專利名稱：一種昆蟲抗冷凍蛋白基因序列及其表達(dá)純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種昆蟲抗冷凍蛋白基因的序列，本發(fā)明還涉及該昆蟲抗冷凍蛋白基因的克隆以及蛋白表達(dá)純化方法。
背景技術(shù)：
抗冷凍蛋白(antifreeze proteins，AFPs)是一類具有降低生物體液冰點(diǎn)和抑制冰晶生長(zhǎng)的生物活性蛋白，在低溫生物的生存中起著重要的作用。抗冷凍蛋白可作為蛋白質(zhì)制劑在醫(yī)藥上應(yīng)用于生物體、離體元件、組織、細(xì)胞系的低溫或超低溫保存以及靶組織的冷凍手術(shù)；在農(nóng)業(yè)上可提高植物、動(dòng)物的耐凍能力；在冷凍食品上應(yīng)用可維持冷凍食品的結(jié)構(gòu)和減少營(yíng)養(yǎng)的損失；另外抗冷凍蛋白還可以制作冰漿以及作為一種新的抑制冰形成制劑。由此可見(jiàn)，抗冷凍蛋白的應(yīng)用潛力巨大。
目前，已從魚類、昆蟲、植物、真菌、細(xì)菌中分離得到了許多種類的抗冷凍蛋白，其中昆蟲抗冷凍蛋白的活性最高，比所有已知北極魚的抗冷凍蛋白活性高出10-30倍，甚至100倍。
現(xiàn)在常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，如pGEX載體，表達(dá)的蛋白會(huì)在N端或C端多余幾個(gè)氨基酸序列，或者帶有His或GST的標(biāo)簽，因此表達(dá)出的蛋白與天然蛋白存在差異，活性可能受到影響；如要切除標(biāo)簽蛋白GST，還必須使用昂貴的內(nèi)切酶，必然增加成本?；蛘咭园w的形式表達(dá)，雖然不帶有多余的氨基酸殘基，但是包涵體的處理步驟繁瑣，最終得到的復(fù)性蛋白活性往往較低。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是公開一種昆蟲抗冷凍蛋白基因的序列，本發(fā)明的另一目的是提供一種高效、簡(jiǎn)便、廉價(jià)的昆蟲抗冷凍蛋白基因的克隆以及蛋白表達(dá)純化的方法。
(二)技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種昆蟲抗冷凍蛋白基因，其序列為SEQ ID NO1。
本發(fā)明提供了一種昆蟲抗冷凍蛋白基因的克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，它包括以下步驟a.提取并純化昆蟲的mRNA；b.設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)P1，上游序列為AFP15’-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3’，下游序列為AFP25’-GACTTTCATGGCTTAATTAGC-3’，用RT-PCR法克隆抗冷凍蛋白基因；c.抗冷凍蛋白基因與T載體連接形成重組質(zhì)粒pGAFP4，測(cè)序；d.設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)P2，上游序列為AFP1′5’-GGT GGT TGC TCTTCC ACC ATG GAT GGC TCG TGT ACA-3’，下游序列為AFP2′5’-GGT GGT CTG CAG TCA TTA ATT AGC ACT GAA-3’，用PCR方法將抗冷凍蛋白基因從重組質(zhì)粒pGAFP4中擴(kuò)增出來(lái)，擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)元件PTYB11連接構(gòu)建了表達(dá)載體PTYB11-afp；e.表達(dá)載體PTYB11-afp轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；f.誘導(dǎo)表達(dá)；g.親和純化抗冷凍蛋白。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，mRNA是從一種生活在瑞典的鱗翅目昆蟲的幼蟲體內(nèi)提取并純化的。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，RT-RCP的反應(yīng)體系為ddH2O 23.0μL5×Buffer 10.0μLdNTPs(10mM)1.0μLAFP1(10μM)5.0μLAFP2(10μM)5.0μLMgSO4(25mM) 2.0μL
AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U·μL-1) 1.0μLTflDNA酶(5U·μL-1)1.0μLmRNA2.0μL；RT-RCP反應(yīng)參數(shù)為反轉(zhuǎn)錄48℃ 45min；預(yù)變性94℃ 2min；循環(huán)參數(shù)94℃ 40s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸6min。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，抗冷凍蛋白基因與T-Vector連接后獲得重組質(zhì)粒pGAFP4。