本發(fā)明涉及用于沉默昆蟲(chóng)保幼激素結(jié)合蛋白基因的物質(zhì)在防治棉花害蟲(chóng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前防治棉花蟲(chóng)害的主要手段是種植Bt轉(zhuǎn)基因棉花和應(yīng)用化學(xué)殺蟲(chóng)劑相結(jié)合的方法。Bt毒蛋白可以殺死一些主要的以作物為食的害蟲(chóng)種群，而對(duì)脊椎動(dòng)物和其它生物無(wú)害。然而，近年來(lái)在實(shí)驗(yàn)室或者種植Bt轉(zhuǎn)基因作物的大田中都發(fā)現(xiàn)對(duì)Bt蛋白產(chǎn)生抗性的害蟲(chóng)。其他一些問(wèn)題也逐漸引起關(guān)注，如化學(xué)殺蟲(chóng)劑使用造成的環(huán)境污染，害蟲(chóng)抗藥性的增加等問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題科學(xué)家們?cè)趯ふ腋行У目瓜x(chóng)技術(shù)方面做了很多嘗試，包括天敵的利用，基于天然產(chǎn)物的殺蟲(chóng)劑的使用，Bt種植區(qū)避難所的設(shè)置等等，但上述手段均收效甚微。綜上所述，亟待一種對(duì)環(huán)境安全，種群特異性強(qiáng)，對(duì)作物性狀沒(méi)有不良影響的新抗蟲(chóng)方法出現(xiàn)。

昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、蛻皮、變態(tài)、滯育、生殖、多型現(xiàn)象等生理過(guò)程以及行為反應(yīng)等都離不開(kāi)激素的參與。昆蟲(chóng)激素已成為殺蟲(chóng)劑研究與開(kāi)發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)領(lǐng)域，不同于以往作用于神經(jīng)系統(tǒng)的傳統(tǒng)殺蟲(chóng)劑，其作用毒性低、污染少、對(duì)天敵和有益生物影響小，有助于可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展、有利于無(wú)公害綠色食品生產(chǎn)、有益于人類(lèi)健康。

保幼激素(juvenile hormone,JH)是一種低分子量、脂溶性、非蛋白質(zhì)的萜烯類(lèi)化合物，已經(jīng)證明有7種天然JH存在，具體如下：(1)JH0，(2)JHI，(3)JHII，(4)JHIII，(5)4-methyl-JHI，(6)JHIII-bisepoxide，(7)mehtylfamesoate。其中(1)、(2)、(3)、(5)存在于鱗翅目中，(6)存在于雙翅目中，(7)存在于蟑螂中，(4)在所有昆蟲(chóng)中都存在。JH由咽側(cè)體合成和釋放,是節(jié)肢動(dòng)物特有的激素，未見(jiàn)于其它動(dòng)物中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供用于沉默昆蟲(chóng)保幼激素結(jié)合蛋白基因的物質(zhì)在防治棉花害蟲(chóng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種培育抗蟲(chóng)性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：在出發(fā)植物中導(dǎo)入特異DNA分子，得到抗蟲(chóng)性提高的轉(zhuǎn)基因植物；所述特異DNA分子包括正義片段、反義片段以及位于它們之間的間隔片段；所述正義片段如序列表的序列2自5’末端第17至499位核苷酸所示；所述反義片段與所述正義片段反向互補(bǔ)。

所述特異DNA分子中，自上游至下游依次包括：所述正義片段、所述間隔片段和所述反義片段。

所述特異DNA分子具體可如序列表的序列2或序列表的序列6所示。

所述特異DNA分子具體可通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述出發(fā)植物；所述重組表達(dá)載 體是在表達(dá)載體中插入所述特異DNA分子得到的重組質(zhì)粒。

所述重組表達(dá)載體中，所述特異DNA分子具體可存在于如下表達(dá)盒中：采用序列表的序列4自5’末端第12至295位核苷酸所示的啟動(dòng)子，序列表的序列5自5’末端第14至194位核苷酸所示的終止子。

