本發(fā)明涉及光動力學(xué)療法天然光敏劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種第二代光敏劑葉綠三酸Chlorine6的高效高純度制備方法。

背景技術(shù)：
葉綠三酸Chlorine6及其衍生物屬于光動力學(xué)療法的第二代光敏劑。Chlorine6是源自葉綠素的天然分子，具有光激發(fā)三線態(tài)壽命長，在可見光的紅區(qū)具有較高的摩爾吸光系數(shù)，與其他卟啉類光敏劑相比價格低廉，其研究應(yīng)用處于臨床試驗階段。Chlorine6一般通過葉綠素a堿性水解轉(zhuǎn)化獲得，商品化的Chlorine6的制備方法中涉及葉綠素的柱層析法分離提純，葉綠素a的得率較低，獲得的Chlorine6純度一般93％～98％。本發(fā)明不需要采用柱層析法分離提純?nèi)~綠素或葉綠三酸，無柱層析損失，葉綠素a利用效率高，最終獲得的葉綠三酸Chlorine6產(chǎn)率高。鈍頂螺旋藻是藍藻的一種，本發(fā)明以鈍頂螺旋藻為原料，制備的Chlorine6不含葉綠素a以外的其它葉綠素轉(zhuǎn)化的葉綠酸，HPLC純度大于99.5％。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對商品化葉綠三酸Chlorine6產(chǎn)率和純度較低的問題，提出了一種高效高純度Chlorine6的制備方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：本發(fā)明高純度葉綠三酸Chlorine6制備方法的具體步驟如下：⑴以培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期的鈍頂螺旋藻為原料，離心收集藻體。⑵藻體用乙醇萃取數(shù)次，萃取液合并。⑶萃取液中加入適量石油醚(沸程60～90℃)混勻，再加入萃取液1/5～1/3體積的水，旋蕩后進行反萃取，石油醚重復(fù)萃取數(shù)次，含色素的石油醚相用水－乙醇溶液(體積比1:1)洗滌數(shù)次。⑷石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液，攪拌反應(yīng)0.5～6h。⑸往上述混合液中加入去離子水，旋蕩后靜置分離，上層石油醚相含有類胡蘿卜素呈橙黃色，下層藍綠色的水－乙醇溶液用石油醚洗滌數(shù)次，至洗滌液無色。⑹滴加5mol/L鹽酸中和，離心分離沉淀，沉淀用去離子水洗滌數(shù)次。⑺沉淀用少量去離子水分散懸浮，-80℃速凍后冷凍干燥，獲得葉綠三酸Chlorine6固體粉末。⑻在上述步驟⑹中，5mol/L鹽酸中和后，加入二氯甲烷溶劑萃取，萃取液用去離子水洗滌數(shù)次。⑼采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法回收二氯甲烷，得到密實的葉綠三酸Chlorine6固體。本發(fā)明制備的Chlorine6不含葉綠素a以外的其它葉綠素轉(zhuǎn)化的葉綠酸，HPLC純度大于99.5％。附圖說明圖1為實施例4所得葉綠三酸Chlorine6的結(jié)構(gòu)圖。圖2為實施例4堿催化反應(yīng)后石油醚相類胡蘿卜素溶液的吸收光譜。圖3為實施例4堿催化反應(yīng)后水-乙醇相含鎂葉綠三酸鈉鹽的吸收光譜。圖4為實施例4所得產(chǎn)品葉綠三酸鈉鹽乙醇溶液的吸收光譜。圖5為實施例4所得產(chǎn)品葉綠三酸乙醇溶液的吸收光譜圖。圖6為實施例4所得產(chǎn)品的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜圖。基質(zhì)中的三氟乙酸使得葉綠三酸帶正電，分子離子峰([M+H]+)的質(zhì)荷比m/z為597.541，與葉氯三酸的理論分子量596.67一致。具體實施方式下面的實施例是對本發(fā)明的進一步描述。實施例1本發(fā)明的高純度葉綠三酸Chlorine6的制備方法的具體步驟如下：取生長至對數(shù)生長期后期的鈍頂螺旋藻藻液1L，離心分離藻體，棄去上清液，沉淀富集在1個離心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。