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，PCR反應(yīng)體系為ddH2O 40.0μL10×Buffer(含Mg2+) 5.0μLdNTPs(10mM) 1.0μLAFP1′(10μM) 1.25μLAFP2′(10μM) 1.25μLTaq DNA聚合酶(5U·μL-1) 0.5μLpGAFP4 1.0μL；PCR反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性94℃ 5min；循環(huán)參數(shù)為94℃ 40s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸6min。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，將從重組質(zhì)粒pGAFP4中擴(kuò)增出來(lái)的抗冷凍蛋白基因(afp)與原核生物表達(dá)元件PTYB11連接，構(gòu)建出表達(dá)載體PTYB11-afp。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，用表達(dá)質(zhì)粒PTYB11-afp轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑取陽(yáng)性克隆搖菌，以試劑盒小量提取重組表達(dá)質(zhì)粒PTYB11-afp。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，把提取的表達(dá)質(zhì)粒PTYB11-afp轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，加入IPTG誘導(dǎo)抗冷凍蛋白的表達(dá)。加入溶菌酶和無(wú)蛋白酶的DNase處理，離心取上清。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，IPTG誘導(dǎo)條件是37℃3h；溶菌酶工作濃度為20μg·mL-1，無(wú)蛋白酶的DNase工作濃度為10μg·mL-1，條件是30℃ 2h。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，在誘導(dǎo)表達(dá)后，用Chitin介質(zhì)純化蛋白并柱上切割，洗脫獲得純化的抗冷凍蛋白。
本發(fā)明中所用的mRNA提取純化試劑盒和RT-PCR試劑盒均為QIAGEN公司產(chǎn)品。
本發(fā)明所用的表達(dá)質(zhì)粒載體PTYB11購(gòu)買自NEB(New England Biolabs)公司，該質(zhì)粒帶有強(qiáng)的T7啟動(dòng)子，目的蛋白基因克隆在標(biāo)簽intein的3’端，且表達(dá)出的目的蛋白N端不帶有載體的氨基酸殘基。
本發(fā)明所用的純化介質(zhì)Chitin在結(jié)合緩沖液中能特異性結(jié)合標(biāo)簽intein，從而純化蛋白，并且在裂解緩沖液中，標(biāo)簽與抗冷凍蛋白斷開，洗脫下純的抗冷凍蛋白。所用的結(jié)合緩沖液成分為HEPES 20mM，NaCl 500mM，TritonX-100 0.1％，PMSF 20μM；所用的裂解緩沖液成分為HEPES 20mM，NaCl500mM，DTT 50mM。
本發(fā)明所述的表達(dá)系統(tǒng)得到的融合蛋白不需要內(nèi)切酶即可切除標(biāo)簽蛋白，不含多余的氨基酸序列，因?yàn)楸磉_(dá)質(zhì)粒PTYB11的目的蛋白(AFP)與PTYB11上的蛋白自剪接元件(稱為“內(nèi)含肽”，intein)及幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白形成了融合蛋白，通過(guò)幾丁質(zhì)柱親和純化融合蛋白，誘導(dǎo)內(nèi)含肽的肽鍵裂解活性，在幾丁質(zhì)介質(zhì)上將目標(biāo)蛋白釋放出來(lái)，而內(nèi)含肽與幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白仍結(jié)合在幾丁質(zhì)介質(zhì)上，達(dá)到單柱分離純化蛋白的目的。pTYB11載體只有在SapI位點(diǎn)被用來(lái)分別克隆目的基因的3’和5’端，此克隆策略使得目的基因和intein標(biāo)簽(即剪切標(biāo)簽)正好相鄰，純化的目的蛋白不含多余的氨基酸殘基。
用本發(fā)明所述的表達(dá)系統(tǒng)得到的融合蛋白更接近天然蛋白活性，這是因?yàn)榧兓哪康牡鞍撞缓嘤嗟陌被釟埢?，保證了表達(dá)出來(lái)的目的蛋白能夠正確折疊成天然的構(gòu)像，從而保持了其天然的活性。
本發(fā)明所用的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第2版，第55頁(yè)，金冬雁，黎孟楓等譯。
本發(fā)明中提取mRNA是按購(gòu)自QIAGEN公司的Oligotex Direct mRNA純化試劑盒中的操作步驟進(jìn)行。
(三)有益效果應(yīng)用本發(fā)明所述的方法成功地克隆到了昆蟲的抗冷凍蛋白基因。誘導(dǎo)表達(dá)的抗冷凍蛋白占菌體總蛋白的30％，通過(guò)介質(zhì)純化后得到的抗冷凍蛋白純度達(dá)95％以上，說(shuō)明本發(fā)明提供的方法是高效的。
另外，用本發(fā)明所述的表達(dá)系統(tǒng)得到的融合蛋白不需要內(nèi)切酶即可切除標(biāo)簽蛋白，不含多余的氨基酸序列，更接近天然蛋白活性。


圖1RT-PCR法擴(kuò)增的電泳圖；圖中M、100bp DNA Mark；M′、1kbDNAMark；1-4均為RT-PCR產(chǎn)物。
