本發(fā)明涉及來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干細(xì)胞及包含其的細(xì)胞治療劑。

背景技術(shù)：

最近生命工程將人類福利作為最終目標(biāo)來提供可解決糧食、環(huán)境、健康問題的新解決辦法，其中利用干細(xì)胞的技術(shù)正成為治療頑固性疾病的新篇章。以前為了治療人類的頑固性疾病而提出了臟器移植、基因治療等，但由于免疫排斥反應(yīng)和臟器供應(yīng)不足、載體研發(fā)或者缺少針對疾病基因的知識而無法有效地應(yīng)用。由此，提高了對干細(xì)胞的關(guān)注，從而認(rèn)識到具有通過增殖和分化可形成所有器官的能力的全能干細(xì)胞既能治療大部分的疾病又能從根本上解決臟器損害。并且，許多科學(xué)家們提出了通過使用干細(xì)胞既能實現(xiàn)人體的幾乎所有臟器再生又能治療帕金森病、各種癌、糖尿病和脊椎損傷等的多種可能性。

干細(xì)胞(stem cell)是指作為未分化的細(xì)胞具有自我復(fù)制能力及分化成兩個以上的互不相同種類的細(xì)胞的能力的細(xì)胞。干細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞學(xué)起源可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞來源于受精卵或者生成中的胎兒組織等，相反，成體干細(xì)胞來源于作為完成胎兒生長后的個體組織的骨髓、臍帶血、脂肪、胎盤、肌肉、滑膜、腦、肝、胰臟等。另一方面，由于胚胎干細(xì)胞存在道德上的限制，因此在使用為細(xì)胞治療劑的方面存在限制，但與此相反地，由于成體干細(xì)胞可主要從骨髓、脂肪、臍帶血及胎盤等獲取，從而不存在道德上的問題。

其中，在上述干細(xì)胞為來源于胎盤的干細(xì)胞的情況下，利用分娩后廢棄的胎盤，從而存在容易提取且可便于確保大量的干細(xì)胞的優(yōu)點。在上述干細(xì)胞為來源于脂肪或骨髓的干細(xì)胞的情況下，受到所要分離、提取的捐獻(xiàn)者的年紀(jì)或健康狀態(tài)等影響而在增殖力或分化能力等上有限制，而且變動性多，但在來源于胎盤的干細(xì)胞的情況下，作為成體干細(xì)胞中可最早獲取的干細(xì)胞，幾乎不受到根據(jù)捐獻(xiàn)者的年紀(jì)等的變數(shù)的干細(xì)胞干性影響，而且具有優(yōu)秀的增殖力及分化能力。并且，來源于胎盤的干細(xì)胞具有可分離能夠適用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝病、肌肉骨骼疾病等多種疾病的干細(xì)胞組的優(yōu)點。

由于上述的優(yōu)點，正積極進(jìn)行與來源于胎盤的干細(xì)胞相關(guān)的研究。例如，在韓國專利授權(quán)第818214號中公開了利用含N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC，N-acrtyl-L-cysteine)的培養(yǎng)基從羊膜或蛻膜分離干細(xì)胞的方法，在韓國專利授權(quán)第871984號中公開了利用含堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF，Basic Fibroblast Growth Factor)的培養(yǎng)基培養(yǎng)來源于羊膜、漿膜、底蛻膜及胎盤組織的干細(xì)胞的多分化能力。但是，目前為止未執(zhí)行針對來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

對此，本發(fā)明人為了在來源于胎盤的干細(xì)胞中也找到干細(xì)胞干性(stemness)更優(yōu)秀的干細(xì)胞而持續(xù)研究的結(jié)果，分離作為胎盤的整個滋養(yǎng)層(total chorionic trophoblast layer，tCT)中的與絨毛膜相連接的部位且作為相當(dāng)于約25％的厚度的組織層的滋養(yǎng)層基底層(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)，從而制備來源于上述滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了來源于上述滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞作為多能干細(xì)胞，與現(xiàn)有的來源于整個胎盤或其它組織的干細(xì)胞相比具有勻質(zhì)的生長特性、優(yōu)秀的增殖特性及分化特性，而且在組織缺損動物模型中具有優(yōu)秀的組織再生效果，由此完成了本發(fā)明。

并且，本發(fā)明的目的在于，提供來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干細(xì)胞。

本發(fā)明的另一目的在于，提供將來源于上述滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞或從上述干細(xì)胞分化的細(xì)胞作為有效成分包含的細(xì)胞治療劑及組織再生用組合物。

用于解決課題的方法

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干細(xì)胞。

并且，本發(fā)明提供將來源于上述滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞或從上述干細(xì)胞分化的細(xì)胞作為有效成分包含的細(xì)胞治療劑。

并且，本發(fā)明提供將來源于上述滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞或從上述干細(xì)胞分化的細(xì)胞作為有效成分包含的組織再生用組合物。

發(fā)明的效果

與現(xiàn)有的來源于整個胎盤或其它組織的干細(xì)胞相比，本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干細(xì)胞具有勻質(zhì)的生長特性、優(yōu)秀的增殖特性及分化特性，而且在組織缺損動物模型中具有優(yōu)秀的組織再生效果，從而可有效地用作細(xì)胞治療劑。