可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述特異DNA分子的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述特異DNA分子構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用所述特異DNA分子構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

所述表達(dá)載體具體可為植物表達(dá)載體pCAMBIA2300。所述特異DNA分子具體可插入所述表達(dá)載體的EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)之間。

所述方法中，所述重組表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述特異DNA分子具體可通過(guò)所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入所述目的植物中。

本發(fā)明還保護(hù)另一種培育抗蟲(chóng)性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：在出發(fā)植物中表達(dá)特異RNA，得到抗蟲(chóng)性提高的轉(zhuǎn)基因植物；所述特異RNA為序列表中的序列3所示的RNA。

以上任一所述方法中，所述抗蟲(chóng)具體可為抗棉鈴蟲(chóng)。

以上任一所述方法中，所述抗蟲(chóng)可體現(xiàn)為促進(jìn)蟲(chóng)的死亡和/或抑制存活下來(lái)的蟲(chóng)的體重增加。

以上任一所述方法中，所述出發(fā)植物具體可為如下a1)-a6)中的任意一種：a1)雙子葉植物；a2)單子葉植物；a3)錦葵科(Malvaceae)植物；a4)棉屬植物；a5)陸地棉(Gossypium hirsutum)；a6)泗棉3號(hào)。

本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列2或序列表的序列6所示的DNA分子。

本發(fā)明還保護(hù)將序列表的序列2或序列表的序列6所示的DNA分子插入植物表達(dá)載體pCAMBIA2300得到的重組質(zhì)粒。所述DNA分子具體可插入植物表達(dá)載體pCAMBIA2300的EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)之間。

本發(fā)明還保護(hù)序列表中的序列3所示的RNA。

本發(fā)明還保護(hù)所述DNA分子、所述重組質(zhì)?；蛩鯮NA在培育抗蟲(chóng)植物中的應(yīng)用。所述抗蟲(chóng)具體可為抗棉鈴蟲(chóng)。所述抗蟲(chóng)可體現(xiàn)為促進(jìn)蟲(chóng)的死亡和/或抑制存活下來(lái)的蟲(chóng)的體重增加。所述植物具體可為如下a1)-a6)中的任意一種：a1)雙子葉植物；a2)單子葉植物；a3)錦葵科(Malvaceae)植物；a4)棉屬植物；a5)陸地棉(Gossypium hirsutum)；a6)泗棉3號(hào)。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種新發(fā)現(xiàn)的基因調(diào)控機(jī)制，是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)所誘導(dǎo)的一種特異性基因沉默現(xiàn)象。有研究表明將dsRNA直接注射進(jìn)昆蟲(chóng)的卵、血腔或局部組織，可引發(fā)遠(yuǎn)距離靶基因的特異性沉默。此外，除了直接注射dsRNA，還可以通過(guò)飼喂dsRNA的方法誘導(dǎo)昆蟲(chóng)產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。目前已有研究表明飼喂相應(yīng)靶基因的dsRNA已成功降低蘋(píng)淺褐卷蛾(Epiphyaspostvittana)幼蟲(chóng)羧酸酯酶表達(dá)水平、蜜蜂(Apismellifera)的雷帕霉素靶蛋白(targetof rapamycin，amTOR)的表達(dá)水平及棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)P450基因的表達(dá)水平。因而，以RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)新的害蟲(chóng)防治方法，為農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治提供了高特異性和環(huán)境安全的新策略。

