，使用CDR的Kabat或者Chothia定義。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體病毒包括SEQ ID NO:3的VH CDR1。例如，所述抗-登革抗體分子可包括SEQ ID NO:3的VH CDR1，結(jié)合表3的VH CDR2和/或VHCDR3，例如，SEQ ID NO:4的VH CDR2和SEQ ID NO:5的VH CDR3。作為進(jìn)一步的實施例，所述抗-登革抗體分子可包括SEQ ID NO:3的VH CDR1，結(jié)合在表2的VH和/或VL區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的其它1、2、3、4或5(例如全部6種)種CDR。

在某些實施方案中，所述抗體分子包括相對于A11的VH F65L突變。在A11的Kabat定義的CDR中，位點65是CDR殘基，但是在A11的Chothia定義的CDR中，位點65則是框架殘基。在一些實施方案中，針對登革病毒的抗體分子的親和性是不受F65L突變影響的。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括表1(例如，D88、A48、F38、F108或C88)抗體的VH區(qū)域的CDR2，使用CDR的Kabat或者Chothia定義。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括CDR2以及表1(例如，D88、A48、F38、F108或者C88)中抗體的VH區(qū)域的CDR1和CDR3的其中之一或兩者，使用CDR的Kabat或者Chothia定義。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括表1抗體的VH區(qū)域的CDR2(例如，D88、A48、F38、F108或C88)結(jié)合在表2的VH和/或VL區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的其它1、2、3、4或5(例如全部6種)種CDR，使用CDR的Kabat或者Chothia定義。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體病毒包括SEQ ID NO:4的VH CDR2。例如，所述抗-登革抗體分子可包括SEQ ID NO:4的VH CDR2，結(jié)合表3的VH CDR1和/或VHCDR3，例如，SEQ ID NO:3的VH CDR1和SEQ ID NO:5的VH CDR3。作為進(jìn)一步的實施例，所述抗-登革抗體分子可包括SEQ ID NO:4的VH CDR2，結(jié)合在表2的VH和/或VL區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的其它1、2、3、4或5(例如全部6種)種CDR。在某些實施方案中歐，所述抗體分子包括相對于A11的VH F65L突變以及VH T33V突變。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括在相對于A11的VH中的位點26上的S的缺失(del26)。在一些實施方案中，所述抗體分子包括del26突變，結(jié)合VH T33V突變和/或VH F65L突變。在某些實施方案中，所述抗體分子包括del26突變以及一種或多種表3的CDR。在某些實施方案中，所述抗體分子包括del26突變，結(jié)合在表2的VH和/或VL區(qū)域中的1、2、3、4、5或6中CDR，使用CDR的Kabat或者Chothia定義。

如下文的實施例4中所示，重鏈的N端對突變是耐受的。因此，在一些實施方案中，重鏈序列的位點1-6具有相對于表1的抗體的1、2、3、4、5或6種突變。在一些實施方案中，一種抗體分子包括在表2中的重鏈你序列的殘基2、3、5或6的一種或多種(例如全部)上的一種取代、插入或者缺失。在某些實施方案中，所述抗體分子包括表2的重鏈序列的一部分，例如氨基酸位點2-117、3-117、4-117、5-117、6-117、8-117或者10-117。

如下文的實施例5中所示，在VH中的位點27和28是突變耐受的，并且在一些實施方案中對于位點27和/或28的突變增強了結(jié)合性。因此，在一些實施方案中，位點27和28的其中之一或者二者具有相對于表1的抗體的突變。

實施例5還顯示了在VH的位點98是突變耐受的，并且在一些實施方案中，對于位點98的突變增強了結(jié)合性。因此，在一些實施方案中，位點98具有相對于表1的抗體的突變。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括重鏈恒定區(qū)、輕鏈恒定區(qū)以及表2的重鏈和輕鏈可變區(qū)。在某些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括重鏈恒定區(qū)、輕鏈恒定區(qū)、以及包括表3的1、2、3、4、5或6中CDR的可變區(qū)域。

在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)是一種表1的重鏈可變區(qū)，其中在VH中的殘基98可以是任意的氨基酸。在某些實施方案中，殘基98可以是任意的無電荷的氨基酸。在一些實施方案中，位點98可以是A、V或S。下文中的實施例5顯示了具有在位點98上的A、V或S的抗體具有針對EDIII優(yōu)異的結(jié)合性。

在人源化過程中，多種框架區(qū)域(例如，VH FW1)可被回復(fù)突變?yōu)楹衼碜孕∈罂贵wA11或B11的殘基。更廣泛的來說，在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包含表1的VH區(qū)域的全部或者部分的序列。例如，在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括表1的VH區(qū)域的氨基酸5-117、10-117、15-117、20-117、25-117、30-117或者32-117。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括一種VH FW1區(qū)域，其選自小鼠VH FW1區(qū)域(例如，在A11或者B11中發(fā)現(xiàn)的)或者人VH FW1區(qū)域(例如，在表1的抗體中發(fā)現(xiàn)的區(qū)域，或者在人種系VH FW1序列中發(fā)現(xiàn)的區(qū)域)。在一些實施方案中，所述VH FW1區(qū)域相對于表1的VH序列的氨基酸1-31具有不超過1、2、3或4個位點的非同一性。

在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括表1中抗體的VH FW2區(qū)域。在一些實施方案中，所述VH FW2區(qū)域相對于表1中VH序列的氨基酸37-50具有不超過1、2、3或4個位點的非同一性。具有與獲自登革病毒的多種血清型的EDIII交叉反應(yīng)能力的抗體分子具有某些優(yōu)異特性。例如，一種治療方法可被用于治療或者診斷多種登革血清型。此外，醫(yī)生為了確定合適的治療方法并不需要確定患者感染的血清型。因此，在一些實施方案中，所述抗-可等各個抗體分子具有以高親和力獨立結(jié)合兩種、三種、四種或者多種登革病毒血清型的能力。例如，所述抗體分子可獨立地以高親和力與DV-1和DV-4的EDIII結(jié)合；與DV-1和DV-3的EDIII結(jié)合；與DV-1和DV-4的EDIII結(jié)合；與DV-2和DV-3的EDIII結(jié)合；與DV-2和DV-4的EDIII結(jié)合；與DV-3和DV-4的EDIII結(jié)合；或者與DV-1和DV-2和DV-3的EDIII結(jié)合；與DV-1和DV-2和DV-4的EDIII結(jié)合；與DV-1和DV-3和DV-4的EDIII結(jié)合；與DV-2和DV-3和DV-4的EDIII結(jié)合；或者與DV-1和DV-2和DV-3和DV-4的EDIII結(jié)合。在某些實施方案中，所述抗體分子可獨立地以高親和力與DV-4的EDIII和一種或多種其它DV血清型的EDIII結(jié)合。

上文中所述的登革病毒的每一種血清型回的是含有多種菌株的類型。本發(fā)明所述的抗體分子顯示了一種良好的反應(yīng)性寬度，與不同血清型(參見附圖11)中的多種菌株結(jié)合。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明所述的抗體分子結(jié)合和/或中和一種或多種(例如，至少2、3、4、5、10、15、或者20、25、或者30或更多)的登革病毒菌株，例如選自DENV-4BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4NewCal09、DENV-4Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3Nic10、DENV-3H87、DENV-2Peru95、DENV-2Sing08、DENV-2NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2New Guinea/1944(NGC)、DENV-3Philippines/1956(H87)、DENV-4Mexico/1997(BC287/97)、和DENV-4H241的菌株，所述菌株列入到本發(fā)明的表6中(例如，表6所提供的那些針對EDIII序列的菌株)，所述菌株存儲于ATCC中，所述菌株列入到針對新興病毒和蟲媒病毒的世界參考中心中(WRCEVA)(獲自www.niaid.nih.gov/labsandresources/resources/dmid/wrceva/Pages/default.aspx)，并且所述菌株列入到CDC部分或者載體媒介感染疾病中(獲自www2a.cdc.gov/nczved/dvbid/misc/reg.asp)。

在一些實施方案中，所述抗體分子以高親和力結(jié)合至DV-1、DV-2、DV-3和DV-4的一種或多種。在一些實施方案中，這些血清型中的每一種的E蛋白質(zhì)的EDIII氨基酸序列指的是在表6中提供的E蛋白序列。

在一些實施方案中，本發(fā)明所公開的抗體分子并不會刺激抗體依賴性激活作用(ADE)。ADE在Balsitis等人，Lethal Antibody Enhancement of Dengue Disease in Mice Is Prevented by Fc Modification，PLoS Pathog 6(2):e1000790.doi:10.1371/journal.ppat.1000790中進(jìn)行了更為詳細(xì)的描述。簡單地說，ADE描述了一種情況，其中人經(jīng)歷由于不同血清型的登革病毒的兩種連續(xù)的登革感染，并且第一感染的發(fā)生是的第二感染更為嚴(yán)重(例如，更可能發(fā)展成為登革出血熱)。用于ADE的機制可以是一種抗-登革抗體同時與病毒以及與宿主細(xì)胞上的抗體Fc受體結(jié)合，增強傳染性。從本發(fā)明所公開的FRNT實施方案中能夠清楚的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了多種抗體分子，其降低了，而不是增強，所述傳染性。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明所述的抗體分子不能夠激活患者體內(nèi)的ADE。在一些實施方案中，所述抗體抑制經(jīng)由ITA抗體(例如，患者的內(nèi)因性抗體)誘導(dǎo)的ADE。

在某些實施方案中，所述抗體分子結(jié)合在EDIII上的線性的或者構(gòu)象的表位。

正如在這里所使用的，術(shù)語“抗體分子”涉及一種蛋白質(zhì)，其包括至少一種免疫球蛋白變體區(qū)域序列。術(shù)語抗體分子包括，例如，全長的抗體、成熟抗體以及抗體的抗原結(jié)合片段。例如，抗體分子能包括一種重鏈(H)可變區(qū)域序列(在本發(fā)明中縮寫為VH)以及一種輕鏈(L)可變區(qū)域序列(在本發(fā)明中縮寫為VL)。在另一個實施例中，抗體分子包括兩種重鏈(H)可變區(qū)域序列以及兩種輕鏈(L)可變區(qū)域序列，因而形成了兩種抗原結(jié)合位點，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、單可變結(jié)構(gòu)域抗體、雙鏈抗體(Dab)(二價體并且有雙特異性)、以及嵌合(例如人源化的)抗體，其可通過整個抗體的修飾或者用重組DNA方法重新合成而產(chǎn)生。這些功能性抗體片段維持了選擇性與其給的抗原或受體結(jié)合的能力。抗體和抗體片段可來自抗體的任意類型，其包括，但不限于，IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE，以及來自抗體的任意子類型。所述抗體可以是單克隆或者多克隆的。所述抗體可以是人、人源化的、CDR-嫁接的，或者在體外產(chǎn)生的抗體。所述抗體能夠具有一種重鏈恒定區(qū)，其選自，例如，IgG1、IgG2、IgG3或者IgG4。所述抗體還可以具有一種輕鏈恒定區(qū)，其選自，例如，kappa或者lambda。

抗原結(jié)合片段的實例包括：(i)一種Fab片段，一種由VL、VH、CL和CH1區(qū)域構(gòu)成的單價片段；(ii)一種F(ab')2片段，一種具有通過在鉸鏈區(qū)上的二硫鍵結(jié)合的兩個Fab片段的二價片段；(iii)一種由VH和CH1區(qū)域構(gòu)成的Fd片段；(iv)一種由抗體單臂的VL和VH區(qū)域構(gòu)成的Fv片段；(v)一種雙特抗體(dAb)片段，其是有VH區(qū)域古城；(vi)一種駱駝的或駱駝化的可變區(qū)域；(vii)一種單鏈Fv(scFv)，參見，例如，Bird等人.(1988)Science 242:423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)的文獻(xiàn)；(viii)一種單區(qū)域抗體。這些抗體片段可使用任意適合的方法獲得，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一些常見的技術(shù)，并且所述片段可被篩選用于在與完整抗體相同的方式中應(yīng)用。

術(shù)語“抗體”包括完整的分子以及其功能片段。所述抗體的恒定區(qū)能夠被改變，例如，突變，從而修飾所述抗體的特性(例如，用于增加或者減少一種或多種：Fc受體結(jié)合性、抗體糖基化、半胱氨酸殘基數(shù)量、效應(yīng)細(xì)胞功能、或者補體功能)。

