阿司匹林-Arg-Gly-Asp-Val綴合物,其合成,納米結(jié)構(gòu)和作為載藥體系的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種新型阿司匹林-Arg-Gly-Asp-Val(A-RGDV)綴合物，還涉及它的制備方法以及它作為抗血栓劑的應(yīng)用。A-RGDV的特征在于，在血液中能夠以納米顆粒選擇性地轉(zhuǎn)運，到達(dá)血栓形成部位之后與被激活的血小板表面的GPIIb/IIIa受體作用，釋放阿司匹林。因此，A-RGDV是阿司匹林的靶向給藥體系。A-RGDV具有強的抗血栓活性，具有良好的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。下面是A-RGDV的結(jié)構(gòu)式。

背景技術(shù)：
阿司匹林在臨床上被廣泛應(yīng)用已逾百年，用于治療急性炎癥，疼痛，心血管疾病，中風(fēng)，妊娠并發(fā)癥，癌癥，糖尿病和阿爾茲海默癥，這些表明它卓越的療效。對于不同的適應(yīng)癥，阿司匹林有不同的治療方案。然而，臨床也已經(jīng)揭示了阿司匹林的嚴(yán)重局限性。最主要的局限性是患者對阿司匹林治療出現(xiàn)耐藥或者喪失療效。患者對阿司匹林治療出現(xiàn)耐藥或者喪失療效，一方面表現(xiàn)在阿司匹林不完全地抑制患者的血小板功能，盡管患者服用了足夠臨床劑量阿司匹林。這種情況嚴(yán)重地降低了阿司匹林的對多種疾病包括二型糖尿病，哮喘，心血管疾病，中風(fēng)，冠心病和小兒心臟手術(shù)的治療效果。為了克服阿司匹林的不足，人們做出了許多努力。例如，為增強糖尿病人血小板的敏感性，實施代謝控制和服用阿司匹林的交替給藥方案；為增強高血漿膽固醇的心血管疾病患者的血小板敏感性，將阿司匹林與脂質(zhì)過氧化抑制劑聯(lián)用；為增強動脈粥樣硬化血栓患者血小板的敏感性，將阿司匹林與他汀類藥物聯(lián)用；為避免患者對阿司匹林的不良容忍性，將阿司匹林與其它藥物交替使用；為增強因阿司匹林致呼吸道疾病加重的病人口服阿司匹林的安全性，使用采用預(yù)處理過的白三烯改造的藥物。盡管這些工作取得了一些成就，患者對阿司匹林治療出現(xiàn)耐藥或者喪失療效至少仍然是限制阿司匹林治療心血管疾病的主要臨床障礙。RGD序列肽是整合素識別膠原，纖連蛋白，玻連蛋白，層粘連蛋白，免疫球蛋白超家族成員和血漿蛋白質(zhì)的觸發(fā)點。雖然整合素與RGD序列肽的相互作用被廣泛用于制備大分子藥物載體，但是沒有任何研究使用單一的RGD四肽直接輸送藥物。在RGD四肽與小分子形成的綴合物的生物學(xué)研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)綴合物的RGD四肽部分與活化的血小板表面的GPIIb/IIIa受體相互作用時，綴合物的小分子部分可以分解下來。也就是說，當(dāng)RGD四肽與小分子形成的綴合物的RGD四肽部分與血栓中活化的血小板表面的GPIIb/IIIa受體相互作用時，綴合物的小分子部分可以分解下來。而在沒有活化血小板的血液循環(huán)中，RGD四肽與小分子形成的綴合物不發(fā)生任何分解。根據(jù)這些認(rèn)識，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個內(nèi)容是將RGDV與阿司匹林綴合，制備新型阿司匹林-Arg-Gly-Asp-Val(A-RGDV)綴合物。下面是該綴合物A-RGDV的結(jié)構(gòu)式。本發(fā)明的第二個內(nèi)容是提供一種制備A-RGDV的方法，該方法包括：1)采用液相合成方法，通過逐步接肽分別合成Arg-Gly的保護(hù)中間體和Asp-Val的保護(hù)中間體；2)脫去Arg-Gly的保護(hù)中間體的C端保護(hù)基；3)脫去Asp-Val的保護(hù)中間體的N端保護(hù)基；4)把N端游離的Asp-Val的保護(hù)中間體和C端游離的Arg-Gly保護(hù)中間體偶聯(lián)得到Arg-Gly-Asp-Val的保護(hù)中間體；5)脫去Arg-Gly-Asp-Val的保護(hù)中間體的N端保護(hù)基；6)把N端游離的Arg-Gly-Asp-Val保護(hù)中間體和阿司匹林偶聯(lián)得到A-RGDV的保護(hù)中間體；7)把A-RGDV的保護(hù)中間體脫去保護(hù)基，得到A-RGDV。