本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中受植物激素調(diào)控的啟動子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

啟動子是一段能使基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的DNA序列，轉(zhuǎn)錄的RNA通過進(jìn)一步的翻譯和修飾形成功能蛋白質(zhì)。根據(jù)啟動子作用的方式及功能不同，可以大致分為4類：組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組織或發(fā)育階段特異型啟動子和合成型啟動子。外源基因在組織或發(fā)育階段特異型啟動子的調(diào)控下，能夠在某些特定的組織器官中表達(dá)。

生長素(auxin)是一類含有一個不飽和芳香族環(huán)和一個乙酸側(cè)鏈的內(nèi)源激素，英文簡稱IAA。除吲哚乙酸外，4-氯-IAA、5-羥-IAA、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸等為類生長素。1872年波蘭園藝學(xué)家謝連斯基對根尖控制根伸長區(qū)生長作了研究；后來達(dá)爾文父子對草的胚芽鞘向光性進(jìn)行了研究。1928年溫特證實了胚芽的尖端確實產(chǎn)生了某種物質(zhì)，能夠控制胚芽生長。1934年，凱格等人從一些植物中分離出了這種物質(zhì)并命名它為吲哚乙酸，因而習(xí)慣上常把吲哚乙酸作為生長素的同義詞。

生長素在植物的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，這些作用包括生長素可促進(jìn)細(xì)胞伸長和莖干生長、誘導(dǎo)形成層及組織培養(yǎng)中的細(xì)胞分裂、木質(zhì)部和韌皮部等維管組織的分化及根的發(fā)生和分化、介導(dǎo)重力和光的向性反應(yīng)、維持頂端優(yōu)勢、延緩葉片衰老和果實成熟、抑制葉片和果實脫落、誘導(dǎo)座果與生長、增加同化活動向生長素源的分配、促進(jìn)雌雄異株花的雌性化和鳳梨科植物的開花。此外，生長素還影響早期胚胎發(fā)育中的胚軸形成，影響原基發(fā)育以及協(xié)調(diào)植物的形態(tài)發(fā)生。

油菜素內(nèi)酯(Brassinolide，BR)是一種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，從1970s被發(fā)現(xiàn)以來，之后的數(shù)十年的研究表明油菜素內(nèi)酯同動物的固醇類激素相似，都能夠促進(jìn)細(xì)胞的延伸和分裂，調(diào)控植物的衰老、花粉的發(fā)育、果實的成熟和植物對各種環(huán)境信號的響應(yīng)。油菜素內(nèi)酯合成途徑的闡明和1990s在擬南芥和其他幾種作物中油菜素內(nèi)酯缺陷型、不敏感型突變體的發(fā)現(xiàn)證實了同我們所熟知的包括生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素在內(nèi)的其他激素一樣對植物的正常的生長發(fā)育起著關(guān)鍵的作用。

同生長素和細(xì)胞分裂素一樣，BR不僅參與了簡單的細(xì)胞伸長，而且調(diào)控復(fù)雜生物學(xué)過程中細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而影響著細(xì)胞周期和分生組織的大小。BR的存在保證了葉綠體的正常發(fā)育和植物的正常開花。BR參與了花藥和花粉的發(fā)育以及花器官和心皮邊緣分生組織的形成。BR可以通過修飾包括過氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶等抗氧化酶和非酶的抗氧化劑，從而有助于超氧自由基、過氧化氫以及羥基的清除，減小氧脅迫對植物的傷害。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種受植物激素BR和IAA誘導(dǎo)的啟動子。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了名稱為Pbhlh7的DNA分子，該DNA分子具有啟動子功能，可以啟動目的基因表達(dá)。

本發(fā)明所提供的DNA分子，是下述a)或b)或c)的DNA片段：

a)3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第1557-2266位核苷酸序列，并且從SEQ ID No.1的第1557位開始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延長，得到長度為710至2266bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能；

b)與a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有啟動子功能的DNA片段；

c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。

其中，SEQ ID No.1由2266個核苷酸組成。

上述DNA分子中，所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次。每次5min 0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次。每次15min。

上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％、95％以上的同一性。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點突變的方法，對本發(fā)明的DNA分子核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的DNA分子核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表達(dá)靶基因的啟動子活性，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的啟動子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機(jī)軟件進(jìn)行評價。使用計算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。

上述DNA分子中，所述DNA分子的最后一位核苷酸是SEQ ID No.1的第2266位。

上述DNA分子中，所述DNA分子是下述A1)-A3)中的任一種DNA片段：

A1)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第783-2266位核苷酸序列，并且從SEQ ID No.1的第783位開始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延長，得到長度為1484至2266bp的任意一個DNA片段；

A2)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第458-2266位核苷酸 序列，并且從SEQ ID No.1的第458位開始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延長，得到長度為1809至2266bp的任意一個DNA片段；