本發(fā)明所公開的抗體還可以是單結(jié)構(gòu)域抗體。所述單結(jié)構(gòu)域抗體可包括其互補決定域是單結(jié)構(gòu)域多肽一部分的抗體。實施例包括，但不限于，重鏈抗體、天然沒有輕鏈的抗體、從常規(guī)4-鏈抗體衍生的單結(jié)構(gòu)域抗體、工程化抗體和單結(jié)構(gòu)域支架，其不同于從抗體衍生的那些支架。單結(jié)構(gòu)域抗體可以是本領(lǐng)域中任一種單結(jié)構(gòu)域或者任一將來的單結(jié)構(gòu)域抗體。單結(jié)構(gòu)域抗體可以源自任意種類，其包括，但不限于，小鼠、人、駱駝、美洲駝、魚、鯊魚、山羊、兔和牛。依據(jù)一些方面，單結(jié)構(gòu)域抗體是一種天然存在的單結(jié)構(gòu)域抗體，其已知為缺少輕鏈的重鏈抗體。例如，這樣的單結(jié)構(gòu)域抗體在WO 9404678中已經(jīng)被公開。為了清楚起見，這種從天然缺少輕鏈的重鏈抗體衍生的可變結(jié)構(gòu)域被稱為VHH或nanobody，從而將其于四鏈免疫球蛋白的常規(guī)VH相區(qū)別。這種VHH分子可以來自在駱駝科(Camelidae)物種，例如在駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝和馱馬中產(chǎn)生的抗體。除了駱駝科之外的其它物種可以產(chǎn)生天然缺少輕鏈的重鏈抗體；這種VHHs在本發(fā)明所公開的范圍內(nèi)。

所述VH和VL區(qū)域可被細(xì)分為被稱為“互補決定區(qū)(CDR)”的高變區(qū)，其散布于被稱為“框架區(qū)(FR)”的更保守的區(qū)域中。已經(jīng)通過一些方法精確地限定了所述框架區(qū)和CDRs的范圍(參見Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，F(xiàn)ifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242；Chothia，C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)；以及采用Oxf或者d Molecular's AbM抗體建模軟件的所述AbM定義。參見，通常例如抗體可變區(qū)域的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)分析。在抗體工程實驗室手冊中(Ed.:Duebel，S.and Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。在一些實施方案中，使用了下述的定義：重鏈可變區(qū)域的CDR1的AbM定義以及針對其它CDRs的kabat定義。在某些實施方案中，kabat定義用于所有的CDRs。此外，針對Kabat或者AbM描述的實施方案中，CDRs還可以使用chothia高變環(huán)來實現(xiàn)。每個VH和VL一般都包括三種CDRs和四種FRs，從氨基端至羧基端按照下列順序排列：FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。

正如在本發(fā)明中所使用的，“免疫球蛋白可變區(qū)域序列”指的是一種氨基酸序列，其能夠形成一種免疫球蛋白可變區(qū)域的結(jié)構(gòu)。舉例來說，所述序列可包括一種天然存在的可變區(qū)域的氨基酸序列的全部或者一部分。例如，所述序列可包括或者不包括一種、兩種或者多種N-或者C-端氨基酸，或者可包括其它與所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)型相同的改變。

術(shù)語“抗原結(jié)合區(qū)域”指的是一種抗體分子的一部分，其包括形成一種結(jié)合E蛋白或其表位的界面的決定簇。針對蛋白質(zhì)(或者蛋白質(zhì)模擬物)，所述抗原結(jié)合區(qū)域典型地包括一種或多種環(huán)(至少了，例如，四種氨基酸或者氨基酸模擬物)，其形成了一種結(jié)合E蛋白質(zhì)的界面。典型地，抗體分子的抗原決定區(qū)域包括至少一種或兩種CDRs，或者更為典型地至少三種、四種、五種或者六種CDRs。

正如在本發(fā)明中所使用的，術(shù)語“單克隆抗體”或者“單克隆抗體組合物”指的是單一分子組合物的抗體分子制備物。一種單克隆抗體組合物表現(xiàn)出針對一種具體表位的單結(jié)合特異性和親和力。一種單克隆抗體能夠通過雜交瘤技術(shù)制備?；蛘咄ㄟ^不適用雜交瘤技術(shù)的方法(例如重組方法)制備。

一種“有效的人”蛋白指的是一種蛋白質(zhì)，其不能誘發(fā)中和抗體應(yīng)答，例如，所述人抗-鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。HAMA可以在許多情況下成為問題，例如，如果所述抗體分子被重復(fù)施用，例如在慢性或周期性的疾病狀況的治療中。HAMA應(yīng)答可能使?jié)撛诘闹貜?fù)抗體施用無效，其是由于從血清中增加的抗體清除(參見，例如，Saleh等人，Cancer Immunol.Immunother.，32:180-190(1990))以及還會由于潛在的過敏反應(yīng)(參見，例如，LoBuglio等人，Hybridoma，5:5117-5123(1986))。

所述抗體分子可以是一種多克隆抗體或者一種單克隆抗體。在一些實施方案中，所述抗體可以是重組制備，例如通過任何合適的噬菌體展示或者組合方法進(jìn)行制備。

本領(lǐng)域已知多種用于產(chǎn)生抗體的噬菌體展示或者組合方法(如在這里所描述的，例如，Ladner等人，U.S.Patent No.5，223，409；Kang等人，International Publication No.WO 92/18619；Dower et al.International Publication No.WO 91/17271；Winter等人，International Publication WO 92/20791；Markland等人，International Publication No.WO 92/15679；Breitling等人，International Publication WO 93/01288；McCafferty等人，International Publication No.WO 92/01047；Garrard等人，International Publication No.WO 92/09690；Ladner等人，International Publication No.WO 90/02809；Fuchs等人，(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等人，(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85；Huse等人，(1989)Science 246:1275-1281；Griffths等人，(1993)EMBO J 12:725-734；Hawkins等人，(1992)J Mol Biol 226:889-896；Clackson等人，(1991)Nature 352:624-628；Gram等人，(1992)PNAS 89:3576-3580；Garrad等人，(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等人，(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137；以及Barbas等人，(1991)PNAS 88:7978-7982，上述文獻(xiàn)的全部內(nèi)容已經(jīng)通過引用并入到本發(fā)明中)。

在一些實施方案中，所述抗體是一種完整的人抗體(例如，一種在小鼠中產(chǎn)生的抗體，其已經(jīng)被基因工程化從而從人免疫球蛋白序列產(chǎn)生一種抗體)，或者一種非人抗體，例如嚙齒類動物(小鼠或大鼠)、山羊、靈長類動物(例如猴子)、駱駝抗體。在某些實施方案中，所述非人抗體是嚙齒類動物(小鼠或大鼠)抗體。用于生成嚙齒類動物(小鼠或大鼠)的方法在本領(lǐng)域中是已知的。

人單克隆抗體能夠使用攜帶有人免疫球蛋白基因而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生。獲自這些用感興趣的抗原免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞可被用于制備雜交瘤，所述雜交瘤分泌對來自人蛋白的表位具有特異性親和性的人mAb(參見例如，Wood et al.International Application WO 91/00906，Kucherlapati et al.PCT publication WO 91/10741；Lonberg et al.International Application WO 92/03918；Kay et al.International Application 92/03917；Lonberg，N.et al.1994Nature 368:856-859；Green，L.L.et al.1994Nature Genet.7:13-21；M或者rison，S.L.et al.1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855；Bruggeman et al.1993Year Immunol 7:33-40；Tuaillon et al.1993PNAS 90:3720-3724；Bruggeman et al.1991Eur J Immunol 21:1323-1326)。

一種抗體可指的是那種，其中所可變區(qū)域或其部分，例如CDRs，是在非-人體組織(例如鼠或小鼠)中生成。嵌合的，CDR-移植的，及人源化的抗體也涵蓋在內(nèi)。在非人體組織(例如鼠或小鼠)中生成并且在之后進(jìn)行修飾(例如，在可變片段或恒定區(qū)中)從而降低在人體中抗原性的抗體，也涵蓋在內(nèi)。

嵌合抗體可以通過任何適合的重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備。其中的很多技術(shù)是本領(lǐng)域所公知的(參見Robinson et al.，International Patent Publication PCT/US86/02269；Akira，et al.，European Patent Application 184，187；Taniguchi，M.，European Patent Application 171，496；M或者rison et al.，European Patent Application 173，494；Neuberger et al.，International Application WO 86/01533；Cabilly et al.U.S.Patent No.4，816，567；Cabilly et al.，European Patent Application 125，023；Better et al.(1988Science 240:1041-1043)；Liu et al.(1987)PNAS 84:3439-3443；Liu et al.，1987，J.Immunol.139:3521-3526；Sun et al.(1987)PNAS 84:214-218；Nishimura et al.，1987，Canc.Res.47:999-1005；Wood et al.(1985)Nature 314:446-449；and Shaw et al.，1988，J.Natl Cancer Inst.80:1553-1559)。

一種人源化或者CDR-移植的抗體將具有用供體CDR替換的至少一種或兩種但通常所有三種受體CDRs(重免疫球蛋白鏈和/或輕免疫球蛋白鏈的)。所述抗體可以用至少一部分非人CDR進(jìn)行替換或者僅包含一部分的CDRs可以用非人CDRs進(jìn)行替換。只需要替換需要將人源化的抗體結(jié)合到EDIII的數(shù)量的CDRs。在一些實施方案中，所述供體將是嚙齒類動物抗體，例如，鼠或小鼠抗體，并且所述受體將是人框架或者人共有框架。典型地，所述提供CDRs的免疫球蛋白被稱為“供體”，并且提供框架的免疫球蛋白被稱為“受體”。在一些實施方案中，所述供體免疫球蛋白是非人的(例如，嚙齒類動物)。所述受體框架代表性地是一種天然存在(例如，人)的框架或者一種共有框架，或者序列大約85％或更高，例如90％、95％、99％或更高與其相同的框架。

正如在本發(fā)明中所使用的，術(shù)語“共有序列”指的是一種相關(guān)序列家族中最經(jīng)常出現(xiàn)的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(例如參見，Winnaker，F(xiàn)rom Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987))。在一種蛋白家族中，共有序列上的每一個位點都被該家族中該位點上最經(jīng)常出現(xiàn)的氨基酸所占據(jù)。如果兩個氨基酸出現(xiàn)的頻率相等，那么其中的任何一個氨基酸都可以包含在共有序列中。“共有序列”指的是共有免疫球蛋白序列中的框架區(qū)。

一種抗體可以通過任何合適的方法進(jìn)行人源化，其中其中某些方法在本領(lǐng)域中是已知的(例如參見，M或者rison，S.L.，1985，Science 229:1202-1207，by Oi et al.，1986，BioTechniques 4:214，and by Queen et al.US 5,585,089，US 5,693,761以及US 5,693,762，這些文獻(xiàn)的全部內(nèi)容已經(jīng)通過引用并入到本發(fā)明中)。

人源化或CDR-移植的抗體能夠通過CDR移植或者CDR取代進(jìn)行制備，其中免疫球蛋白鏈的一種、兩種或者全部CDR可以被取代。參見，例如，U.S.Patent 5，225，539；Jones et al.1986Nature 321:552-525；Verhoeyan et al.1988Science 239:1534；Beidler et al.1988J.Immunol.141:4053-4060；Winter US 5,225,539，這些文獻(xiàn)的全部內(nèi)容已經(jīng)通過引用并入到本發(fā)明中。Winter描述的是一種CDR移植方法，其可被用于制備人源化抗體(UK Patent Application GB 2188638A，filed on March 26，1987；Winter US 5,225,539)，該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容已經(jīng)通過引用并入到本發(fā)明中。

本發(fā)明還提供了人源化抗體，其中具體的氨基酸可以被取代、缺失或者添加。用于從供體中選擇氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)在例如，US 5,585,089，例如US 5,585,089的第12-16欄中進(jìn)行了描述，該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容已經(jīng)通過引用并入到本發(fā)明中。其它用于人源化抗體的技術(shù)在1992Ian12月23日公開的Padlan等人EP 519596A1中進(jìn)行描述。

所述抗體分子可以是一種單鏈抗體。一種單鏈抗體(scFV)可以被工程化(參見，例如，Colcher，D.et al.(1999)Ann N Y Acad Sci 880:263-80；和Reiter，Y.(1996)Clin Cancer Res 2:245-52))。所述單鏈抗體可以被二聚體化或多聚體化用于產(chǎn)生針對相同目標(biāo)蛋白對的不同表位具有特異性的多價抗體。

