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黑附球菌與曲霉屬真菌共培養(yǎng)的方法及獲得的化合物與流程

文檔序號(hào):11898949閱讀:1494來源:國(guó)知局
黑附球菌與曲霉屬真菌共培養(yǎng)的方法及獲得的化合物與流程

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域,具體涉及黑附球菌與曲霉屬真菌共培養(yǎng)的方法及獲得的化合物。



背景技術(shù):

曲霉屬真菌(Aspergillus spp.)是一類重要的絲狀真菌,該屬中很多類群與人類的生活和健康密切相關(guān),在傳統(tǒng)釀酒制醬和現(xiàn)代的食品加工業(yè)均有廣泛的運(yùn)用,如:曲霉屬與酵母菌、細(xì)菌或結(jié)合菌一起發(fā)酵大豆用于生產(chǎn)豆醬和醬油;混合發(fā)酵大米用于生產(chǎn)米酒;用于催熟奶酪可使奶酪具有特殊的風(fēng)味,還可用于熏制火腿、香腸等食物。多年來,在曲霉屬真菌中發(fā)現(xiàn)了大量次級(jí)代謝產(chǎn)物,具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。其中一些是具有很強(qiáng)致癌性的真菌毒素,如:曲霉屬真菌產(chǎn)生的黃曲霉毒素(Aflatoxins)和雜色曲霉素(Sterigmatocystin)在世界范圍內(nèi)的食品和農(nóng)作物中均有發(fā)現(xiàn);曲霉屬真菌也是重要的天然藥物來源,其產(chǎn)生的多種次級(jí)代謝產(chǎn)物廣泛應(yīng)用于臨床,如土曲霉(Aspergillus terreus)產(chǎn)生的洛伐他汀(Lovastatin)可作為抗膽固醇的降血壓特效藥劑。但隨著研究的不斷深入,從真菌中發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物的傳統(tǒng)的篩選模式得到的化合物卻是大量重復(fù)發(fā)現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)條件下曲霉只能產(chǎn)生有限的代謝產(chǎn)物,曲霉中有活性的新化合物越來越難以發(fā)現(xiàn),現(xiàn)有培養(yǎng)方法極大地限制了新化合物的發(fā)現(xiàn)。

近年來,一些新的研究策略被用來解決傳統(tǒng)方法發(fā)現(xiàn)真菌中新的代謝產(chǎn)物過程中遇到的困境,而大量真菌基因組測(cè)序的完成為開發(fā)真菌新的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)方法創(chuàng)造了條件。模式真菌基因組生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),大量的編碼天然產(chǎn)物基因簇處于“沉默”狀態(tài),這表明大量的潛在的具有新穎結(jié)構(gòu)的化合物隱藏在“沉默”基因簇中未被發(fā)現(xiàn)?;诖耍芯堪l(fā)現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)室條件下與其他生物的共培養(yǎng)可以對(duì)真菌帶來外在壓力,從而誘導(dǎo)真菌中“沉默”基因簇的表達(dá),從而可誘導(dǎo)新化合物的產(chǎn)生或產(chǎn)量增加。目 前已發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌與真菌的共培養(yǎng)導(dǎo)致新化合物產(chǎn)生的有:根霉菌(Rhizopus microsporus)與伯克氏菌(Burkholderia gladioli)的共培養(yǎng)可誘導(dǎo)抗菌聚酮化合物的合成;鐮刀菌(Fusarium tricinctum)與芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的共培養(yǎng)可導(dǎo)致大量次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生;鐮刀菌(F.pallidoroseum)與糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的共培養(yǎng)可誘導(dǎo)Tetramic Acid同系物的生成。細(xì)菌與曲霉屬真菌的共培養(yǎng)可誘導(dǎo)新化合物的產(chǎn)生,如:海生曲霉真菌(Emericella sp.)與放線菌(Salinispora arenicola)的共培養(yǎng)可誘導(dǎo)化合物emericellamides A和B的產(chǎn)生;煙曲霉(A.fumigatus)在與放線菌(Streptomyces spp.)共培養(yǎng)時(shí),可產(chǎn)生化合物N-Formyl Alkaloids和diketopiperazine;土曲霉(A.terreus)與芽孢桿菌(B.subtilis和B.cereus)的共培養(yǎng)可誘導(dǎo)相關(guān)化合物的產(chǎn)量提高34倍。關(guān)于通過真菌之間共培養(yǎng)而產(chǎn)生新的次級(jí)代謝產(chǎn)物的方法,僅有很少的報(bào)道,如鐮刀菌菌株(F.tricinctum和F.begoniae)間的共培養(yǎng)可誘導(dǎo)縮肽類化合物depsipeptides的產(chǎn)生;而發(fā)癬菌(Trichophyton rubrum)和淡色生赤殼菌(Bionectria ochroleuca)的共培養(yǎng)可誘導(dǎo)5個(gè)化合物的產(chǎn)生。目前尚無曲霉屬真菌通過與其他真菌共培養(yǎng)的方式產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)化合物的報(bào)道。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明提供了一種黑附球菌與曲霉屬真菌共培養(yǎng)的方法及獲得的化合物,首次公布了黑附球菌與曲霉屬真菌共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)新天然產(chǎn)物的方法,并發(fā)現(xiàn)曲霉孢子顏色變化可以作為次級(jí)代謝產(chǎn)物變化的指示反應(yīng),用于誘導(dǎo)或者激活曲霉菌中相關(guān)基因簇表達(dá),從而使曲霉產(chǎn)生單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)量極低和/或者不產(chǎn)生的新結(jié)構(gòu)化合物。