萃取液中加入20mL石油醚(沸程60～90℃)混勻，再加入萃取液1/3體積的水，旋蕩后進行反萃取，石油醚重復(fù)萃取兩次，含色素的石油醚相用20mL水－乙醇溶液(體積比1:1)洗滌兩次。石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL，攪拌反應(yīng)0.5h。往上述混合液中加入10mL水，旋蕩后靜置分離，上層石油醚相含有類胡蘿卜素呈橙黃色，下層藍綠色的水－乙醇溶液用石油醚洗滌兩次。滴加5mol/L鹽酸中和至pH約為5，離心分離沉淀，沉淀用去離子水洗滌兩次。沉淀用少量去離子水分散懸浮，-80℃速凍后冷凍干燥，獲得葉綠三酸Chlorine6固體粉末。實施例2本發(fā)明的高純度葉綠三酸Chlorine6的制備方法的具體步驟如下：取生長至對數(shù)生長期后期的鈍頂螺旋藻藻液1L，離心分離藻體，棄去上清液，沉淀富集在1個離心管中，然后用40mL乙醇萃取三次，萃取液合并。萃取液中加入15mL石油醚(沸程60～90℃)混勻，再加入萃取液1/3體積的水，旋蕩后進行反萃取，石油醚重復(fù)萃取兩次，含色素的石油醚相用0.5mol/LNaOH的水－乙醇溶液(體積比1:1)15mL快速洗滌兩次。石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL，攪拌反應(yīng)2h。往上述混合液中加入10mL水，旋蕩后靜置分離，上層石油醚相含有類胡蘿卜素呈橙黃色，下層藍綠色的水－乙醇溶液用石油醚洗滌兩次。滴加5mol/L鹽酸中和至pH約為5，離心分離沉淀，沉淀用去離子水洗滌兩次。沉淀用少量去離子水分散懸浮，-80℃速凍后冷凍干燥，獲得葉綠三酸Chlorine6固體粉末。實施例3本發(fā)明的高純度葉綠三酸Chlorine6的制備方法的具體步驟如下：取生長至對數(shù)生長期后期的鈍頂螺旋藻藻液1L，離心分離藻體，棄去上清液，沉淀富集在1個離心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。萃取液中加入20mL石油醚(沸程60～90℃)混勻，再加入萃取液1/3體積的水，旋蕩后進行反萃取，石油醚重復(fù)萃取兩次，含色素的石油醚相用20mL水－乙醇溶液(體積比1:1)洗滌兩次。石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL，攪拌反應(yīng)3h。往上述混合液中加入10mL水，旋蕩后靜置分離，上層石油醚相含有類胡蘿卜素呈橙黃色，下層藍綠色的水－乙醇溶液用石油醚洗滌兩次。滴加5mol/L鹽酸中和至pH約為5，加入二氯甲烷溶劑萃取，萃取液用去離子水洗滌數(shù)次。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法回收二氯甲烷，得到密實的葉綠三酸Chlorine6固體。實施例4本發(fā)明的高純度葉綠三酸Chlorine6的制備方法的具體步驟如下：取生長至對數(shù)生長期后期的鈍頂螺旋藻藻液1L，離心分離藻體，棄去上清液，沉淀富集在1個離心管中，然后用40mL乙醇萃取三次，萃取液合并。萃取液中加入15mL石油醚(沸程60～90℃)混勻，再加入萃取液1/3體積的水，旋蕩后進行反萃取，石油醚重復(fù)萃取兩次，含色素的石油醚相用0.5mol/LNaOH的水－乙醇溶液(體積比1:1)15mL快速洗滌兩次。石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL，攪拌反應(yīng)6h。往上述混合液中加入10mL水，旋蕩后靜置分離，上層石油醚相含有類胡蘿卜素呈橙黃色，下層藍綠色的水－乙醇溶液用石油醚洗滌兩次。滴加5mol/L鹽酸中和至pH約為5，加入二氯甲烷溶劑萃取，萃取液用去離子水洗滌數(shù)次。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法回收二氯甲烷，得到密實的葉綠三酸Chlorine6固體。盡管已經(jīng)示出了本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以根據(jù)上述說明對這些實施例進行改進或變換，而這些改進或變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所述權(quán)利要求的保護范圍。