A3)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第358-2266位核苷酸序列，并且從SEQ ID No.1的第358位開始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延長，得到長度為1909至2266bp的任意一個DNA片段。

上述DNA分子中，所述DNA分子為下述1)-5)中任意一種：

1)核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.1的第358-2266位核苷酸所示的DNA分子；

2)核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.1的第783-2266位核苷酸所示的DNA分子；

3)核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.1的第1-2266位核苷酸所示的DNA分子；

4)核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.1的第1557-2266位核苷酸所示的DNA分子；

5)核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.1的第458-2266位核苷酸所示的DNA分子。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了含有所述DNA分子的生物材料。

本發(fā)明所提供的含有所述DNA分子的生物材料，為下述B1)至B19)中的任一種：

B1)含有所述DNA分子的表達(dá)盒；

B2)含有所述DNA分子的重組載體；

B3)含有B1)所述表達(dá)盒的重組載體；

B4)含有所述DNA分子的重組微生物；

B5)含有B1)所述表達(dá)盒的重組微生物；

B6)含有B2)所述重組載體的重組微生物；

B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；

B8)含有所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

B9)含有B1)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

B10)含有B2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

B11)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

B12)含有所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物組織；

B13)含有B1)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；

B14)含有B2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；

B15)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；

B16)含有所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物器官；

B17)含有B1)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；

B18)含有B2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官；

B19)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。

上述生物材料中，所述表達(dá)盒可由所述DNA分子、所述DNA分子啟動表達(dá)的目的 基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉(zhuǎn)錄終止序列連接。在本發(fā)明的一個實施例中，所述目的基因具體為β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述目的基因具體為綠色螢光蛋白(GFP)基因。

所述重組載體中，由所述DNA分子啟動目的基因的表達(dá)。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組載體具體為在pIG46載體的多克隆位點插入所述啟動子得到的重組質(zhì)粒pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS。所述多克隆位點具體為限制性內(nèi)切酶識別位點ClaI和PstI。所述目的基因具體為β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因。

在本發(fā)明的另一個實施例中，所述重組載體具體為將pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中所述啟動子啟動的目的基因替換為綠色螢光蛋白(GFP)基因得到的重組質(zhì)粒pIG46-Pbhlh7-GFP。

上述表達(dá)盒或重組載體可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、微注射法、電穿孔法和微束激光打孔法等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化動物器官或組織或細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或組織或器官。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述DNA分子作為啟動子的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述P1或P2的成套試劑：

P1、調(diào)控植物生長的成套試劑，由所述DNA分子與植物激素組成；

P2、調(diào)控植物生長的成套試劑，由所述生物材料與所述植物激素組成。

上述成套試劑中，所述植物激素具體可為油菜素內(nèi)酯或IAA。所述油菜素內(nèi)酯可為油菜素內(nèi)酯溶液或油菜素內(nèi)酯水溶液。所述油菜素內(nèi)酯溶液的由溶質(zhì)和溶劑組成，所述溶質(zhì)為油菜素內(nèi)酯，所述溶劑為W5溶液，所述油菜素內(nèi)酯溶液中油菜素內(nèi)酯的濃度可為0.1-10μM，如1μM和0.5μM。所述W5溶液可為由溶質(zhì)和溶劑組成的溶液，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)及其濃度分別為0.154mol/L NaCl、0.125mol/L CaCl₂、5mmol/L KCl和2mmol/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)。

所述油菜素內(nèi)酯水溶液為向水中加入油菜素內(nèi)酯得到的溶液，所述油菜素內(nèi)酯水溶液中油菜素內(nèi)酯的濃度可為0.1-100μM，如1μM和10μM。

所述IAA可為IAA溶液或IAA水溶液。所述IAA溶液的由溶質(zhì)和溶劑組成，所述溶質(zhì)為IAA，所述溶劑為W5溶液，所述IAA溶液中油IAA的濃度可為0.1-10μM，如0.5μM、1μM和5μM。

上述成套試劑中，所述DNA分子可為所述A3)。所述DNA分子具體可為所述1)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：

M1、所述DNA分子在植物中啟動目的基因表達(dá)中的應(yīng)用；

M2、所述生物材料在植物中啟動目的基因表達(dá)中的應(yīng)用；

M3、所述成套試劑在植物中啟動目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：

N1、所述DNA分子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；

N2、所述生物材料在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；

N3、所述成套試劑在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述植物可為陸生植物。所述陸生植物具體可為單子葉植物。所述單子葉植物可為玉米。所述玉米可為玉米自交系齊319。

實驗證明，本發(fā)明的DNA分子——Pbhlh7具有啟動子活性，可以啟動目的基因的表達(dá)：Pbhlh7可以啟動目的基因GUS的表達(dá)，含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS(pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中，Pbhlh7與目的基因GUS相連接)的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活是含有pIG46空載載體的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活的53.6倍；Pbhlh7還可以啟動目的基因GFP的表達(dá)。