本發(fā)明的一個(gè)方面,提供一種黑附球菌與曲霉屬真菌共培養(yǎng)的方法,所述共培養(yǎng)方法可使曲霉菌產(chǎn)生在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)量極低和/或者單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)不產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物;所述方法包括如下步驟:

a)將所述黑附球菌與所述曲霉屬真菌分別接種于活化培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化;

b)將活化后的所述黑附球菌與所述曲霉屬真菌接種到同一培養(yǎng)容器的固體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng);或?qū)⒒罨蟮乃龊诟角蚓c所述曲霉屬真菌接 種到同一培養(yǎng)容器的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng);

c)當(dāng)所述固體培養(yǎng)基中的曲霉屬真菌孢子變成黃色時(shí),收集所述曲霉屬真菌及所述培養(yǎng)基獲取產(chǎn)物。

以上所述的共培養(yǎng)方法,所述黑附球菌為Epicoccum nigrum YL001,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào),郵編10010,保藏編號(hào)為:CGMCC No.11397,保藏日期為2015年10月16日。

以上所述的共培養(yǎng)方法,所述曲霉屬真菌包括構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉或米曲霉(Aspergillus oryzae)中的一種(均可由商業(yè)途徑或從中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心等菌種保藏機(jī)構(gòu)購買獲得)。

以上所述的共培養(yǎng)方法,步驟b)中所述固體培養(yǎng)基為固體真菌培養(yǎng)基,優(yōu)選為PDA培養(yǎng)基,所述液體培養(yǎng)基為液體真菌培養(yǎng)基,優(yōu)選為PDB培養(yǎng)基。

以上所述的共培養(yǎng)方法,步驟b)中所述靜置培養(yǎng)的溫度為25℃~28℃;所述振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)溫度25℃~28℃,100~250rpm/min。

以上所述的共培養(yǎng)方法,所述黑附球菌的活化培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基,所述曲霉屬真菌的活化培養(yǎng)基為GMM培養(yǎng)基。

以上所述的共培養(yǎng)方法,所述PDA固體培養(yǎng)基每升包括:PDA培養(yǎng)基粉成品37g,余量為蒸餾水,pH值自然;所述GMM固體培養(yǎng)基每升包括:葡萄糖10g,硝酸鹽母液50mL,微量元素母液1mL,酵母抽提物1g,瓊脂15-20g,余量為蒸餾水,pH值6.5。

以上所述的共培養(yǎng)方法,所述硝酸鹽母液每升包括:NaNO3 120g,KCl 10.4g,MgSO4·7H2O 10.4g,K2HPO4·3H2O 30.4g,余量為蒸餾水。

以上所述的共培養(yǎng)方法,所述微量元素母液每100mL包括ZnSO4·7H2O 2.2g,H3BO31.1g,MnCl2·4H2O 0.5g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.16g,CoCl2·5H2O 0.16g,CuSO4·5H2O 0.16g,(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.11g,Na2EDTA 5.0g,余量為蒸餾水。

本發(fā)明的另一個(gè)方面,提供利用以上所述的黑附球菌與構(gòu)巢曲霉在PDA培養(yǎng)基共培養(yǎng)方法獲得的化合物,所述化合物的通式如式1所示:

