專利名稱：：轉(zhuǎn)基因病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒。尤其是，本發(fā)明涉及包含涉及蛻皮和變態(tài)的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒。該轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒可用作生物農(nóng)藥。傳統(tǒng)害蟲(chóng)防治以使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑與主導(dǎo)。雖然它們起作用迅速，但這些化學(xué)品有時(shí)是在環(huán)境方面不具有吸引力的。此外，用于害蟲(chóng)防治的許多化學(xué)品是非種特異性的，并且可能影響非靶脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物以及靶害蟲(chóng)。這些化學(xué)品或它們的副產(chǎn)物有時(shí)可在環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間繼續(xù)存留。開(kāi)發(fā)和使用害蟲(chóng)生物學(xué)，種群動(dòng)力學(xué)，造林培植應(yīng)用，天然防治劑(即寄生物，病原體)，和改進(jìn)的可實(shí)用的森林害蟲(chóng)管理實(shí)踐是進(jìn)行森林管理的新的工具。作為成功防治害蟲(chóng)的方法，生物防治，使用活生物防治昆蟲(chóng)害蟲(chóng)已變得日益更為人接受。例如，生物殺蟲(chóng)劑芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)，被用于防治云杉食心蟲(chóng)和卷葉蛾幼蟲(chóng)。然而，最近一些對(duì)Bt特異性的關(guān)注導(dǎo)致形成它不應(yīng)該應(yīng)用于對(duì)鱗翅目造成危害的地區(qū)這一建議。生態(tài)學(xué)關(guān)注導(dǎo)致重點(diǎn)轉(zhuǎn)移至試驗(yàn)和開(kāi)發(fā)其它微生物產(chǎn)品，包括昆蟲(chóng)病毒。昆蟲(chóng)病毒為被認(rèn)為是宿主特異性和環(huán)境安全的自然產(chǎn)生的昆蟲(chóng)病原體。它們可持續(xù)數(shù)年對(duì)幾代昆蟲(chóng)野生影響。存在多于1200種可能對(duì)昆蟲(chóng)防治具有潛力的昆蟲(chóng)病毒(核多角體病毒，顆粒體病毒，病毒痘病毒，cypovirus和其它)。與一些天然昆蟲(chóng)病毒相關(guān)的一個(gè)問(wèn)題是在病毒進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)和致死感染之間存在一段時(shí)間延遲。昆蟲(chóng)病毒必須被幼蟲(chóng)攝取以使得能夠感染，含有污染葉片的昆蟲(chóng)顆粒的包藏體被攝取并被昆蟲(chóng)中腸液體溶解，釋放病毒顆粒。這些顆粒通過(guò)腸細(xì)胞，感染宿主幼蟲(chóng)的氣管和其它身體組織。通常在15天后，病毒在敏感組織中復(fù)制，最終導(dǎo)致死亡。在此期間感染的幼蟲(chóng)仍然進(jìn)食；然而，在病毒進(jìn)入和昆蟲(chóng)死亡之間的時(shí)間間隔仍可發(fā)生植物的明顯脫葉。這一進(jìn)食的損害是使用天然昆蟲(chóng)病毒的內(nèi)在問(wèn)題。與天然昆蟲(chóng)病毒相關(guān)的其它問(wèn)題是缺乏毒性，例如，廣泛的大田試驗(yàn)表明云杉食心蟲(chóng)多角體病毒(CfMNPV)感染云杉食心蟲(chóng)群體，但并沒(méi)有產(chǎn)生導(dǎo)致大規(guī)模死亡和種群減少的動(dòng)物流行病(Cunningham和House，1984，樅色卷蛾(clemens)，云杉食心蟲(chóng)(鱗翅目卷葉蛾科)；B.病毒應(yīng)用和評(píng)價(jià)。加拿大針對(duì)昆蟲(chóng)和雜草的生物防治工程1969-1980，Kelleher，J.S.和Hulme，M.A.編，公共健康農(nóng)業(yè)局，Slough，英國(guó))。已采取許多策略來(lái)降低由感染昆蟲(chóng)導(dǎo)致的飼養(yǎng)危害。一種策略是應(yīng)用包含“病毒增強(qiáng)劑”的針對(duì)早期蛻期幼蟲(chóng)的病毒制劑以加快感染，從而防止嚴(yán)重的脫葉。不幸的是，如果昆蟲(chóng)是可避免的，或如果不能獲得大量的昆蟲(chóng)病毒，則不能使用這種方法。對(duì)于用多角體的UGMW毒防治云杉食心蟲(chóng)(樅色卷蛾)(Clem)則是這種情況。生物技術(shù)的發(fā)展提供了用于遺傳改造昆蟲(chóng)病毒以增加它們的效果的工具。編碼毒素(蝎/蝎毒素)，酶(保幼激素(JH)酶酯)，神經(jīng)肽(促前胸腺激素)和蛻殼激素的基因被各種研究小組導(dǎo)入病毒基因組中(Bonning等，昆蟲(chóng)學(xué)年鑒85437-446)。這些基因編碼在病毒感染的細(xì)胞之外發(fā)揮它們功能的分泌蛋白和肽。將JH酯酶基因插入到苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)導(dǎo)致酶JH酯酶分泌到血淋巴中，從而改善了作為防治劑的病毒。