昆蟲(chóng)激素在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育中起著極其重要的作用。調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)發(fā)育的昆蟲(chóng)激素，其合成、運(yùn)輸和代謝途徑中所涉及的關(guān)鍵基因多數(shù)具有很強(qiáng)的物種特異性，即與其他物種的基因同源性低，尤其是與人類(lèi)基因相比幾乎沒(méi)有同源性，這在很大程度上降低了RNAi技術(shù)的“脫靶效應(yīng)”，從而為應(yīng)用安全性方面提供了保障。因此，在植物中表達(dá)昆蟲(chóng)激素相關(guān)基因的dsRNA，其優(yōu)點(diǎn)在于只對(duì)植食性的昆蟲(chóng)有抑制作用，同時(shí)還可以根據(jù)昆蟲(chóng)激素相關(guān)基因的物種特異性，通過(guò)表達(dá)不同序列的dsRNA對(duì)某一種或某一屬昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響，從而達(dá)到精確、安全的控制蟲(chóng)害的目的。

本發(fā)明對(duì)于植食性昆蟲(chóng)的生物防治、植物抗蟲(chóng)基因工程具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為干擾載體PRP:dsJHBP的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為部分再生植株的PCR鑒定結(jié)果.

圖3為死亡率結(jié)果。

圖4為體重結(jié)果。

圖5為Ha-JHBP基因的表達(dá)水平。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

植物表達(dá)載體pCAMBIA2300：CAMBIA公司；詳細(xì)序列見(jiàn)GenBank:AF234315.1，網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/7638145。

根癌農(nóng)桿菌EHA105：公眾可以從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；參考文獻(xiàn)：Hood EE,Gelvin SB,Melchers S,Hoekema A(1993)New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants(EHA105).Trans Res 2:208-218。

陸地棉(Gossypium hirsutum)品種泗棉3號(hào)：公眾可以從中國(guó)科學(xué)院遺傳發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；參考文獻(xiàn)：Shen-Jie Wu,Hai-Hai Wang,Fei-Fei Li,Tian-Zi Chen,Jie Zhang,Yan-Jie Jiang,Yezhang Ding,Wang-Zhen Guo,Tian-Zhen Zhang.Enhanced Agrobacterium-mediated Transformation of Embryogenic Calli of Upland Cotton via Efficient Selection and Timely Subculture of Somatic Embryos.Plant Molecular Biology Reporter.2008Sep 26(3):174-185。

棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)：公眾可以從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；參考文獻(xiàn)：Wu KM,Lu YH,Feng HQ,Jiang YY,Zhao JZ.Suppression of cotton bollworm in multiple crops in China in areas with Bt toxin-containing cotton.Science.2008Sep 19；321(5896):1676-8。

MSB0液體培養(yǎng)基：含MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽、B5培養(yǎng)基的有機(jī)物、30g/L葡萄糖和0.75g/LMgCl₂，補(bǔ)水至1L。

MSB培養(yǎng)基：含MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽、B5培養(yǎng)基的有機(jī)物、30g/L葡萄糖、2.5g/L phytalgel和1.1g/L MgCl₂，補(bǔ)水至1L。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，另加入終濃度為0.1mg/L的IAA(吲哚乙酸)、終濃度為1mg/L的6-BA(6-芐氨基嘌呤)、終濃度為100μM的AS(乙酰丁香酮)。

MSB2培養(yǎng)基：含MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽、B5培養(yǎng)基的有機(jī)物、30g/L葡萄糖、1.5g/L phytalgel、1.1g/L MgCl₂和3.8g/L KNO₃，補(bǔ)水至1L。

篩選培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，另加入終濃度為0.1mg/L的IAA(吲哚乙酸)、終濃度為1mg/L的6-BA(6-芐氨基嘌呤)、終濃度為400mg/L的Cef(頭孢霉素)、終濃度為100mg/L的Kan(卡那霉素)。

分化培養(yǎng)基(pH6.5)：含MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽、B5培養(yǎng)基的有機(jī)物、30g/L葡萄糖、 4g/L phytalgel、1.1g/L MgCl₂和1.9g/L KNO₃，補(bǔ)水至1L。