附圖說明

圖1為示出作為胎盤(Pla)的細(xì)微組織的絨毛膜(chorionic membrane，CM)、絨毛膜滋養(yǎng)層(chorionic membrane and chorionic trophoblast layer，CMT)、整個滋養(yǎng)層(total chorionic trophoblast layer，tCT)、滋養(yǎng)層上層部(upper portion of chorionic trophoblast layer，uCT)及滋養(yǎng)層基底層(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的剖面照片的圖。

圖2為示出通過顯微鏡觀察本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞的繼代培養(yǎng)之前(P0)與長時間繼代培養(yǎng)之后(P31)的細(xì)胞形態(tài)的照片(X100)的圖。

圖3為示出通過顯微鏡觀察來源于整個胎盤的干細(xì)胞的繼代培養(yǎng)之間(P0)的細(xì)胞形態(tài)與長時間繼代培養(yǎng)之后(P29)的細(xì)胞形態(tài)的照片(X100)的圖。

圖4為示出來源于整個胎盤、胎盤的各細(xì)微組織及其它組織的干細(xì)胞的群體倍增時間的圖。

圖5為示出來源于整個胎盤、胎盤的各細(xì)微組織及其它組織的干細(xì)胞的集落形成單位的圖。

圖6為示出本發(fā)明的用于確認(rèn)來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞的表面因子表達(dá)特性的流式細(xì)胞分析結(jié)果的圖。

圖7為示出用于觀察來源于整個胎盤、胎盤的各細(xì)微組織及其它組織的干細(xì)胞的分化成脂肪細(xì)胞(Adipogenesis)、軟骨細(xì)胞(Chondr ogenesis)或骨細(xì)胞(Osteogenesis)的程度的各染色結(jié)果的圖。

圖8為示出為了觀察來源于整個胎盤、胎盤的各細(xì)微組織及其它組織的干細(xì)胞的分化成軟骨細(xì)胞的程度而利用番紅O(Safranin-O)進(jìn)行染色后進(jìn)行定量化的結(jié)果的圖。

圖9為示出為了觀察來源于整個胎盤、胎盤的各細(xì)微組織及其它組織的干細(xì)胞的分化成軟骨細(xì)胞的程度而在進(jìn)行利用Ⅱ型膠原蛋白(Type II collagen)的免疫組織化學(xué)染色后進(jìn)行定量化的結(jié)果的圖。

圖10為示出為了觀察來源于整個胎盤、胎盤的各細(xì)微組織及其它組織的干細(xì)胞的分化成骨細(xì)胞的程度而利用堿性磷酸鹽(Alkaline phosphate)進(jìn)行染色后進(jìn)行定量化的結(jié)果的圖。

圖11為示出為了觀察來源于整個胎盤、胎盤的各細(xì)微組織及其它組織的干細(xì)胞的分化成骨細(xì)胞的程度而利用茜素紅S(Alizarin red S)進(jìn)行染色后進(jìn)行定量化的結(jié)果的圖。

圖12為示出為了觀察來源于整個胎盤、胎盤的各細(xì)微組織及其它組織的干細(xì)胞的分化成脂肪細(xì)胞的程度而利用油紅O(Oil red O)進(jìn)行染色后進(jìn)行定量化的結(jié)果的圖。

圖13為示出向軟骨損傷動物模型投入來源于臍帶血(UCB)的干細(xì)胞或來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞后通過蘇木精-伊紅(H&E)及番紅O(Safranin-O)染色確認(rèn)軟骨再生效果的結(jié)果的圖。

圖14為示出向軟骨損傷動物模型投入來源于臍帶血(UCB)的干細(xì)胞或來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞后通過利用國際軟骨修復(fù)學(xué)會(ICRS，International Cartilage Repair Society)宏觀評分(macroscopic score)的定量化確認(rèn)軟骨再生效果的結(jié)果的圖。

具體實施方式

以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明提供來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干細(xì)胞。

在本發(fā)明中，“干細(xì)胞”是指具有自我復(fù)制能力及分化成兩個以上的互不相同種類細(xì)胞的能力的細(xì)胞。干細(xì)胞根據(jù)分化能力可分為全能干細(xì)胞(totipotent stem cell)、多潛能干細(xì)胞(pluripotent stem cells)、多能(多功能)干細(xì)胞(multpotent stem cells)。

在本發(fā)明中，“全能干細(xì)胞(totipotent stem cells)”是指如下的細(xì)胞，即，作為具有可發(fā)育為一個完整的個體的全能的性質(zhì)的細(xì)胞，在完成卵子與精子的受精之后，使細(xì)胞直到8細(xì)胞期為止具有上述性質(zhì)，而且若分離上述細(xì)胞并移植于子宮，則可使上述細(xì)胞發(fā)育為一個完整的個體。在本發(fā)明中，“多潛能干細(xì)胞(pluripotent stem cells)”是指如下的細(xì)胞，即，作為可增殖為來源于外胚層、中胚層、內(nèi)胚層的多種細(xì)胞和組織的細(xì)胞，來源于位于在受精4～5日之后出現(xiàn)的胚泡(blastocyst)的內(nèi)側(cè)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass)，將其稱為胚胎干細(xì)胞，可分化成多種不同的組織細(xì)胞，但無法形成新生命體。在本發(fā)明中，“多能干細(xì)胞”是指只能分化成形成包含干細(xì)胞的組織及器官的特異性細(xì)胞的細(xì)胞。作為本發(fā)明的目的，優(yōu)選地，上述“干細(xì)胞”為多能干細(xì)胞。