蝎毒素和螨毒素也被插入到AcMNPV中。這些蛋白為分泌到血淋巴中，并對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起作用的神經(jīng)毒素。這些轉(zhuǎn)基因病毒的主要缺陷是外源基因編碼不得不在感染細(xì)胞外，例如在血淋巴中起作用的分泌產(chǎn)物。這些基因產(chǎn)物存在被昆蟲(chóng)解毒系統(tǒng)降解或消除的危險(xiǎn)。仍然需要開(kāi)發(fā)作為生物農(nóng)藥的新的轉(zhuǎn)基因病毒。尤其是需要通過(guò)將新類型的外源基因?qū)氩《净蚪M來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因病毒。本發(fā)明提供可用作于生物農(nóng)藥的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒。本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，該病毒與未改造的病毒相比，能迅速發(fā)揮作用并具有增強(qiáng)的毒性。本發(fā)明制備一種轉(zhuǎn)基因病毒，該病毒編碼代替在感染細(xì)胞外，而在感染細(xì)胞內(nèi)起作用的蛋白因子。最后，本發(fā)明提供一種殺蟲(chóng)組合物，該組合物包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，并可被用于防治昆蟲(chóng)種群。本發(fā)明的這些以及其它目的由下面描述的一個(gè)或多個(gè)具體實(shí)施方案來(lái)提供。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了一種轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，該病毒含有可操作性地與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)相接的編碼發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的外源DNA。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子與蛻皮和變態(tài)相關(guān)。本發(fā)明的具體實(shí)施方案還設(shè)計(jì)了包含這些轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒的殺蟲(chóng)劑和它們用于防治昆蟲(chóng)種群的應(yīng)用。本發(fā)明的這些和其它具體實(shí)施方案提供了新類型的轉(zhuǎn)基因病毒。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因病毒能使蛋白產(chǎn)物在病毒感染的細(xì)胞內(nèi)起作用，并且從而克服了與其它轉(zhuǎn)基因病毒的分泌蛋白相關(guān)的問(wèn)題。這一特性也使得轉(zhuǎn)基因病毒能迅速起作用并能有效地作為生物農(nóng)藥。圖1表明CfMNPV轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建。圖2表明CHR3DNA在CfMNPV的預(yù)期區(qū)域被插入。圖3表明在用重組病毒感染的細(xì)胞中的CHR3表達(dá)的時(shí)間過(guò)程。圖4表明在生物分析中AcMHR3的作用。AcMNPV(●)表示未修飾病毒，AcGFP(▲)表示AcMNPV重組表達(dá)綠色熒光的蛋白，和AcMHR3(■)表示AcMNPV重組表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子MHR3。本發(fā)明涉及含有發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的昆蟲(chóng)病毒和其對(duì)昆蟲(chóng)的防治。在一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼涉及蛻皮和變態(tài)的編碼昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的外源DNA的昆蟲(chóng)病毒。根據(jù)本發(fā)明，廣范圍的鱗翅目昆蟲(chóng)可被防治。具體的實(shí)例包括下面任何對(duì)病毒感染的敏感的昆蟲(chóng)均可作為用于本發(fā)明的靶。昆蟲(chóng)病毒為天然發(fā)生的昆蟲(chóng)病原體。它們可為DNA病毒或RNA病毒?，F(xiàn)有技術(shù)中已知許多昆蟲(chóng)病毒和它們的宿主范圍?，F(xiàn)有技術(shù)中任何昆蟲(chóng)病毒可用于本發(fā)明的目的。采用的昆蟲(chóng)病毒優(yōu)選為宿主特異性和環(huán)境安全的。較優(yōu)選的昆蟲(chóng)病毒為已被一般性地用作昆蟲(chóng)害蟲(chóng)生物防治劑的DNA病毒，例如桿狀病毒(核多角體病毒和顆粒體病毒)和寄生昆蟲(chóng)痘病毒。適用于本發(fā)明的RNA病毒包括但不局限于cypovirus。