實驗證明，本發(fā)明的DNA分子——Pbhlh7的啟動子活性受植物激素的誘導(dǎo)，并且Pbhlh7的啟動子活性隨植物激素濃度與誘導(dǎo)時間的變化而變化：0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的酶活分別為0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-GUS的原生質(zhì)體的5.36、6.81、3.69、0.93和1.28倍；0.5μM BR處理0小時、0.25小時、0.5小時、1小時、3小時、6小時和12小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的酶活分別是0μM BR各相應(yīng)處理時間的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的酶活的1.03、3.34、4.51、2.80、1.47、1.32、0.76倍。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系中，0.1μM、1μM、10μM和100μM BR處理的轉(zhuǎn)基因植株的GUS酶活分別為0μM BR處理的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活的5.68、3.31、3.40和1.02倍；0.1μM BR處理0小時、0.25小時、0.5小時、1小時、3小時、6小時和12小時的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活分別是0μM BR各相應(yīng)處理時間的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活的1.04、1.26、1.70、5.03、3.28、1.14、0.86倍。0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活分別為0μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的酶活的1.66、1.47、1.89、1.48、1.16倍。1μM IAA處理0小時、0.1小時、0.25小時、0.5小時、1小時、3小時、6小時和12小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的酶活分別是0μM IAA各相應(yīng)處理時間的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的酶活的0.96、1.61、1.75、1.42、1.75、1.55、1.32、0.93倍。

實驗證明，本發(fā)明的DNA分子——Pbhlh7的不同截短片段也具有啟動子活性，并 且部分截短片段的啟動子活性也受植物激素的誘導(dǎo)：0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS和pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的酶活分別為0μM BR處理的含有pIG46空載體的原生質(zhì)體中GUS蛋白的酶活的148.5、165.86、134.9、1.34倍，說明Pbhlh7的截短片段(Pbhlh7-1484和Pbhlh7-710)均具有啟動子活性。0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS和pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的酶活分別為0μM BR處理的含有各相應(yīng)重組載體原生質(zhì)體中的GUS酶活的5.96、5.20、1.21、1.41、1.01倍，說明Pbhlh7的截短片段(Pbhlh7-1909)的啟動子活性受BR的誘導(dǎo)。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系中，1μM IAA處理的轉(zhuǎn)基因植株的GUS酶活為0μM IAA處理的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活的1.76倍。

實驗證明，本發(fā)明的DNA分子——Pbhlh7及其不同的片段具有啟動子活性，并且本發(fā)明的DNA分子——Pbhlh7及其部分片段受到植物激素的誘導(dǎo)，可以利用本發(fā)明的DNA分子——Pbhlh7及其部分片段培育轉(zhuǎn)基因植物，如受植物激素(如油菜素內(nèi)酯或IAA)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物。

附圖說明

圖1為重組載體pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的構(gòu)建過程。

圖2為重組載體pIG46-Pbhlh7-GFP的構(gòu)建過程。

圖3為Pbhlh7的功能驗證結(jié)果。其中，A為培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS和pIG46的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活，Pbhlh7:GUS表示培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體，pIG46表示培養(yǎng)后的含有pIG46的原生質(zhì)體；B為培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP和pIG46的原生質(zhì)體中GFP表達(dá)情況，a為培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生質(zhì)體中綠色熒光蛋白發(fā)光情況，b為白光下的培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生質(zhì)體，c為培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生質(zhì)體中葉綠體的自發(fā)熒光，d為a、b和c的疊加。

圖4為瞬時轉(zhuǎn)化體系中油菜素內(nèi)酯對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)作用。其中，A為不同濃度的BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活，NT表示0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活；B為油菜素內(nèi)酯的處理時間對Pbhlh7啟動子活性的影響。

圖5為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系中油菜素內(nèi)酯對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)作用。其中，A為不同濃度的BR處理的轉(zhuǎn)基因植株中GUS蛋白的酶活，NT表示0μM BR處理的轉(zhuǎn)基因植株GUS蛋白的酶活；B為油菜素內(nèi)酯的處理時間對Pbhlh7啟動子活性的影響。

圖6為瞬時轉(zhuǎn)化體系中Pbhlh7的不同截短片段的啟動子活性及油菜素內(nèi)酯對Pbhlh7的不同截短片段啟動子活性的誘導(dǎo)作用。其中，A為Pbhlh7的不同截短片段的啟動子活性，NT表示0.5μM BR處理的含有pIG46的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活；B為油菜素內(nèi)酯對Pbhlh7的不同截短片段啟動子活性的誘導(dǎo)作用。