其中，所述的N端保護(hù)基是對多肽的N端進(jìn)行保護(hù)時常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是叔丁氧羰基(Boc)，所述的C端保護(hù)基是對多肽的C端進(jìn)行保護(hù)時常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是芐氧基(OBzl)。以上所述的液相合成中間體并加以保護(hù)的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)并公知的技術(shù)。本發(fā)明的第三個內(nèi)容是用透射電子顯微鏡(TEM)，掃描電子顯微鏡(SEM)和原子力顯微鏡(AFM)測定A-RGDV的納米結(jié)構(gòu)。通過ROESY2DNMR圖譜，ESl-MS圖譜和介觀理論計算，考察A-RGDV形成納米顆粒的機理。本發(fā)明的第四個內(nèi)容是研究A-RGDV與GPIIb/IIIa和COX-1的相互作用，說明A-RGDV在血液中保持綴合物分子的完整性，在血栓中釋放阿司匹林，以及顯示的靶向抗血栓作用。附圖說明圖1阿司匹林-Arg-Gly-Asp-Val(A-RGDV)的合成路線圖。i)二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)，N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，N-甲基嗎啉(NMM)；ii)NaOH(1M)；iii)氯化氫-乙酸乙酯(6M)；iv)H2和Pd/C。圖2A-RGDV的1HNMR圖譜。圖3A-RGDV的ROESY2DNMR圖譜和4個相關(guān)峰。相關(guān)峰1表示A-RGDV的構(gòu)造，相關(guān)峰2-4表示A-RGDV的分子間聚集。圖4A-RGDV的ESI-MS圖譜。圖5左圖為A-RGDV的透射電鏡照片，右圖為A-RGDV的掃描電鏡照片。圖6A-RGDV的原子力顯微鏡照片。A)A-RGDV在水中的原子力顯微鏡照片；B)大鼠血漿的原子力顯微鏡照片；C)A-RGDV在大鼠血漿中的原子力顯微鏡照片。圖7A-RGDV形成四聚體從而形成納米結(jié)構(gòu)組圖。圖8A-RGDV在大鼠血漿中孵育30min后的ESI-MS圖譜。圖9A-RGDV加GPIIb/IIIa在水中孵育30min后的ESI-MS圖譜。圖10A-RGDV加COX-1在水中孵育30min后的ESI-MS圖譜。圖11不同劑量阿司匹林，RGDV和不同劑量A-RGDV的體內(nèi)抗血栓活性。圖12A-RGDV對GPIIb/IIIa表達(dá)水平的影響。具體實施方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例1制備Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl將10.0g(31.3mmol)Boc-Arg(NO2)用100ml無水四氫呋喃(THF)溶解，冰浴冷卻，向得到的溶液中加入4.3g(31.3mmol)N-羥基苯并三氮唑(HOBt)和6.4g(31.3mmol)二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)，將此反應(yīng)液冰浴下攪拌10min。加入10.6g(31.3mmol)Tos·Gly-OBzl和3.5g(31.3mmol)N-甲基嗎啉(NMM)，室溫攪拌24h。反應(yīng)混合物過濾，濾除二環(huán)己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮，殘留物用150ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO3水溶液洗，飽和NaCl水溶液洗，5％KHSO4水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。有機相用無水Na2SO4干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，殘留物經(jīng)柱層析純化(氯仿/甲醇，30∶1)，得到12.84g(88％)油狀標(biāo)題化合物。ESI-MS(m/e)：467[M+H]+。實施例2制備Boc-Arg(NO2)-Gly將11.85g(25.4mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl溶解在50ml甲醇中，冰浴冷卻，加入12ml氫氧化鈉-甲醇溶液(1M)，攪拌1小時，反應(yīng)液用2M鹽酸中和至pH＝7，減壓濃縮除去甲醇，殘留物用2M鹽酸酸化至pH＝2，減壓濃縮除去水。