任何發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子適用于本發(fā)明。發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子為昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的五型。這些昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子為調(diào)節(jié)蛋白。它們通常具有內(nèi)含的核定位信號(hào)，該信號(hào)指導(dǎo)它們進(jìn)入細(xì)胞核，在那里它們與DNA相互作用并發(fā)揮它們的作用。它們還具有特異性的DNA結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與基因的調(diào)節(jié)區(qū)中的特定序列結(jié)合。發(fā)育調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子在昆蟲(chóng)中通常以少量產(chǎn)生并暫時(shí)和在空間上被調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生通常依賴于各種激素，例如由于昆蟲(chóng)激素，如蛻皮激素，保幼激素和其它激素的作用，它們被表達(dá)，活化，和/或失活。它們還可可能具有類似于激素受體或?qū)儆谑荏w超家族的結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有技術(shù)業(yè)已知發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子。它們包括，但不局限于果蠅BR-C，E74，E75，超氣孔(Ultraspiracle)E78，Sevenup，Kni/Knrl/egon，F(xiàn)TZ-Fl，DHR38，E93，Relish-抗菌轉(zhuǎn)錄因子，Col-頭模式轉(zhuǎn)錄因子，Escargot和蝸牛轉(zhuǎn)錄因子，例如胚胎翼盤(pán)，Dorsal轉(zhuǎn)錄因子，例如對(duì)UV發(fā)生應(yīng)答的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，DSX-M和DSX-F轉(zhuǎn)錄因子，分別如卵黃蛋白的阻遏和活化，Dif反式激活殺菌肽基因，無(wú)眼(Eyeless)轉(zhuǎn)錄因子，Gap基因Kni轉(zhuǎn)錄因子，類似于KappaE樣免疫基因的活化轉(zhuǎn)錄因子，由調(diào)節(jié)前和后末端(termini)的胚胎發(fā)育的Zygotic基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，和DHR78，DHR96，ManducaMHR3-蛻皮激素可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，卷蛾激素受體2(CHR2)，卷蛾激素受體3(CHR3)，樅色卷蛾蛻皮激素受體(CfEcR)，Choristonerafumiferana超氣孔蛋白(CfUSP)，活化轉(zhuǎn)錄因子的Spodoptera病毒gp64，以及Egr-1主開(kāi)關(guān)基因，及BombyxMori絲蛋白轉(zhuǎn)錄因子。最優(yōu)選的受發(fā)育調(diào)控的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子是那些與昆蟲(chóng)的蛻皮，再生，變態(tài)及發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。受發(fā)育調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子可以引發(fā)定基因組的表達(dá)，所述基因可以依次開(kāi)啟和關(guān)閉涉及蛻皮及變態(tài)等生理現(xiàn)象的基因。許多這樣的調(diào)節(jié)蛻皮及變態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，例如，卷蛾激素受體2(CHR2)，卷蛾激素受體3(CHR3)，樅色卷蛾蛻皮激素受體(CfEcR)，樅色卷蛾超氣孔蛋白(CfUSP)，Manduca激素受體3(MHR3)，及果蠅激素受體38(DHR38)。轉(zhuǎn)基因或重組昆蟲(chóng)病毒可以通過(guò)將編碼受發(fā)育調(diào)控的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的基因片斷或連續(xù)異源DNA引入病毒基因組內(nèi)而構(gòu)建。如現(xiàn)有技術(shù)中已知的，異源DNA可以一種順式構(gòu)型操作連接或共價(jià)連接于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，從而昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)由通常位于基因的5′端上游的調(diào)節(jié)區(qū)域驅(qū)使。另外，DNA片斷可以編碼融合蛋白及一種可分析產(chǎn)品，所述蛋白包含受發(fā)育調(diào)控的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子。