圖7為瞬時轉(zhuǎn)化體系中生長素對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)作用。其中，A為不同濃度的IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活，NT表示0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活；B為IAA的處理時間對Pbhlh7啟動子活性的影響。

圖8為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系中IAA對Pbhlh7啟動子活性誘導(dǎo)作用的檢測結(jié)果。其中，control為0μM IAA處理的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活。

圖9為pCAMBIA3301-Pbhlh7-Intron-GUS的構(gòu)建過程。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的玉米自交系齊319(王艷麗等，玉米自交系齊319在種質(zhì)改良中的應(yīng)用，農(nóng)業(yè)科技通訊2013(8))公眾可從申請人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的載體pIG46(Ono A et al.,The rab16B promoter of rice contains two distinct abscisic acid responsive elements,Plant physiology,1996Oct；112(2):483-491.)公眾可從申請人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的載體pCAMBIA3301(Liu et al.,Identification and characterization of promoters specifically and strongly expressed in maize embryos,Plant Biotechnology Journal(2014)12,pp.1286–1296)公眾可從申請人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer試劑盒為Promega公司產(chǎn)品,貨號為E4030。

下述實施例中的酶解液為向去離子水中加入纖維素酶(Cellulase R10)、離析酶(Macerozyme R10)、甘露醇、KCl、CaCl₂和BSA得到的溶液，酶解液中，纖維素酶(Cellulase R10)、離析酶(Macerozyme R10)、甘露醇、KCl、CaCl₂和BSA的濃度分 別為0.15g/10ml、0.04g/10ml、0.4mol/L、2mM、10mM和0.01g/10ml。

下述實施例中的W5溶液溶液為由溶質(zhì)和溶劑組成的溶液，其中，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度分別為0.154mol/L NaCl、0.125mol/L CaCl₂、5mmol/L KCl和2mmol/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)。

實施例1、Pbhlh7啟動子的克隆及功能驗證

1、Pbhlh7啟動子的克隆及重組載體的構(gòu)建

以提取得到的玉米自交系齊319葉片的基因組DNA為模板，用引物F：5′-ATCGATGTTCGCTTTCATGTAATCGTTGTGC-3′(下劃線處為ClaI的識別序列)和引物R：5′-CTGCAGTGAAAGAGAGAAAGGC-3′(下劃線處為PstI的識別序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增程序為：94℃2min；94℃20s，56℃20s，72℃70s，33個循環(huán)；72℃5min。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pIG46分別用ClaI和PstI進(jìn)行雙酶切，然后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，經(jīng)篩選后挑取單克隆測序，將經(jīng)測序后表明含有序列表中SEQ ID No.1所示DNA片段(Pbhlh7)的重組載體命名為pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的構(gòu)建過程如圖1所示。SEQ ID No.1由2266個核苷酸組成，為啟動子Pbhlh7的核苷酸序列。

將SEQ ID No.2所示的DNA片段和pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS分別用PstI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，然后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，經(jīng)篩選后挑取單克隆測序，將經(jīng)測序后表明含有序列表中SEQ ID No.2所示DNA片段(SEQ ID No.2所示DNA片段含有GFP的編碼基因和終止子Tnos)的重組載體命名為pIG46-Pbhlh7-GFP，pIG46-Pbhlh7-GFP的構(gòu)建過程如圖2所示。

其中，SEQ ID No.2的第1-6位為PstI的識別序列，SEQ ID No.2的第987-992位為EcoRI的識別序列，SEQ ID No.2的第7-723位為GFP的編碼基因，SEQ ID No.2的第734-986位為終止子Tnos的序列。

2、Pbhlh7啟動子的功能鑒定

選取黑暗條件下生長至二葉一心的玉米自交系齊319的第一片真葉，將該真葉中部5-6cm部分沿垂直于葉脈的方向切成寬為1mm左右的細(xì)絲，將細(xì)絲置于10ml酶解液中，避光酶解5小時，酶解過程始終保持40r/min持續(xù)震蕩，酶解結(jié)束后得到玉米葉肉原生質(zhì)體。

參考文獻(xiàn)(Yoo SD,Cho YH,Sheen J.Arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell system for transient gene expression analysis.Nature Protocols,2007,2:1565-1572)中的PEG誘導(dǎo)葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化法，對該PEG誘導(dǎo)葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化法進(jìn)行以下的改動：①在洗去酶解液后，用W5溶液輕柔重懸收集到的原生質(zhì)體，冰上放置40min，以達(dá)到徹底沉降原生質(zhì)體的目的；②完成原生質(zhì)體沉降后，50g離心1min，避免過高的離心力導(dǎo)致細(xì)胞間壓力過大，減小對原生質(zhì)體的傷害；③加入220μl 30％的PEG-Ga²⁺溶液后，室溫誘導(dǎo)10min，分別將pIG46、步驟1的pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS和pIG46-Pbhlh7-GFP導(dǎo)入玉米葉肉原生質(zhì)體中，分別得到含有pIG46的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體和含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生質(zhì)體。