殘留物用100ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液用飽和NaCl水溶液洗。有機相用無水Na2SO4干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干。加少量石油醚將殘留物研磨成8.9g(93％)標(biāo)題化合物，直接投下步反應(yīng)。ESI-MS(m/e)：377[M-H]-。實施例3制備Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl按照實施例1的方法由7.7g(23.7mmol)Boc-Asp(OBzl)和9.0g(23.7mmol)Tos.Val-OBzl制得10.7g(89％)油狀標(biāo)題化合物。ESI-MS(m/e)：513[M+H]+。實施例4制備Asp(OBzl)-Val-OBzl將10.7g(20.9mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶解在100ml氯化氫-乙酸乙酯溶液(6M)中，冰浴下攪拌反應(yīng)2h，TLC(氯仿/甲醇，5∶1)監(jiān)測反應(yīng)。減壓濃縮，殘留物加100ml乙酸乙酯溶解，水泵抽干以除去游離HCl，重復(fù)3次。加100ml乙醚將殘留物研磨得標(biāo)題化合物，直接投下步反應(yīng)。ESI-MS(m/e)：413[M+H]+。實施例5制備Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl按照實施例1的方法由8.9g(23.5mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly和9.7g(23.5mmol)Asp(OBzl)Val-OBzl制得15.9g(88％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：771[M+H]+。實施例6制備Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl按照實施例4的方法由2.0g(2.6mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl制得1.7g(96％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：671[M+H]+。實施例7制備N-(2-乙酰氧基苯甲酰基)-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl按照實施例1的方法由322mg(1.8mmol)阿司匹林和1.2g(1.8mmol)Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)Val-OBzl制得262mg(21％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。Mp62℃；[α]D25＝-391(c＝0.25，CH3OH)。ESI-MS(m/e)：791[M-42+H]+。IR(KBr)：3277，2939，2868，1734，1639，1603，1544，1492，1456，1367，1303，1234，1207，1026，995，756，663。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：8.86(m，1H)，8.53(s，1H)，8.39(t，J＝5.4Hz，J＝5.4Hz，1H)，8.27(d，J＝6.6Hz，1H)，8.18(d，J＝8.1Hz，1H)，7.95(d，J＝7.5Hz，1H)，7.43(s，1H)，7.33(m，10H)，6.92(m，2H)，5.07(m，4H)，4.78(m，1H)，4.56(m，1H)，4.17(m，1H)，3.74(m，2H)，3.17(m，2H)，2.74(m，1H)，2.58(m，1H)，2.05(m，1H)，1.79(m，2H)，1.56(m，2H)，0.83(d，J＝6.6Hz，6H)。