編碼可分析產(chǎn)物的受體基因可在現(xiàn)有技術(shù)中方便地獲得?？煞治霎a(chǎn)物可以是一種便于分析的酶，例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)化酶，β-半乳糖苷酶，綠熒光蛋白，或熒光系酶。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域或啟動(dòng)子可以是早期或晚期病毒啟動(dòng)子或用于細(xì)胞中的組成啟動(dòng)子。這樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域是已知的再在現(xiàn)有技術(shù)中可方便獲得。它們包括但不限于晚期啟動(dòng)子，例如，多角體蛋白啟動(dòng)子及p10啟動(dòng)子，早期至晚期啟動(dòng)子，例如，ETL啟動(dòng)子，早期啟動(dòng)子，例如，速發(fā)早期基因1(IE1)，蛻皮類固醇葡糖基轉(zhuǎn)移酶(egt)啟動(dòng)子，及p35啟動(dòng)子，及組成啟動(dòng)子，例如，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可與編碼轉(zhuǎn)錄因子的一份或多份DNA相連接?？梢允褂门c不同啟動(dòng)子相連接的多份轉(zhuǎn)錄因子。另外也可以使用與多種啟動(dòng)子相連接的不同的轉(zhuǎn)錄因子。這些啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子的組合可用于提高轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和對(duì)修飾病毒的控制。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，將異源DNA引入病毒基因組位點(diǎn)或基因中所述基因與病毒宿主特性無(wú)關(guān)，其功能對(duì)于病毒不是必需的。有許多這樣的基因，例如，蛻皮類固醇UDP葡糖基轉(zhuǎn)移基因(egt)，p10基因，p48基因，多角體蛋白基因，這些基因可進(jìn)行分離并可用作異源DNA的引入位點(diǎn)。任何足以引起早熟及不完全蛻皮或異常昆蟲(chóng)進(jìn)化的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平在本發(fā)明中都進(jìn)行了研究。當(dāng)轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒感染昆蟲(chóng)時(shí)，昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)在可探測(cè)水平得到表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選地在高于受感染昆蟲(chóng)生理所需量的水平進(jìn)行表達(dá)或超表達(dá)。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄因了可以在幾乎所有引入轉(zhuǎn)基因病毒的昆蟲(chóng)組織內(nèi)得到表達(dá)。通常，為了得到轉(zhuǎn)基因病毒要建立重組轉(zhuǎn)錄載體。例如，編碼昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的DNA片斷可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，例如限制消化，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以及連接與病毒啟動(dòng)子或組成細(xì)胞啟動(dòng)子，例如p10啟動(dòng)子，進(jìn)行共價(jià)連接。隨后，將含有啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子的DNA片斷插入病毒基因座，例如，由可方便獲得的載體，例如pUC18攜帶的egt基因。通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中所用的方法例如脂轉(zhuǎn)染法可將重組轉(zhuǎn)移載體與昆蟲(chóng)病毒共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞線中。由重組轉(zhuǎn)移基因載體所攜帶的含有啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子的重組昆蟲(chóng)病毒可通過(guò)探測(cè)可分析產(chǎn)物，昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子，標(biāo)記基因或啟動(dòng)子進(jìn)行確定。探測(cè)可用南方印跡法，北方印跡法，PCR，西方印跡法，酶分析法，限制消化法，或現(xiàn)有技術(shù)中得到的任何其它方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒的建立和測(cè)定只需現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)技術(shù)。