本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種綠色無有機試劑殘留的蘋果膳食纖維的硫酸酯化改性方法。

背景技術(shù)：
我國是蘋果生產(chǎn)大國，果汁在加工過程中會產(chǎn)生大量的蘋果渣。據(jù)報道蘋果渣中膳食纖維高達60～80％，是制備膳食纖維的良好原料。膳食纖維作為食品的重要組成成分，被稱為“第七大營養(yǎng)素”，具有順腸通便、調(diào)節(jié)控制血糖濃度、降血脂等多種生理功能。按溶解性，膳食纖維可以分為水溶性膳食纖維(SDF)和水不溶性膳食纖維(IDF)。其中SDF在預(yù)防糖尿病、心血管疾病、降低膽固醇等方面具有比IDF更強的生理活性。從結(jié)構(gòu)上看，SDF是由半乳糖、葡萄糖、木糖等聚合而成的雜多糖，植物多糖溶解度低，其自身不具備某些活性或生物活性很弱。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)硫酸酯化是一種有效的多糖修飾方法，多糖大分子單糖分子上的羥基被硫酸根所取代，具有抗凝血、抗腫瘤、抗病毒等生理活性。多糖硫酸酯化的方法很多，根據(jù)所用硫酸化試劑的不同，常用的方法有：濃硫酸法、三氧化硫法、氯磺酸法。多糖硫酸化研究表明，硫酸酯化劑濃硫酸、三氧化硫、氯磺酸等單獨使用會引起多糖嚴重降解，而路易斯堿介質(zhì)能夠降低降解反應(yīng)，因此酯化溶劑在酯化反應(yīng)中的作用非常關(guān)鍵。硫酸酯化反應(yīng)中常用的酯化介質(zhì)有甲酰胺、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)。公開號為CN1651466A的中國專利公開了一種多糖的硫酸酯化衍生物及其制法和用途，該專利采用氯磺酸吡啶法對海洋真菌多糖YCP進行硫酸酯化修飾，制得的硫酸酯化多糖取代度為0.13～1.3；公開號為CN102219865A的中國專利公開了具有抗腫瘤活性的金櫻子多糖衍生物的制備方法，該專利采用氯磺酸-DMF法制備金櫻子多糖硫酸酯化衍生物，其對直腸癌細胞的增殖具有抑制作用；公開號為CN1786034A的中國專利公開了豬苓多糖硫酸酯的制備方法，采用氯磺酸-甲酰胺法硫酸酯化豬苓多糖，得到生物活性較高的豬苓多糖硫酸酯。上述酯化反應(yīng)介質(zhì)均為揮發(fā)性有機溶劑，制備的硫酸酯化多糖存在有機溶劑殘留等問題，產(chǎn)生安全隱患，使其在食品、藥品的應(yīng)用方面受到限制。黃雪芳等(正交優(yōu)化龍眼肉多糖硫酸酯化反應(yīng)條件研究，中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2011，5，124-125)采用濃硫酸法對龍眼多糖進行硫酸酯化改性，獲得的硫酸酯化龍眼多糖取代度為2.03，但是濃硫酸酯化需要在低溫條件下反應(yīng)，否則由于濃硫酸的碳化作用使產(chǎn)物顏色較深，操作條件苛刻；公開號為CN103610081A的中國專利公開了一種蘋果膳食纖維的改性方法，該專利采用氨基磺酸-吡啶法對蘋果膳食纖維進行硫酸酯化修飾，制備的硫酸酯化蘋果膳食纖維取代度為1.29，但是該方法是在吡啶介質(zhì)中進行酯化的，吡啶介質(zhì)毒性大，易揮發(fā)，氣味刺鼻。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種基于水介質(zhì)的硫酸酯化蘋果水溶性膳食纖維的制備方法，可以制備得到不存在有機溶劑殘留、具有高生理活性的蘋果水溶性膳食纖維。為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：1)將蘋果膳食纖維與蘋果膳食纖維重量20～40％的蒸餾水攪拌混合均勻后靜置30～120min，靜置后進行擠壓改性，然后依次經(jīng)烘干、粉碎以及過篩得蘋果膳食纖維擠壓改性物(即擠壓改性蘋果膳食纖維)；2)向蘋果膳食纖維擠壓改性物中加入蒸餾水后于50～70℃浸提1～2h，蘋果膳食纖維擠壓改性物與蒸餾水的質(zhì)量比為1:20～1:40，浸提結(jié)束后抽濾并收集濾液，將濾液真空濃縮后加入1～4倍體積的95％乙醇并靜置過夜(水提醇沉法)，然后離心并收集沉淀，將沉淀烘干得蘋