圖2誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白電泳圖；圖中1、蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2、誘導(dǎo)前菌體總蛋白；3-8、誘導(dǎo)2h、4h、6h、8h、10h、12h菌體總蛋白；箭頭所指為誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白。
圖3純化后的蛋白電泳圖；圖中1、蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2、上樣流出液；3-7、洗脫液；細(xì)頭所指為融合蛋白，粗箭頭所指為昆蟲抗冷凍蛋白。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例11.取1只3齡昆蟲幼蟲，去掉頭部后，放在一液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮，迅速研磨至粉狀并轉(zhuǎn)進(jìn)一液氮預(yù)冷的無(wú)RNase的1.5mL離心管中，根據(jù)mRNA的提取和純化試劑盒中的說(shuō)明獲得純mRNA。
2.以AFP1(5’-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3’)和AFP2(5’-GACTTTCATGG CTTAATTAGC-3’)為引物，以mRNA為模板進(jìn)行抗冷凍蛋白基因的RT-PCR擴(kuò)增。
RT-PCR的反應(yīng)體系為ddH2O 23.0μL，5×Buffer 10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，AFP1(10μM)5.0μL，AFP2(10μM)5.0μL，MgSO4(25mM)2.0μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/μL)1.0μL，TflDNA酶(5U/μL)1.0μL，mRNA 2.0μL，總體積50.0μL。
反應(yīng)參數(shù)為反轉(zhuǎn)錄48℃ 45min；預(yù)變性94℃ 2min；循環(huán)參數(shù)94℃40s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸6min。
擴(kuò)增產(chǎn)物以1％膠電泳并回收。
3.回收的抗冷凍蛋白基因直接與pGEMR T-Vector相連，得到重組質(zhì)粒pGAFP4并由上海基因公司測(cè)序獲得抗冷凍蛋白基因核苷酸全序列。
4.以AFP1′5′-GGT GGT TGC TCT TCC ACC ATG GAT GGC TCGTGT ACA-3和AFP2′5′-GGT GGT CTG CAG TCA TTA ATT AGC ACTGAA-3′為引物，以重組質(zhì)粒pGAFP4為模板用PCR法重新擴(kuò)增出抗冷凍蛋白基因。
PCR反應(yīng)體系為ddH2O 40.0μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)5.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，AFP1′(10μM)1.25μL，AFP2′(10μM)1.25μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，質(zhì)粒pGAFP41.0μL，總體積50μL。
反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性94℃ 5min；循環(huán)參數(shù)為94℃ 40s，55℃ 30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸6min。
5.該基因片段直接連接到新的表達(dá)載體PTYB11中，形成抗冷凍蛋白的表達(dá)載體PTYB11-afp。
6.取10μL質(zhì)粒PTYB11-afp加入150μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴2min，加800μL LB，于37℃搖床上搖45min，轉(zhuǎn)速為220rpm，鋪板，抗生素為100μg·mL-1氨芐。
7.挑取陽(yáng)性克隆，用試劑盒小量提取重組表達(dá)質(zhì)粒PTYB11-afp。
8.將表達(dá)質(zhì)粒PTYB11-afp轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，然后加入ITPG誘導(dǎo)抗冷凍蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)條件是37℃ 3h。再加入溶菌酶和無(wú)蛋白酶的DNase處理，離心取上清。溶菌酶工作濃度為20μg·mL-1，無(wú)蛋白酶的DNase工作濃度為10μg·mL-1，條件是30℃ 2h。
9.用Chitin介質(zhì)純化融合蛋白并柱上切割，洗脫獲得純化的抗冷凍蛋白。所用的結(jié)合緩沖液成分為HEPES 20mM，NaCl 500mM，Triton X-100 0.1％，PMSF 20μM；所用的裂解緩沖液成分為HEPES 20mM，NaCl 500mM，DTT50mM。