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因或重組病毒可用于生物殺蟲(chóng)劑。轉(zhuǎn)基因病毒的宿主范圍由未修飾的野生型病毒的天然宿主范圍決定。轉(zhuǎn)基因病毒的毒性要高于野生型病毒，至少要高于5倍并且通常高于10倍。昆蟲(chóng)病毒的毒性可用現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法方便測(cè)定。如果將插入病毒的轉(zhuǎn)錄因子從同一宿主昆蟲(chóng)中分離或者保持其在同一宿主昆蟲(chóng)中的天然狀態(tài)，轉(zhuǎn)基因病毒的效果最佳?？梢允褂脕?lái)自與宿主昆蟲(chóng)具有相同順序的昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄因子，或者來(lái)自使用類似轉(zhuǎn)錄因子的昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子的作用可由本領(lǐng)域技術(shù)人員方便確定。一旦病毒侵染了宿主昆蟲(chóng)，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因病毒可在宿主昆蟲(chóng)中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。通過(guò)常規(guī)方法，包括消化，吸入以及將轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒與昆蟲(chóng)或昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)進(jìn)行直接接觸，將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒侵染昆蟲(chóng)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)使用帶有轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒的內(nèi)含體由經(jīng)途徑給藥轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒。一般地，喂給昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)或昆蟲(chóng)的內(nèi)含體的量相當(dāng)于約0.2至0.001LD50的那類未修飾昆蟲(chóng)病毒和昆蟲(chóng)宿主。LD50依昆蟲(chóng)的種類和幼蟲(chóng)的年齡而異，并且LD50可由本領(lǐng)域技術(shù)人員方便測(cè)得。典型地，所用內(nèi)含體的數(shù)量與存在于某區(qū)域要處理的昆蟲(chóng)的數(shù)量有關(guān)。通常該數(shù)量的變化范圍為每英畝約103至約1012內(nèi)含子。優(yōu)選地，該數(shù)量為每英畝從約106至約109個(gè)內(nèi)含子并且更優(yōu)選為每英畝從103至106個(gè)內(nèi)含子。在內(nèi)含體形成不發(fā)生的情況下(例如當(dāng)多角體基因用作異源基因插入位點(diǎn)時(shí))，昆蟲(chóng)與轉(zhuǎn)基因和野生型病毒的芽(budded)病毒形態(tài)的共轉(zhuǎn)染提供了含有重組和野生型病毒的內(nèi)含體，并且允許由經(jīng)途徑進(jìn)行的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)染。本發(fā)明的殺蟲(chóng)組合物包含對(duì)適于環(huán)境的載體和轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，該組合物應(yīng)適于農(nóng)業(yè)應(yīng)用，森林應(yīng)用，或其它設(shè)想的特定的使用。一般地，組合物的組成必須是無(wú)毒的并且對(duì)于內(nèi)含病毒的完整性無(wú)害。對(duì)葉子的施用不應(yīng)該損傷或傷害植物葉子。除了適宜的固態(tài)的或較優(yōu)選的液態(tài)的載體，組合物應(yīng)包括分散劑，展布粘著劑，UV保護(hù)劑，昆蟲(chóng)誘導(dǎo)劑，病毒強(qiáng)化因子，粘著和粘合劑，乳化劑，潤(rùn)濕劑，以及刺激昆蟲(chóng)食用的試劑，但不包括產(chǎn)生不期望效果，例如阻抑昆蟲(chóng)食用的組分。用于殺蟲(chóng)組合物的適定的載體是已知的并在現(xiàn)有技術(shù)中可方便獲得，例如，稀釋劑例如水，粘土等。以下實(shí)施例僅用作解釋發(fā)明目的，并非用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建如圖1所示，通過(guò)首先將含有egt基因的6kb的CfMNPV片段克隆進(jìn)pUCuc18中來(lái)創(chuàng)建CfMNPV轉(zhuǎn)移載體。然后將含有AcMNPV多角體蛋白和p10啟動(dòng)子區(qū)以及在p10啟動(dòng)子下游的β-半乳糖苷酶可讀框插入egt基因的中部。