本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒，以及其高通量快速提取瓊脂糖凝膠dna的方法。
背景技術(shù)：
：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，從電泳后瓊脂糖凝膠中回收、純化dna片段是最常用的技術(shù)之一，已經(jīng)有近40年的發(fā)展歷史。早期從瓊脂糖凝膠中回收dna的方法有低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、透析帶電洗脫法、deae纖維素膜紙片法等，這些方法都需要用到酚類、氯仿等有機(jī)試劑進(jìn)行抽提，然后用乙醇沉淀，操作過(guò)程往往耗時(shí)較長(zhǎng)，1份樣品花費(fèi)的時(shí)間就需要近2個(gè)小時(shí)，此類方法當(dāng)前已很少有人使用。后來(lái)，柱式法dna回收試劑盒的發(fā)展大大提高了dna回收工作的便利性。其主要原理為利用包埋有純化填料的純化柱對(duì)dna分子的吸附作用，將dna分子分離，再經(jīng)離心、洗滌、洗脫等步驟后實(shí)現(xiàn)對(duì)dna的回收工作，操作速度得到了大大提升。當(dāng)前，柱式法回收dna應(yīng)用廣泛，但也有其自身缺陷，比如柱式法不利于回收大片段dna，大片段dna容易被機(jī)械剪切力破壞，柱式法中頻繁的離心操作難以避免對(duì)大片段dna的破壞作用；另外，隨著基因測(cè)序產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，柱式法的操作速度又一次受到挑戰(zhàn)，雖然柱式法操作效率較早期的dna提取方法已經(jīng)有了大大提高，但依然需要在ep管中進(jìn)行操作，柱子需要頻繁轉(zhuǎn)出和轉(zhuǎn)入ep管、以及操作過(guò)程中需配合大量的離心工作，導(dǎo)致操作時(shí)間隨之增加，針對(duì)一個(gè)或幾個(gè)樣品其操作效率可以接受，但針對(duì)大規(guī)模高通量dna提取工作依然不理想。當(dāng)前，隨著基因測(cè)序領(lǐng)域的快速發(fā)展，單個(gè)項(xiàng)目需要處理的dna樣品數(shù)量就可以達(dá)到幾萬(wàn)、幾十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)個(gè)，柱式法dna提取方法已經(jīng)逐漸難以滿足日益龐大的樣品量對(duì)操作速度的迫切需求。近年來(lái)，因操作的便利性，磁珠法應(yīng)用在瓊脂糖凝膠dna提取中越來(lái)越受到關(guān)注。其原理為磁珠表面修飾有特殊化學(xué)基團(tuán)，在不同條件下可以對(duì)dna分子形成特異性吸附或者解吸附作用，再加上磁珠本身?yè)碛许槾判?，在外加磁?chǎng)作用下可方便、快捷的實(shí)現(xiàn)磁珠與目標(biāo)操作母液的分離。專利cn200910022810公開(kāi)了一種金磁微粒用于純化回收瓊脂糖凝膠中dna的方法，方法提到將切膠后膠塊放入ep管中，加入液溶膠后，再依次加入peg8000和300~800ug金磁微粒進(jìn)行dna吸附，再經(jīng)清洗和洗脫后獲得目標(biāo)dna。該金磁微粒用于純化回收瓊脂糖凝膠中dna的方法操作簡(jiǎn)便，其不足之處在于整個(gè)操作需在ep管中進(jìn)行，當(dāng)樣品量增多時(shí)，則純化耗時(shí)增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)人員的工作量明顯增加，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中人為誤差也隨之增大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供了一種磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒。該試劑盒可以從用tae或tbe制成的瓊脂糖凝膠中回收80bp及以上的dna片段，回收效率高達(dá)85%以上，并且所得dna產(chǎn)物純度優(yōu)良，可以直接應(yīng)用于測(cè)序、連接、酶切、標(biāo)記、pcr擴(kuò)增等下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的目的之二在于提供了一種磁珠法瓊脂糖凝膠dna高通量快速提取的方法。配合96孔板、96孔板用磁板架、96位磁棒爪、渦旋混合器、真空干燥箱等常規(guī)設(shè)備快速完成。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒，包括：溶膠結(jié)合液、磁珠分散液、清洗液ⅰ、清洗液ⅱ和洗脫液；所述溶膠結(jié)合液由nai或異硫酸氰胍，與醋酸鈉或醋酸鉀組成，ph值為5.1；所述磁珠分散液的磁珠采用內(nèi)核為超順磁性四氧化三鐵，表面包覆有硅羥基，直徑為200~800nm；所述清洗液ⅰ包括tris-hcl、edta和異丙醇；所述清洗液ⅱ為乙醇溶液；所述洗脫液為tris堿或去離子水；所述溶膠結(jié)合液中nai或異硫酸氰胍的濃度為5~7mol/l，醋酸鈉或醋酸鉀的濃度為0.02~0.05mol/l。優(yōu)選的由6mol/l的nai或者異硫酸氰胍、0.03mol/l的醋酸鈉組成；所述磁珠分散液濃度為20~40μg/ul，溶劑為蒸餾水。優(yōu)選的濃度為20μg/ul，直徑為500~550nm；所述清洗液ⅰ中tris-hcl的濃度為30~100mmol/l的，edta的濃度為6~20mmol/l，異丙醇為45%~65%。優(yōu)選的由40mmol/l的tris-hcl、10mmol/l的edta和50%(v/v)的異丙醇組成；所述清洗液ⅱ，乙醇溶液的濃度為70%~80%(v/v)。優(yōu)選濃度為80%的乙醇溶液(v/v)；所述洗脫液，tris堿的濃度為0.9~1.1mm。優(yōu)選1.0mm的tris堿溶液，ph值為8.0。上述試劑盒高通量快速提取dna的方法，包括以下步驟：步驟一：在紫外燈下，將電泳后的瓊脂糖凝膠中的dna條帶切下，膠塊質(zhì)量小于400mg，將膠塊放入96孔板樣品孔中；步驟二：用多通道自動(dòng)加液器向96孔板樣品孔中分別加入結(jié)合液，后將96孔板置于65℃水浴中溫?zé)嶂聊z塊完全溶化；步驟三：取出96孔板，用多通道自動(dòng)加液器，向96孔板中分別加入磁珠分散液，之后將96孔板置于渦旋混合儀上900rpm振蕩5分鐘后，將96孔板放置到96孔板用磁板架上靜置20秒，保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣棄去上清液，然后呈倒扣狀置于吸水紙上，徹底去除上清液；步驟四：將96孔板從磁板底座上取下，用多通道自動(dòng)加液器向樣品孔中分別加入清洗液ⅰ，之后將96孔板置于渦旋混合儀上900rpm振蕩25秒，將96孔板重新放置于磁板架上靜置20秒，保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣棄去上清液，然后呈倒扣狀置于吸水紙上，徹底棄去上清液；用清洗液ⅱ重復(fù)以上清洗操作兩次；步驟五：將清洗完畢的96孔板連同磁板架一起置于45℃真空烘箱中真空干燥8分鐘，取出96孔板，用多通道自動(dòng)加液器向樣品孔中分別加入洗脫液，將96孔板置于渦旋混合儀上900rpm振蕩1分鐘；步驟六：將96孔板從渦旋混合儀上取下，向96孔板中準(zhǔn)確插入已經(jīng)裝入磁爪套的96位磁棒爪，靜置20秒，從96孔板中移出磁棒爪，棄磁珠，獲得目標(biāo)dna產(chǎn)物于澄清洗脫液中。