在一些實施方案中，所述抗體分子具有一種重鏈恒定區(qū)域，其選自例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD和IgE的重鏈恒定區(qū)；具體的，選自例如，IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的(例如，人)重鏈恒定區(qū)。在另一個實施方案中，所述抗體分子具有一種輕鏈恒定區(qū)，其選自，例如kappa或者lambda的(例如，人)輕鏈恒定區(qū)。所述恒定區(qū)能夠被改變，例如突變，從而對抗體的特性進(jìn)行修飾(例如增加或者降低一種或多種：Fc受體結(jié)合、抗體糖基化、半胱氨酸殘基數(shù)量、效應(yīng)器細(xì)胞功能、和/或補體功能)。在一些實施方案中，所述抗體具有效應(yīng)功能，并且能夠固定補體。在另一個實施方案中，所述抗體并不會回復(fù)效應(yīng)器細(xì)胞或者固定受體。例如，它可以是同位素或亞型、片段或其它突變體，其不支持結(jié)合到Fc受體，例如，它具有一個誘變的或缺失的Fc受體結(jié)合區(qū)。

所述抗體恒定區(qū)在一些實施方案中是被改變的。用于改變一種抗體恒定區(qū)的方法在本領(lǐng)域中是已知的。具有改變的功能的抗體，例如針對效應(yīng)器配體改變的親和性，例如，在細(xì)胞上的FcR，或者補體的C1成分可以通過用一種不同的殘基取代至少一種在抗體恒定區(qū)中的氨基酸殘基來制備(參見，EP 388，151A1，U.S.Pat.No.5，624，821和U.S.Pat.No.5,648,260，上述文獻(xiàn)的全部內(nèi)容已經(jīng)通過引用并入到本文中)。氨基酸突變，其穩(wěn)定了在人IgG4中的氨基酸結(jié)構(gòu)，如S228P(EU命名法，在Kabat命名法中為S241P)也涵蓋在范圍之內(nèi)。相似類型的改變將被描述如果應(yīng)用于小鼠，或者其它種類的免疫球蛋白將減少或者消除這些功能。

在一些實施方案中，在所述抗-登革抗體分子中的氨基酸是規(guī)范氨基酸。在一些實施方案中，所述抗-登革抗體分子包括天然產(chǎn)生的氨基酸；其類似物、衍生物和酮類物質(zhì)；具有變體側(cè)鏈的氨基酸類似物；和/或所有上述物質(zhì)中的任意一種的全部立體異構(gòu)體。所述抗-登革抗體分子可包括氨基酸的D或者L光學(xué)異構(gòu)體以及擬態(tài)。

抗-登革抗體分子的多肽可以是直鏈或者支鏈的，其可包括修飾的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中斷。所述抗體分子還可以被修飾，例如，通過二硫鍵的形成、糖基化、脂化、乙?；⒘姿峄?、或其它任何操作，例如與標(biāo)記組分共軛。所述多肽可以從天然來源中被分離，可以是通過重組技術(shù)從原核生物或真核生物宿主進(jìn)行制備，或者可以是一種合成方法的產(chǎn)物。

所述抗-登革抗體分子可單獨以為結(jié)合的形式使用，或者可以結(jié)合一種物質(zhì)，例如毒素或其部分(例如，一種治療藥物；化合物發(fā)射輻射；植物、真菌或細(xì)菌開元的分子；或者一種生物蛋白(例如一種蛋白質(zhì)毒素))或者顆粒(例如，一種重組病毒顆粒，例如通過病毒性外殼蛋白)。例如，所述抗-登革抗體可以耦合于放射性同位素，例如α-，β-，或γ-放射體，或者β-和γ-放射體。

抗體分子可衍生或者鏈接到另一種功能分子上(例如，其它的肽或蛋白質(zhì))。正如本發(fā)明所使用的，“衍生”抗體分子可以是已經(jīng)被修飾的。衍生化的方法包括，但不限于，熒光部分、放射性同位素、毒素、酶或親和配體如生物素的添加。因此，抗體分子包括本發(fā)明所述的衍生以及別的修飾形式的抗體，包括免疫粘附分子。例如，抗體分子可被功能性結(jié)合(通過化學(xué)結(jié)合、基因融合、非共價鍵聯(lián)合或其它方式)至一種或多種其它分子實體，例如其它抗體(例如，一種雙特異性抗體或者雙特抗體)、可檢測的試劑、毒素、藥物學(xué)試劑、和/或一種能接到抗體或抗體片段與另一種分子作用的蛋白質(zhì)或肽(例如鏈親和素核心區(qū)或多聚組氨酸標(biāo)簽)。

一些類型的衍生抗體分子可通過交聯(lián)兩種或多種抗體(相同類型的或者不同類型的，例如，從而構(gòu)成雙特異性抗體)制備。合適的交聯(lián)劑包括那些具有由適當(dāng)間隔區(qū)隔開的兩個不同反應(yīng)基團(tuán)的異型雙功能的(例如，間-馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯)或同型雙功能(例如，雙琥珀酰亞胺基辛二酸鹽)的交聯(lián)劑。這些交聯(lián)劑可以從Pierce Chemical Company，Rockf或者d，Ill買到。

能衍生(或標(biāo)記)抗-登革抗體分子的有用的可檢測試劑包括熒光化合物、各種酶、輔基、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、熒光發(fā)射金屬原子例如銪(Eu)、和其它鑭系元素、和放射性物質(zhì)(如下文中所述的)。代表性的熒光檢測試劑包括熒光素、異硫氰熒光素、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻紅蛋白等。一種抗體還可通過可檢測的酶，例如堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶，乙酰膽堿酯酶，葡萄糖氧化酶等等來衍生。當(dāng)利用可檢測的酶來衍生抗體時，可以通過加入另外的試劑，使酶利用加入的試劑產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)產(chǎn)物來進(jìn)行檢測。例如，當(dāng)可檢測試劑是辣根過氧化物酶時，加入過氧化氫和二氨基聯(lián)苯會產(chǎn)生可檢測的顯色反應(yīng)產(chǎn)物?？贵w分子還可以用輔基(例如，抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素)來衍生。例如，可以用生物素來衍生抗體，通過間接測定鏈親和素或親和素的結(jié)合來進(jìn)行檢測。合適的熒光材料的例子包括傘形花內(nèi)酯、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的例子包括魯米諾；生物發(fā)光材料的例子包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白。

標(biāo)記的抗體分子可以用于多種環(huán)境，例如可用于診斷和/或?qū)嶒?，包?i)利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如親和色譜或免疫沉淀來分離預(yù)定的抗原；(ii)為了評估預(yù)定的抗原(例如細(xì)胞裂解產(chǎn)物或血清樣品中的SARS病毒粒子)表達(dá)的豐度和方式對該蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測；(iii)作為臨床試驗程序的一部分，監(jiān)測組織中蛋白質(zhì)的水平，以確定約定的治療方案的療效。

可以將抗體分子與另一種分子實體偶聯(lián)，典型的情況是與標(biāo)記物，治療制劑(例如，細(xì)胞毒性制劑或抑制細(xì)胞生長的制劑)或半分子(moiety)偶聯(lián)。在診斷或治療應(yīng)用中可以使用放射性同位素。能與所述抗-登革抗體耦合的放射性同位素包括，但不限于，α-，β-或γ-發(fā)射源，或者β-和γ-發(fā)射源。所述放射性同位素包括，但不限于，碘(¹³¹I或¹²⁵I)、釔(⁹⁰Y)、镥(¹⁷⁷Lu)、錒(²²⁵Ac)、鐠、砹(²¹¹At)、錸(¹⁸⁶Re)、鉍(²¹²Bi或²¹³Bi)、銦(¹¹¹In)、锝(⁹⁹mTc)、磷(³²P)、銠(¹⁸⁸Rh)、硫(³⁵S)、碳(¹⁴C)、氚(³H)、鉻(⁵¹Cr)、氯(³⁶Cl)、鈷(⁵⁷Co或⁵⁸Co)、鐵(⁵⁹Fe)、硒(⁷⁵Se)或鎵(⁶⁷Ga)?？捎米髦委焺┑姆派湫酝凰匕ㄡ?⁹⁰Y)、镥(¹⁷⁷Lu)、錒(²²⁵Ac)、鐠、砹(²¹¹At)、錸(¹⁸⁶Re)、鉍(²¹²Bi或²¹³Bi)、和銠(¹⁸⁸Rh)?？捎米鳂?biāo)簽的放射性同位素，例如，例如在診斷中應(yīng)用，包括碘(¹³¹I或¹²⁵I)、銦(¹¹¹In)、锝(⁹⁹mTc)、磷(³²P)、碳(¹⁴C)、以及氚(³H)，或者一種或多種上述所列的治療同位素。

本發(fā)明提供了放射性標(biāo)記的抗體分子以及標(biāo)記所述抗體分子的方法。在一些實施方案中，公開了標(biāo)記抗體分子的方法。所述方法包括使抗體分子與螯合劑接觸，從而制備共軛的抗體。所述共軛抗體是用放射性同位素進(jìn)行放射性標(biāo)記，例如，¹¹¹銦、⁹⁰釔和¹⁷⁷镥，從而制備一種標(biāo)記的抗體分子。

正如在上文中所討論的那樣，所述抗體分子可被共軛至治療制劑。已經(jīng)提到了治療有效的放射性同位素。其它的治療制劑的實例包括抗-病毒制劑。

在一些方面，本發(fā)明提供了一種提供本發(fā)明所述的抗體分子的方法。所述方法包括：提供一種抗原，例如一種登革病毒E蛋白質(zhì)或其部分；得到一種特異性了解所述抗原的抗體分子；評估抗體分子，在調(diào)節(jié)抗原活性和/或有機體表達(dá)所述抗原方面的效力，例如登革病毒。所述方法可進(jìn)一步包括向受試者(例如，人)施用所述抗體分子，包括其衍生物(例如，一種人源化的抗

本發(fā)明提供了一種分離的核苷酸分子，其編碼上述抗體分子、載體及其宿主細(xì)胞。所述核苷酸分子包括，但不限于，RNA、基因組DNA以及cDNA。

動物模型

本發(fā)明所公開的抗體分子可以在動物模型中進(jìn)行評估。例如，動物模型可被用于檢測本發(fā)明所述描述的抗體分子在降低登革病毒感染、復(fù)制和/或傳播方面的功效。能夠被用于評估本發(fā)明所述的抗體分子的示例性動物模型包括，但不限于，AG129小鼠模型(例如，正如在Tharakaraman et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64；Johnson et al.J Virol.1999；73(1):783-6中所描述的)；非小鼠適應(yīng)的小鼠模型(例如，在Tan等人PLoS Negl Trop Dis.2010；4(4):e672中描述的非小鼠適應(yīng)的DENV-2D2Y98P小鼠模型)；人源化的小鼠模型(例如，在Sridharan等人，J Virol.2013；87(21):11648-58中描述的模型)；非人靈長類模型(例如，在Goncalvez等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2007；104(22):9422-7中描述的模型)；以及蚊蟲模型(例如，在Vu等人，PLoS Negl Trop Dis.2010；4(7):e757中描述的模型)。

所述AG129小鼠菌株，其同時缺少I型和II型干擾素受體，回的是一種動物模型，所述模型復(fù)制了在登革熱臨床病例中觀察到的某些疾病臨床表現(xiàn)，包括病毒血癥和其它病癥(Tharakaraman et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64；Johnson et al.J Virol.1999；73(1):783-6)。所述模型在抗病毒治療的評估中是有效的，并且能夠被用于證明原理研究。簡單地說，所述AG129(其在IFN-α/β和IFN-γ受體方面不足)小鼠用登革病毒進(jìn)行攻擊，并且使用一種候選的治療抗體分子。典型地，病毒血癥(在血液樣本中的病毒滴度)指的是實驗的終點。病毒血癥能夠用例如定量的RT-PCR進(jìn)行測量。在實施例10中描述了一種示例的AG129小鼠模型。