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，用基于CHR3的N-末端和C-末端核苷酸序列的合成引物來(lái)擴(kuò)增CHR3cDNA。在所述的引物序列內(nèi)還含有BaglII限制酶位點(diǎn)。在電泳凝膠上檢查PCR產(chǎn)物并發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物的大小與預(yù)期的一致。然后使PCR產(chǎn)物通過(guò)Sephadex柱，除去引物、核苷酸和PCR混合物中的其他組份，以此來(lái)純?cè)揚(yáng)CR產(chǎn)物。然后用BaglII消化該DNA并用Sephadex柱除去被消化BaglII接頭而再次純化之。用T4DNA連接酶在16攝氏度16小時(shí)將該經(jīng)消化和純化的DNA與經(jīng)BamHI消化的CfMNPV轉(zhuǎn)移載體連接起來(lái)。該連接起來(lái)的DNA用BamHI消化以消除自體連接的載體。然后將該連接起來(lái)的DNA轉(zhuǎn)化入XLI藍(lán)細(xì)胞中，并用32P標(biāo)記的探針(Feinberg和Vogelstein，1984，分析生物化學(xué)，137，266-267)篩選重組克隆。從陽(yáng)性克隆中分離DNA并用BamHI消化之。將來(lái)源于該重組克隆但未被BamHI線性化的DNA和兩個(gè)CHR3引物用于PCR程序，來(lái)證實(shí)插入片段的大小。采用雙脫氧終止法對(duì)來(lái)自重組子的DNA測(cè)序。在3-和5-端，核苷酸序列與CHR3的3-和5-端的核苷酸序列一致。每一方向選取一個(gè)克隆，用于轉(zhuǎn)入CfMNPV。實(shí)施例2重組病毒的產(chǎn)生采用脂轉(zhuǎn)染法，將CFMNPVDNA和重組的轉(zhuǎn)移載體DNA(有義和反義方向的CHR3)共轉(zhuǎn)染到CF-124T細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染一周之后，收集培養(yǎng)基并將之用作純化重組病毒的空斑接種物。為了空斑純化，把各種稀釋度的重組芽(budded)病毒(BV)鋪板到CF-203細(xì)胞上。侵染一周后，用X-gal對(duì)接種板染色。挑取在最低稀釋度觀察到藍(lán)色的區(qū)域并將之再度空斑化。重復(fù)該步驟4次。得到了在有義方向和反義方向表達(dá)CHR3的兩株病毒。然后將空斑純化的病毒在CF-203細(xì)胞中擴(kuò)增。從BV中分離DNA，用HindIII消化并在瓊脂糖凝膠上分離之。將該凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜上，并用32P標(biāo)記的CHR3探針檢測(cè)。如圖2所示，在重組病毒DNA的消化物中觀察到與CHR3探針雜交的一條帶，但在野生型的DNA中卻未觀察到。重組子的HindIII消化圖譜與野生型CFMNPVDNA的相比較表明，CHR3插入到了CFMNPV的預(yù)期區(qū)域內(nèi)。把自重組病毒分離的DNA和CHR3引物用于CPR程序中，以證實(shí)該重組病毒中的CHR3插入體的大小。發(fā)現(xiàn)兩株病毒均含有預(yù)期大小的插入體。然后對(duì)該P(yáng)CR擴(kuò)增的DNA測(cè)序，該核苷酸序列與CHR3的序列相一致。實(shí)施例3CHR3表達(dá)的時(shí)間過(guò)程為了研究CHR3在被重組表達(dá)感染的CF-203細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)間過(guò)程，用以有義方向或反義方向表達(dá)CHR3的重組表達(dá)對(duì)CF-203細(xì)胞接種。分別在接種后0、6、12、24、48、96小時(shí)時(shí)收集細(xì)胞。分離總RNA，并采用CHR3cDNA作探針以Northern雜交法分析之。如圖3所示，無(wú)論用兩株病毒的那一株接種，在接種后24小時(shí)時(shí)CHR3mRNA開(kāi)始積累。直到接種后96小時(shí)時(shí)，該mRNA的還保持高水平存在。實(shí)施例4重組病毒殺蟲(chóng)活性的評(píng)價(jià)在第一組試驗(yàn)中，將從CF-203細(xì)胞中分離得到的1×105個(gè)包涵體(occlusionbodies)(OB)飼喂第5齡的樅色卷蛾幼蟲(chóng)，所述的CF-203細(xì)胞是用以有義方向或反義方向表達(dá)CHR3的重組病毒接種過(guò)的細(xì)胞。在用以有義方向表達(dá)CHR3的重組病毒對(duì)該幼蟲(chóng)飼喂2-3天后，10只幼蟲(chóng)中的8只表現(xiàn)出頭部被膜滑落(HCS)并保持在半死狀態(tài)，其它兩只以第5齡幼蟲(chóng)死亡。這些表現(xiàn)出頭部被膜滑落的幼蟲(chóng)，其頭部被膜不變黑，停止進(jìn)食，保持在半死狀態(tài)并最終死亡。在某些情況下，后腸自肛門(mén)伸出。這些癥狀與幼蟲(chóng)由于對(duì)非類固醇蛻皮激素拮抗劑tebufenozide的中毒而表現(xiàn)出的癥狀相似。用以反義方向表達(dá)CHR3的重組病毒飼喂的幼蟲(chóng)，沒(méi)有一只表現(xiàn)出這些癥狀。