13CNMR(125MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝172.01，171.93，171.47，171.03，171.01，170.23，169.21，169.19，169.12，168.10，167.98，159.17，136.46，136.27，134.01，129.58，128.86，128.84，128.56，128.48，128.43，128.31，119.33，119.28，117.56，117.47，116.73，116.68，79.62，66.41，66.17，58.17，53.07，53.01，49.56，49.46，42.38，42.27，42.24，36.67，36.64，30.24，29.66，19.32，18.56。實施例8制備N-(2-乙酰氧基苯甲酰基)-Arg-Gly-Asp-Val(A-RGDV)將200mg(0.2mmo1)N-(2-乙酰氧基苯甲?；?-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶解在25ml甲醇中，加入1.0gPd/C，攪拌混懸。0.02Mba氫氣環(huán)境中反應(yīng)5h至反應(yīng)完成。制得131mg(90％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。Mp71℃；[α]D25＝-196(c＝0.1，H2O)。ESI-MS(m/e)：565[M-42+H]＋。IR(KBr)：3350，2964，2937，1660，1639，1597，1533，1496，1454，1373，1307，1234，1161，1026，756。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：9.75(s，1H)，8.95(d，J＝6.6Hz，1H)，8.79(d，J＝8.1Hz，1H)，8.69(m，1H)，8.24(s，2H)，7.97(d，J＝7.5Hz，1H)，7.38(t，J＝7.2Hz，J＝7.2Hz，1H)，7.21(d，J＝8.4Hz，2H)，6.89(m，2H)，4.56(m，1H)，4.41(m，1H)，4.03(m，2H)，3.58(m，1H)，3.42(m，2H)，3.18(s，1H)，3.02(s，1H)，2.57(m，1H)，2.39(m，1H)，2.05(m，2H)，1.81(m，2H)，1.57(m，2H)，1.11(m，4H)，0.83(d，J＝6.6Hz，6H)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝174.79，173.65，172.50，170.93，169.06，168.06，167.83，164.42，159.89，159.32，159.20，157.82，133.90，129.74，119.16，117.61，116.90，65.35，63.27，58.00，56.49，53.10，50.36，42.78，37.49，30.92，30.39，25.19，19.53，19.00，18.22，15.61。實驗例1ROESY2DNMR與A-RGDV的分子內(nèi)和分子間相互作用將A-RGDV用氘代DMSO溶解，800MHz核磁共振儀上測得ROESY2DNMR譜(圖3)，用以支持分子間和分子內(nèi)的相互作用能促使A-RGDV形成納米粒子。如圖3，標(biāo)出了4個相關(guān)峰。相關(guān)峰1表示阿司匹林上的乙?；谆鵋和精氨酸上的胍基H的距離相關(guān)峰1表明精氨酸上的胍基H和阿司匹林上的乙酰基O可能形成氫鍵，A-RGDV的阿司匹林-精氨酸部分能形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。相關(guān)峰2表示天冬氨酸的羧基氫和精氨酸的胍基氫相關(guān)。相關(guān)點3表示阿司匹林苯環(huán)上對位氫和天冬氨酸的羧基氫相關(guān)。相關(guān)峰4表示纈氨酸的甲基氫和精氨酸側(cè)鏈的β-和γ-CH2的氫相關(guān)。這些相關(guān)峰表明，一個分子的苯環(huán)H到另一個分子的肽鏈H的距離和一個分子的肽鏈H到另一個分子的肽鏈H的距離都這些H靠近既反映了A-RGDV分子間相互接近的立體化學(xué)關(guān)系，也反映了A-RGDV分子間相互接近的立體化學(xué)關(guān)系來自分子間締合。實驗例2ESI-MS譜圖支持A-RGDV以四聚體存在于溶液中將A-RGDV溶于水進(jìn)行質(zhì)譜測試，ESI-MS高分辨譜圖如圖4。