在本發(fā)明中，“胎盤(placenta)”是指懷孕期間為了胎兒而形成的生物體內(nèi)組織，其呈重量為500～600g、直徑為15～20cm、厚度為2～3cm左右的圓盤形態(tài)。胎盤的一側(cè)與母體相接觸，另一側(cè)與胎兒相接觸，在上述胎盤中，在母體的血液與胎兒的血管之間實現(xiàn)營養(yǎng)及氧的傳遞。胎盤可大致分為羊膜、絨毛膜、蛻膜的3層，更詳細(xì)地，可分為羊膜上皮、羊膜、絨毛膜、滋養(yǎng)層、蛻膜。圖1簡要示出胎盤的剖面圖。

在本發(fā)明中，“滋養(yǎng)層基底層”是指作為位于絨毛膜與蛻膜之間的滋養(yǎng)層中的相當(dāng)于與絨毛膜相連接(相鄰)部位的20至30％厚度的組織，一般是指相當(dāng)于約5～6mm的厚度的組織層。

在本發(fā)明中，“滋養(yǎng)層”是指如下的組織，即，作為位于胚胞外部的胚胎的外胚層，將卵子附著于子宮壁且向胚胎提供營養(yǎng)成分。絨毛膜及羊膜來源于這種滋養(yǎng)層，滋養(yǎng)層的內(nèi)細(xì)胞層覆蓋絨毛，且稱之為細(xì)胞滋養(yǎng)層。

在本發(fā)明中，“絨毛膜”是指人體胚胎學(xué)中的胚胎體最外層的細(xì)胞性膜。

在本發(fā)明中，“蛻膜”是指在娩出后脫落的子宮的粘膜。

可通過如下的方法獲取本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞，即，向從胎盤分離的滋養(yǎng)層基底層組織添加酶溶液來進(jìn)行酶反應(yīng)，從而獲取細(xì)胞，并在添加有胎牛血清及抗生劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細(xì)胞，而不使用生長因子，然后進(jìn)行回收來獲取。上述酶包括胰蛋白酶(Trypsin)、膠原酶(collagenase)、分散酶(dispase)、脫氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)、蛋白酶(protease)、脂肪酶(lipase)、透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)及彈性蛋白酶(elastase)等，但并不限定于此。上述膠原酶包括膠原酶A、膠原酶Ⅰ、膠原酶Ⅱ、膠原酶Ⅲ或膠原酶Ⅳ等。

本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞具有如下的特征。

(a)成纖維細(xì)胞(fibroblastic cell)形狀的形態(tài)學(xué)特征。

(b)以實現(xiàn)25至30以上的繼代次數(shù)的方式可長時間增殖的能力。

(c)可分化成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或骨細(xì)胞的能力。

(d)集落形成能力。

(e)對CD44、CD73、CD90及CD105的陽性免疫學(xué)特性。

(f)對CD31、CD34、CD45及HLA-DR的陰性免疫學(xué)特性。

本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞可分化成互不相同種類的細(xì)胞，例如，可分化成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、韌帶細(xì)胞或肌腱細(xì)胞(tenocyte)等多種種類的細(xì)胞，但并不限定于此。

在本發(fā)明中，“分化(differentiation)”是指通常比較單一的系被分化成實質(zhì)上不同的兩種以上的部分系的現(xiàn)象，具體地是指細(xì)胞在通過分裂增殖來進(jìn)行生長的過程中使不同的結(jié)構(gòu)或功能特殊化的現(xiàn)象，即，生物的細(xì)胞、組織等為了執(zhí)行各自擔(dān)當(dāng)?shù)娜蝿?wù)而改變形態(tài)或功能的現(xiàn)象。相對地，“未分化”是指未發(fā)生上述的分化現(xiàn)象且還保持作為干細(xì)胞的特征的狀態(tài)。

分化干細(xì)胞的方法可根據(jù)現(xiàn)有的公知方法進(jìn)行，對其不進(jìn)行特別限定。例如，優(yōu)選地可使用如下的方法，即，通過在包含地塞米松(dexamethasone)、吲哚美辛(indomethacin)、胰島素及3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，3-isobutyl-1-methylxanthine)的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述干細(xì)胞來分化成脂肪細(xì)胞的方法；通過在包含地塞米松、骨形態(tài)生成蛋白-6(BMP-6，bone morphogenetic protein 6)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β，Transforming growth factor beta)、抗壞血酸(ascorbic acid)及L-脯氨酸(L-proline)的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述干細(xì)胞來分化成軟骨細(xì)胞的方法；在包含地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鹽(β-glycrophosphate)及抗壞血酸-2-磷酸鹽(ascorbic acid-2-phosphate)的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述干細(xì)胞來分化成骨細(xì)胞的方法等。

雖然不特別限定測定通過上述方法分化的來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的分化程度的方法，但可使用作為本領(lǐng)域公知的技術(shù)的流式細(xì)胞分析方法、免疫細(xì)胞化學(xué)方法、使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或基因表達(dá)圖譜來測定細(xì)胞表面標(biāo)記或形態(tài)的變化的方法、使用光學(xué)顯微鏡或共聚焦顯微鏡來觀察細(xì)胞的形態(tài)變化的方法、測定基因表達(dá)圖譜的變化的方法等，優(yōu)選地，可使用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、油紅O(Oil-red O)染色法、番紅O(Safranin O)染色法、Ⅱ型膠原蛋白(Type II collagen)免疫組織化學(xué)染色法，堿性磷酸鹽(ALP，alkaline phosphate)染色法或茜素紅S(Alizarin red S)染色法等。