果水溶性膳食纖維；3)將蘋果水溶性膳食纖維溶解于蒸餾水中得混合物A，在攪拌條件下向混合物A中加入氨基磺酸并滴加濃硫酸，然后在超聲頻率為20～40kHz、溫度為60～90℃的條件下反應(yīng)1～4h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，然后用2～4mol/LNaOH水溶液調(diào)節(jié)pH值為中性，然后加入1～4倍體積的95％乙醇并靜置過夜，然后離心并收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中，然后用蒸餾水透析2～4天，然后向透析液中(指透析袋內(nèi)的液體)加入1～4倍體積的95％乙醇并靜置過夜，然后離心并收集沉淀，將沉淀烘干得硫酸酯化蘋果水溶性膳食纖維(命名為SSDF)。所述擠壓改性是在螺桿擠壓機螺桿轉(zhuǎn)速為700～900r/min條件下擠壓膨化。所述真空濃縮的條件為：溫度為45～60℃，真空度為0.06～0.09MPa，濃縮至濾液體積的1/4～1/6。所述混合物A中蘋果水溶性膳食纖維與蒸餾水的質(zhì)量比為1:50～1:80。所述蘋果水溶性膳食纖維與復(fù)合酯化劑的質(zhì)量比為1:1～1:7，復(fù)合酯化劑為所述氨基磺酸和濃硫酸。所述氨基磺酸與濃硫酸的質(zhì)量比為1:0.5～1:4。所述蘋果膳食纖維的制備方法包括以下步驟：將蘋果渣與蒸餾水攪拌混合均勻后用2～4mol/LNaOH水溶液調(diào)節(jié)pH為10～14，蘋果渣與蒸餾水的質(zhì)量比為1:6～1:10，然后于50～80℃保溫10min得混合物B，向混合物B加入蒸餾水體積1～3％的雙氧水，然后于50～80℃攪拌反應(yīng)1～3h，攪拌反應(yīng)結(jié)束后用流水洗滌至中性，洗滌后依次經(jīng)烘干、粉碎以及過篩，得蘋果膳食纖維。所述烘干的溫度均為35～60℃；所述過篩均采用20～80目篩。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：(1)本發(fā)明采用的反應(yīng)介質(zhì)為水，具有無毒、無色、無味、不易揮發(fā)等優(yōu)點。制得的產(chǎn)品安全、無有機溶劑殘留，相比常用的反應(yīng)介質(zhì)吡啶、甲酰胺等更為安全。(2)本發(fā)明采用超聲波輔助蘋果SDF硫酸酯化，縮短酯化時間，降低蘋果SDF在酸性環(huán)境下降解，提高反應(yīng)效率，制得硫酸酯化蘋果SDF顏色淺，得率高，酯化工藝操作簡單，環(huán)境友好，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。(3)本發(fā)明以氨基磺酸-濃硫酸為硫酸酯化的復(fù)合酯化劑，酯化條件易于控制，這樣既避免了濃硫酸酯化需要營造低溫條件，又解決氨基磺酸在水介質(zhì)中反應(yīng)活性低的問題。(4)本發(fā)明制備得到的硫酸酯化蘋果SDF對乳腺癌細胞MM231增殖具有顯著的抑制作用。(5)本發(fā)明通過對蘋果渣進行處理，不僅起到脫色作用，還提高了處理產(chǎn)物中蘋果膳食纖維的含量，通過進一步對蘋果膳食纖維進行擠壓改性處理，不僅顯著提高SDF構(gòu)成比例，同時提高SDF持水力、膨脹力等。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。蘋果膳食纖維的制備方法：稱取一定質(zhì)量20目蘋果渣，按照料液比為1:8(g:mL)的比例加入蒸餾水，攪拌均勻，用2mol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH為13，于70℃保溫10min，然后加入蒸餾水體積2％的雙氧水，70℃攪拌反應(yīng)2h，待反應(yīng)結(jié)束后過100目篩，篩上物用流水洗滌至中性，將其置于55℃烘箱中烘干、粉碎并過20目篩，即得蘋果膳食纖維。