96孔板為市售2.2ml的標(biāo)準(zhǔn)96孔圓孔板或圓底方孔板；96孔板用磁板架、96位磁棒爪為配套96孔板使用的磁性分離裝置，對(duì)超順磁性納米材料通過(guò)外加磁場(chǎng)快速吸附聚集；渦旋混合器為市售96孔pcr板用高速渦旋混合器，渦旋速率大于1500轉(zhuǎn)/分。96孔板用磁板架，上面安裝有按照4x6排列的24根3mmx3mm的磁棒，磁棒高度為6~8mm，從背面插入到96孔板后，可在20秒內(nèi)將對(duì)樣品孔中磁珠實(shí)現(xiàn)磁場(chǎng)吸附聚集，所述96位磁棒爪，配合磁棒套插入到96孔板后，可在20秒內(nèi)對(duì)樣品孔中磁珠進(jìn)行吸附，并將磁珠快速轉(zhuǎn)移出洗脫液。本申請(qǐng)創(chuàng)新性的配合96孔板、96孔板用磁板架、96位磁棒爪、渦旋混合器共同完成，使得從瓊脂糖凝膠中提取dna的工作可以直接在96孔板中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各緩沖試液的加液可以使用多通道自動(dòng)加液器進(jìn)行快速操作，一塊96孔板可進(jìn)行96份樣品的dna提取工作，使用該試劑盒以及高通量方法，單個(gè)實(shí)驗(yàn)人員同時(shí)操作6塊96孔板的情況下，僅需要約70~80min，即可完成576個(gè)樣品的dna提取工作。本發(fā)明的有益效果：（1）dna提取回收率高，可達(dá)85%以上。該方法基于磁珠法開(kāi)發(fā)，磁珠表面修飾有可以對(duì)dna進(jìn)行特異性吸附的化學(xué)基團(tuán)，在高鹽、低ph值下可以實(shí)現(xiàn)快速吸附，在低鹽、高ph值下又可以快速解離，dna提取回收率高，可達(dá)85%以上。（2）操作簡(jiǎn)潔。在配合96孔板用磁板架和96位磁棒爪的使用，使得從瓊脂糖凝膠提取dna的工作可以直接在96孔板中進(jìn)行，不需要樣品的轉(zhuǎn)移，96孔板每個(gè)樣品孔可以進(jìn)行一份dna樣品的提取實(shí)驗(yàn)，一塊板可以同時(shí)進(jìn)行96個(gè)dna樣品的提取操作，方便了電動(dòng)移液槍的自動(dòng)加液。（3）可以高通量、大規(guī)模提取，工作效率大幅提高。該試劑盒配合高通量操作方法，操作簡(jiǎn)潔高效，單個(gè)實(shí)驗(yàn)人員同時(shí)操作6塊96孔板的情況下，僅需要約70~80min，即可完成576個(gè)樣品的dna提取工作，且出錯(cuò)率極地。（4）該方法所需實(shí)驗(yàn)器材簡(jiǎn)單，成本低，有明顯經(jīng)濟(jì)效果。對(duì)比使用當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的柱式法進(jìn)行576個(gè)dna樣品的提取實(shí)驗(yàn)，或者配合甩板離心機(jī)等昂貴設(shè)備，依然需要大于4.5小時(shí)方可完成；或者使用柱式法，操作人員進(jìn)行如此數(shù)量樣品量操作，需花費(fèi)大量時(shí)間用于柱子轉(zhuǎn)入和轉(zhuǎn)出ep管的操作，工作將非常繁忙，容易產(chǎn)生誤差。因此，該發(fā)明提供的磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒及高通量快速提取方法，工作效率得到了大幅度提升，非常適合進(jìn)行高通量實(shí)驗(yàn)。附圖說(shuō)明圖1是實(shí)施例1中從瓊脂糖凝膠中提取600bpdna產(chǎn)物的電泳膠圖（a1-a2：axygen柱式法對(duì)照；y1-y4：4份平行測(cè)試樣本）。圖2是實(shí)施例2中從瓊脂糖凝膠中高通量提取96份600bpdna產(chǎn)物的電泳膠圖。