式1中,R=CHO或

本發(fā)明的再一個(gè)方面,提供利用以上所述的黑附球菌與土曲霉在PDA培養(yǎng)基共培養(yǎng)方法獲得的化合物,所述化合物Fallacino的化學(xué)式如式2所示。

本發(fā)明的又一個(gè)方面,提供利用以上所述的黑附球菌與米曲霉在PDA培養(yǎng)基共培養(yǎng)方法獲得的化合物,所述化合物Parasperone A的化學(xué)式如式3所示。

本發(fā)明的又一個(gè)方面,提供利用以上所述的黑附球菌與構(gòu)巢曲霉在PDB培養(yǎng)基共培養(yǎng)方法獲得的化合物,所述化合物的通式如式4所示:

式4中,或或

或或

本發(fā)明利用黑附球菌與曲霉屬的構(gòu)巢曲霉、土曲霉和米曲霉共培養(yǎng),以曲霉菌的孢子變色為指示,調(diào)控或者激活曲霉中相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)基因簇的表達(dá),導(dǎo)致相關(guān)化合物產(chǎn)量增加或者新化合物的生成。這為研究通過絲狀真菌間共培養(yǎng)的策略來提高其天然產(chǎn)物的產(chǎn)量或激活真菌中“沉默”基因簇的表達(dá)和發(fā)現(xiàn)新天然產(chǎn)物提供了新方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中在PDA培養(yǎng)基上黑附球菌和構(gòu)巢曲霉共培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況圖;

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中在PDA培養(yǎng)基上黑附球菌和土曲霉共培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況圖;

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中在PDA培養(yǎng)基上黑附球菌和米曲霉共培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況圖;

圖4為本發(fā)明實(shí)施例5中黑附球菌和構(gòu)巢曲霉在PDA培養(yǎng)基上共培養(yǎng)時(shí)化合物HPLC分析檢測(cè);

圖5為本發(fā)明實(shí)施例6中黑附球菌和土曲霉在PDA培養(yǎng)基上共培養(yǎng)時(shí)化合物HPLC分析檢測(cè);

圖6為本發(fā)明實(shí)施例7黑附球菌和米曲霉在PDA培養(yǎng)基上共培養(yǎng)時(shí)化合物HPLC分析檢測(cè);

圖7為本發(fā)明黑附球菌和構(gòu)巢曲霉液體在PDB培養(yǎng)基中共培養(yǎng)化合物HPLC分析檢測(cè)。

圖中標(biāo)記為A的部分,曲霉菌孢子已經(jīng)變?yōu)辄S色。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行更加詳細(xì)的說明,以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)。然而,以下描述的具體實(shí)施方式和實(shí)施例僅是說明的目的,而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

本發(fā)明所用的黑附球菌菌株菌種活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基,121℃高壓濕熱滅菌20-30分鐘。倒90mm培養(yǎng)皿,取黑附球菌菌絲接種,25℃靜置培養(yǎng)3天至7天,4℃保存,用于培養(yǎng)接種。

實(shí)施例2

本發(fā)明所用的曲霉菌種活化培養(yǎng)基為GMM培養(yǎng)基,每1L所述固體培養(yǎng)基按如下方法配制:葡萄糖10g,硝酸鹽母液50mL,微量元素母液1mL,酵母抽提物1g,瓊脂15-20g,上述成分依次添加,最后補(bǔ)加蒸餾水終體積至1L,pH值調(diào)至6.5,121℃高壓濕熱滅菌20-30分鐘。倒90mm培養(yǎng)皿,劃線接種,37℃靜置培養(yǎng)3天至4天。滅菌水收集孢子,每個(gè)平板收集孢子,制成終體積為2mL的孢子懸液,4℃保存用于培養(yǎng)接種。

其中,硝酸鹽母液配制(1L)方法如下:硝酸鈉NaNO3 120g,氯化鉀KCl 10.4g,硫酸鎂MgSO4·7H2O 10.4g,磷酸氫二鉀K2HPO4·3H2O 30.4g,上述成分依次添加,最后補(bǔ)加蒸餾水終體積至1L,pH值自然,121℃高壓濕熱滅菌20-30分鐘,室溫保存;