將含有pIG46的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體和含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生質(zhì)體分別在弱光下在W5溶液中過夜培養(yǎng)16小時分別得到培養(yǎng)后的含有pIG46的原生質(zhì)體、培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體和培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生質(zhì)體。

GUS相對酶活的測定：利用Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer試劑盒分別測定培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中的GUS和LUC酶活，將組成型表達(dá)的LUC酶活作為內(nèi)參，得到培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活(圖3中A)。

按照上述方法，將培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體替換為培養(yǎng)后的含有pIG46的原生質(zhì)體，其他步驟均不變，得到培養(yǎng)后的含有pIG46的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活(圖3中A)。

結(jié)果顯示，培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活是培養(yǎng)后的含有pIG46的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活的53.6倍，表明Pbhlh7具有啟動子活性，可以驅(qū)動GUS基因的表達(dá)。

在激光共聚焦顯微鏡下，觀察培養(yǎng)后的含有pIG46的原生質(zhì)體和培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生質(zhì)體中的GFP基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3中B所示。結(jié)果顯示，培養(yǎng)后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生質(zhì)體的細(xì)胞核、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中可見綠色熒光，表明Pbhlh7具有啟動子活性，可以驅(qū)動GFP基因的表達(dá)。

實施例2、Pbhlh7的啟動子活性受油菜素內(nèi)酯的誘導(dǎo)

實驗重復(fù)四次，每次重復(fù)實驗的具體步驟如下：

1、瞬時轉(zhuǎn)化體系中油菜素內(nèi)酯對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)

1.1不同濃度的油菜素內(nèi)酯對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)作用

將實施例1步驟2的含有pIG46-Pbhlh7-GUS的原生質(zhì)體在弱光下在0.5μM BR溶液(0.5μM BR溶液為向W5溶液中添加油菜素內(nèi)酯(BR)得到的BR濃度為0.5μM的溶液)中培養(yǎng)1小時，得到0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

按照上述方法，將0.5μM分別替換為0μM、0.1μM、1μM、5μM和10μM，其他步驟均不變，得到0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.1μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、1μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體和10μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

按照實施例1步驟2中GUS相對酶活的測定方法，分別測定上述0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.1μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、1μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體和10μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活(圖4中A)，將0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活定義為1。

結(jié)果顯示，將0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活定為1(圖4中A)，0.1μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、1μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體和10μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活分別為5.36、6.81、3.69、0.93、1.28(圖4中A)。表明，油菜素內(nèi)酯可以誘導(dǎo)Pbhlh7的啟動子活性，并且Pbhlh7的啟動子活性隨油菜素內(nèi)酯的濃度變化，油菜素內(nèi)酯的濃度為0.5μM時Pbhlh7的啟動子活性最高。

1.2油菜素內(nèi)酯處理時間對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)作用

將實施例1步驟2的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體在弱光下在步驟1.1的0.5μM BR溶液中培養(yǎng)1小時，得到0.5μM BR處理1小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體；將0μM BR溶液(即W5溶液)作為對照，得到0μM BR處理1小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

按照上述方法，將1小時分別替換為0小時、0.25小時、0.5小時、3小時、6小時和12小時，其他步驟均不變，得到0.5μM與0μM BR處理0小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM與0μM BR處理0.25小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM與0μM BR處理0.5小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM與0μM BR處理3小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM與0μM BR處理6小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM與0μM BR處理12小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

按照實施例1步驟2中GUS相對酶活的測定方法，分別測定上述各原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活(圖4中B)。

結(jié)果顯示，分別將0μM BR各處理時間的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活定義為1，0.5μM BR處理0小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理0.25小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理0.5小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理1小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理3小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理6小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理12小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活相對于0μM BR各相應(yīng)處理時間的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活分別為1.03、3.34、4.51、2.80、1.47、1.32、0.76(圖4中B)。表明，油菜素內(nèi)酯可以誘導(dǎo)Pbhlh7的啟動子活性，并且Pbhlh7的啟動子活性隨油菜素內(nèi)酯的處理時間變化，油菜素內(nèi)酯處理0.5小時時Pbhlh7的啟動子活性最高。

2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系中油菜素內(nèi)酯對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)

將實施例1步驟1得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pCAMBIA3301分別用EcoRI和NcoI進(jìn)行雙酶切，然后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，經(jīng)篩選后挑取單克隆測序，將經(jīng)測序后表明含有序列表中SEQ ID No.1所示DNA片段(Pbhlh7)的重組載體命名為pCAMBIA3301-Pbhlh7-Intron-GUS，pCAMBIA3301-Pbhlh7-Intron-GUS的構(gòu)建過程如圖9所示。SEQ ID No.1由2266個核苷酸組成，為啟動子Pbhlh7的核苷酸序列。