具體實(shí)施方式基于上述試劑盒中各溶液優(yōu)選的參數(shù)，結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：實(shí)施例1：磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒：磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒包括：溶膠結(jié)合液：ph值為5.2、6m的nai、和0.03m的醋酸鈉的混合溶液。具體配制方法：稱取90g碘化鈉和0.25g醋酸鈉，加入足夠蒸餾水進(jìn)行充分溶解，繼續(xù)加入蒸餾水定容到100ml，用冰醋酸調(diào)節(jié)ph值至5.2。磁珠分散液：濃度為20μg/ul的磁珠混懸液，磁珠內(nèi)核為四氧化三鐵(fe3o4)，表面包覆了sio2層。具體配制方法：稱取2g磁珠，加入到100ml蒸餾水中，超聲分散均勻。清洗液?。?0mm的tris-hcl、10mm的edta和50%(v/v)的異丙醇水溶液。具體配制方法：稱取0.63gtris-hcl和0.29gedta，加入足夠50%(v/v)的異丙醇水溶液進(jìn)行充分溶解，繼續(xù)加入50%(v/v)的異丙醇水溶液定容到100ml。清洗液ⅱ：80%(v/v)的乙醇溶液。洗脫液：1mm的tris堿水溶液，ph值為8.0。具體配制方法：稱取12mgtris堿，加入足夠蒸餾水進(jìn)行充分溶解，繼續(xù)加入蒸餾水定容到100ml，用濃鹽酸調(diào)節(jié)ph值至8.0。600bpdna片段的瓊脂糖凝膠dna提取，并與axygen柱式法對(duì)比。步驟一：樣品準(zhǔn)備取6ul濃度為50ng/ul的600bpdna片段，用1%的瓊脂糖凝膠在tae緩沖液中進(jìn)行電泳，電泳完成后，在紫外燈下小心將目的dna條帶從瓊脂糖凝膠中切下，保持膠塊重量小于400mg，將膠塊分別放入干凈的96孔圓孔板中，平行4份樣品。步驟二：溶膠用移液器向4份樣品孔中分別加入500ul結(jié)合液，將96孔板置于65℃水浴中8分鐘至溶膠完全。步驟三：磁珠與dna結(jié)合將96孔板從水浴中取出，向4份樣品孔中分別加入50ul磁珠分散液。加畢將96孔板置于渦旋混合儀上，900rpm下振蕩5分鐘。取下96孔板，放到96孔板用磁板架上，靜置20秒。保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣96孔板棄去上清液，然后呈倒扣狀放置于吸水紙上片刻，徹底棄去上清液。步驟三：清洗將96孔板從磁板架上取下，向4份樣品孔中分別加入550ul清洗液ⅰ，900rpm下渦旋振蕩25秒，取下96孔板并裝入磁板底座靜置20秒。保持96孔板固定于磁板底座上直接倒扣96孔板棄上清液，然后呈倒扣狀置于吸水紙上，徹底棄去上清液。用清洗液ⅱ重復(fù)以上清洗操作兩次。步驟四：洗脫將棄去清洗液ⅱ后的96孔板連同磁板架一起置于45℃真空烘箱中干燥8分鐘，取出96孔板，用移液器向4份樣品孔中分別加入35ul洗脫液，900rpm渦旋震蕩1分鐘。步驟五：轉(zhuǎn)移獲得dna產(chǎn)物將96孔板重新裝回磁板底座上，靜置約20s，待磁珠完全吸附于96孔板側(cè)壁后，用移液器小心將洗脫液轉(zhuǎn)移至另一潔凈96孔板中得目的dna回收產(chǎn)物，棄去磁珠。實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用了axygen柱式法瓊脂糖膠dna回收試劑盒，對(duì)相同dna樣品進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：對(duì)所得4份dna回收產(chǎn)物，分別取2ul上樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠圖（見(jiàn)圖1）顯示所獲得dna產(chǎn)物條帶清晰完整，平行性好，每份提取的dna條帶亮度與axygen柱式法結(jié)果相當(dāng)。od值檢測(cè)：使用超微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)對(duì)4份dna回收樣品進(jìn)行了od值檢測(cè)（見(jiàn)表1）。