與現(xiàn)有的來源于整個胎盤或其他組織的干細(xì)胞相比，本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干細(xì)胞具有勻質(zhì)的生長特性、優(yōu)秀的增殖特性及分化特性，而且在組織缺損動物模型中組織再生效果優(yōu)秀。

因此，本發(fā)明提供將來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞或從上述干細(xì)胞分化的細(xì)胞作為有效成分包含的細(xì)胞治療劑。

雖然并未特別限定被分化的上述細(xì)胞，但被分化的上述細(xì)胞包括脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、韌帶細(xì)胞、肌腱細(xì)胞等，而且可根據(jù)治療目的選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞。

本發(fā)明的術(shù)語“細(xì)胞治療劑(cellular therapeutic agent)”是指如下的醫(yī)藥品，即，作為從人類分離或者通過培養(yǎng)及特殊操作制備的細(xì)胞及組織而以治療、診斷及預(yù)防為目的使用的醫(yī)藥品(美國FDA規(guī)定)，為了復(fù)原細(xì)胞或組織的功能而在體外增殖篩選存活的自身細(xì)胞、同種細(xì)胞或異種細(xì)胞或者通過其他方法使細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生變化等的一系列操作，來使這些細(xì)胞適用于治療、診斷及預(yù)防疾病的目的。

本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞可用于使身體的組織或器官通過目的細(xì)胞群落例如干細(xì)胞或分化細(xì)胞群落的植入、移植或注入而被調(diào)整、強(qiáng)化、治療或替代的多種種類的治療方案。本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞可通過替代或強(qiáng)化存在的組織使其成為新的組織或發(fā)生變化的組織或者使其與生物學(xué)組織或結(jié)構(gòu)相結(jié)合。

優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)胞治療劑可用于治療軟骨損傷、軟骨缺陷、骨缺損、肌腱-韌帶缺損或脂肪組織缺損等。

在本發(fā)明中，“軟骨缺陷”是指身體內(nèi)的軟骨產(chǎn)生損傷、缺陷(defect)或不足的情況，例如，包括軟骨外傷、軟骨斷裂、軟骨軟化、軟骨壞死、骨軟骨炎、軟骨缺損或骨關(guān)節(jié)炎等，但并不限定于此。

并且，向關(guān)節(jié)內(nèi)投入本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞，從而治療關(guān)節(jié)軟骨的病變，或者，向肌腱或韌帶部位投入上述干細(xì)胞，從而可適用于治療或預(yù)防等的目的。例如，向關(guān)節(jié)、肌腱或韌帶部位投入本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞，從而實現(xiàn)針對上述組織的損傷部位的恢復(fù)或調(diào)整，而且可利用來源于本發(fā)明的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的軟骨組織結(jié)構(gòu)物等來源于干細(xì)胞的物質(zhì)，以使關(guān)節(jié)(例如，膝蓋關(guān)節(jié)等)的組織重組或再生等的方法進(jìn)行治療。

本發(fā)明的細(xì)胞治療劑的優(yōu)選劑量隨個體的狀態(tài)及體重、疾病的程度、藥物形態(tài)、給藥途徑及期間而異，但可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員選擇適當(dāng)?shù)膭┝俊＝o藥次數(shù)可以為一天一次，也可分次進(jìn)行給藥，上述劑量不管在任何方面都不限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(basal portion of chorionic trophoblast layer，bCT)的干細(xì)胞具有優(yōu)秀的增殖能力和分化能力，從而具有優(yōu)秀的組織再生效果。

因此，本發(fā)明提供將來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞或從上述干細(xì)胞分化的細(xì)胞作為有效成分包含的組織再生用組合物。

雖然未特別限定上述組織，但可包括軟骨、脂肪、骨、神經(jīng)、韌帶、肌腱等的組織。

上述軟骨包括透明軟骨(hyaline cartilage)、纖維軟骨(fibrocar tilage)或彈性軟骨(elastic cartilage)等，例如，可以為關(guān)節(jié)軟骨(ar ticular Cartilage)、耳軟骨、鼻軟骨、胳膊肘軟骨、半月板軟骨(men iscus)、膝蓋軟骨、肋軟骨、踝關(guān)節(jié)軟骨、氣管軟骨、喉軟骨或脊椎軟骨，但并不限定于此。

上述脂肪與體內(nèi)位置無關(guān)地包括所有脂肪，例如，皮下脂肪(subcutaneous fat)、位于腸胃間的脂肪(網(wǎng)膜(omentum)，腸系膜(mesentery))、骨髓脂肪(bone marrow fat)、腹膜后脂肪(retroperitoneal fat)等，但并不限定于此。

以下，通過下述實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。這些實施例僅用于詳細(xì)說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不限定于這些實施例。

