本發(fā)明涉及一種結(jié)合串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5的Dof蛋白質(zhì),尤其涉及一種可以結(jié)合植物串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5的Dof蛋白因子及其編碼基因，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，它通過影響或控制特定基因的表達(dá)而參與許多重要的生物過程，如：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、形態(tài)發(fā)生、環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)等等。眾所周知，轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合啟動子區(qū)的順勢調(diào)控元件進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄速率，另外，轉(zhuǎn)錄因子也可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（NatRevGenet2004,5:276-287）。目前，人們已鑒定了許多轉(zhuǎn)錄因子基因家族，這其中有許多是植物特異性的，如WRKY家族、R2R3-MYB家族、bZIP家族、MADS家族等等。Dof(DNAbindingwithonefinger)蛋白也是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，它通常含有兩個結(jié)構(gòu)域：一個是N-末端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；另一個是C-末端的調(diào)控結(jié)構(gòu)域。其中，N-末端的結(jié)合域含有4個位置保守的Cys，它可以形成C2-C2鋅指結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)域參與了不同調(diào)控蛋白或信號的結(jié)合，因而呈現(xiàn)多種生物功能，如：植物抗性（PlantJ1996,10:955-966）、種子儲存蛋白合成（ProcNatlAcadSciUSA1997,94:7685-7690）、植物生長素和赤霉素響應(yīng)（PlantCell1999,11:323-334;BiochimBiophysActa2001,1520:54-62）、碳水化合物代謝（PlantCell1998,10:75-89）、種子萌發(fā)（PlantCell2002,14:1253-1263）、光控植物開花（TrendsPlantSci2006,11:550-558）、細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)（PlantJ2008,56:779-792）等等。Dof蛋白還可以通過與其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合參與生物活性，如：Dof轉(zhuǎn)錄因子（OBP1）與bZIP轉(zhuǎn)錄因子（OBF4、OBF5）作用可以促進(jìn)后者與靶DNA的結(jié)合（PlantCell1995,7:2241-2252）；小麥WPBF與TaQM作用可以促進(jìn)參與種子發(fā)育的阿爾法麩朊蛋白的轉(zhuǎn)錄（PlantMolBiol2007,63:73–84）。許多試驗表明Dof蛋白與AAAG基序特異性結(jié)合（TrendsPlantSci2002,7:555-560）。Dof蛋白通過結(jié)合啟動子上的AAAG基序激活轉(zhuǎn)錄,而啟動子中該序列的突變往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的消失（PlantCell1998,10:75-89;PlantJ2001,28:455-464）。番茄Dof基因通過結(jié)合KST1啟動子區(qū)的TAAAG基序誘導(dǎo)基因在保衛(wèi)細(xì)胞中的表達(dá)（PlantJ2001,28:455–464）。然而，至今還沒有Dof轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合串聯(lián)重復(fù)序列的報道。本發(fā)明鑒定了一可以結(jié)合串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5的Dof蛋白質(zhì)，而前期實驗(ZL201210087731.5)表明該串聯(lián)重復(fù)序列具有提高植物基因表達(dá)活性的特征，因而，該Dof蛋白質(zhì)具有潛在的調(diào)控基因表達(dá)活性的功能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是提供一種結(jié)合串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5的Dof蛋白質(zhì)及其編碼基因。