序列表<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>SEQ ID NO1<130>一種昆蟲抗冷凍蛋白基因序列及其表達(dá)純化方法<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>411<212>DNA<213>Budworm<400>1tgcaggaatc ggcacgagga aagacatatt tttttttagt ttcaaaagtt gtgtacattt 60ttctcaagta tcatgaagtg tttaatgctg atcatggctc tagccattat caacactgta120
tcttctgatg gctcgtgtac aaacacgaac tctcagctca gcgcaaactc caagtgcgaa180aaatcgacgt tgaccaactg ctacgtcgat aaaagcgagg tttacggcac tacctgtaca240ggaagccgat tcgacggagt cactataacg acttcaacat ctaccggttc acgtatttca300ggccctggat gcaagatttc cacttgcatt atcaccgggg gtgtacctgc tccatcagct360gcttgcaaga tttctggatg tactttcagt gctaattaag ccatgaaagt c 41權(quán)利要求
1.一種昆蟲抗冷凍蛋白基因，其序列為SEQ ID NO1。
2.一種昆蟲抗冷凍蛋白基因的克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，其特征在于包括以下步驟a.提取并純化昆蟲的mRNA；b.設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)P1，上游序列為AFP15’-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3’，下游序列為AFP25’-GACTTTCATGGCTTAATTAGC-3’，用RT-PCR法克隆抗冷凍蛋白基因；c.抗冷凍蛋白基因與T載體連接形成重組質(zhì)粒pGAFP4，測(cè)序；d.設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)P2，上游序列為AFP1′5’-GGT GGT TGC TCTTCC ACC ATG GAT GGC TCG TGT ACA-3’，下游序列為AFP2′5’-GGT GGT CTG CAG TCA TTAATT AGC ACT GAA-3’，用PCR方法將抗冷凍蛋白基因從重組質(zhì)粒pGAFP4中擴(kuò)增出來(lái)，擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)元件PTYB11連接構(gòu)建了表達(dá)載體PTYB11-afp；e.表達(dá)載體PTYB11-afp轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；f.誘導(dǎo)表達(dá)；g.親和純化抗冷凍蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于mRNA是從一種生活在瑞典的鱗翅目昆蟲的幼蟲體內(nèi)提取并純化的。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于用構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒PTYB11-afp轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行搖菌，試劑盒小量提取表達(dá)質(zhì)粒PTYB11-afp。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于用提取的表達(dá)質(zhì)粒PTYB11-afp轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，然后加入IPTG誘導(dǎo)抗冷凍蛋白的表達(dá)。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于誘導(dǎo)表達(dá)后，用Chitin介質(zhì)純化蛋白并柱上切割，洗脫獲得純化的抗冷凍蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種昆蟲抗冷凍蛋白基因，其序列為SEQ ID NO1。本發(fā)明還提供了該昆蟲抗冷凍蛋白基因的克隆、蛋白表達(dá)及純化方法，主要包括以下步驟利用特異性引物擴(kuò)增該昆蟲抗冷凍蛋白基因，與原核生物表達(dá)元件PTYB11連接構(gòu)建表達(dá)載體PTYB11－afp，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，以及純化抗冷凍蛋白。運(yùn)用本發(fā)明所述的方法成功地克隆到了昆蟲抗冷凍蛋白基因。誘導(dǎo)表達(dá)的抗冷凍蛋白占菌體總蛋白的30％，通過(guò)介質(zhì)純化后得到的抗冷凍蛋白純度達(dá)95％以上，說(shuō)明本發(fā)明提供的方法是高效的。而且，用本發(fā)明所述的表達(dá)系統(tǒng)得到的融合蛋白不需要內(nèi)切酶即可切除標(biāo)簽蛋白，不含多余的氨基酸序列，更接近天然蛋白活性。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1800393SQ20051012641
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者郭麗瓊, 林俊芳, 陳小萍 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)