實施例1：獲取來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞

胎盤是根據(jù)韓國三星首爾醫(yī)院臨床試驗倫理委員會指南從在韓國三星首爾醫(yī)院同意捐贈的剖腹產(chǎn)正常分娩的產(chǎn)婦收集的。將收集的胎盤組織放入被滅菌的容器并移動，在從胎盤組織去除羊膜后，利用經(jīng)過滅菌的手術(shù)鑷W和手術(shù)刀小心地分離相當(dāng)于位于絨毛膜(CM)與蛻膜(DC)之間的滋養(yǎng)層(tCT)中的與絨毛膜相連接(相鄰)的部位的約25％厚度(約5～6mm厚度)的滋養(yǎng)層基底層組織。將分離的滋養(yǎng)層基底層組織移動至150mm的盤后，利用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗8～10次，從而去除血液及血球細(xì)胞。將完成清洗的上述滋養(yǎng)層基底層組織移動至50ml的管后，投入添加有0.2％的膠原酶的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基，在37℃的溫度下，利用攪拌器反應(yīng)2～3小時，從而獲取來源于滋養(yǎng)層基底層的細(xì)胞。利用70μm的網(wǎng)過濾所獲取的來源于滋養(yǎng)層基底層的細(xì)胞，從而去除未分解的組織，在投入添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基后，在25℃的溫度下，以1000rpm離心分離4分鐘。在去除上清液后的所沉淀的細(xì)胞中投入不包含生長因子且添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基，在37℃的溫度下，在5％的CO₂條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在上述培養(yǎng)物中篩選附著于培養(yǎng)容器的底面的細(xì)胞，從而獲取來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞。

比較例1：獲取來源于其他組織的干細(xì)胞

1-1.獲取來源于整個胎盤的干細(xì)胞

切碎整個胎盤組織，利用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行清洗，從而從胎盤組織去除血液及血球細(xì)胞。向所清洗的上述胎盤組織投入添加有0.2％的膠原酶的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基，在37℃的溫度下，利用攪拌器進(jìn)行反應(yīng)，從而獲取胎盤細(xì)胞。利用70μm的網(wǎng)過濾所獲取的上述胎盤細(xì)胞，從而去除未分解的組織，在投入添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基后，在25℃的溫度下，以1000rpm離心分離4分鐘。在去除上清液后的所沉淀的細(xì)胞中投入不包含生長因子且添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基，在37℃的溫度下，在5％的CO₂條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在上述培養(yǎng)物中篩選附著于培養(yǎng)容器的底面的細(xì)胞，從而獲取來源于整個胎盤(Whole placenta，Pla)的干細(xì)胞。

1-2.獲取來源于胎盤細(xì)微組織的干細(xì)胞

從胎盤分別分離作為細(xì)微組織的絨毛膜(chorionic membrane，C M)、絨毛膜滋養(yǎng)層(chorionic membrane and chorionic trophoblast layer，CMT)、整個滋養(yǎng)層(total chorionic tropholast layer，tCT)及滋養(yǎng)層上層部(upper portion of chorionic tropholast layer，uCT)組織。更具體地，在整體胎盤組織中，利用經(jīng)過滅菌的手術(shù)鑷W和手術(shù)刀去除羊膜后，通過小心地去除蛻膜來分離絨毛膜滋養(yǎng)層，將其中的一部分重新分離成絨毛膜及整個滋養(yǎng)層。為了從上述整個滋養(yǎng)層組織分離滋養(yǎng)層上層部，利用經(jīng)過滅菌的手術(shù)鑷W和手術(shù)刀小心地分離相當(dāng)于除了上述實施例1的滋養(yǎng)層基底層之外的位于絨毛膜(CM)與蛻膜(DC)之間的整個滋養(yǎng)層(tCT)中的與蛻膜相連接(相鄰)的部位的約75％厚度的組織。將通過上述步驟分別分離的胎盤細(xì)微組織移動至150mm的盤后，利用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗8～10次，從而去除血液及血球細(xì)胞。將完成清洗的上述胎盤細(xì)微組織移動至50ml的管后，投入添加有0.2％的膠原酶的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基，在37℃的溫度下，利用攪拌器反應(yīng)2～3小時，從而分別獲取來源于絨毛膜、絨毛膜滋養(yǎng)層、整個滋養(yǎng)層及滋養(yǎng)層上層部的細(xì)胞。利用70μm的網(wǎng)過濾所獲取的各細(xì)胞，從而去除未分解的組織，在投入添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基后，在25℃的溫度下，以1000rpm離心分離4分鐘。向去除上清液后的所沉淀的細(xì)胞中投入不包含生長因子且添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基，在37℃的溫度下，在5％的CO₂條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在上述培養(yǎng)物中篩選附著于培養(yǎng)容器的底面的細(xì)胞，從而分別獲取來源于絨毛膜、絨毛膜滋養(yǎng)層、整個滋養(yǎng)層及滋養(yǎng)層上層部的干細(xì)胞。

1-3.分離來源于骨髓的干細(xì)胞

將骨髓(Bone Marrow)移動至50ml的管后，投入同量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行清洗，在25℃的溫度下，以2580rpm離心分離10分鐘。反復(fù)進(jìn)行2次上述清洗步驟后，將除去上清液后的所沉淀的骨髓懸浮于同量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)后(共5ml)，將上述溶液緩慢地移動至預(yù)先準(zhǔn)備的25ml的聚蔗糖(Ficoll)溶液后，在25℃的溫度下，以2580rpm離心分離30分鐘。在因密度差而分離的三個層中，僅分離位于中間層的細(xì)胞層并進(jìn)行清洗后，重新在25℃的溫度下，以2580rpm離心分離5分鐘。向通過上述步驟獲取的細(xì)胞中投入不包含生長因子且添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基，在37℃的溫度下，在5％的CO₂條件下進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲取來源于骨髓的干細(xì)胞。