右上角放大圖顯示質(zhì)荷比為2261.45306的離子峰表示4個A-RGDV失去乙?；瑫r加H。意味著A-RGDV在水中以四聚體存在。質(zhì)譜圖還給出了質(zhì)荷比為1697.73621，1131.45904和566.11528的離子峰，它們分別對應(yīng)3個A-RGDV失去乙酰基同時加H，2個A-RGDV失去乙?；瑫r加H，1個A-RGDV失去乙?；瑫r加H?？梢姡诟叻直尜|(zhì)譜條件下A-RGDV的四聚體溶液裂解丟失乙?；⑨尫湃垠w，二聚體和單體。在這些離子峰中，二聚體的峰最高。實驗例3A-RGDV的透射電鏡和掃描電鏡照片1)制樣配制A-RGDV的水溶液，調(diào)pH＝7.2，將此溶液滴在銅網(wǎng)上，再滴一滴無水甲醇促進(jìn)溶劑揮發(fā)。揮干溶劑后在透射電鏡(TEM)下觀察其納米形態(tài)。將A-RGDV溶于超純水(1.2mM)，凍干。用雙面膠將凍干粉粘在銅板上，掃描電鏡(SEM)下觀察。2)實驗結(jié)果A-RGDV在pH＝7.2的水溶液中能形成直徑為5-175nm的納米球，90％以上的納米顆粒的直徑小于50nm。這種尺寸既能使納米顆粒避開巨噬細(xì)胞吞噬，也有利于納米顆粒中的A-RGDV在血液循環(huán)中轉(zhuǎn)運。SEM下觀察A-RGDV的固體形態(tài)，為長2-14μm的橢球。在粉線標(biāo)識的固體顆粒表面能看到一些小點，暗示這些顆粒是由一些小顆粒構(gòu)成的。由SEM照片不難想象，在水中這些顆粒能分散成之前提到的尺寸的納米顆粒。圖5左為A-RGDV的TEM照片，圖5右為A-RGDV的SEM照片。實驗例4A-RGDV在大鼠血漿中的原子力顯微鏡照片1)制樣將A-RGDV溶于水或大鼠血漿中，配制成8.0×10-7M的濃度，調(diào)pH＝7.2。2)實驗結(jié)果拍攝A-RGDV在大鼠血漿中的原子力顯微鏡(AFM)照片如圖6，用以了解A-RGDV在血液中的納米特征。如圖6所示，在水中和大鼠血漿中，A-RGDV呈直徑約為50nm的納米顆粒，然而單純大鼠血漿的照片沒有觀察到相似的納米結(jié)構(gòu)。這些觀察結(jié)果表明，即便在大鼠血漿中，A-RGDV的納米粒仍然穩(wěn)定，能夠在血液循環(huán)中完整地轉(zhuǎn)運。實驗例5A-RGDV四聚體形成納米顆粒的過程通過計算機輔助的分子動力學(xué)方法，模擬了A-RGDV的優(yōu)勢構(gòu)象。用系統(tǒng)搜索方法產(chǎn)生30個構(gòu)象，用BEST方法產(chǎn)生195個構(gòu)象。生成的這225個構(gòu)象通過可視化的檢測，符合ROESY2DNMR圖譜上相關(guān)峰1并選出有最低自由能的構(gòu)象。為滿足結(jié)構(gòu)要求，分子間氫鍵相互作用通過ROESY2DNMR圖譜上相關(guān)峰2-4規(guī)定，ESI-MS譜圖上2260.63965離子峰說明4個分子應(yīng)該在附近并形成一個四聚體。通過計算機輔助的介觀模擬軟件使用四聚體作為構(gòu)造塊，構(gòu)建納米顆粒。發(fā)現(xiàn)，形成一個直徑為5nm的納米顆粒需要24個四聚體。圖5和圖7d，7e，7g所示，A-RGDV形成的最小的納米顆粒的直徑為5nm。因此，最小的納米顆粒包含24個A-RGDV四聚體。實驗例6A-RGDV在血栓中釋放阿司匹林1)制樣大鼠眼眶取血，往血樣中加3.8％檸檬酸鈉水溶液或不加3.8％檸檬酸鈉水溶液。往200μL血樣中加50μLA-RGDV水溶液(3μM)或不加50μLA-RGDV水溶液(3μM)。血液凝固后，不含3.8％檸檬酸鈉溶液的樣品在37℃孵育30min。離心10min，轉(zhuǎn)速10000r/m。將不含3.8％檸檬酸鈉的血樣形成的血栓磨碎，離心10min，轉(zhuǎn)速10000r/m。取10μL進(jìn)樣。2)實驗結(jié)果用ESI-MS檢測A-RGDV在血漿和血栓中的變化，考察RGDV是否能作為阿司匹林的載體，譜圖見圖8。圖8A2表明，A-RGDV在大鼠血漿中孵化30minESI-MS譜只給出A-RGDV的離子峰(606.23637)，沒有發(fā)現(xiàn)RGDV自身的離子峰(444.25338)。另一方面，不含A-RGDV大鼠血漿的ESI-MS譜(圖8A1)也沒有類似的離子峰?？梢?，A-RGDV在大鼠血漿中孵化30min不釋放阿司匹林。圖8B2表示A-RGDV在大鼠血栓中孵化30min，ESI-MS譜給出A-RGDV(606.23637)，RGDV(444.25338)和阿司匹林二聚體加C1-(395.13477)的離子峰。