非小鼠適應(yīng)的小鼠模型可使用例如一種非小鼠適應(yīng)的DEN2病毒菌株(D2Y98P)進(jìn)行制備，其一經(jīng)腹腔內(nèi)施用在AG129小鼠內(nèi)是高度傳染的(Tan et al.PLoS Negl Trop Dis.2010；4(4):e672)。具有高劑量D2Y98P的感染誘導(dǎo)細(xì)胞因子、大規(guī)模器官損傷、以及嚴(yán)重的血管滲漏，導(dǎo)致在病毒血癥的高峰期時動物出血和快速死亡。具有低劑量D2Y98P的感染能夠?qū)е略谙嚓P(guān)氣管內(nèi)的無癥狀的病毒擴散和復(fù)制，然后在病毒清除幾天后動物非麻痹性死亡，與人體中的疾病運動相似。脾損傷、肝功能損害和血管通透性增加，但沒有出血，能夠在垂死的動物中觀察到，這表明未受損傷血管完整性，在登革休克綜合征中的一種基本功能。

人源化的小鼠模型能夠例如通過人CD34⁺胚胎肝細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到NOD-scid Il2rg^-/-(NSG)小鼠中來產(chǎn)生，其增進(jìn)了人血小板、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞的顯著水平(Sridharan et al.J Virol.2013；87(21):11648-58)。這些小鼠用登革病毒例如DENV血清型2(DENV-2)的感染能夠重現(xiàn)在人體內(nèi)登革病毒感染的某些性能特征，例如，瞬態(tài)白細(xì)胞減少和血小板減少。

非人靈長類模型可以例如在DENV攻擊后年幼恒河猴體內(nèi)進(jìn)行制備，如在oncalvez等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2007；104(22):9422-7中所描述的。感染猴子的病毒血癥滴度能夠通過例如定量PCR或焦點形成單位(CFU)檢測進(jìn)行確定。

蚊蟲模型也可以用于評估抗體針對登革熱病毒的抑制活性，例如，病毒感染的中和或者受試者和蚊子之間的傳輸?shù)臏p少。登革熱病毒是一種蚊蟲傳播的RNA病毒。某些登革熱病毒可以增加在體內(nèi)的適應(yīng)度優(yōu)勢，這可能導(dǎo)致較高可能性的人-到-蚊蟲傳播(Vu等人，PLoS Negl Trop Dis.2010；4(7):e757)。為了建立一個蚊子模型，含有病毒和抗體的血液可以被供給到蚊蟲。在蚊蟲腹部的病毒載量能夠通過qRT-PCR來測量。一種典型的蚊蟲模型在實施例13中進(jìn)行描述。

藥物組合物和試劑盒

在一些方面，本發(fā)明提供了組合物，例如藥學(xué)上可接受的組合物，其包括本發(fā)明所述的抗-登革抗體分子，與藥學(xué)上可接受的載體一起配制。正如在本發(fā)明中所使用的那樣，“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、等滲劑、吸收延遲劑等等。所述載體能夠適用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、胃腸外、直腸、脊柱或表皮施用(例如通過注射或輸注)。在某些實施方案中，在所述藥物組合物中少于大約5％，例如少于大約4％、3％、2％或1％，的抗體分子作為聚集體存在。在其它實施方案中，在所述藥物組合物中少于大約96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％或者更多的抗體分子作為單體存在。在一些實施方案中，抗體聚集體或者抗體單體的水平是通過色譜分析，例如，高效尺寸排阻色譜分析(HP-SEC)進(jìn)行確定的。

所述組合物可以有多種形式。例如，這些形式包括液體、半固體和固體劑型，如溶液(例如可注射和可輸注的液體)、分散劑或懸浮劑、脂質(zhì)體和栓劑。合適的形式取決于預(yù)期的施用方式及治療應(yīng)用。典型的合適組合物是注射和輸注溶液形式。施用的合適方式是胃腸外方式(例如，靜脈注射、皮下注射、腹膜注射、肌肉注射)。在一些實施方案中，所述抗體分子是通過靜脈輸注或者注射進(jìn)行施用。在某些實施方案中，所述抗體分子是通過肌肉注射或者皮下注射進(jìn)行施用。

本發(fā)明中所使用的短語“胃腸外施用(pareneral administration)”和“腸胃外地施用(administered parennterally)”指的是除腸內(nèi)和局部施用之外的施用方式，通常為注射方式，并且非限制性地包括靜脈、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬腦膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。

典型地治療組合物在制備和存儲過程中，通常必須是無菌并且穩(wěn)定的?？梢詫⒔M合物配制成溶液、微乳劑、分散劑、脂質(zhì)體或適合高抗體濃度的其它有序結(jié)構(gòu)形式。無菌注射溶液可通過將活性化合物(抗體或抗體部分)以所需的濃度在合適的溶劑中溶解后，與需要的其它聯(lián)用組分的一種或多種成分，然后進(jìn)行過濾除菌。通常，分散劑可通過將活性化合物與無菌載體混合后進(jìn)行制備，所述無菌載體含有基本分散介質(zhì)和其它上文所列的需要成分。對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉狀物，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，所述方法能夠產(chǎn)生所述活性成分與源自已無菌過濾的溶液的任何所需附加成分的粉狀物。溶液的流動性可通過一些方法來保持，例如，通過利用如卵磷脂這種涂層、通過在分散相的情況下保持所需顆粒的大小、以及通過使用表面活性劑。注射用組合物的延長吸收可以通過在所述組合物中包括延遲吸收的藥劑形成，例如硬脂酸鹽和明膠。

所述抗體分子可以通過多種方法進(jìn)行施用。一些是本領(lǐng)域所已知的，并且針對多種治療應(yīng)用，合適的施用途徑/方式是靜脈注射或者輸注。例如，抗體分子能夠以小于10mg/min的速率通過靜脈輸注進(jìn)行施用；優(yōu)選小于或等于5mg/min從而達(dá)到大約1到100mg/m²的劑量，優(yōu)選大約5到50mg/m²，大約7到25mg/m²并且更為優(yōu)選地大約10mg/m²。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的那樣，施用的途徑和/或方式取決于所希望達(dá)到的結(jié)果。在某些實施方案中，所述活性化合物可以用保護(hù)該化合物免于快速釋放的載體進(jìn)行制備，例如一種控釋劑型，包括植入物、透皮貼片、以及微膠囊化的遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到饩酆衔?、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于這些制劑的多種制備方法已被專利保護(hù)或通常被本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。參見，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New Y或者k，1978。

在某些實施方案中，抗體分子能夠例如與惰性稀釋劑或者可同化的可使用載體一起口服施用。所述抗體分子(以及其它成分，如果需要)也可以包在硬或軟的膠囊殼中，壓縮在片劑中或直接并入到受試者的飲食中。對于口服治療施用，所述抗體分子可以與賦形劑一起加入，并以可攝入的片劑、頰含片、糖錠、膠囊、酏劑、懸浮體、糖漿、糯米紙囊劑等形式使用。除胃腸外給藥外，在施用抗體分子時，可能需要用防止藥物的失活的某種材料來包裹所述化合物或共同給予所述化合物。治療組合物還能夠用醫(yī)療器械進(jìn)行施用，并且其中某些是本領(lǐng)域所公知的。

對給藥方案進(jìn)行調(diào)整從而提高所需的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以以單次劑量施用，也可以在一段時間內(nèi)以幾個分開的劑量進(jìn)行施用，或者所述劑量可以根據(jù)治療狀況所出現(xiàn)的緊急事件的預(yù)示來按比例進(jìn)行減少或增加。以劑量單元形式制備腸胃外組合物對于方便施用和劑量均勻性是尤其有利的。這里用到的劑量單位形式是指作為治療受試者的單位劑量的生理區(qū)分的單位；每個單位包含預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計算可以與要求的藥物載體協(xié)同作用，產(chǎn)生需要的治療效果。本發(fā)明對劑量單位形式的說明是依據(jù)(a)抗體的獨特性質(zhì)和要達(dá)到的特定治療或預(yù)防效果，和(b)不同個體對抗體治療敏感性的差異造成藥物配制的內(nèi)在局限性。

抗體分子的治療或預(yù)防有效量的示例性非限制的范圍是0.1-20mg/kg，更為優(yōu)選的1-10mg/kg。所述抗體分子可通過靜脈輸注進(jìn)行施用，其以小于10mg/min的速率，優(yōu)選小于或等于5mg/min，用以達(dá)到大約1到100mg/m²的劑量，優(yōu)選大約5到50mg/m²，大約7到25mg/m²，并且更為優(yōu)選大約10mg/m²。需要注意的是，劑量值可以隨著所要緩解的疾病的癥狀和類型進(jìn)行變化。還應(yīng)當(dāng)理解的是，對于任何特定的受試者而言，具體的劑量用法應(yīng)當(dāng)是隨時間根據(jù)個體需要以及管理或監(jiān)督組合物給藥的人員的專業(yè)判斷來調(diào)節(jié)的，并且在此給出的劑量范圍僅僅是示例性的，而不意在限制所要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵤?/p>

本發(fā)明所述的藥物組合物包括“治療有效量”或“預(yù)防有效量”的抗體分子?！爸委熡行Я俊敝傅氖窃诜脮r能在一定劑量下以及必要的時間段內(nèi)，有效地達(dá)到預(yù)期治療效果的有效劑量。治療有效量的改性抗體或抗體片段可根據(jù)多種因素而變化，例如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及抗體和抗體部分在所述個體中激發(fā)所述反應(yīng)的能力。治療有效量同時也指的是抗體分子治療效果要大于其帶來的任何毒性或有害性的劑量。與未治療者相比，“治療有效劑量”優(yōu)選抑制至少大約20％的可測量參數(shù)，更為優(yōu)選至少大約40％，甚至更優(yōu)選至少大約60％，并且仍然更為優(yōu)選至少大約80％。所述可測量參數(shù)可以是，例如，病毒載量、高熱、頭痛、肌肉或關(guān)節(jié)痛、皮膚紅疹、出血、降低的血小板水平、以及降低的血壓。可以用能預(yù)測抗體分子在登革病毒內(nèi)功效的動物模型系統(tǒng)來評估抗體分子抑制可測量參數(shù)的能力。可選擇的，組合物的這種特性能夠通過檢驗抗體分子用于中和登革病毒例如通過體外分析關(guān)注制劑的能力來進(jìn)行評估。

“預(yù)防有效量”指的是在必要的劑量下以及一段時間內(nèi)，有效地達(dá)到預(yù)防治療效果的有效劑量。通常，由于預(yù)防劑量是在疾病之前或早期用于受試者，因此預(yù)防有效量將會低于治療有效量。

在本發(fā)明中還公開了一種試劑盒，其包括本發(fā)明所述的抗體分子。所述試劑盒可包含一種或多種其它成分，所述成分包括：使用說明書；其它試劑，例如標(biāo)記物、治療制劑、用于螯合的試劑或其它將抗體偶聯(lián)到標(biāo)記物或治療制劑上的試劑、輻射防護(hù)組分；制備施用的SARS蛋白或抗體的裝置或其它材料；藥學(xué)上可接受的載體和給受試者施用藥物的裝置或其它材料。

核酸

本發(fā)明的特征還在于包含編碼本發(fā)明所述的抗-登革抗體分子的重鏈和輕鏈可變區(qū)域和CDRs的核苷酸序列的核酸。例如，本發(fā)明的特征在于分別編碼抗-登革抗體分子的重鏈和輕鏈可變區(qū)域的第一核酸和第二核酸，所述抗-登革抗體分子選自一種或多種本發(fā)明所述的抗體分子例如表1的抗體，或抗體的一部分例如表2的可變區(qū)域。所述核酸可以包括一種核苷酸序列，其可編碼在本發(fā)明所述表中的任意一種氨基酸序列，或者與其基本相同的序列(例如，與其有至少大約85％，90％，95％，99％或更多同一性的序列，或者與本發(fā)明表中所示的序列相異不超過3，6，15，30，或45個核苷酸的序列)。

在某些實施方案中，所述核酸可以包括一種核苷酸序列，其編碼來自重鏈可變區(qū)域的至少一種、兩種或三種CDRs，所述重鏈可變區(qū)域具有本發(fā)明表中所列的氨基酸序列或基本上與其同源的序列(例如，與其具有至少大約85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一種或多種取代，比方說保守取代)。在一些實施方案中，所述核酸能夠一種核苷酸序列，其編碼來自輕鏈可變區(qū)域的至少一種、兩種、或三種CDRs，所述輕鏈可變區(qū)域具有本發(fā)明表中所列的氨基酸序列或基本上與其同源的序列(例如，與其具有至少大約85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一種或多種取代，比方說保守取代)。在一些實施方案中，所述核酸可包括一種核苷酸序列，其編碼來自重鏈和輕鏈可變區(qū)域的至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種CDRs，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)域具有本發(fā)明表中所列的氨基酸序列或基本上與其同源的序列(例如，與其具有至少大約85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一種或多種取代，比方說保守取代)。