按照文獻(xiàn)(Frame BR et al.,Agrobacterium tumefaciens-Medicated Transformation of Maize Embryos Using a Standard Binary Vector system,Plant Physiology,2002May；129(1):13-22.)中玉米的遺傳轉(zhuǎn)化方法利用pCAMBIA3301-Pbhlh7-Intron-GUS轉(zhuǎn)化玉米自交系齊319，得到轉(zhuǎn)基因植株。

用鑒定BAR抗性的轉(zhuǎn)基因植株，具體方法如下：取轉(zhuǎn)基因植株的幼苗葉片于2ml離心管中，加入約400μl去離子水，用玻璃棒研磨，得到葉片研磨液，然后將試紙條(試紙條為AGDIA公司產(chǎn)品，貨號為STX14200/0012)插入葉片研磨液中，當(dāng)試紙條中出現(xiàn)2條紫色條帶時為陽性轉(zhuǎn)基因植株，1條帶時為陰性轉(zhuǎn)基因植株，即非轉(zhuǎn)基因植株。

2.1不同濃度的油菜素內(nèi)酯對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)作用

用不同濃度的油菜素內(nèi)酯處理上述陽性轉(zhuǎn)基因植株，每個濃度10株，實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)實驗的具體步驟如下：

用0.1μM的BR溶液(0.1μM的BR溶液的配制方法為：稱取48毫克的油菜素內(nèi)酯用少量酒精溶解后定容至10ml，得到油菜素內(nèi)酯濃度為10mmol/L的母液，將母液用水稀釋100000倍，得到0.1μM的BR溶液)噴灑兩葉一心時的陽性轉(zhuǎn)基因植株，在噴灑1小時后得到0.1μM BR處理的轉(zhuǎn)基因植株，利用Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer試劑盒測定0.1μM BR處理的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活(圖5中A)。

按照上述方法，將0.1μM分別替換為0μM、1μM、10μM和100μM，其他步驟均不變，分別得到0μM、1μM、10μM和100μM BR處理的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活(圖5中A)。

上述0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM BR處理的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活測定均在相同總蛋白濃度下測定的。總蛋白濃度的測定為利用BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，貨號為PC0020)進(jìn)行的。

結(jié)果顯示，將0μM BR處理的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活定義為1，0.1μM、1μM、10μM和100μM BR處理的轉(zhuǎn)基因植株的GUS相對酶活分別為5.68、3.31、3.40和1.02，表明，BR可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因玉米中Pbhlh7的啟動子活性，Pbhlh7的啟動子活性隨BR濃度變化而變化，其中0.1μM誘導(dǎo)的Pbhlh7的啟動子活性最高。

2.2油菜素內(nèi)酯處理時間對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)作用

用上述步驟2.1中的0.1μM的BR溶液噴灑兩葉一心時的陽性轉(zhuǎn)基因植株，在噴灑1小時時得到0.1μM BR處理1小時的轉(zhuǎn)基因植株，利用Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer試劑盒測定得到0.1μM BR處理1小時的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活，共10個重復(fù)；將0μM BR溶液(即水)作為對照，得到0μM BR處理1小時的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活，共10個重復(fù)。

按照上述方法，將1小時分別替換為0小時、0.25小時、0.5小時、3小時、6小時和12小時，其他步驟均不變，分別得到0.1μM與0μM BR處理0小時的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活、0.1μM與0μM BR處理0.25小時的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活、0.1μM與0μM BR處理0.5小時的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活、0.1μM與0μM BR處理3小時的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活、0.1μM與0μM BR處理6小時的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活、0.1μM與0μM BR處理12小時的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活(圖6中B)。

上述各GUS酶活測定均在相同總蛋白濃度下測定的?？偟鞍诐舛鹊臏y定為利用BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，貨號為PC0020)進(jìn)行的。

結(jié)果顯示，分別將0μM BR處理不同時間的轉(zhuǎn)基因植株中GUS酶活定義為1，0.1μM BR處理0小時的轉(zhuǎn)基因植株、0.1μM BR處理0.25小時的轉(zhuǎn)基因植株、0.1μM BR處理0.5小時的轉(zhuǎn)基因植株、0.1μM BR處理1小時的轉(zhuǎn)基因植株、0.1μM BR處理3小時的轉(zhuǎn)基因植株、0.1μM BR處理6小時的轉(zhuǎn)基因植株、0.1μM BR處理12小時的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活相對于0μM BR各相應(yīng)處理時間的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活的相對酶活分別為1.04、1.26、1.70、5.03、3.28、1.14、0.86(圖5中B)。表明，在轉(zhuǎn)基因玉米中，油菜素內(nèi)酯可以誘導(dǎo)Pbhlh7的啟動子活性，并且Pbhlh7的啟動子活性隨油菜素內(nèi)酯的處理時間變化；在轉(zhuǎn)基因玉米中，油菜素內(nèi)酯處理1小時時Pbhlh7的啟動子活性最高。