本發(fā)明提供的Dof蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，來源于擬南芥（Arabidopsisthaliana,Columbiaecotype），具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明提供的Dof蛋白質(zhì)，其編碼基因為如下（1）或（2）所示的核苷酸序列：（1）具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；（2）與（1）限定的DNA序列至少具有不低于70%同源性且編碼植物轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的核苷酸序列。本發(fā)明提供的可以結(jié)合串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5的Dof蛋白質(zhì)是由酵母單雜交實驗獲得，并且其結(jié)合方式已被EMSA（電泳遷移率實驗）實驗證實。本發(fā)明還提供一種含有Dof蛋白編碼序列的重組載體pUC-Dof。本發(fā)明還提供一種含有Dof蛋白編碼序列的重組表達(dá)載體pET-Dof。本發(fā)明還提供一種重組菌，由重組載體pUC-Dof轉(zhuǎn)化所得。本發(fā)明還提供一種重組菌，由重組載體pET-Dof轉(zhuǎn)化所得。本發(fā)明還提供一種含有三個拷貝的串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5基因片段的重組載體pHIS2-TR；一種含有重組載體pHIS2-TR的重組大腸桿菌；一種含有重組質(zhì)粒pHIS2-TR的重組酵母菌。本發(fā)明的有益效果：利用現(xiàn)有分子生物學(xué)技術(shù)，本發(fā)明首次得到一種可以結(jié)合(TTTACAC)5的Dof轉(zhuǎn)錄因子，它們的結(jié)合已經(jīng)酵母單雜交實驗及EMSA實驗驗證。前期實驗(ZL201210087731.5)表明該串聯(lián)重復(fù)序列具有提高植物基因表達(dá)活性的特征，這對于闡明調(diào)控基因表達(dá)機制具有重要的理論價值，因此在生產(chǎn)實踐中也具有重要意義。附圖說明圖1為pHIS2-TR菌液PCR鑒定圖圖2為pHIS2-TR質(zhì)粒酵母轉(zhuǎn)化結(jié)果圖3為文庫轉(zhuǎn)化效率結(jié)果圖4為Dof蛋白與串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5酵母單雜交結(jié)果圖5為EMSA驗證Dof蛋白與該串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5的結(jié)合。具體實施方式下面根據(jù)具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。實施例1：串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5片段（命名為TR）合成及其與pUC18克隆載體鏈接合成三個拷貝的串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5片段，并在其首尾同時加上EcoRI（識別序列為5’-GAATTC-3’）、SacI（識別序列為5’-GAGCTC-3’）、sfiIA（識別序列為5’-GGCCATTACGGCC-3’）和sfiIB（識別序列為5’-GGCCGCCTCGGCC-3’）酶切位點，合成序列信息如下5’-GAATTCGGCCATTACGGCCTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACTTTACACGGCCGCCTCGGCCGAGCTC-3’，其中下劃線處為添加的酶切位點，該基因片段由上海桑尼生物科技有限公司合成。該片段與pUC18-T載體（購自大連寶生物）鏈接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞（購自上海捷瑞生物工程有限公司），命名為pUC-TR，進(jìn)行擴增和質(zhì)粒提取，獲得足夠量的目的片段。實施例2：TR片段與酵母單雜交誘餌載體pHIS2鏈接對實施例1中獲得的pUC-TR質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI/SacI雙酶切，切開的片段鏈接到相同雙酶切的pHIS2（購自上海?？