1-4.分離來源于臍帶血的干細(xì)胞

將臍帶血(Umbilical Cord Blood)移動至50ml的管后，投入同量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行清洗，在25℃的溫度下，以2580rpm離心分離10分鐘。反復(fù)進(jìn)行2次上述清洗步驟后，將除去上清液后的所沉淀的臍帶血懸浮于同量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)后(共5ml)，將上述溶液緩慢地移動至預(yù)先準(zhǔn)備的25ml的聚蔗糖(Ficoll)溶液后，在25℃的溫度下，以2580rpm離心分離30分鐘。在因密度差而分離的三個層中，僅分離位于中間層的細(xì)胞層并進(jìn)行清洗后，重新在25℃的溫度下，以2580rpm離心分離5分鐘。向通過上述步驟獲取的細(xì)胞中投入不包含生長因子且添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基，在37℃的溫度下，在5％的CO₂條件下進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲取來源于骨髓的干細(xì)胞。

1-5.分離來源于脂肪或滑膜的干細(xì)胞

將脂肪(Adipose)或滑膜(Synovium)組織移動至150mm的盤后，利用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗2～3次，從而去除血液及血球細(xì)胞。在將上述脂肪或滑膜組織切成小塊后，將各組織移動至50ml的管，投入添加有0.2％的膠原酶的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基后，在37℃溫度的條件下，利用攪拌器進(jìn)行反應(yīng)，從而獲取脂肪或滑膜細(xì)胞。利用70μm的網(wǎng)過濾所獲取的上述脂肪或滑膜細(xì)胞，從而去除未分解的組織，投入添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基后，在25℃的溫度下，以1000rpm離心分離4分鐘。向去除上清液后的所沉淀的細(xì)胞中投入不包含生長因子且添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基，在37℃的溫度下，在5％的CO₂條件下分別進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲取來源于脂肪或滑膜的干細(xì)胞。

實施例2：繼代培養(yǎng)來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞

利用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗在上述實施例1中獲取的來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞后，每2～3日更換未包含生長因子且添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)。在上述干細(xì)胞生長80％以上的時點上實施TryPLE處理，并從培養(yǎng)容器分離干細(xì)胞，在以1/4的比率稀釋所分離的干細(xì)胞之后，以在其他培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)的方法進(jìn)行繼代培養(yǎng)。重復(fù)進(jìn)行如上所述的繼代培養(yǎng)，并測定不再進(jìn)行繼代培養(yǎng)的繼代次數(shù)(passage number)，用顯微鏡觀察繼代培養(yǎng)之前(P0)與長時間繼代培養(yǎng)之后的細(xì)胞形態(tài)。并且，利用在上述比較例1中獲取的來源于整個胎盤(Whole placenta，Pla)的干細(xì)胞，以相同的方法進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，用顯微鏡觀察繼代培養(yǎng)之前(P0)與長時間繼代培養(yǎng)之后的細(xì)胞形態(tài)。在圖2及圖3分別示出其結(jié)果。

如圖2所示，本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞具有繼代次數(shù)達(dá)到31的優(yōu)秀的增殖能力，從而確認(rèn)到可進(jìn)行長時間培養(yǎng)。

并且，如圖3所示，可確認(rèn)到來源于整個胎盤(Whole placenta，Pla)的干細(xì)胞從繼代培養(yǎng)初期呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞形狀的形態(tài)特性且混合有多個互不相同的形態(tài)的細(xì)胞，而不是一個形態(tài)。即，與圖2相比，在繼代培養(yǎng)前后，來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞僅特異性維持單一的細(xì)胞，但來源于整個胎盤的干細(xì)胞混合有互不相同形態(tài)的細(xì)胞。

實施例3：來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的集落形成能力分析

確認(rèn)了在上述實施例1中獲取的來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的群體倍增時間及集落形成能力。更具體地，以上述實施例2的方法對在上述實施例1獲取的來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)，在完成上述繼代培養(yǎng)的時點上，在100mm的盤分別接種(seeding)5×10³個后，在未包含生長因子且添加有胎牛血清及抗生劑的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基培養(yǎng)10日。測定從P2到P6的干細(xì)胞的數(shù)量變成兩倍所需的時間(群體倍增時間)，將所培養(yǎng)的上述干細(xì)胞為對象進(jìn)行吉姆沙染色法(Giemsa stain)，從而對形成在干細(xì)胞的群落進(jìn)行計數(shù)。并且，利用在上述比較例1中獲取的來源于整個胎盤、其它胎盤細(xì)微組織及其他組織的干細(xì)胞，以相同的方法測定群體倍增時間及集落形成能力。當(dāng)測定集落形成能力時，將來源于整個胎盤的干細(xì)胞的結(jié)果值作為100％進(jìn)行換算。在圖4及圖5分別示出其結(jié)果。

如圖4所示，確認(rèn)了本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞的群體倍增時間(population doubling time)明顯短于來源于整個胎盤、其它胎盤細(xì)微組織及其他組織的干細(xì)胞的群體倍增時間，從而細(xì)胞增殖更快。