再生培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，另加入終濃度為1mg/L的6-BA(6-芐氨基嘌呤)、終濃度為400mg/L的Cef(頭孢霉素)、終濃度為100mg/L的Kan(卡那霉素)。

生根培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，另加入終濃度為200mg/L的Cef(頭孢霉素)、終濃度為100mg/L的Kan(卡那霉素)。

MS培養(yǎng)基配方如下：

B5培養(yǎng)基配方如下：

實(shí)施例1、干擾載體PRP:dsJHBP的構(gòu)建

一、重組質(zhì)粒pC2300PN的構(gòu)建

在植物表達(dá)載體pCAMBIA2300中插入棉花曲葉病毒(CLCuV)互補(bǔ)鏈啟動(dòng)子PRP和T-NOS終止子，獲得質(zhì)粒pC2300PN。

1、將序列表的序列4自5’末端第12至295位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入植物表達(dá)載體pCAMBIA2300的EcoRI和PstI酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA2300-PRP。

2、將序列表的序列5自5’末端第14至194位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入重組質(zhì)粒pCAMBIA2300-PRP的PstI和HindIII酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pC2300PN。

經(jīng)測(cè)序，對(duì)重組質(zhì)粒pC2300PN進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：以植物表達(dá)載體pCAMBIA2300為骨架載體，在EcoRI和PstI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列4自5’末端第12至295位核苷酸所示的雙鏈DNA分子，在PstI和HindIII酶切位點(diǎn)之間插入了序列5自5’末端第14至194位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。

二、干擾載體PRP:dsJHBP的構(gòu)建

1、人工合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。

序列表的序列2中，第17至499位核苷酸為HaJHBP基因區(qū)段(JHBP S)，第504至704位核苷酸為內(nèi)含子(intron)，第713至1195位核苷酸為所述HaJHBP基因區(qū)段的反向互補(bǔ)序列(JHBP A)。HaJHBP基因如序列表的序列1所示。

2、用限制性內(nèi)切酶PstI酶切步驟1得到的雙鏈DNA分子，回收酶切產(chǎn)物。

3、用限制性內(nèi)切酶PstI酶切重組質(zhì)粒pC2300PN，回收載體骨架。

4、將步驟2得到的酶切產(chǎn)物與步驟3得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒，即為干擾載體PRP:dsJHBP。

經(jīng)測(cè)序，對(duì)干擾載體PRP:dsJHBP進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在植物表達(dá)載體pCAMBIA2300的EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)插入了序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子。干擾載體PRP:dsJHBP的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。干擾載體PRP:dsJHBP表達(dá)序列表的序列3所示的RNA。

實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因棉花的獲得和抗蟲(chóng)性鑒定

一、轉(zhuǎn)基因棉花的獲得

1、將干擾載體PRP:dsJHBP電擊導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，得到重組農(nóng)桿菌。

2、取步驟1得到的重組農(nóng)桿菌，用含100μmol/L AS的MSB0液體培養(yǎng)基懸浮，然后轉(zhuǎn)接入含100μmol/L AS的MSB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)至OD_600nm＝0.5，然后用含100μmol/L AS的MSB液體培養(yǎng)基稀釋至OD_600nm＝0.3-0.7，得到農(nóng)桿菌侵染液。

3、切割泗棉3號(hào)的莖段，將7cm左右的下胚軸莖段浸泡于步驟2得到的農(nóng)桿菌侵染液5-8min，然后用濾紙吸干，放在鋪有一層滅菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，22-25℃共培養(yǎng)2天(下胚軸切段兩端切口長(zhǎng)出的愈傷組織)。

4、完成步驟2后，切取愈傷組織，在MSB2培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)繼代，直至出現(xiàn)黃綠色或灰綠色、米粒狀的胚性愈傷。

5、取步驟4得到的胚性愈傷，在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天。

6、完成步驟5后，取成活的胚性愈傷，依次在分化培養(yǎng)基、再生培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到再生植株。