粕锛夹g(shù)有限公司）載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)后長出的轉(zhuǎn)化子（pHIS2-TR），隨機挑取12個轉(zhuǎn)化子接種于帶卡那抗性的液體LB培養(yǎng)基，于37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)16h（過夜）后，分別取1μL菌液進(jìn)行PCR擴增，將產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。實驗表明：空載體可以擴增出約150bp的片段，而成功插入目的片段的載體可以擴出300bp左右的片段，由圖1可見，條帶1，2，5，7，12可能為成功插入目的片段的轉(zhuǎn)化子。對其進(jìn)行進(jìn)一步測序鑒定后，經(jīng)比對確定其序列正確。實施例3：pHIS2-TR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母從YPDA（完全培養(yǎng)基）平板上挑取Y187酵母菌落接種于3mLYPDA液體培養(yǎng)基，30℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)18-20小時。轉(zhuǎn)接YPDA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)體積為50mL，使初始OD600=0.2，30℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)4-5小時，至OD600=0.6。然后，室溫下1000g離心5min收集菌體。用20mL無菌水重懸菌體，混勻，室溫下1000g，離心5min收集菌體，棄上清。用5mL0.1MLiAc（醋酸鋰）重懸菌體，混勻，室溫下1000g，離心5min收集菌體，棄上清。用1mL0.1MLiAc重懸菌體，混勻，分裝至1.5mL離心管，每個100μL，備用。在每個1.5mL離心管中依次加入240μL50%PEG3350、36μL1MLiAc、25μLssDNA(10mg/mL)、5μLpHIS2-TR質(zhì)粒，用槍頭吹打混勻或劇烈震蕩1min左右，至完全混勻。30℃水浴孵育，30min后再42℃水浴熱激，25min，然后再30℃水浴復(fù)蘇，1小時。室溫下700g離心5min，棄上清。用100μL無菌水懸浮菌液，溫和混勻，涂布在SD-Trp-His+50mM3AT缺陷平板上，30℃恒溫培養(yǎng)3-4天，結(jié)果如圖2，已獲得pHIS2-TR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母。實施例4：酵母單雜交篩庫用實施例3中含有正確pHIS2-TR誘餌載體的酵母菌Y187作為受體菌制備感受態(tài)，將擬南芥cDNA酵母單雜交文庫（購自上海?？粕锛夹g(shù)有限公司）質(zhì)粒轉(zhuǎn)入其中，涂SD-Trp-Leu-His+50mM3AT平板。具體實驗步驟如下：從SD-Trp-Leu-His+50mM3AT平板挑取單克隆菌種接于液體SD-Trp-Leu-His+50mM3AT培養(yǎng)基3mL，在30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)8h。將3mL菌液全部轉(zhuǎn)接至SD-Trp-Leu-His+50mM3AT液體培養(yǎng)基50mL，30℃，250rpm，振蕩培養(yǎng)過夜，12-14h。然后再轉(zhuǎn)接于600mLYPDA液體培養(yǎng)基中，使初始OD600=0.2，30℃，250rpm，振蕩培養(yǎng)4-5h，至OD600=0.6。室溫下1000g離心5min，收集菌體。用30mL無菌水重懸菌體，混勻，室溫下1000g離心5min，收集菌體，棄上清。然后再用10mL0.1MLiAc重懸菌體，混勻，室溫下1000g離心5min，收集菌體，棄上清。用5mL0.1MLiAc重懸菌體，混勻，室溫下1000g離心5min，收集菌體，棄上清。向離心管中依次加入9.6mL50%PEG3350、1.44mL1MLiAc、800μLssDNA(10mg/mL)、25μg擬南芥cDNA酵母單雜交文庫質(zhì)粒，用槍頭吹打混勻，或劇烈振蕩1min左右，至完全混勻。先在30℃水浴孵育30min后，轉(zhuǎn)入42℃水浴熱激25min。室溫下700g離心3min收集菌體，棄上清。加入5mL2×YPD，輕輕吹打混勻，30℃，100rpm震蕩培養(yǎng)1.5h。取20μL培養(yǎng)物梯度稀釋后涂SD-Trp-Leu-His+50mM3AT平板。30℃恒溫培養(yǎng)3天后觀察。圖3列舉了4中不同稀釋度（分別是10倍稀釋、100倍稀釋、1000倍稀釋和10000倍稀釋）后，轉(zhuǎn)化菌體涂布SD-Trp-Leu-His+50mM3AT平板生長出的轉(zhuǎn)化子，根據(jù)轉(zhuǎn)庫效率檢測平板的轉(zhuǎn)化子數(shù)量可以計算文庫的轉(zhuǎn)化效率，該文庫的轉(zhuǎn)化效率為:（320+230+1200+100）/(4*20)*5000/25μg=7*103/μgDNA（圖3）。實施例5：酵母單雜交陽性克隆鑒定將檢測的陽性克隆菌株接入SD-Trp-Leu液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)過夜后抽提酵母質(zhì)粒。