并且，如圖5所示，確認(rèn)了與來源于整個胎盤、其它胎盤細(xì)微組織及其他組織的干細(xì)胞相比，本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞的集落形成能力明顯優(yōu)秀。

實施例4：來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的表面標(biāo)志分析

為了確認(rèn)在上述實施例1中獲取的來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的免疫學(xué)特性，而進(jìn)行了如下的實驗。首先，利用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞，實施TryPLE處理后，收集干細(xì)胞，并以1000rpm離心分離4分鐘。去除上清液后，為了抑制非特異性結(jié)合而添加2％的胎牛血清(FBS)及磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的混合液，清洗干細(xì)胞后，以1000rpm離心分離5分鐘。去除上清液后，將干細(xì)胞懸浮于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，并以1×10⁵cell分株于流式細(xì)胞儀專用圓底燒瓶。向其分別添加抗體(PE標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體，PE-conjugated mouse anti-human monoc lonal antibody)，在冰塊中孵化30分鐘后，以1000rpm離心分離5分鐘。重新除去上清液后，利用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行清洗，并以1000rpm離心分離5分鐘。反復(fù)進(jìn)行2次上述步驟。最后，去除上清液后，使干細(xì)胞單一化，并利用流式細(xì)胞儀(FACS)來分析免疫學(xué)特性。并且，利用相同的方法分析在上述比較例1中獲取的來源于整個胎盤、其它胎盤細(xì)微組織及其他組織的干細(xì)胞的免疫學(xué)特性。在表1及圖6示出了其結(jié)果。

表1

如表1及圖6所示，確認(rèn)到本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞對CD44、CD73、CD90及CD105呈現(xiàn)陽性的標(biāo)記因子表達(dá)特性，對CD31、CD34、CD45及HLA-DR呈現(xiàn)陰性的標(biāo)記因子表達(dá)特性。

實施例5：確認(rèn)來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的分化成軟骨細(xì)胞的能力

為了確認(rèn)在上述實施例1獲取的來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的分化成軟骨細(xì)胞的能力，而在公知的軟骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(包含有0.1μM的地塞米松、50μg/mL的抗壞血酸、40μg/mL的L-脯氨酸、10ng/mL的轉(zhuǎn)化生長因子-β3、500ng/mL的骨形態(tài)生成蛋白-6、50mg/ml的ITS通用型培養(yǎng)混合劑(ITS premix)的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基)中培養(yǎng)干細(xì)胞3周，從而誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞。為了測定上述干細(xì)胞的分化成軟骨細(xì)胞的程度，根據(jù)現(xiàn)有的公知的方法進(jìn)行利用番紅O(Safranin-O)染色及Ⅱ(Type II)型膠原蛋白的免疫化學(xué)染色法。并且，以相同的方法測定在上述比較例1中獲取的來源于作為整個胎盤、其它胎盤細(xì)微組織及其他組織的干細(xì)胞的分化成軟骨細(xì)胞的能力。在圖7至圖9示出其結(jié)果。

如圖7至圖9所示，確認(rèn)到與來源于整個胎盤、其他胎盤細(xì)微組織及其他組織的干細(xì)胞相比，本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞具有可更均勻地分化成軟骨細(xì)胞的優(yōu)秀的軟骨細(xì)胞分化能力。

實施例6：確認(rèn)來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的分化成骨細(xì)胞的能力

為了確認(rèn)在上述實施例1獲取的來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的分化成骨細(xì)胞的能力，而在公知的骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(包含有10％的胎牛血清(FBS)、1％的抗生素(anti-biotics)、100μM的地塞米松、50mM的抗壞血酸-2-磷酸鹽、10μM的β-甘油磷酸鹽、250μM的抗壞血酸的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基)中培養(yǎng)干細(xì)胞4周，從而誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞。此時，在開始分化誘導(dǎo)后經(jīng)過2周的時點上，根據(jù)現(xiàn)有的公知的方法通過堿性磷酸鹽(ALP，Alkaline phosphate)染色法進(jìn)行染色，經(jīng)過4周的時點上，根據(jù)現(xiàn)有的公知的方法通過茜素紅S(Alizarin red S)染色法進(jìn)行染色，從而分析分化成骨細(xì)胞的程度。并且，以相同的方法測定在上述比較例1中獲取的來源于整個胎盤、其它胎盤細(xì)微組織及其他組織的干細(xì)胞的分化成骨細(xì)胞的能力。在圖7、圖10及圖11示出其結(jié)果。

如圖7、圖10及圖11所示，確認(rèn)到與來源于整個胎盤、其他胎盤細(xì)微組織及其他組織的干細(xì)胞相比，本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞具有可更均勻地分化成骨細(xì)胞的優(yōu)秀的骨細(xì)胞分化能力。

實施例7：確認(rèn)來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的分化成脂肪細(xì)胞的能力

為了確認(rèn)在上述實施例1中獲取的來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞的分化成脂肪細(xì)胞的能力，而以3～4天為替換周期在公知的脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基1(包含有10％的胎牛血清(FBS)、1％的抗生素(Anti-biotics)、1μM的地塞米松、20μM的吲哚美辛、10μM的胰島素、50μM的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基)及脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基2(包含有10％的胎牛血清、1％的抗生素、10μM的胰島素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基)中培養(yǎng)干細(xì)胞3周，從而誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞。為了測定上述干細(xì)胞的分化成脂肪細(xì)胞的程度，根據(jù)現(xiàn)有的公知的方法進(jìn)行油紅O(Oil red O)染色。并且，以相同的方法測定在上述比較例1中獲取的來源于整個胎盤、其它胎盤細(xì)微組織及其他組織的干細(xì)胞的分化成脂肪細(xì)胞的能力。在圖7及圖12示出其結(jié)果。