微量元素母液配制(100mL)方法如下:硫酸鋅ZnSO4·7H2O 2.2g,硼酸H3BO3 1.1g,氯化錳MnCl2·4H2O 0.5g,硫酸亞鐵FeSO4·7H2O 0.16g,氯化鈷CoCl2·5H2O 0.16g,硫酸銅CuSO4·5H2O 0.16g,鉬酸銨(NH4) 6Mo7O24·4H2O 0.11g,EDTA鈉鹽Na2EDTA 5.0g,上述成分依次添加,最后補(bǔ)加蒸餾水終體積至100mL,121℃高壓濕熱滅菌20-30分鐘,室溫保存。

實(shí)施例3

本發(fā)明所用的黑附球菌與曲霉共培養(yǎng)方法為:黑附球菌分別與構(gòu)巢曲霉、土曲霉及米曲霉同時(shí)接種到倒有PDA培養(yǎng)基的同一培養(yǎng)皿上,共同培 養(yǎng)。所述培養(yǎng)溫度為25℃~28℃,靜置培養(yǎng);培養(yǎng)一段時(shí)間后,接近黑附球菌一側(cè)的曲霉生長(zhǎng)受到明顯抑制,且曲霉孢子明顯變色;培養(yǎng)時(shí)間為4天至7天。

實(shí)施例4

本發(fā)明所用的黑附球菌與曲霉共培養(yǎng)方法為所述的黑附球菌菌絲與構(gòu)巢曲霉孢子同時(shí)接種到裝有PDB液體培養(yǎng)基的同一三角瓶中,共同培養(yǎng)。所述培養(yǎng)溫度為25℃~28℃,搖床振蕩100~250rpm/min,培養(yǎng)時(shí)間為4天至7天。

實(shí)施例5

黑附球菌與構(gòu)巢曲霉共培養(yǎng)化合物的HPLC分析:通過HPLC分析所述共培養(yǎng)中化合物的變化。在下述條件下進(jìn)行HPLC分析:裝置:Waters e2695系統(tǒng);檢測(cè)器:Waters 2998(200-600nm);色譜柱:38020-41COSMOSIL 5C18-MS-II Packed Column,4.6mm I.D.x 250mm;洗脫速度:1mL/min,洗脫劑:酸水(0.1%formic acid)和乙腈(0.1%formic acid)在20min內(nèi)將乙腈含量由20%乙腈/酸水增加至100%乙腈。

在將黑附球菌和構(gòu)巢曲霉共培養(yǎng)4天至7天獲得菌絲和培養(yǎng)基進(jìn)行化合物萃取。將1個(gè)平板的培養(yǎng)物分成小塊置于三角瓶中,加入20-40mL MEA(乙酸乙酯:甲醇:冰乙酸=89:10:1)進(jìn)行超聲萃取(超聲頻率80Hz,時(shí)間為1小時(shí));收集提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度30℃,轉(zhuǎn)速100rpm,真空度<3mmHg);蒸干后用0.30-0.60mL甲醇溶解,稀釋適當(dāng)濃度進(jìn)樣20-40ul,20-100%甲醇沖柱,進(jìn)行HPLC分析。在保留時(shí)間22.697min和23.389min的峰處檢測(cè)到式1;在保留時(shí)間在20min至25min的峰處檢測(cè)到式4。黑附球菌單獨(dú)培養(yǎng)4天至7天的萃取液中未檢出此化合物,而構(gòu)巢曲霉單獨(dú)培養(yǎng)4天至7天的萃取液中檢測(cè)到微量或檢測(cè)不到此化合物。

實(shí)施例6

黑附球菌與土曲霉共培養(yǎng)化合物的HPLC分析:通過HPLC研究所述共培養(yǎng)中化合物的變化。在下述條件下進(jìn)行HPLC分析:裝置:Waters e2695系統(tǒng)檢測(cè)器:Waters 2998(200-600nm);色譜柱:38020-41COSMOSIL5C18-MS-II Packed Column,4.6mm I.D.x 250mm;洗脫速度:1mL/min,洗脫劑:酸水(0.1%formic acid)和甲醇(0.1%formic acid)在20min內(nèi)將 甲醇含量由20%甲醇/酸水增加至100%甲醇。

在將黑附球菌和土曲霉共培養(yǎng)4天至7天獲得菌絲和培養(yǎng)基進(jìn)行化合物萃取。將1個(gè)平板的培養(yǎng)物分成小塊置于三角瓶中,加入20-40mL MEA(乙酸乙酯:甲醇:冰乙酸=89:10:1)進(jìn)行超聲萃取(超聲頻率80Hz,時(shí)間為1小時(shí));收集提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度30℃,轉(zhuǎn)速100rpm,真空度<3mmHg);蒸干后用0.30-0.60mL甲醇溶解,稀釋適當(dāng)濃度進(jìn)樣20-40ul,20-100%甲醇沖柱,進(jìn)行HPLC分析。在保留時(shí)間18.072的峰處檢測(cè)到式2。與此同時(shí),在將黑附球菌或土曲霉單獨(dú)培養(yǎng)4天至7天的萃取液中均未檢出此種化合物。