實施例11)稱取一定質(zhì)量20目蘋果膳食纖維，加入蘋果膳食纖維質(zhì)量20％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置30min后，在螺桿轉(zhuǎn)速為700r/min條件下擠壓膨化，擠壓處理后將擠出物置于45℃烘箱中烘干，粉碎并過20目篩，獲得擠壓改性蘋果膳食纖維；2)稱取一定質(zhì)量20目擠壓改性蘋果膳食纖維，按1:20的料液比(g:mL)加入蒸餾水，于50℃浸提2h，抽濾并收集濾液，濾液在溫度為60℃，真空度為0.07MPa下真空濃縮至1/5體積，加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于45℃烘箱中烘干，即得蘋果SDF；3)準確稱取1.0g蘋果SDF，將其溶于50mL水中，在攪拌條件下加入1.0g氨基磺酸并緩慢滴加2mL濃硫酸，隨后于超聲頻率為20kHz、溫度為60℃下反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，隨后用2.5mol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值為中性，加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中，蒸餾水透析3天，透析液加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于45℃烘箱中烘干，即得到0.564g的SSDF。實施例21)稱取一定質(zhì)量20目蘋果膳食纖維，加入蘋果膳食纖維質(zhì)量30％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置60min后，在螺桿轉(zhuǎn)速為800r/min條件下擠壓膨化，擠壓處理后將擠出物置于50℃烘箱中烘干，粉碎并過40目篩，獲得擠壓改性蘋果膳食纖維；2)稱取一定質(zhì)量40目擠壓改性蘋果膳食纖維，按1:30的料液比(g:mL)加入蒸餾水，于60℃浸提1.5h，抽濾并收集濾液，濾液在溫度為50℃，真空度為0.06MPa下真空濃縮至1/5體積，加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于50℃烘箱中烘干，即得蘋果SDF；3)準確稱取1.0g蘋果SDF，將其溶于80mL水中，在攪拌條件下加入1.0g氨基磺酸并緩慢滴加1mL濃硫酸，隨后于超聲頻率為30kHz、溫度為90℃下反應(yīng)1h，隨后用2.5mol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值為中性，加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中，蒸餾水透析3天，透析液加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于50℃烘箱中烘干，即得到0.568g的SSDF。實施例31)稱取一定質(zhì)量20目蘋果膳食纖維，加入蘋果膳食纖維質(zhì)量40％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置90min后，在螺桿轉(zhuǎn)速為900r/min條件下擠壓膨化，擠壓處理后將擠出物置于55℃烘箱中烘干，粉碎并過60目篩，獲得擠壓改性蘋果膳食纖維；2)稱取一定質(zhì)量60目擠壓改性蘋果膳食纖維，按1:40的料液比(g:mL)加入蒸餾水，于70℃浸提1h，抽濾并收集濾液，濾液在溫度為55℃，真空度為0.08MPa下真空濃縮至1/6體積，加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于55℃烘箱中烘干，即得蘋果SDF；3)準確稱取1.0g蘋果SDF，將其溶于60mL水中，在攪拌條件下加入2.0g氨基磺酸并緩慢滴加2mL濃硫酸，隨后于超聲頻率為40kHz、溫度為70℃下反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，隨后用2.5mol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值為中性，加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中，蒸餾水透析3天，透析液加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于55℃烘箱中烘干，即得到0.648g的SSDF。