在某些實施方案中，所述核酸可以包括一種核苷酸序列，其編碼來自重鏈可變區(qū)域的至少一種、兩種或三種CDRs，所述重鏈可變區(qū)域具有本發(fā)明表5中所列的氨基酸序列或基本上與其同源的序列(例如，與其具有至少大約85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一種或多種取代，比方說保守取代)。在一些實施方案中，所述核酸能夠一種核苷酸序列，其編碼來自輕鏈可變區(qū)域的至少一種、兩種、或三種CDRs，所述輕鏈可變區(qū)域具有本發(fā)明表5中所列的氨基酸序列或基本上與其同源的序列(例如，與其具有至少大約85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一種或多種取代，比方說保守取代)。在一些實施方案中，所述核酸可包括一種核苷酸序列，其編碼來自重鏈和輕鏈可變區(qū)域的至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種CDRs，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)域具有本發(fā)明表5中所列的氨基酸序列或基本上與其同源的序列(例如，與其具有至少大約85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一種或多種取代，比方說保守取代)。

在某些實施方案中，所述核酸包括本發(fā)明表5中所列的核苷酸或者基本上與其同源的序列(例如，與其具有至少大約85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一種或多種取代，比方說保守取代)。在一些實施方案中，所述核酸包括本發(fā)明表5中所列的部分核苷酸或者基本上與其同源的序列(例如，與其具有至少大約85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一種或多種取代，比方說保守取代)。所述部分可編碼，例如，一種可變區(qū)域(例如，VH或VL)；一種、兩種、或三種或多種CDRs；或者一種、兩種、三種或四種或多種框架區(qū)域。

本發(fā)明所公開的核酸包括脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。所述多核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的，并且如果是單鏈則可能是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。核苷酸的序列可以通過非核苷酸成分進(jìn)行中斷。聚合后，可以對多核苷酸作進(jìn)一步修飾，如通過連接標(biāo)記組分。所述核苷酸可以是一種重組多核苷酸、或者基因組，cDNA，半合成或合成來源的多核苷酸，它們或不天然存在，或以非自然排列方式與其它多核苷酸連接。

在一些方面，本發(fā)明的特征在于含有本發(fā)明在此所述的核苷酸的宿主細(xì)胞和載體。所述核苷酸可存在于單個載體或者分離的載體中，所述載體存在于相同的宿主細(xì)胞或者分離的宿主細(xì)胞中，如下面將詳細(xì)描述的。

載體

本發(fā)明進(jìn)一步提供了載體，其包括編碼本發(fā)明所描述的抗體分子的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述載體包括編碼本發(fā)明所描述的抗體分子的核苷酸。在一些實施方案中，所述載體包括本發(fā)明所描述的核苷酸序列。所述載體包括，但不限于，病毒、質(zhì)粒、黏質(zhì)體、λ噬菌體、或者酵母菌人工染色體(YAC)。

可采用多種載體系統(tǒng)。例如，一類載體利用DNA元件，其衍生自動物病毒例如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或者SV40病毒。另一類載體利用RNA元件，其衍生自RNA病毒例如Semliki森林病毒，東方馬腦炎病毒和黃病毒。

此外，有DNA整合入其染色體的細(xì)胞可以通過引入一個或多個標(biāo)記來進(jìn)行選擇，所述標(biāo)記使得可選擇轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。所述標(biāo)記可為營養(yǎng)缺陷的宿主提供例如質(zhì)子轉(zhuǎn)移，抗微生物劑抗性，(例如，抗生素)，或者對重金屬如銅的抗性等等。可選擇的標(biāo)記基因可以直接連接至被表達(dá)的DNA，或者通過共轉(zhuǎn)化引入到同一細(xì)胞中。優(yōu)化mRNA的合成還可能需要其他的附加元件。這些元件可以包括剪接信號以及轉(zhuǎn)錄啟動子、增強子和終止信號。

一旦制備了用于表達(dá)的含有構(gòu)型的表達(dá)載體或DNA序列，便可以將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染/引入至合適的宿主細(xì)胞中。多種技術(shù)可被用于得到這種，例如，原生質(zhì)體融合，磷酸鈣沉淀，電穿孔，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，病毒轉(zhuǎn)染，基因槍，基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染或其它常規(guī)技術(shù)。在原生質(zhì)體融合的情況下，所述細(xì)胞在介質(zhì)中生長，并針對適當(dāng)活性進(jìn)行篩選。

依據(jù)本申請說明書，用于培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及用于恢復(fù)所生產(chǎn)的抗體分子的方法和條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，并且可以根據(jù)特異性表達(dá)載體和應(yīng)用的哺乳類宿主細(xì)胞進(jìn)行改變或優(yōu)化。

細(xì)胞

本發(fā)明還提供了含有核酸的宿主細(xì)胞，所述核酸編碼本發(fā)明所述的抗體分子。例如，所述宿主細(xì)胞可包括表5中的核酸，基本上與其同源的序列(例如，與其具有至少大約85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或能夠在本發(fā)明所描述的嚴(yán)格條件下雜交的能力)，或者所述核酸其中之一的一部分。此外，所述宿主細(xì)胞可包括編碼表2或表3的氨基酸序列的核酸，或基本上與其同源的序列(例如，與其具有至少大約85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列)，或者所述核酸其中之一的一部分。

在一些實施方案中，所述宿主細(xì)胞進(jìn)行基因工程化從而包括編碼抗體分子的核酸。

在某些實施方案中，所述宿主細(xì)胞通過使用一種表達(dá)盒進(jìn)行基因工程化。術(shù)語“表達(dá)盒”指的是核苷酸序列，其能印象基因在于這種序列相容的宿主中的表達(dá)。所述盒可以包括啟動子、具有內(nèi)含子或不具有內(nèi)含子的開放式閱讀框、以及終止信號。還可以使用影響表達(dá)必須的或優(yōu)異的額外因素，例如，誘導(dǎo)型啟動子。

本發(fā)明還提供了包括在這里所描述的載體的宿主細(xì)胞。

所述細(xì)胞可以是，但不限于，真核細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或人細(xì)胞。合適的真核細(xì)胞包括，但不限于，Vero細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、BHK細(xì)胞、以及MDCKII細(xì)胞。合適的昆蟲細(xì)胞包括，但不限于，Sf9細(xì)胞。

抗-登革抗體分子的應(yīng)用

本發(fā)明所公開的抗體分子具有在體外和在體內(nèi)進(jìn)行診斷、治療和預(yù)防的用途。在一些實施方案中，所述抗體分子中和中和登革病毒。例如，所述分子可以被施用于培養(yǎng)中的細(xì)胞，在體外和在體內(nèi)，或者施用于受試者，例如人受試者，例如在體內(nèi)，用于中和登革病毒。因此，在一些方面，本發(fā)明提供了一種治療受試者中登革病毒感染的方法，包括向受試者施用本發(fā)明所述的抗體分子，因而登革病毒感染被治療。例如，這些抗體分子可以被施用于培養(yǎng)中的細(xì)胞，在體外和在體內(nèi)，或者施用于受試者，例如在體內(nèi)，從而治療、預(yù)防、和/或診斷登革病毒感染。

正如在這里所使用的，術(shù)語“受試者”意欲包括人和非人動物。在一些實施方案中，所述受試者施人受試者，例如感染有登革病毒的人患者或者具有感染登革病毒風(fēng)險的人患者。術(shù)語“非人動物”包括哺乳動物或非哺乳動物，例如非人靈長類動物。在一些實施方案中，所述受試者是人。本發(fā)明所述的方法和組合物施用于治療感染有登革病毒的人患者。感染登革病毒的患者包括哪些已經(jīng)暴露于病毒但是(至少暫時地)無癥狀的患者、患有登革熱的患者、患有登革出血熱的患者、以及患有登革熱休克綜合征的患者。

治療登革病毒的方法

登革病毒顯示了在病毒表面上的E(包膜)蛋白質(zhì)。所述E蛋白有助于病毒附著至宿主細(xì)胞。所述E大白包括DI區(qū)域(九鏈的β桶)，以及DIII區(qū)域(胞外區(qū)域)。雖然不希望受理論的束縛，但是在一些實施方案中，本發(fā)明所述的抗體分子可銅鼓歐結(jié)合至其E蛋白DIII(EDIII)區(qū)域來綜合登革病毒，例如，通過預(yù)防病毒與宿主細(xì)胞融合、預(yù)防病毒連接至宿主細(xì)胞、擾亂E蛋白的結(jié)構(gòu)、或者去穩(wěn)定所述病毒。

登革熱是一種傳染病，通常為蚊傳播的，由登革病毒引起。初次感染之后通常是短暫的無癥狀期，通常為4-7天。有時感染的患者并不會出現(xiàn)任何登革熱癥狀。但是，在表現(xiàn)出登革熱的患者中，典型的癥狀是突發(fā)性發(fā)熱(有時超過40℃)、頭痛、肌肉和關(guān)節(jié)痛、皮疹。在所述感染的發(fā)熱階段，表現(xiàn)出發(fā)燒、疼痛和頭痛。在一些患者中，所述發(fā)熱階段之后是關(guān)鍵階段(與登革休克綜合征和登革出血熱有關(guān))，其中患者可能經(jīng)歷在胸腔和腹腔中積液，通過循環(huán)的流體的枯竭，供應(yīng)不足的血液至重要器官、以及出血。這之后為恢復(fù)階段。在一些實施方案中，本發(fā)明所述的抗體分子被施用于在無癥狀期、發(fā)熱階段、關(guān)鍵階段和/或恢復(fù)階段的患者。

登革病毒一般是依據(jù)體格檢查和患者報告的癥狀進(jìn)行診斷。一種可能的診斷能夠在患者表現(xiàn)出發(fā)燒以及選自惡心/嘔吐、皮疹、廣義疼痛、減少的白血細(xì)胞的水平或正止血帶試驗中的至少兩種癥狀下進(jìn)行。表明登革熱的其他試驗包括用于降低白血細(xì)胞數(shù)量的試驗、低的血小板水平的試驗、代謝性酸中毒試驗、來自肝的轉(zhuǎn)氨酶升高的水平試驗、血液濃縮試驗、血白蛋白減少試驗、通過超聲波檢測流體試驗(表明登革休克綜合征)、低于20毫米汞柱的脈壓試驗(表明登革休克綜合征)、延遲的毛細(xì)血管再充盈(表明周圍血管崩潰)。因此，在一些實施方案中，抗體分子被施用于滿足上述條件的患者。

本發(fā)明所描述的某些抗體分子能夠治療至少兩種、三種或四種登革病毒血清型。因此，在某些實施方案中，所述抗體分子被施用于感染有登革病毒或者具有感染登革病毒風(fēng)險的患者，當(dāng)沒有測試被執(zhí)行用于確定登革病毒的血清型，例如登革病毒的血清型可能是未知的。在一些實施方案中，所述登革病毒是血清型DV-1、DV-2、DV-3或DV-4。

所述抗體分子一般是以保持患者系統(tǒng)中抗體的治療有效量水平的頻率進(jìn)行施用，直至患者恢復(fù)。例如，所述抗體分子可以一種頻率進(jìn)行施用，所述頻率獲得一種可滿足至少大約1、2、5、10、20、30或40個抗體與每個病毒粒子結(jié)合的血清濃度。在一些實施方案中，所述抗體分子每1，2，3，4，5，6或7天進(jìn)行施用。

施用多種抗體分子的方法是本領(lǐng)域已知的并且在下文中進(jìn)行了描述。所使用的合適劑量的抗體分子將依據(jù)受試者的年齡和體重以及所使用的具體藥物。

所述抗體分子可就獨自進(jìn)行使用，或者耦合至第二制劑進(jìn)行使用例如抗-病毒制劑、毒素、或蛋白質(zhì)。例如一種第二抗登革抗體。這種方法包括：單獨施用抗體分子或與第二制劑耦合的抗體分子至需要所述治療的受試者。所述抗體分子可以被用于遞送多種治療劑，例如毒素或抗-病毒制劑或者它們的混合物。