然后，酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10新鮮感受態(tài)進(jìn)行擴增。將含有陽性克隆的Top10轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接含有Amp+的LB液體培養(yǎng)擴增后抽提質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序和BLAST比對。鑒定結(jié)果得出：Dof基因（SEQIDNO.2）可以結(jié)合該串聯(lián)重復(fù)序列TR（圖4）。實施例6：Dof蛋白表達(dá)與探針標(biāo)記根據(jù)實施例5中所鑒定的Dof基因序列，在擬南芥cDNA中,利用特異性引物：上游引物5’-GGATCCATGTCTAAATCTAGAGATACGGAGAT-3’（內(nèi)含BamHI酶切位點）；下游引物5’-GAGCTCTTATTGTTGCATGCTCTCCCTGAAGT-3’（內(nèi)含SacI酶切位點）克隆全長Dof基因，然后將該基因首先連接到pUC18-T（購自大連寶生物）載體上，獲得重組載體，命名為pUC-Dof，然后通過BamHI和SacI雙酶切質(zhì)粒后，獲得Dof基因片段，再連接到pET30a（購自Novagen公司）原核表達(dá)載體上，獲得重組載體，命名為pET-Dof，在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白表達(dá)后，HPLC（高效液相色譜法）純化蛋白，備用。利用羅氏EMSA試劑盒標(biāo)記探針，溶解探針為10pmol/μL，95℃，10min，然后慢慢冷卻到室溫。用滅菌的TEN-buffer將溶解探針稀釋到3-4pmol/μL，加3.85pmol的雙鏈核苷酸，用ddH2O定容到10μL。在冰上加入5×labelingbuffer4μL；CoCl2-solution4μL；DIG-ddUTPsolution1μL；Terminaltransferase(400U)1μL，混勻，37℃放置15min。然后加入2μL0.2MEDTA(pH8.0)停止反應(yīng)。實施例7：凝膠遷移率實驗（EMSA）驗證Dof蛋白與串聯(lián)重復(fù)序列的結(jié)合提前配制非變性PAGE膠，預(yù)跑5min。在冰上加入Bindingbuffer4μL、poly[d(I-C)]1μL、polyL-lysine1μL、DIG標(biāo)記的探針（見實施例6）2μL、ddH2O12μL、非標(biāo)記的探針、Oct2Afactor1μL、Dof純化蛋白（以上的探針、非標(biāo)記的探針和蛋白可根據(jù)自己的需要而改變）?；靹?，室溫下放置15min后放到冰上，再加5μLLoadingbuffer，上樣跑非變性PAGE膠。轉(zhuǎn)膜、洗膜后放置于Detectionbuffer加底物CSPD中，室溫下放置5min后再置于37℃10min。最后用X射線膠片曝光30min，用顯影液漂洗5min，再用定影液漂洗5min，結(jié)果如圖5，由圖得知：該Dof蛋白可以結(jié)合串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5。SEQUENCELISTING<110>江蘇大學(xué)<120>一種結(jié)合串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5的Dof蛋白質(zhì)<130>一種結(jié)合串聯(lián)重復(fù)序列(TTTACAC)5的Dof蛋白質(zhì)<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>399<212>PRT<213>擬南芥（Arabidopsisthaliana,Columbiaecotype）<400>1MetSerLysSerArgAspThrGluIleLysLeuPheGlyArgThrIle151015ThrSerLeuLeuAspValAsnCysTyrAspProSerSerLeuSerPro202530ValHisAspValSerSerAspProSerLysGluAspSerSerSerSer354045SerSerSerCysSerProThrIleGlyProIleArgValProValLys505560LysSerGluGlnGluSerAsnLysPheLysAspProTyrIleLeuSer65707580AspLeuAsnGluProProLysAlaValSerGluIleSerSerProArg859095SerSerLysAsnAsnCysAspGlnGlnSerGluIleThrThrThrThr100105110ThrThrSerThrThrSerGlyGluLysSerThrAlaLeuLysLysPro115120125AspLysLeuIleProCysProArgCysGluSerAlaAsnThrLysPhe130