從表現(xiàn)出部分蛻皮癥狀的昆蟲(chóng)中分離獲得病毒，并用于第二組和第三組如表1和表2所示的生物試驗(yàn)。以低至100OB劑量的重組病毒飼喂的幼蟲(chóng)也表現(xiàn)出不完全蛻皮的典型癥狀。表1</tables>表2</tables>實(shí)施例5表達(dá)Manduca激素受體3(MHR3)的苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)的產(chǎn)生我們已經(jīng)構(gòu)建了表達(dá)MHR3的重組的AcMNPV。通過(guò)限制酶消化(即，以EcoRI和XhoI消化)來(lái)分離MHR3Cdna(Palli等人，1992，發(fā)育生物學(xué))，并克隆進(jìn)AcMNPV轉(zhuǎn)移載體pFASTBACI(生命科技公司)的EcoRI和XhoI位點(diǎn)之間。然后按照由生產(chǎn)商(生命科技公司)提供的步驟鑒定表達(dá)MHR3的AcMNPV重組子。采用MHR3cDNA作探針，以Southern印跡法驗(yàn)證MHR3DNA存在于AcMNPV重組子中。由空斑測(cè)驗(yàn)步驟測(cè)定病毒的滴度。用感染復(fù)數(shù)(MOI)為1的AcMNPV重組子對(duì)培養(yǎng)在SF-900培養(yǎng)基中的昆蟲(chóng)細(xì)胞系—草地貪夜蛾9細(xì)胞(ATCCCRL-1711)接種。在接種后12、24、48和96小時(shí)時(shí)收獲細(xì)胞。從一組細(xì)胞樣品中分離RNA，在1.0％的瓊脂糖甲醛凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜上，并在Northern雜交條件下用MHR3cDNA探測(cè)。從另一組細(xì)胞樣品中分離蛋白質(zhì)，并采用MHR3抗體以Western印跡分析該蛋白質(zhì)。在接種12小時(shí)后開(kāi)始在AcMHR3接種的SF-9細(xì)胞中檢測(cè)到MHR3RNA，并在接種24小時(shí)后開(kāi)始檢測(cè)到MHR3蛋白質(zhì)。然后通過(guò)生物測(cè)驗(yàn)法，用粉紋夜蛾幼蟲(chóng)對(duì)該重組的AcMHR3進(jìn)行評(píng)價(jià)。未經(jīng)修飾的AcMNPV和表達(dá)綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)的重組AcMNPV(其構(gòu)建方法類似于AcMHR3)被用來(lái)在生物測(cè)驗(yàn)中與AcMHR3比較。將含有一定量病毒(空斑形成單位)的溶液1μl注射入倒數(shù)第二齡的T.Ni幼蟲(chóng)體內(nèi)。注射之后，將幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到攝食杯中，并每日對(duì)該幼蟲(chóng)進(jìn)行觀察直至它們飼喂或化蛹。如圖4所示，AcMHR3能殺死昆蟲(chóng)，并且其效率比AcMNPV高1000倍。AcGFP的效率僅比AcMNPV高15倍。在上述說(shuō)明書(shū)中已對(duì)本發(fā)明的原則、優(yōu)選實(shí)施方案和操作方式進(jìn)行了描述。然而，不能把意欲在此得到保護(hù)的本發(fā)明看作限制在具體公開(kāi)的形式之內(nèi)，因?yàn)樗鼈儍H為了描述而不是限制。在不背離本發(fā)明精神的前提下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可進(jìn)行各種變化和改變。權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，含有異源DNA，所述的DNA編碼發(fā)育調(diào)控的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子并與轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地連接。2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，其中所述的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子與昆蟲(chóng)的蛻皮和變態(tài)有關(guān)。3.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，其中所述的異源DNA編碼包括受發(fā)育調(diào)控的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子和可測(cè)產(chǎn)物的融合蛋白。4.