聯(lián)合療法

所述抗-登革抗體分子可與其他的治療劑聯(lián)合使用。例如，所述聯(lián)合治療劑可以包括抗-登革抗體分子與一種或多種另外的治療劑，例如抗-病毒制劑(包括其他的抗-登革抗體)、疫苗(包括登革病毒疫苗)、或增強免疫應(yīng)答的制劑共同配置和/或共同施用。在另一個實施方案中，所述抗體分子與其他治療方案聯(lián)合施用，例如靜脈內(nèi)水合、退燒制劑(例如對乙酰氨基酚)，或輸血法。所述聯(lián)合療法可有利地施用更低劑量的所施用治療制劑，因而避免可能的毒性或與多種單個治療相關(guān)的并發(fā)癥。

在此所用的“聯(lián)合”施用指的是，在將兩種(或多種)不同治療遞送至受試者之前，或者指受試者在經(jīng)受病癥折磨期間。在一個實施方案中，兩種或多種治療進(jìn)行預(yù)防地遞送，例如，在所述受試者感染或診斷為登革病毒之前。在另一個實施方案中，所述兩種或多種治療可在受試者被診斷具有登革病毒滯后進(jìn)行遞送。在一些實施方案中，在一種治療的遞送仍在進(jìn)行時開始給與第二種遞送，所以存在重疊。有時這可參照本發(fā)明所述的“同時給予”或“并行(concurrent)給予”。在另一個實施方案中，一種治療的遞送在其他治療遞送開始之前結(jié)束。在任一情況的實施方案中，由于聯(lián)合施用因而所述治療更為有效。例如，第二治療更為有效，例如，較少量的第二種治療仍可見到相同效果、或者如與在第一治療缺少是施用第二治療相比，第二治療可更大程度降低癥狀、或者第一治療可見到類似的情況。在一些實施方案中，遞送可使所述癥狀降低，或者其他與病癥相關(guān)的參數(shù)比遞送一種治療而其他治療缺少時所見更大。所述兩種治療的效果可以部分地累加、全部地累加或者超過累加。這樣遞送可時遞送第一治療的效果在遞送第二治療時仍可檢測到。

所述抗-病毒制劑可以是，例如巴拉匹韋(balapiravir)、氯喹、西戈斯韋(celgosivir)、伊佛霉素、或者Carica folia。

所述疫苗可以是，例如，活的、衰減的、重組的登革血清型1、2、3和4病毒(例如，通過Sanofi Pasteur的臨床試驗NCT01488890)；CYD四階登革熱疫苗(例如，通過Sanofi Pasteur的臨床試驗NCT00730288)，嵌合的登革血清型(1、2、3、4)(例如，通過Sanofi的臨床試驗NCT00730288)，CYD登革熱疫苗(例如，通過Sanofi Pasteur的臨床試驗NCT00993447)，四價活衰減的登革熱疫苗(例如通過GlaxoSmithKline的臨床試驗NCT00322049)，四價登革熱疫苗(TVDV)(例如，根據(jù)美國陸軍醫(yī)學(xué)研究司令部資助的臨床試驗NCT01502358)，嵌合的四價登革熱(血清型1、2、3、4)(例如，通過Sanofi Pasteur的臨床試驗NCT00842530)，登革熱凍干疫苗(例如，通過Butantan Institute的臨床試驗NCT01696422)，ChimeriVax^TM四價登革熱疫苗(通過Sanofi的臨床試驗NCT00617344)，二價CYD-1，3登革熱(Vero)(例如，通過Sanofi Pasteur的臨床試驗NCT00740155)，二價CYD-2，4登革熱(Vero)(例如，通過Sanofi Pasteur的臨床試驗NCT00740155)，四價混合的VDV-2/CYD-1，3，4登革熱(Vero)(例如，通過Sanofi Pasteur的臨床試驗NCT00740155)，四價CYD-1，2，3，4登革熱(Vero)(例如，通過Sanofi Pasteur的臨床試驗NCT00740155)，rDEN1delta30或者rDEN2/4delta30(ME)(例如，通過國家急性和傳染性疾病研究院的臨床試驗NCT00458120)，修飾的活四價嵌合登革熱疫苗(SC或ID)(例如，通過國家急性和傳染性疾病研究院的臨床試驗NCT01110551)，登革熱病毒(例如，根據(jù)美國陸軍醫(yī)療裝備發(fā)展機構(gòu)的臨床試驗NCT00384670)，用于登革熱病毒子類型2的臨床研究性疫苗(例如，通過國家急性和傳染性疾病研究院的臨床試驗NCT01073306)，F(xiàn)17(例如，根據(jù)美國陸軍醫(yī)學(xué)研究司令部資助的臨床試驗NCT01843621)，轉(zhuǎn)然后的F17或者轉(zhuǎn)染后的F19(例如，根據(jù)美國陸軍醫(yī)學(xué)研究司令部資助的臨床試驗NCT00468858)，DENVax(例如，根據(jù)Inviragen Inc.的臨床試驗NCT01511250)，D1ME(登革熱-1前膜蛋白/鞘膜DNA疫苗)(例如，根據(jù)U.S.Army Office of the Surgeon General的臨床試驗NCT00290147)，用于DEN1的臨床研究性疫苗(例如，通過國家急性和傳染性疾病研究院的臨床試驗NCT01084291)，活衰減的四價登革熱疫苗(例如，根據(jù)沃爾特·里德陸軍研究所的臨床試驗NCT00350337)，rDEN4delta30-200，201(例如，通過國家急性和傳染性疾病研究院的臨床試驗NCT00270699)，TetraVax-DV-TV003或者rDEN2Δ30-7169(例如，通過國家急性和傳染性疾病研究院的臨床試驗NCT02021968)，TetraVax-DV任選混合(例如，通過國家急性和傳染性疾病研究院的臨床試驗NCT01436422)，DEN4候選疫苗(例如，通過國家急性和傳染性疾病研究院的臨床試驗NCT00919178)，rDEN4delta30-4995(例如，通過國家急性和傳染性疾病研究院的臨床試驗NCT00322946)，rDEN3delta30/31‐7164(例如，通過國家急性和傳染性疾病研究院的臨床試驗NCT00831012)，TDENV-PIV(例如，根據(jù)美國陸軍醫(yī)學(xué)研究司令部資助的臨床試驗NCT01502735)，rDEN3-3'D4delta30(例如，通過國家急性和傳染性疾病研究院的臨床試驗NCT00712803)，V180(例如，通過Merck Sharp&Dohme C或者p.的臨床試驗NCT01477580)，或者DEN1-80E(例如，通過Hawaii Biotech，Inc.的臨床試驗NCT00936429)。

其他的治療可以是，例如，高滲乳酸鈉、活化的重組人因子VII、或抗-d(例如，根據(jù)醫(yī)學(xué)教育和研究的研究生院的臨床試驗NCT01443247)。

在某些實施方案中，其他的抗-病毒制劑是一種第二抗-登革抗體分子，例如，與第一抗-登革抗體分子不同的抗-登革抗體分子。示例的能夠聯(lián)合施用的抗-登革抗體分子包括，但不限于，表1中所列的抗體的任意組合(例如，兩種或兩種以上的D88，F(xiàn)38，A48，C88，F(xiàn)108，B48，A68，A100，C58，C78，C68，D98，A11(也稱為單克隆抗體4E5A(Tharakaraman et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64))或者B11的任意組合)；單克隆抗體4E11(Thullier et al.，J Biotechnol.1999；69(2-3):183-90)；人抗體14c10(HM14c10)(Teoh et al.Sci Transl Med.2012Jun 20；4(139):139ra83)；人單克隆抗體1F4，2D22以及5J7(de Alwis et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2012；109(19):7439-44)；人單克隆抗體DV1.1，DV1.6，DV3.7，DV4.4，DV5.1，DV6.1，DV7.5，DV8.1，DV10.16，DV13.4，DV13.8，DV14.5，DV14.5，DV15.7，DV16.5，DV16.8，DV17.6，DV18.21，DV18.4，DV19.3，DV20.1，DV21.1，DV21.5，DV22.3，DV22.3LALA，DV23.13，DV25.5，DV27.2，DV28.1，DV28.8，DV34.4，DV35.3，DV38.1，DV51.6，DV52.1，DV53.4，DV54.7，DV55.1，DV56.12，DV54.7，DV57.4，DV59.3，DV60.3，DV61.2，DV62.5，DV63.1，DV64.3，DV65.5，DV66.1，DV67.9，DV68.2，DV69.6，DV70.1，DV71.1，DV74.4，DV75.9，DV76.5，DV77.5，DV78.6，DV79.3，DV82.11，DV82.11LALA，DV86.2，DV87.1，DV87.1LALA，DV90.3，DV257.13，DV291.7，DV415.8和DV470.12(Beltramello et al.，Cell Host Microbe.2010；8(3):271-83)；人單克隆抗體3-147，58/5，2F5，2G4，5F9，和135.3(Dejnirattisai et al.，Science.2010；328(5979):745-8)；mAb 2H12(Midgley et al.J Immunol.2012；188(10):4971-9)；人源化的單克隆抗體1A5(Goncalvez et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2007；104(22):9422-7)；以及人單克隆抗體1C19(Smith et al.，MBio.2013；4(6):e00873-13)；或者在下述文獻(xiàn)中公開的任意抗體：Lai，C.和Purcell，R的WO 05/056600(例如，抗體1A5和5H2)；Lanzavecchia，A.等人的WO2010/043977；Dimitrov等人的WO2013/173348；Macary等人的US2013/0259871；Fink等人的WO 2013/089647；Setthapramote等人的WO 2013/035345；Han-Chung Wu等人的US 8,637,035；或者Sasisekharan，R等人的WO 2014/025546；或者任意上述抗體的衍生物(例如，其人或人源化的形式)。

可以與本發(fā)明所述的抗-登革抗體聯(lián)合使用的其他的治療制劑包括，但不限于，例如，α-葡糖苷酶I抑制劑(例如，在Rath或者e et al.，Antiviral Res.2011；92(3):453-60中描述的西戈斯韋)；腺苷核苷抑制劑(例如，在Yin et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2009；106(48):20435-9中描述的NITD008)；NS3和/或其輔因子NS2B抑制劑(例如，阻斷結(jié)合NS3中口袋的NS2B的化合物，例如[5-氨基-1-(苯基)磺酰基-吡唑-3-基]化合物，如在Lescar et al.，Antiviral Res.2008；80(2):94-101中所描述的)；RNA-依賴的RNA聚合酶(RdRp)抑制劑(例如，在Noble et al.，J Virol.2013；87(9):5291-5中描述的NITD107)；宿主嘧啶生物合成抑制劑，例如，宿主二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)(例如，在Wang et al.，J Virol.2011；85(13):6548-56中描述的NITD-982和布喹那(brequinar))抑制劑；病毒性的NS4B蛋白質(zhì)抑制劑(例如，在Xie et al.，J Virol.2011；85(21):11183-95中描述的NITD-618)；以及亞氨基糖類(例如，在Perry et al.，Antiviral Res.2013；98(1):35-43中描述的UV-4)。

診斷方法

在一些方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測體外或體內(nèi)(例如，在受試者中想象的體內(nèi))登革病毒E蛋白存在的診斷方法(例如，在生物樣本中，例如血液樣本)。所述方法包括：(i)將樣本與本繁忙所述的抗體分子接觸，或者將抗體分子施用于受試者；(任選地)(ii)將參考樣本，例如對照樣本(例如，對照生物樣本，例如等離子體或血液)或?qū)φ帐茉囌吲c本繁忙所述的抗體分子接觸；以及(iii)檢測在抗體分子和樣本或受試者，或者對照樣本或受試者之間的復(fù)合體的形成，其中，相對于對照樣本或受試者，在樣本或受試者中的復(fù)合體的形成中的一種變化，例如，統(tǒng)計學(xué)上顯著的變化，表明在樣本中登革病毒的存在。所述抗體分子能夠直接或間接地用可檢測的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，從而促進(jìn)結(jié)合或未結(jié)合抗體的檢測。合適的可檢測的物質(zhì)包括多種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料和放射性材料，如上文和下面比較詳細(xì)的內(nèi)容所描述的那樣。

術(shù)語“樣本”，其指的是用于檢測多肽所使用的樣本，包括，單不限于，細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、蛋白質(zhì)或者細(xì)胞膜提取物、體液例如血液、或組織樣品。