實施例3、Pbhlh7的不同截短片段的啟動子活性及油菜素內(nèi)酯對其誘導(dǎo)作用

1、含有Pbhlh7啟動子不同截斷片段的重組載體的構(gòu)建

在Pbhlh7的5′端將Pbhlh7進(jìn)行截短，獲得的5個DNA片段分別為Pbhlh7-1909(SEQ ID No.1的第358-2266位所示的DNA片段)、Pbhlh7-1809(SEQ ID No.1的第458-2266位所示的DNA片段)、Pbhlh7-1484(SEQ ID No.1的第783-2266位所示的DNA片段)、Pbhlh7-710(SEQ ID No.1的第1557-2266位所示的DNA片段)、Pbhlh7-74(SEQ ID No.1的第2195-2266位所示的DNA片段)。

將pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的ClaI和PstI識別序列間的DNA片段替換為SEQ ID No.1的第358-2266位所示的DNA片段(Pbhlh7-1909)，其他核苷酸均不變，得到重組載體pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS與pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的差別僅在于：pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS為將pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中SEQ ID No.1的第1-357位所示的DNA片段刪除得到的重組載體。

將pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的ClaI和PstI識別序列間的DNA片段替換為SEQ ID No.1的第458-2266位所示的DNA片段(Pbhlh7-1809)，其他核苷酸均不變，得到重組載體pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS與pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的差別僅在于：pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS為將pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中SEQ ID No.1的第1-457位所示的DNA片段刪除得到的重組載體。

將pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的ClaI和PstI識別序列間的DNA片段替換為SEQ ID No.1的第783-2266位所示的DNA片段(Pbhlh7-1484)，其他核苷酸均不變，得到重組載體pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS與pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的差別僅在于：pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS為將pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中SEQ ID No.1的第1-782位所示的DNA片段刪除得到的重組載體。

將pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的ClaI和PstI識別序列間的DNA片段替換為SEQ ID No.1的第1557-2266位所示的DNA片段(Pbhlh7-710)，其他核苷酸均不變，得到重組載體pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS與pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的差別僅在于：pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS為將pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中SEQ ID No.1的第1-1556位所示的DNA片段刪除得到的重組載體。

將pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的ClaI和PstI識別序列間的DNA片段替換為SEQ ID No.1的第2195-2266位所示的DNA片段(Pbhlh7-74)，其他核苷酸均不變，得到重組載體pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS與pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的差別僅在于：pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS為將pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中SEQ ID No.1的第1-2194位所示的DNA片段刪除得到的重組載體。

按照實施例1步驟2的方法，分別將pIG46、pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS和pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS導(dǎo)入實施例1步驟2的玉米葉肉原生質(zhì)體中，分別得到含有pIG46的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-710-GUS的原生質(zhì)體和含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

2、油菜素內(nèi)酯對Pbhlh7的不同截短片段啟動子活性的誘導(dǎo)作用

實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)實驗的具體步驟如下：

將實施例1步驟2的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體在弱光下在0.5μM BR溶液(0.5μM BR溶液為向W5溶液中添加BR得到的BR濃度為0.5μM的溶液)中培養(yǎng)1小時溶液，得到0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

按照上述方法，將含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體分別替換為含有pIG46的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生質(zhì)體和含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生質(zhì)體，其他步驟均不變，分別得到0.5μM BR處理的含有pIG46的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生質(zhì)體和0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

按照上述方法，將0.5μM BR溶液替換為0μM BR溶液，其他步驟均不變，得到0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

按照上述方法，將0.5μM BR溶液替換為0μM BR溶液，并將含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體分別替換為含有pIG46的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生質(zhì)體、含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生質(zhì)體和含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生質(zhì)體，其他步驟均不變，分別得到0μM BR處理的含有pIG46的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生質(zhì)體和0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

按照實施例1步驟2中GUS相對酶活的測定方法，分別測定0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有 pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生質(zhì)體和0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活。

2.1Pbhlh7的不同截短片段的啟動子活性

將0μM BR處理的含有pIG46的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活定義為1，結(jié)果顯示(圖6中A)，0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生質(zhì)體和0μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活分別為148.5、165.86、134.9、1.34。表明，Pbhlh7、Pbhlh7-1484和Pbhlh7-710均具有啟動子活性，而Pbhlh7-74沒有啟動子活性。