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，其中所述的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子選自果蠅BR-C、E74、E75、超氣孔蛋白、E78、Sevenup、Kni/Knrl/egon、FTZ-F1、DHR38、E93、Relish-抗細(xì)菌轉(zhuǎn)錄因子、Col-頭模式轉(zhuǎn)錄因子、Escargot和蝸牛轉(zhuǎn)錄因子、Dorsal轉(zhuǎn)錄因子、DSX-M和DSX-F轉(zhuǎn)錄因子、Dif、無(wú)眼轉(zhuǎn)錄因子、Gap基因kni轉(zhuǎn)錄因子、kB樣免疫基因活化轉(zhuǎn)錄因子、由調(diào)控前/后termini胚胎發(fā)育的合子基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子、DHR78、DHR96、ManducaMHR-3蛻皮激素誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子、卷蛾激素受體2(CHR2)、卷蛾激素受體3(CHR3)樅色卷蛾蛻皮激素受體(CfEcR)、樅色卷蛾超氣孔蛋白(CfUSP)、Spodoptera病毒gp64活化轉(zhuǎn)錄因子、Egr-1主開(kāi)關(guān)基因、以及BombyxMori絲蛋白轉(zhuǎn)錄因子。5.權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，其中所述的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子選自卷蛾激素受體2(CHR2)、卷蛾激素受體3(CHR3)、樅色卷蛾蛻皮激素受體(CfEcR)、樅色卷蛾超氣孔蛋白(CfUSP)、Manduca激素受體3(MHR3)、以及果蠅激素受體38(DHR38)。6.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，其中所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)選自p10啟動(dòng)子、多角體蛋白啟動(dòng)子、ETL啟動(dòng)子、IE1啟動(dòng)子、egt啟動(dòng)子、p35啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。7.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，其中所述的病毒是DNA病毒。8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，其中所述的DNA病毒選自桿狀病毒、昆蟲(chóng)痘病毒A、以及昆蟲(chóng)痘病毒B。9.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，其中所述的異源DNA存在于病毒基因之內(nèi)，所述病毒基因選自多角體蛋白基因、p10基因、p48基因、蛻皮類固醇葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因。10.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒，其中所述的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子在被權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒感染的昆蟲(chóng)中表達(dá)。11.殺蟲(chóng)組合物，含有權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒和適于環(huán)境的載體。12.治理害蟲(chóng)的方法，包括向含有所述害蟲(chóng)的地區(qū)施用權(quán)利要求11的殺蟲(chóng)組合物。13權(quán)利要求12的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因病毒含有編碼受發(fā)育調(diào)控的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的異源DNA，所述轉(zhuǎn)錄因子天然存在于所述的昆蟲(chóng)中。14.使昆蟲(chóng)異常發(fā)育的方法，包括用權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒侵染昆蟲(chóng)。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因病毒含有編碼受發(fā)育調(diào)控的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的異源DNA，所述轉(zhuǎn)錄因子天然存在于所述的昆蟲(chóng)中。全文摘要本發(fā)明描述的是一種含有昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因病毒。具體地講,該轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒含有涉及蛻皮和變態(tài)的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子。這樣的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)病毒可用作生物殺蟲(chóng)劑。文檔編號(hào)C12N7/00GK1190128SQ98100159公開(kāi)日1998年8月12日申請(qǐng)日期1998年1月22日優(yōu)先權(quán)日1997年1月22日發(fā)明者蘇巴·雷迪·帕利,巴茲爾·蒙塔茲·阿里夫,薩爾達(dá)·辛格·索黑,阿瑟·雷特納卡蘭申請(qǐng)人:加拿大自然資源部