在抗體分子和登革熱病毒蛋白質(zhì)之間的復(fù)合物構(gòu)型可以通過檢測或觀察結(jié)合到登革病毒蛋白的抗體分子或者未結(jié)合的抗體分子進(jìn)行檢測?？梢允褂萌魏魏线m的檢測試驗，并且常見的檢測試驗包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或組織免疫組織化學(xué)法。除標(biāo)記抗體分子之外，能夠在樣本中對登革病毒蛋白質(zhì)的存在進(jìn)行分析，通過用可檢測的物質(zhì)標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)與未標(biāo)記的抗體分子的競爭性免疫分析。在這種分析方法中，生物樣本，標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)以及抗體分子可進(jìn)行結(jié)合，并且確定結(jié)合到未標(biāo)記的結(jié)合分子上的標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)的量。在樣本中的登革病毒蛋白質(zhì)的量與結(jié)合到抗體分子的標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)的量成反比。

實施例

實施例1：抗-登革抗體的結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的設(shè)計

表位和模板鑒定

在登革病毒E蛋白質(zhì)二聚體內(nèi)存在多種中和表位。這些表位包括例如在EDI、EDII、EDIII、融合環(huán)、EDI/II鉸鏈以及EDIII“A”β-鏈中的區(qū)域。EDI和EDII在人體重視免疫顯性的，并且能夠誘導(dǎo)微弱中和但高度交叉反應(yīng)性的抗體。EDIII能夠誘導(dǎo)有效中和抗體。針對融合環(huán)的抗體，位于EDII中，通常表現(xiàn)出交叉血清型反應(yīng)性，但中和活性不強。針對EDI/II鉸鏈區(qū)域的抗體能夠表現(xiàn)出有效中和性，但是由于表位區(qū)域的低保守性因而通常是血清型特異性的。針對EDIII A-鏈的抗體通常部分由于所述區(qū)域到抗體的較高的可達(dá)性，但是通常具有限制的交叉血清型反應(yīng)性。

為了程式化一種廣泛活性的并且針對登革病毒具有高度有效的中和抗體，小鼠mAb 4E11可作為模板抗體，因為其會連接到EDIII A-鏈表位區(qū)域，并且表現(xiàn)出針對DENV-1，DENV-2和DENV-3的強效中和作用，同時對DENV-4不表現(xiàn)出強效中和作用。4E11對于DENV-4具有非常低的(μM)結(jié)合性。一種方法被用于增加的4E11與DENV-4的分子接觸，用來增加針對DENV-4DE親和力以及中和效力。要做到這一點。產(chǎn)生了，生成的具有EDIII的4E11結(jié)構(gòu)模型，然后進(jìn)行分析以確定4E11的血清型特異性結(jié)合決定因素。

技術(shù)和工具發(fā)展

用于蛋白質(zhì)工程的傳計算方法通常依賴于能量基礎(chǔ)方法。由這些方法所得到的結(jié)果通常對于在一種結(jié)構(gòu)或模型中精確的原子位置高度敏感，因此這些方法通常要求所述蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的高分辨率和特性的晶體結(jié)構(gòu)或相似的數(shù)據(jù)，用于準(zhǔn)確建模和優(yōu)異突變預(yù)測。此外，用于蛋白質(zhì)工程的傳統(tǒng)能量基礎(chǔ)方法通常不會包含抗體特異性特性和知識。

不同的方法是使用經(jīng)驗信息學(xué)，并且具體為殘基配對傾向法(Tharakaraman K.et al.(2013)Proc Natl Acad Sci U S A.23；110(17):E1555-64)。針對登革病毒的廣泛交叉反應(yīng)抗體工程是通過評估針對給定表位環(huán)境的抗體決定簇殘基的配對傾向(“適當(dāng)性”)進(jìn)行的，所述登革病毒具有光譜活性和增加的體內(nèi)效能。何種適合度矩陣基于抗體-抗原結(jié)構(gòu)經(jīng)驗數(shù)據(jù)，并且與其他的方法相比對于精確原子位置較不敏感。因此，這種方法可以有效用于增強抗體-抗原計算分子對接的準(zhǔn)確度，并且用于增加清河性-增強突變的預(yù)測以及對于親和性成熟的位置的識別。

應(yīng)用：針對結(jié)合所有四種DENV血清型的pM-nM的工程模型

制備4E11-EDIII結(jié)構(gòu)模型，并且對親和性-增強的突變/位置進(jìn)行預(yù)測。例如，在特異性位點上對個體突變進(jìn)行預(yù)測，并且對位置進(jìn)行選擇用于合理的、關(guān)鍵組合文庫的創(chuàng)立。正如在附圖23中所示，所產(chǎn)生的人源化抗體D88證明了，相對于抗體4E11，在對DENV1-3改善親和力的同事對DENV1-3的10，000倍的親和性增益。

4E11mAb A11與mAb 4E11的比較

在Tharakaraman et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64中提供了對于抗-登革抗體4E11(所述抗體在Thullier et al.，J Biotechnol.1999Apr 15；69(2-3):183-90進(jìn)行了描述)和A11(4E5A)二者之間的對比。與4E11相比，4E5A具有五個點突變，在A55E(VH)、R31K(VL)、N57E(VL)、E59Q(VL)和S60W(VL)(Tharakaraman et al.，2013，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64)上。

實施例2：De126提高DV-4中和活性

B11是一種抗-登革抗體，其與A11(4E5A)相比具有在框架1(FR1)中S26的重鏈缺失。4G2是一種對照抗-登革抗體。針對來自四種登革病毒血清型的EDIII的每一種抗體的中和活性是通過聚焦還原中和試驗(FRNT)進(jìn)行測試的。

當(dāng)?shù)歉锊《靖腥舅拗魇欠侵蘧G猴腎(Vero)細(xì)胞，所述聚焦還原中和試驗檢測所形成的病灶。簡單地說，抗體的稀釋物與等體積的稀釋的病毒進(jìn)行混合，并且將混合物轉(zhuǎn)移至非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞單層，并且檢測病灶。數(shù)據(jù)表示為相對傳染性。FRNT₅₀代表達(dá)到50％病毒中和作用所需要的抗體濃度。關(guān)于聚焦還原中和試驗更為詳細(xì)的協(xié)議可以在Tharakaraman et al.，2013，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64中找到。

附圖2的四個圖組顯示每種抗體針對登革病毒血清型的典型菌株的中和活性。附圖3是每種抗體針對登革病毒血清型DV-4的重復(fù)試驗。所述結(jié)果概括在附圖2底部的表中，其中顯示了每種抗體針對病毒(以)的IC50。

出乎意料的，在框架1區(qū)域中的一種氨基酸的缺失賦予在B11上的增加的DV-4中和活性。更為具體的，與具有的IC50的A11相比，抗體B11改善了DV-4的中和作用，得到的IC50。這些結(jié)果表明B11獲得比A11低大約8到大約12倍的IC50。根據(jù)B11優(yōu)異的中和活性，形成了B11的人源化變體。

實施例3：人源化的抗-登革抗體

附圖4描述了一些與A11和B11的相關(guān)的人源化抗體。對多種人源化框架進(jìn)行測試。最右邊的四列顯示了針對登革病毒血清型DV-1、DV-2、DV-4和DV-4的EDIII，每一種抗體的親和性。在重鏈FW3(將抗體B48+A98V與抗體B48相比)中的A98V突變改善將結(jié)合DV-4增加了大約5倍，但是維持或改善與其他血清型的結(jié)合。

實施例4：人源化的抗-登革抗體的回復(fù)突變

為了增強對于EDIII的抗體親和性，特別是在DV-4中，需要對選定的人源化抗體的重鏈N-端進(jìn)行多種回復(fù)突變。附圖5顯示出，D48，其是一種完整的N-端小鼠回復(fù)突變，相對于具有完整人源化N-端的抗體具有在親和性方面大約兩倍的提升。另外，回復(fù)突變導(dǎo)致針對EDIII-DV-4的類似的、略低的、或者略高的親和性。

在附圖5的上表和下表中的最右一列顯示了對于DV-4的人源化抗體親和力是在7.494和26.89nM之間。這種結(jié)合活性的保留表明存在一種相當(dāng)數(shù)量的用于N-末端區(qū)域突變的公差，例如在重鏈的位置1-6中。

實施例5：通過親和力增強的突變在抗體親和力方面的改進(jìn)

為了進(jìn)一步改善人源化抗體針對DV-4的親和力，可對多種親和力增強突變單獨或者組合測試。在附圖6中，對下述突變進(jìn)行測試：T33V，del26，G27A，G27Y，F(xiàn)28W，F(xiàn)28G，F(xiàn)28A和F28Y，全部在VH中。與單獨的T33V突變(在抗體C88中)相比，Del26和T33V一起(在抗體D88中)被發(fā)現(xiàn)可將對于EDIII-DV-4的親和力提升大約4倍。在抗體D88中發(fā)現(xiàn)的雙del26和T33V突變還使親和力提升至超過具有單獨的del26突變的抗體。在結(jié)合方面的這種附加的或協(xié)同的改進(jìn)是不期望的。

根據(jù)附圖6可以發(fā)現(xiàn)，顯然數(shù)個突變可以在不降低親和力或者僅在親和力上適度減少下進(jìn)行組合(例如，在抗體D118中的F28W和T33V，在抗體D98中的G27A和T33V，在抗體D148中的G27Y和T33V，在抗體108中的G27Y和F28W和T33V，以及在抗體D128中的G27A和F28W和T33V)。該實驗表明，所述抗體對在位置27和28上的取代具有一些抗性。

然后，測試在VH中位置98上的突變與其他突變的組合。原始人源化序列在位置98上具有A。附圖7顯示，相對于98S或98A，對于T33V突變而言，98V將DV-4的結(jié)合性提升了大約兩倍(參見表的上面三行)。所述表的下面三行顯示，對于雙突變del26+T33V而言，對于位置98的突變并不具有很大的影響。因此，所述抗體分子對殘基98的突變具有一些抗性。

實施例6：在人源化抗-登革抗體方面的其他結(jié)合性研究

檢測人源化抗-登革抗體結(jié)合來自登革病毒血清型DV-1、DV-2、DV-3和DV-4的EDIII的能力。附圖8顯示的是通過競爭ELISA分析確定的抗體親和力，以及附圖9顯示的是通過SPR確定的抗體親和力。當(dāng)所有的人源化抗體具有強親和力(例如，全部低于或等于24.35nM，并且多個出于位于亞納摩爾(sub-nanomolar)范圍內(nèi))時，一些抗體具有特別強的結(jié)合性。例如，C88和D88以超過C98大約20倍高的親和力結(jié)合至DV-1。附圖9中的對于DV-2和DV-3全部三種抗體具有大約相同的親和力。在附圖9中的抗體，對于DV-4，D88具有最強的親和力。

不僅在血清型之間存在登革病毒的遺傳和抗原多樣性，還在血清型中存在這樣的登革病毒的遺傳和抗原多樣性。為了更為徹底地研究抗-登革病毒抗體的結(jié)合寬度，進(jìn)行一系列的分析從而鑒定菌株序列組，所述一組菌株序列組進(jìn)一步捕獲登革病毒序列多樣性，尤其在EDIII中。首先，將登革病毒的>3，500E蛋白質(zhì)序列從NCBI GenBank中分離，用于分析在EDIII中的氨基酸多樣性。通過這種分析，確定21菌株EDIII序列組，并且對其進(jìn)行選擇用于更為完全地表達(dá)登革病毒多樣性。更為具體的，那些序列表達(dá)所有基因型，所述基因型具有來自主要流行地區(qū)(臨床相關(guān)菌株)的最近的循環(huán)和最近的分離株的證據(jù)。在任何可能的時候選擇挑戰(zhàn)性的分離株，例如，那些具有在表位區(qū)域附近或之內(nèi)的多樣性位置。此外，包括原型菌株。在附圖10A中總結(jié)了所述選定的21種登革病毒分離株組的EDIII氨基酸序列的親緣關(guān)系。在附圖10B中顯示了抗體D88結(jié)合二十一種不同的登革菌株的EDIII蛋白質(zhì)組的結(jié)果。正如在附圖10B中所示的，抗體D88表現(xiàn)出結(jié)合登革病毒的全部范圍。

實施例7：人源化的抗-登革抗體與來自多個血清型DV-2，DV-3和DV-4菌株的EDIII的結(jié)合

對D88(附圖11，最右列)和C88(從右數(shù)第二列)檢測其與從登革病毒多種菌株中分離的EDIII結(jié)合的能力。在最左邊的兩列中表明了所述菌株的血清型和地理位置。一般而言，所述抗體表現(xiàn)出一種好的結(jié)合性寬度，表明他們可能對廣泛的登革病毒菌株有效。