7、提取再生植株葉片的基因組DNA，采用P1和P2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中具有約402bp條帶，該再生植株為PCR鑒定陽(yáng)性，為轉(zhuǎn)基因棉花。

P1:5’-GGCTTGGGACTGGTCTATGAT-3’；

P2:5’-TAAAGCCACCTTGTTAGTCTCGT-3’。

部分再生植株的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2(0代表泗棉3號(hào)，1至11代表不同的再生植株)。

二、對(duì)照轉(zhuǎn)基因棉花的獲得

用pC2300PN載體代替干擾載體PRP:dsJHBP，其它同步驟一，得到轉(zhuǎn)空載體棉花，作為轉(zhuǎn)基因棉花的對(duì)照。

三、棉花的抗蟲(chóng)性檢測(cè)(飼喂試驗(yàn))

待測(cè)植株為步驟一獲得的轉(zhuǎn)基因棉花(轉(zhuǎn)基因株系1或轉(zhuǎn)基因株系2)、步驟二獲得的轉(zhuǎn)空載體棉花或泗棉3號(hào)。

1、將待測(cè)植株置于溫室培養(yǎng)(生長(zhǎng)溫度為25℃，光照周期為16h光照/8h黑暗)。

2、每個(gè)培養(yǎng)皿放入2片待測(cè)棉花的嫩葉和6頭2齡棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)，加紙覆蓋以防害蟲(chóng)逃逸，分別于第6天、第10天以及蛹期，統(tǒng)計(jì)棉鈴蟲(chóng)的累計(jì)死亡率以及成活的棉鈴蟲(chóng)的平均體重。

進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)試驗(yàn)中每種待測(cè)植株設(shè)置5個(gè)培養(yǎng)皿，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值。

累計(jì)死亡率結(jié)果見(jiàn)圖3。飼喂轉(zhuǎn)基因棉花的棉鈴蟲(chóng)的死亡率重明顯高于飼喂轉(zhuǎn)空 載體棉花的棉鈴蟲(chóng)和飼喂泗棉3號(hào)的棉鈴蟲(chóng)。飼喂轉(zhuǎn)空載體棉花的棉鈴蟲(chóng)和飼喂泗棉3號(hào)的棉鈴蟲(chóng)各個(gè)時(shí)間的累計(jì)死亡率沒(méi)有顯著差異。

體重結(jié)果見(jiàn)圖4。飼喂轉(zhuǎn)基因棉花的棉鈴蟲(chóng)的幼蟲(chóng)體重明顯小于飼喂轉(zhuǎn)空載體棉花的棉鈴蟲(chóng)的幼蟲(chóng)體重。飼喂轉(zhuǎn)空載體棉花的棉鈴蟲(chóng)的幼蟲(chóng)體重和飼喂泗棉3號(hào)的棉鈴蟲(chóng)的幼蟲(chóng)體重沒(méi)有顯著差異。

4、分組處理的第10天，取存活的棉鈴蟲(chóng)，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用QRT-PCR的方法檢測(cè)Ha-JHBP基因的表達(dá)水平。

用于檢測(cè)Ha-JHBP基因的引物如下：

P3:5’-ATTGCTTGCATTTGCGAGTTGTGT-3’；

P4:5’-TCCGGGAAACCATTGCTTGT-3’。

用于檢測(cè)內(nèi)參ACTIN基因的引物如下：

P5:5’-CCTGGTATTGCTGACCGTATGC-3’；

P6:5’-CTGTTGGAAGGTGGAGAGGGAA-3’。

結(jié)果見(jiàn)圖5。飼喂轉(zhuǎn)基因棉花的棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)Ha-JHBP基因的mRNA水平顯著低于飼喂于轉(zhuǎn)空載體棉花的棉鈴蟲(chóng)，說(shuō)明取食轉(zhuǎn)基因棉花植株葉片可以降低棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)Ha-JHBP基因的表達(dá)量。