實施例41)稱取一定質(zhì)量20目蘋果膳食纖維，加入蘋果膳食纖維質(zhì)量20％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置120min后，在螺桿轉(zhuǎn)速為825r/min條件下擠壓膨化，擠壓處理后將擠出物置于60℃烘箱中烘干，粉碎并過80目篩，獲得擠壓改性蘋果膳食纖維；2)稱取一定質(zhì)量80目擠壓改性蘋果膳食纖維，按1:25的料液比(g:mL)加入蒸餾水，于60℃浸提2h，抽濾并收集濾液，濾液在溫度為45℃，真空度為0.09MPa下真空濃縮至1/5體積，加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于60℃烘箱中烘干，即得蘋果SDF；3)準確稱取1.0g蘋果SDF，將其溶于80mL水中，在攪拌條件下加入2.0g氨基磺酸并緩慢滴加1mL濃硫酸，隨后于超聲頻率為30kHz、溫度為80℃下反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，隨后用2.5mol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值為中性，加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中，蒸餾水透析3天，透析液加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于60℃烘箱中烘干，即得到0.562g的SSDF。本發(fā)明首先在堿性環(huán)境下制備蘋果膳食纖維；其次對蘋果膳食纖維進行擠壓改性處理，經(jīng)擠壓改性處理后水溶性膳食纖維含量從原料中的3.4％增加到23.5％；隨后采用水提醇沉法提取水溶性膳食纖維；最后以氨基磺酸以及濃硫酸(98％濃硫酸，密度1.84g/mL)為酯化劑，水作反應(yīng)介質(zhì)，對所得水溶性膳食纖維進行硫酸酯化修飾，獲得高生物活性的蘋果膳食纖維。本發(fā)明測定了硫酸酯化蘋果SDF對乳腺癌細胞MM231的增值抑制效果：在相同濃度下，硫酸酯化蘋果SDF對MM231細胞的抑制作用明顯高于蘋果SDF。當濃度為20mg/L時，對MM231細胞的抑制作用最為顯著，其抑制率分別58.42％，31.79％。利用Graphpad軟件計算IC50，得到蘋果SDF及硫酸酯化蘋果SDF對MM231細胞48h的IC50分別為268.3mg/L，16.27mg/L。由此可見，水介質(zhì)硫酸酯化蘋果SDF能夠顯著提高蘋果SDF對MM231細胞增值的抑制作用。針對現(xiàn)有硫酸酯化方法存在的缺陷，本發(fā)明以氨基磺酸-濃硫酸作為硫酸酯化的復(fù)合酯化劑，以水為反應(yīng)介質(zhì)，用超聲波輔助蘋果SDF硫酸酯化，獲得具有較高生理活性的硫酸酯化蘋果SDF。本發(fā)明的優(yōu)點是：1)選擇氨基磺酸-濃硫酸作為硫酸酯化的復(fù)合酯化劑，避免了氨基磺酸單獨使用在水介質(zhì)中酯化活性低的不足，這是因為多糖酯化反應(yīng)屬于可逆反應(yīng)，水介質(zhì)不利制備高取代度的硫酸酯化多糖，而濃硫酸具有強酸性及強質(zhì)子化能力，促進磺酰基(-SO3H)的生成，降低反應(yīng)活化能，提高反應(yīng)速率，被用作酯化反應(yīng)的催化劑，因此本發(fā)明選用氨基磺酸-濃硫酸作為硫酸酯化的復(fù)合酯化劑，這樣既避免了濃硫酸酯化需要營造低溫條件，又解決氨基磺酸在水介質(zhì)中反應(yīng)活性低等問題。2)采用超聲波輔助蘋果SDF硫酸酯化，一方面利用超聲技術(shù)使蘋果SDF與氨基磺酸均勻分散于水中，強化蘋果SDF與酯化劑的接觸；另一方面，利用超聲波產(chǎn)生的強烈的空化效應(yīng)、機械效應(yīng)、熱效應(yīng)等，促進酯化劑分解產(chǎn)生更多的-SO3H基團，進而與蘋果SDF上的-OH發(fā)生取代反應(yīng)，從而達到酯化反應(yīng)的目的。3)水作酯化介質(zhì)無毒無味，不存在有機試劑殘留，是一種安全、綠色的酯化方法。