本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種寡聚甘露糖醛酸的制備方法。
背景技術(shù)：
褐藻膠是褐藻細(xì)胞間隙與細(xì)胞壁中含有的一類水溶性生物大分子，是由褐藻酸與鈉、鉀、鈣等金屬離子結(jié)合的褐藻酸鹽。褐藻膠分子可為海藻在海水中的生長提供強(qiáng)度與韌性。自從1881年由stanford發(fā)現(xiàn)后，褐藻膠由于其具有良好的生物兼容性，低毒，價格低廉等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在提供一種制備寡聚甘露糖醛酸的方法，以快速大量制備高純度的寡聚甘露糖醛酸。
一種寡聚甘露糖醛酸的制備方法，包括兩次水解與分級，具體如下：
（1）一次水解及分級：褐藻膠用少量95%的乙醇分散后，加入10倍水中。加入鹽酸使反應(yīng)體系中酸的濃度為0.5mol/l，然后在100℃下攪拌回流10h，冷卻后，將上述水解混合物離心，收集沉淀。將沉淀用水洗滌，加入na2co3溶液溶解沉淀，然后調(diào)節(jié)溶液ph至2.86，離心，沉淀為g1。
（2）二次水解及分級：向上清液中加入鹽酸，使反應(yīng)體系中酸的濃度為0.1mol/l。繼續(xù)加熱攪拌回流3h。用na2co3溶液中和至沉淀溶解，再用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的ph至2.86，離心，向上清液中繼續(xù)加入稀鹽，產(chǎn)生大量沉淀，離心收集沉淀，沉淀用70-75%的乙醇充分洗滌，經(jīng)95%的乙醇脫水，干燥即得寡聚甘露糖醛酸。
褐藻酸是由β-d-寡聚甘露糖醛酸（m）和α-l-聚古羅糖醛酸（g）組成的二元線型嵌段化合物。為了獲得純度較高的寡聚甘露糖醛酸，采用了兩次水解與分級的策略。采用兩次水解與兩次分級的方法可以制得純度較高的中間體寡聚甘露糖醛酸。當(dāng)水解過程進(jìn)行10小時后，從產(chǎn)物中分級得到的(m)n片段和(g)n片段的相應(yīng)單體殘基含量可達(dá)90%以上。根據(jù)褐藻酸的這些結(jié)構(gòu)特點和水解反應(yīng)規(guī)律，確定了從褐藻酸中經(jīng)水解和ph分級方法制備m2的工藝條件，一次水解條件為0.5mol/l鹽酸100℃下水解10h；二次水解條件為0.1mol/l的鹽酸100℃水解3h。
本發(fā)明的寡聚甘露糖醛酸的制備方法相比于現(xiàn)有技術(shù)：制備方法簡單，快速，且能夠大量得到目的產(chǎn)物，產(chǎn)物的純度高。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實施例1
寡聚甘露糖醛酸的制備，包括如下步驟：
（1）一次水解及分級：褐藻膠用少量95%的乙醇分散后，加入10倍水中。加入鹽酸使反應(yīng)體系中酸的濃度為0.5mol/l，然后在100℃下攪拌回流10h，冷卻后，將上述水解混合物離心，收集沉淀。將沉淀用水洗滌，加入na2co3溶液溶解沉淀，然后調(diào)節(jié)溶液ph至2.86，離心，沉淀為g1。
（2）二次水解及分級：向上清液中加入鹽酸，使反應(yīng)體系中酸的濃度為0.1mol/l。繼續(xù)加熱攪拌回流3h。用na2co3溶液中和至沉淀溶解，再用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的ph至2.86，離心，向上清液中繼續(xù)加入稀鹽，產(chǎn)生大量沉淀，離心收集沉淀，沉淀用70-75%的乙醇充分洗滌，經(jīng)95%的乙醇脫水，干燥即得寡聚甘露糖醛酸（m2）。
實施例2
寡聚甘露糖醛酸（m2）的含量測定
糖類化合物一般缺乏特征的紫外吸收，為提高其在hplc檢測中的靈敏度，常采用衍生化的方法使其形成具有紫外或熒光吸收的衍生物。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，pmp)可以在溫和的條件下與還原糖進(jìn)行定量反應(yīng)，且無立體異構(gòu)產(chǎn)物，被成功應(yīng)用于多糖化合物的單糖組成分析。
采用的色譜條件為：
色譜柱：agilenteclipsexdb-c18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)；流動相：0.1mol/l磷酸鹽(ph6.7)緩沖液-乙腈(v/v，82:18)；流速：1ml/min；檢測波長：245nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：20μl。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取干燥至恒重的m和g對照品，按文獻(xiàn)方法進(jìn)行色譜分析，以峰面積(s，×106mau)為橫坐標(biāo)，以濃度(c，g/l)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣品的測定：稱取5mgm2樣品于2ml安瓿瓶中，加入3mol/l三氟乙酸1.5ml，混勻，充氮?dú)夂蠓夤埽?10℃沙浴中降解6h。待反應(yīng)完成后，將三氟乙酸旋蒸至干，每次加入少量甲醇，蒸干至無酸味為止，加入500μlh2o轉(zhuǎn)移至離心管中，按上述衍生條件和色譜分析條件進(jìn)行hplc分析。根據(jù)樣品中m和g的峰面積以及標(biāo)準(zhǔn)曲線即可算出樣品中m的相對含量。
根據(jù)液相色譜結(jié)果，m的線性回歸方程為sm=7.72c-0.56(r2=0.9974)，g的線性回歸方程為sg=7.08c-0.47(r2=0.9976)。結(jié)果表明：m和g與pmp的衍生物在0.2～2.0g/l濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。根據(jù)g、m的標(biāo)準(zhǔn)曲線及校正系數(shù)，算得m2的含量達(dá)到91%。