如圖7及圖12所示，確認(rèn)到與來源于整個胎盤、其他胎盤細(xì)微組織及其他組織的干細(xì)胞相比，本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞具有可更均勻地分化成脂肪細(xì)胞的優(yōu)秀的脂肪細(xì)胞分化能力。

實施例8：驗證來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞在軟骨損傷動物模型中作為細(xì)胞治療劑的效果

為了驗證在上述實施例1中獲取的來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞在組織缺損動物模型中作為細(xì)胞治療劑的效果，而進(jìn)行了如下的實驗。更具體地，為了制作家兔(rabbit)關(guān)節(jié)軟骨損傷動物模型，而選擇健康的家兔，并根據(jù)體重利用適量的氯胺酮和甲苯噻嗪進(jìn)行注射麻醉后，確認(rèn)家兔完全被全身麻醉，在剃掉兩側(cè)下肢的膝關(guān)節(jié)部位的毛后，在維持姿勢的同時，使用醫(yī)用膠布進(jìn)行固定。使用聚維酮對兩側(cè)膝關(guān)節(jié)部位進(jìn)行消毒，通過觸摸確認(rèn)髕骨位置后，沿著經(jīng)過膝關(guān)節(jié)的上部及下部、髕骨的內(nèi)側(cè)的切割線通過旁正中入路(paramedian approach)到達(dá)膝關(guān)節(jié)內(nèi)，通過向外側(cè)掀動髕骨來彎曲膝關(guān)節(jié)，從而觀察關(guān)節(jié)內(nèi)部。在確認(rèn)無特別病理結(jié)果后，從髁間窩(interchondylar notch)的上端前端向上1mm的位置上用尖錐制作傷痕后，以其為中心利用鉆頭制作直徑為3mm且深度為5mm的孔，從而造成軟骨全層(full thickness)損傷。在造成如上所述的軟骨損傷8周和16周后，觀察損傷部位，從而確認(rèn)軟骨損傷部位未自然愈合。利用注射器混合透明質(zhì)酸和本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞后，向制作在上述動物模型的右側(cè)的軟骨損傷部位注入500μL的上述混合液(上述500μL的量為考慮到組合物的量的缺少或者手術(shù)時失誤的情況而為了手術(shù)的便利充分準(zhǔn)備的量)。然后，將髕骨復(fù)原至原來位置后，利用吸水性線縫合髕骨周圍的軟組織，而且利用非吸水性線縫合皮膚。作為陽性對照組，混合透明質(zhì)酸和來源于臍帶血的干細(xì)胞，并以與上述混合液相同量注入相對側(cè)腿。在確認(rèn)家兔從麻醉中醒來后，允許家兔可自由的移動，為了防止手術(shù)后5天之內(nèi)的感染而投入鎮(zhèn)痛劑和抗生劑。經(jīng)過8周和16周后，從各家兔獲取造成過損傷及進(jìn)行過治療的關(guān)節(jié)軟骨部位的切片，并進(jìn)行蘇木精-伊紅及番紅O(Safranin O)染色，通過利用國際軟骨修復(fù)學(xué)會(ICRS，International Cartilage Repair Society)宏觀評分(macroscopic score)的定量化分析新形成的軟骨。在圖13及圖14示出其結(jié)果。

如圖13及圖14所示，與注入來源于臍帶血的干細(xì)胞的組相比，注入本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞的組的新生成的軟骨細(xì)胞層的整體厚度為2倍以上。因此，確認(rèn)到來源于滋養(yǎng)層基底層(bCT)的干細(xì)胞在損傷的關(guān)節(jié)軟骨部位中能夠以優(yōu)秀的效率生成軟骨細(xì)胞，從而可有效地治療關(guān)節(jié)軟骨損傷。

通過上述實驗結(jié)果，可確認(rèn)到在現(xiàn)有的來源于整個胎盤的干細(xì)胞混合有來源于具有多種特性的細(xì)微組織的干細(xì)胞，從而無法實現(xiàn)均勻地分化成互不相同的細(xì)胞的能力，與其相反，本發(fā)明的來源于作為胎盤的細(xì)微組織的滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞在優(yōu)秀的分化能力和針對其他干細(xì)胞的多種特性的勻質(zhì)性的方面，與現(xiàn)有的來源于整個胎盤的干細(xì)胞相比，可實現(xiàn)優(yōu)秀的特性。尤其，與來源于作為其他胎盤細(xì)微組織的絨毛膜、絨毛膜滋養(yǎng)層、滋養(yǎng)層及滋養(yǎng)層上層部的干細(xì)胞相比，本發(fā)明的來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞在成長、增殖、形態(tài)及分化的特性方面呈現(xiàn)一致的模式，而且呈現(xiàn)最優(yōu)秀的干細(xì)胞的特性。因此，當(dāng)使用上述來源于滋養(yǎng)層基底層的干細(xì)胞時，可提高分化成所需要的細(xì)胞的效率，在多種疾病方面可有效地用作細(xì)胞治療劑。