135140CysTyrTyrAsnAsnTyrAsnValAsnGlnProArgTyrPheCysArg145150155160AsnCysGlnArgTyrTrpThrAlaGlyGlySerMetArgAsnValPro165170175ValGlySerGlyArgArgLysAsnLysGlyTrpProSerSerAsnHis180185190TyrLeuGlnValThrSerGluAspCysAspAsnAsnAsnSerGlyThr195200205IleLeuSerPheGlySerSerGluSerSerValThrGluThrGlyLys210215220HisGlnSerGlyAspThrAlaLysIleSerAlaAspSerValSerGln225230235240GluAsnLysSerTyrGlnGlyPheLeuProProGlnValMetLeuPro245250255AsnAsnSerSerProTrpProTyrGlnTrpSerProThrGlyProAsn260265270AlaSerPheTyrProValProPheTyrTrpGlyCysThrValProIle275280285TyrProThrSerGluThrSerSerCysLeuGlyLysArgSerArgAsp290295300GlnThrGluGlyArgIleAsnAspThrAsnThrThrIleThrThrThr305310315320ArgAlaArgLeuValSerGluSerLeuArgMetAsnIleGluAlaSer325330335LysSerAlaValTrpSerLysLeuProThrLysProGluLysLysThr340345350GlnGlyPheSerLeuPheAsnGlyPheAspThrLysGlyAsnSerAsn355360365ArgSerSerLeuValSerGluThrSerHisSerLeuGlnAlaAsnPro370375380AlaAlaMetSerArgAlaMetAsnPheArgGluSerMetGlnGln385390395<210>2<211>1200<212>DNA<213>擬南芥（Arabidopsisthaliana,Columbiaecotype）<400>2atgtctaaatctagagatacggagataaagttgtttgggaggacaatcacatctctttta60gatgtgaattgttatgatccgtcgtcgttgtcccctgttcacgatgtttcttctgatcca120agcaaggaggattcgtcttcttcttcatcttcttgttctccaactattggaccaatcagg180gttccggttaaaaaaagtgagcaagagagtaacaaattcaaagatccatatatattatcc240gatctaaacgaaccaccaaaagcagtatctgagatttcatcaccaagaagttccaagaac300aactgtgatcaacagagcgagatcacaacaacaactaccacaagtactacatcaggagag360aaatcaacggctctcaagaaaccggacaagcttattccatgtcctagatgtgaaagcgca420aacaccaaattctgttattacaacaactacaacgtgaaccagccacgttacttctgcagg480aactgtcagaggtattggacagctggtggatctatgaggaacgttcctgttggctcaggt540cgtcgcaagaacaaaggatggccttcttcaaaccattacttgcaagtcacttctgaggat600tgtgataataataactcggggacgatccttagtttcggttcttcggagtcttcggttaca660gagactggtaagcatcagtcaggtgatacagcaaagataagtgctgattcagtttctcaa720gaaaataaaagctaccaagggtttcttcctccgcaagtaatgttacctaataattcttct780ccttggccttaccaatggagtccaacgggtcctaacgctagtttctaccctgtccccttc840tactggggatgcacggttccgatataccctacctcagagacttcatcatgtttaggaaaa900cggtcaagagatcaaactgaaggaagaatcaatgatactaatacaacaataactactaca960agagcaagattggtctcagaatctcttagaatgaatatcgaagctagtaagagcgctgtg1020tggtctaagttaccgacaaaacccgagaaaaaaacgcaaggattcagtttgttcaatgga1080tttgacacaaagggaaacagcaacagaagtagcttggtctccgaaacttctcacagtcta1140caagcaaaccctgcagcgatgtctagagctatgaacttcagggagagcatgcaacaataa1200