實施例8：人源化抗-登革抗體在一種聚焦還原中和試驗中中和登革病毒

人源化抗體具有在聚焦還原中和試驗中中和DV-1，DV-2，DV-3和DV-4的能力。在上文的實施例2中對所述分析進(jìn)行了描述。附圖12、13和14顯示了這些使用代表性的DV-3和DV-4菌株的實驗結(jié)果。在這些分析中人源化抗體在中和登革病毒方面是有效的。例如，與小鼠抗-登革抗體A11相比，A48、C98和D88取得了針對DV-1較低的EC50(附圖12)。附圖13顯示的是，抗體D88、D188和D128具有針對這種DV-3菌株的在426-506ng/ml范圍內(nèi)的EC50。此外，與小鼠抗-登革抗體A11相比，D88、D188和D128具有針對DV-4較低的EC50(附圖14)。人源化抗體還具備中和DV-1和DV-2的能力(數(shù)據(jù)并未顯示)。令人意想不到的是，人源化抗體將得到比小鼠抗-登革抗體較高的活性。至少部分地基于在這里所示的結(jié)合數(shù)據(jù)以及已知登革分離物的序列分析，如在本發(fā)明中所描述的人源化抗-登革抗體分子可能具有廣泛的中和能力，包括在這里所列的典型的登革病毒多樣性的那些菌株的所有血清型和基因型。

實施例9：人源化抗體的熱穩(wěn)定性是通過熱偏移分析測試

通過使用試劑Sypro或者ange的熱偏移分析對選定的人源化抗體的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。試驗結(jié)果記錄在附圖115A、15B和15C中。通常，人源化抗體顯示優(yōu)異的穩(wěn)定性，常常具備大約64到68之間的Tm。

實施例10：用于登革病毒的小鼠模型

在本發(fā)明中所描述的抗體分子可以在動物模型中進(jìn)行功效檢測。在Tharakaraman et al.，2013，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64中描述來了上述的一種模型，AG129小鼠模型。所述同時缺少I型干擾素受體和II型干擾素受體的AG129小鼠模型，是一種常用的動物模型，其可復(fù)制在登革熱臨床病例中觀察到的一些疾病臨床表現(xiàn)，包括病毒血癥和其他病癥。感染AG129的小鼠可能經(jīng)歷與在腦中DENV復(fù)制相關(guān)的神經(jīng)功能損傷，其僅僅會在感染有病毒的人患者中被罕見地觀察到。這往往導(dǎo)致在病毒攻擊大約18天后感染AG129的小鼠死亡((Stein，D.A.，et al.，J Antimicrob Chemother，2008.62(3):p.555-65.；Johnson AJ，Roehrig JT.J Virol.1999Jan；73(1):783-6)。盡管缺少與人感染的相似性，但是這種模式在抗病毒治療的評估中是有用的，并且能夠在原理研究的證據(jù)中使用。簡單地說，所述AG129(其缺少IFN-α/β和IFN-γ受體)小鼠受到登革病毒的攻擊，并且施用一種候選治療抗體分子。典型地，病毒血(在血液樣本中的病毒滴度)是實驗的終點。病毒血能夠用例如定量RT-PCR進(jìn)行測量。在這種研究中，病毒血癥、體重變化以及殘存物在用DENV-2的New Guinea C(NGC)株感染之后被作為疾病信號。在這個實施例中顯示的結(jié)果證明了在DENV-2小鼠模型中抗體D88的強體內(nèi)抑制活性。

將動物根據(jù)籠子區(qū)組隨機分配到組中，每一個中包含10個。在病毒攻擊前一天，用抗體D88、不相關(guān)的同種型匹配對照mAb(CmAb)或者安慰劑對動物進(jìn)行處理。將其中并沒有被病毒攻擊的一組小鼠用D88進(jìn)行處理，并且將其作為毒性對照。還將一組小鼠作為正常對照，并且并不對其進(jìn)行處理或者并不用病毒對其進(jìn)行攻擊，用于監(jiān)測處理和控制技術(shù)對免疫功能低下的AG129小鼠的效果。在最小必須培養(yǎng)基中制備病毒的10^-1稀釋液((10^6.8CCID₅₀(細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量50％)/ml)。將0.4ml的稀釋病毒(10^6.4CCID₅₀/動物)腹腔內(nèi)(i.p.)注射到小鼠。每天對死亡率進(jìn)行觀測共31天。在第0天對小鼠進(jìn)行稱重，并且在1dpi(感染后天數(shù))開始每隔一天對小鼠進(jìn)行稱重。在3dpi時從所有的動物中收集血清用于通過qRT-PCR量化病毒血。

附圖16顯示的是，在感染登革病毒之后，施用D88(25mg/kg)、D88(5mg/kg)、CmAb或PBS的小鼠生存率。如在附圖16中所示，大約90％的用25mg/kg的D88處理的小鼠以及大約60％的用25mg/kg的D88處理的小鼠存活至第31天，而用CmAb或PBS處理的對照小鼠全部在第17天或第17天之前死亡。

附圖17顯示的是，在感染登革病毒之后，施用D88(25mg/kg)、D88(5mg/kg)、CmAb或PBS的小鼠的平均體重變化。還對用D88(25mg/kg)或者PBS處理但是沒有感染登革病毒(模擬)的小鼠進(jìn)行測試。如在附圖17中所示，施用抗體D88的小鼠甚至在感染后31天都沒有顯著的體重變化，而施用CmAb或PBS的小鼠在第15天時有顯著的體重減輕。作為對照，用D88或PBS處理但是沒有感染登革病毒的小鼠則不會表現(xiàn)出表觀重量變化。

附圖18顯示的是，在登革病毒感染之后，在施用D88(25mg/kg)、D88(5mg/kg)、CmAb或PBS的小鼠中的病毒血滴度。結(jié)果以外推PFU每毫升以及基因拷貝數(shù)等同物(GCE)/ml進(jìn)行表達(dá)。P值<0.001的顯著性用符號***進(jìn)行表示。如在附圖18中所示，與用25mg/kg的D88或5mg/kg的D88的小鼠相比，施用CmAb(同種型對照)或PBS的小鼠具有較高的病毒血滴度。

這些結(jié)果表明，單一全身施用的抗體D88導(dǎo)致循環(huán)病毒滴度迅速減少?？贵wD88分別為在25mg/kg和5mg/kg下的9/10以及6/10的動物提供強有效的保護(hù)，繼續(xù)存在DENV-2致死攻擊?？贵wD88表明，感染3天之后在病毒滴度方面的顯著并劑量依賴的降低，病毒血峰天數(shù)。

實施例11.體內(nèi)針對ADE的保護(hù)

本發(fā)明所述的抗體分子可在動物模型中針對功效進(jìn)行測試。在Balsitis et al.，2010(Lethal antibody enhancement of dengue disease in mice is prevented by Fc modification，PLoS Pathogens，2010Feb 12；6(2):e1000790)中描述了一種這樣的模型，即在AG129小鼠中抗體增強的重癥登革病毒感染。簡單的說，在用登革病毒(例如D2S10)攻擊前1天，將登革病毒增強的抗體(例如，DV1抗血清或者4G2單克隆抗體)施用于AG129小鼠。在攻擊前(預(yù)防)1天或者攻擊后(治療)1或2天施用候選的抗體分子。代表性地，死亡率是實驗的重點；血清中的病毒血和炎癥性細(xì)胞因子(例如TNF-α)水平也可以作為端點。

實施例12.在昆蟲和哺乳動物細(xì)胞中繁殖的登革病毒血清型的中和。

在上文的實施例2中描述了通過聚焦還原中和試驗(FRNT)檢測了針對四種登革病毒血清型的人源化抗體的中和活性。在昆蟲細(xì)胞或者哺乳動物細(xì)胞中繁殖四種登革病毒血清型(DENV-1，DENV-2，DENV-3和DENV-4)，并且將其用于感染宿主Vero(猴子)細(xì)胞。附圖16-18顯示了這些具有典型DENV-1-4菌株實驗對的結(jié)果。數(shù)據(jù)代表了相對感染性。例如，所述EC₅₀或者FRNT₅₀值代表完成50％的病毒中和所需要的抗體濃度。正如在附圖16-18中所示，所述檢測的抗體在中和昆蟲和哺乳動物細(xì)胞中繁殖的DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4菌株方面是有效的。

附圖19顯示了抗體D88中和在C6/36昆蟲細(xì)胞中繁殖的DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4菌株。所述結(jié)果總結(jié)在附圖19的底部的表中，其中顯示了針對典型的DENV-1，DENV-2，DENV-3and DENV-4菌株(ng/ml)的EC₅₀值。對DENV-1菌株Hawaii/1944、DENV-2菌株New Guinea/1944(NGC)、DENV-3菌株P(guān)hilippines/1956(H87)、和DENV-4菌株Mexico/1997(BC287/97)進(jìn)行檢測。

附圖20顯示了抗體D88中和Vero細(xì)胞中繁殖的DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4菌株。所述結(jié)果顯示為針對典型的DENV-1，DENV-2，DENV-3and DENV-4菌株(ng/ml)的FRNT₅₀值。對DENV-1菌株Hawaii/1944、DENV-2菌株New Guinea/1944(NGC)、DENV-3菌株P(guān)hilippines/1956(H87)和DENV-4菌株Mexico/1997(BC287/97)進(jìn)行檢測。

附圖21顯示了抗體D88和A11中和Vero細(xì)胞中繁殖的DENV-4菌株H241。所述結(jié)果總結(jié)在附圖21的底部的表中，其中顯示了針對DENV-4菌株H241的抗體EC₅₀值。

這些結(jié)果表明抗體D88有效地中和了全部四種DENV血清型，EC50值<1μg/ml?？贵wD88有效地中和了所述攻擊的DENV-4菌株H241，其以100nM親和力結(jié)合。

實施例13.針對登革病毒的蚊蟲模型用于評估抗體的抑制活性。

本發(fā)明所述的抗體分子是在蚊蟲模型中對其功效進(jìn)行測試。登革病毒是一種蚊蟲傳播的RNA病毒。某些登革病毒能夠體內(nèi)顯示合適的優(yōu)勢，其可能導(dǎo)致較高的人-到-蚊蟲傳播可能性(Vu et al.，PLoS Negl Trop Dis.2010；4(7):e757)。為了構(gòu)建蚊蟲模型從而評估抗體針對登革病毒的抑制活性，將含有病毒的血液與在多種稀釋度下的抗體混合，并且在37℃下溫育30分鐘。將抗體-摻加的血液添加到蚊蟲喂食器中，并且喂養(yǎng)所述蚊蟲大約1個小時。對蚊蟲進(jìn)行冷麻醉，并且選擇充血的那些。在血液喂養(yǎng)7天后收集所述蚊蟲的腹部。病毒載量可通過qRT-PCR進(jìn)行測量。蚊蟲腹部感染的比例科能夠計算為感染腹部的數(shù)量除以PCR檢測的腹部的總數(shù)。

實施例14.抗-登革抗體的HP-SEC評價

使用高效尺寸排阻色譜(HP-SEC)分析用于評估在非變性、非壓力條件下的抗-登革抗體聚合傾向。這種方法考慮到抗體二聚物和來自單體的聚合物的區(qū)別。二聚物和聚合物可致使免疫原性增加的風(fēng)險。

在這種研究中，抗體被純化至1mg/ml，并且通過一種尺寸排阻柱，例如Phenomenex BioSep s3000，使用PBS作為流動相，流速為1ml/min。

附圖22顯示了抗體D88的典型的色譜圖，其顯示高于98％的呈現(xiàn)為單體的抗體(僅通過蛋白質(zhì)A色譜分析純化)。正如在附圖22的底部表中所總結(jié)的那樣，99.15％的抗體A48、98.37％的抗體C88以及99.59％的抗體D88在樣品中表現(xiàn)為單體。

通過引用的合并

在此所提到的所有出版物和專利的整體披露內(nèi)容在此作為參考被引用，如同對每個單獨出版物或?qū)＠M(jìn)行特定且單獨的說明從而作為參考引用所述出版物或?qū)＠粯印?/p>

等同方案

雖然本文論述了本發(fā)明在這里所述的組合物和方法多個特定實施方案，但上述說明僅僅具有例證性并不具備限制性。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，參考此說明書和下面的權(quán)利要求對本發(fā)明進(jìn)行很多變化是顯而易見的。本發(fā)明的全部范圍應(yīng)該由所附權(quán)利要求、等同實施方案的全部范圍、本發(fā)明說明書以及所述修改來決定。