2.2油菜素內(nèi)酯對Pbhlh7的不同截短片段啟動子活性的誘導(dǎo)作用

分別將0μM BR處理的含有各重組載體原生質(zhì)體中GUS的相對酶活定義為1，結(jié)果顯示(圖6中B)，0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM BR處理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生質(zhì)體bhlh7中GUS蛋白的相對酶活相對于0μM BR處理的含有各相應(yīng)重組載體原生質(zhì)體中的GUS酶活的相對酶活分別為5.96、5.20、1.21、1.41、1.01。表明，油菜素內(nèi)酯可以誘導(dǎo)Pbhlh7和Pbhlh7-1909的啟動子活性，油菜素內(nèi)酯不能誘導(dǎo)Pbhlh7-1809、Pbhlh7-1484和Pbhlh7-710的啟動子活性。

實施例4、IAA對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)作用

實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)實驗的具體步驟如下：

1、IAA可以誘導(dǎo)Pbhlh7的啟動子活性

將實施例1步驟2的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體在弱光下在0.5μM IAA溶液(0.5μM IAA溶液為向W5溶液溶液中添加IAA得到的IAA濃度為0.5μM的溶液)中培養(yǎng)1小時溶液，得到0.5μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-GUS的原生質(zhì)體。

按照上述方法，將0.5μM分別替換為0μM、0.1μM、1μM、5μM和10μM，其他步驟均不變，得到0μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.1μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、1μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、5μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體和10μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

按照實施例1步驟2中GUS相對酶活的測定方法，分別測定0.5μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.1μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、1μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、5μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體和10μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活。

將0μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活定義為1，結(jié)果顯示(圖7中A)，0.1μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、1μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、5μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體和10μM IAA處理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活分別為1.66、1.47、1.89、1.48、1.16。表明，IAA可以誘導(dǎo)Pbhlh7的啟動子活性，并且Pbhlh7的啟動子活性隨IAA的濃度變化，IAA的濃度為1μM時Pbhlh7的啟動子活性最高。

2.生長素處理時間對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)作用

將實施例1步驟2的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體在弱光下在步驟1的0.5μM IAA溶液中培養(yǎng)1小時，得到0.5μM IAA處理1小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體；將0μM IAA溶液(即W5溶液)作為對照，得到0μM IAA處理1小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

按照上述方法，將1小時分別替換為0小時、0.1小時、0.25小時、0.5小時、3小時、6小時和12小時，其他步驟均不變，得到0.5μM與0μM IAA處理0小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM與0μM IAA處理0.1小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM與0μM IAA處理0.25小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM與0μM IAA處理0.5小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM與0μM IAA處理3小時的含有 pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM與0μM IAA處理6小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM與0μM IAA處理12小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體。

按照實施例1步驟2中GUS相對酶活的測定方法，分別測定上述各原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活(圖7中B)。

結(jié)果顯示，分別將0μM IAA各處理時間的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活定義為1，0.5μM IAA處理0小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM IAA處理0.1小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM IAA處理0.25小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM IAA處理0.5小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM IAA處理1小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM IAA處理3小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM IAA處理6小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體、0.5μM IAA處理12小時的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活相對于0μM IAA各相應(yīng)處理時間的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生質(zhì)體中GUS蛋白的相對酶活分別為0.96、1.61、1.75、1.42、1.75、1.55、1.32、0.93(圖7中B)。表明，生長素可以誘導(dǎo)Pbhlh7的啟動子活性，并且Pbhlh7的啟動子活性隨生長素的處理時間變化，生長素處理0.25小時和1小時后Pbhlh7的啟動子活性最高。

3、IAA在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系中對Pbhlh7啟動子活性的誘導(dǎo)作用

實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)實驗的具體步驟如下：

用不同濃度的IAA處理實施例2步驟2的陽性轉(zhuǎn)基因植株，每個濃度10株，實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)實驗的具體步驟如下：

用1μM的IAA溶液(1μM的IAA溶液的配制方法為：稱取17.5毫克的吲哚乙酸用少量酒精溶解后定容至10ml，得到吲哚乙酸濃度為10mmol/L的母液，將該母液用水稀釋10000倍，得到1μM的IAA溶液)噴灑兩葉一心時的陽性轉(zhuǎn)基因植株，在噴灑1小時后得到1μM的IAA處理的轉(zhuǎn)基因植株，利用Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer試劑盒測定1μM的IAA處理的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活(圖8)。

按照上述方法，將1μM替換為0μM，其他步驟均不變，得到0μM IAA處理的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活(圖8)。

上述各GUS酶活測定均在相同總蛋白濃度下測定的?？偟鞍诐舛鹊臏y定為利用BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，貨號為PC0020)進(jìn)行的。

結(jié)果顯示，將0μM IAA處理的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS酶活定義為1，1μM IAA處理的轉(zhuǎn)基因植株的GUS相對酶活為1.76，表明，IAA可以在轉(zhuǎn)基因玉米中誘導(dǎo)Pbhlh7的啟動子活性。