實(shí)施例7

黑附球菌與米曲霉共培養(yǎng)化合物的HPLC分析:通過HPLC研究所述共培養(yǎng)中化合物的變化。在下述條件下進(jìn)行HPLC:裝置:Waters e2695系統(tǒng)檢測(cè)器:Waters 2998(200-600nm);色譜柱:38020-41COSMOSIL5C18-MS-II Packed Column,4.6mm I.D.x 250mm;洗脫速度:1mL/min,洗脫劑:酸水(0.1%formic acid)和甲醇(0.1%formic acid)在20min內(nèi)將甲醇含量由20%甲醇/酸水增加至100%甲醇;。

在將黑附球菌和米曲霉共培養(yǎng)4天至7天的獲得的菌絲和培養(yǎng)基進(jìn)行化合物萃取。將1個(gè)平板的培養(yǎng)物分成小塊置于三角瓶中,加入20-40mL MEA(乙酸乙酯:甲醇:冰乙酸=89:10:1)進(jìn)行超聲萃取(超聲頻率80Hz,時(shí)間為1小時(shí));收集提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度30℃,轉(zhuǎn)速100rpm,真空度<3mmHg);蒸干后用0.30-0.60mL甲醇溶解,稀釋適當(dāng)濃度進(jìn)樣20-40ul,20-100%甲醇沖柱,進(jìn)行HPLC分析。在保留時(shí)間15.226的峰處檢測(cè)到式3。與此同時(shí),在將黑附球菌或米曲霉單獨(dú)培養(yǎng)4天至7天的培養(yǎng)液中未檢出此種化合物。

實(shí)施例8

黑附球菌與構(gòu)巢曲霉共培養(yǎng)化合物的分離純化:從實(shí)施例3和實(shí)施例4中得到的培養(yǎng)基中提取有機(jī)化合物,使用乙酸乙酯分離共培養(yǎng)菌株培養(yǎng)基3次,并使用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器在30℃將所述提取物在減壓下干燥,然后將所得的提取物硅膠柱梯度洗脫,結(jié)果得到7個(gè)組分。HPLC對(duì)所得到的組分進(jìn)行分析,結(jié)果證實(shí)在100%二氯甲烷洗脫的組分中含有式1和式4化合物。 將所述組分通過半制備液相色譜進(jìn)行制備。在保留時(shí)間22.697min和23.389min處分別得到式1化合物,而在保留時(shí)間20min至25min間得到式4化合物。

式1中,R=CHO或

式4中,或或

或或

實(shí)施例9

黑附球菌與土曲霉共培養(yǎng)化合物的分離和純化:從實(shí)施例3得到的培養(yǎng)基中提取有機(jī)化合物,使用乙酸乙酯分離共培養(yǎng)菌株培養(yǎng)基3次,并使用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器在30℃將所述提取物在減壓下干燥,然后將所得的提取物硅膠柱梯度洗脫,結(jié)果得到7個(gè)組分。HPLC對(duì)所得到的組分進(jìn)行分析,結(jié)果證實(shí)在二氯甲烷:甲醇=100:3洗脫的組分中含有式2。將所述組分分別通過葡萄糖凝膠柱層析和半制備液相色譜進(jìn)行制備。在保留時(shí)間15.397min處得到如式2化合物。

實(shí)施例10

黑附球菌與米曲霉共培養(yǎng)化合物的分離和純化:從實(shí)施例3得到的培養(yǎng)基中提取有機(jī)化合物,使用乙酸乙酯分離共培養(yǎng)菌株培養(yǎng)基3次。使用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器在30℃將所述提取物在減壓下干燥,然后將所得的提取物通過葡萄糖凝膠柱層析,使用甲醇進(jìn)行洗脫,得到含有式3化合物的組分。在半制備液相色譜進(jìn)行所得到的組分進(jìn)行分析,在70%甲醇/酸水的等度條件下進(jìn)行制備,獲得式3所示化合物。

最后應(yīng)說明的是:顯然,上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例,而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。

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