檢測(cè)結(jié)果顯示使用本方法對(duì)瓊脂糖凝膠電泳后dna進(jìn)行提取得到的dna產(chǎn)物含量高且純度良好。表1：實(shí)施例1中從瓊脂糖凝膠中提取600bpdna產(chǎn)物的od值檢測(cè)結(jié)果（a1、a2：axygen柱式法對(duì)照；y1-y4：4份平行測(cè)試樣本）樣品a260/230a260/280濃度(ng/ul)a10.241.827.59y10.361.777.42y20.421.887.67y30.451.837.78y40.271.777.69a20.201.877.75實(shí)施例2：對(duì)96份600bpdna片段電泳后的瓊脂糖凝膠高通量dna提取。使用實(shí)施例1所述試劑盒進(jìn)行提取。步驟一：樣品準(zhǔn)備分別取96份50ng/ulx6ul的600bpdna片段上樣，用1%的瓊脂糖凝膠在tae緩沖液中進(jìn)行電泳，電泳完成后，在紫外燈下小心將目的dna條帶從瓊脂糖凝膠中切下，保持膠塊重量小于400mg，將膠塊分別放入干凈的96孔圓孔板中，共平行96份樣品。步驟二：溶膠用多通道自動(dòng)加液器向96份樣品孔中分別加入500ul結(jié)合液。將96孔板置于65℃水浴中10分鐘。步驟三：磁珠與dna結(jié)合將96孔板從水浴中取出，用8道自動(dòng)加液器向96份樣品孔中分別加入50ul磁珠分散液。加畢將96孔板置于渦旋混合儀上，900rpm下振蕩5分鐘。取下96孔板，放置到96孔板用磁板架上，靜置20秒。保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣96孔板棄去上清液，然后呈倒扣狀放置于吸水紙上片刻，徹底棄去上清液。步驟四：清洗將96孔板從磁板底座上取下，用8通道自動(dòng)加液器分別向96份樣品孔中加入550ul清洗液ⅰ，900rpm下渦旋振蕩25秒，取下96孔板并放到磁板架上靜置20秒。保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣96孔板棄去上清液，然后呈倒扣狀放置于吸水紙上片刻，徹底棄去上清液。用清洗液ⅱ重復(fù)以上清洗操作兩次。步驟五：洗脫將棄去清洗液ⅱ后的96孔板連同磁板底座一起置于45℃真空烘箱中干燥9分鐘，取出96孔板，用8道電動(dòng)加液器向96份樣品孔中分別加入35ul洗脫液，900rpm渦旋震蕩1分鐘。步驟六：轉(zhuǎn)移獲得dna產(chǎn)物將96孔板從渦旋混合儀上取下，向96孔板中準(zhǔn)確插入已經(jīng)裝入磁爪套的96位磁棒爪，靜置20秒后，從96孔板中移出磁棒爪，棄磁珠，獲得目標(biāo)dna產(chǎn)物于澄清洗脫液中。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：對(duì)所得96份dna回收產(chǎn)物及回收前樣品作為對(duì)照，分別取2ul上樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠圖（見(jiàn)圖2）顯示所獲得dna產(chǎn)物條帶清晰完整，平行性好，回收率在90%左右。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但實(shí)施例并不是用來(lái)限定本發(fā)明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，自當(dāng)可作各種變化或潤(rùn)飾，但同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以本申請(qǐng)的權(quán)利要求保護(hù)范圍所界定的為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12