可見，在大鼠血漿中孵化30min，A-RGDV會釋放阿司匹林。另一方面，不含A-RGDV的大鼠血栓的ESI-MS譜(圖8B1)上沒有類似的峰。實驗例7與GPIIb/IIIa的相互作用導(dǎo)致A-RGDV釋放阿司匹林1)制樣制備A-RGDV的水溶液(100μg/mL)，GPIIb/IIIa的水溶液(0.4μg/mL)，A-RGDV和GPIIb/IIIa的混合水溶液(100μg/mL和0.4μg/mL)37℃下孵化30min。各取10μL進(jìn)樣。2)實驗結(jié)果眾所周知，在被激活血小板的表面存在RGD序列的受體GPIIb/IIIa。用ESI-MS譜檢測GPIIb/IIIa對A-RGDV釋放阿司匹林的影響，譜圖如圖9。在GPIIb/IIIa自身的ESI-MS譜(圖9A)中沒有與A-RGDV，RGDV及阿司匹林有關(guān)的離子峰。而在A-RGDV加GPIIb/IIIa的ESI-MS譜(圖9B)中存在A-RGDV(606.23637)，A-RGDV裂解乙?；?564.24836，強度為6×107)和RGDV(444.22655)的離子峰。存在RGDV的離子峰，表明GPIIb/IIIa和A-RGDV的相互作用導(dǎo)致A-RGDV釋放了阿司匹林。實驗例8與COX-1的相互作用導(dǎo)致A-RGDV轉(zhuǎn)移乙酰基1)制樣制備COX-1的水溶液(2.2μg/mL)，A-RGDV的水溶液(100μg/mL)，A-RGDV和COX-1的混合水溶液(100μg/mL和2.2μg/mL)37℃下孵化30min。各取10μL進(jìn)樣。2)實驗結(jié)果眾所周知，環(huán)氧合酶-1(COX-1)是促使花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素G2的關(guān)鍵酶。用ESI-MS譜檢測COX-1與A-RGDV的作用，如圖10。在COX-1的ESI-MS圖譜(圖10A)中沒有發(fā)現(xiàn)與A-RGDV，RGDV和阿司匹林有關(guān)的離子峰，在A-RGDV加COX-1的ESI-MS譜(圖10B)中只存在A-RGDV丟失乙酰基(564.24803)的離子峰。在A-RGDV自身的ESI-MS譜(圖10C)中，同時存在A-RGDV(606.23637)和A-RGDV丟失乙酰基(564.24803)的離子峰。可見，A-RGDV與COX-1的相互作用導(dǎo)致A-RGDV徹底消失。很明顯，這與A-RGDV向COX-1轉(zhuǎn)變乙?；嘘P(guān)。實驗例9A-RGDV體外抗血小板聚集活性實驗1)配液血小板聚集誘導(dǎo)劑(均來源于SIGMA公司)均用生理鹽水(NS)溶解，二磷酸腺苷(ADP，濃度500μmol/ml)，花生四稀酸(AA，濃度7.4mg/ml)，凝血酶(TH，濃度1-5U/ml)。A-RGDV，RGDV，阿司匹林用NS配成濃度為10-4M的溶液。3)實驗方法豬頸動脈取血，用經(jīng)硅烷化處理的血清瓶收集，預(yù)先按10％的比例加入3.8％枸櫞酸鈉溶液抗凝，37℃下保存。將新鮮豬全血迅速以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，收集上清液即為富血小板血漿(PRP)。剩下的全血1500r/min離心10min，收集上清液即為貧血小板血漿(PPP)。PRP與PPP均保存在37℃下。在血小板聚集儀上測定ADP，TH和AA為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集。每個測量平行6次。表1為RGDV，阿司匹林，A-RGDV對ADP，TH，AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用的影響。數(shù)據(jù)說明，阿司匹林和RGDV不能抑制TH和AA誘導(dǎo)的血小板聚集，A-RGDV抑制TH和AA誘導(dǎo)的血小板聚集的能力明顯高于阿司匹林和RGDV。A-RGDV抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的能力低于RGDV。A-RGDV選擇性地抑制AA誘導(dǎo)的血小板聚集，比RGDV高出23倍。表1RGDV，阿司匹林，A-RGDV對ADP，TH和AA誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制率實驗例10A-RGDV的體內(nèi)抗血栓活性實驗1)分組，劑量及配液陽性對照組：阿司匹林16.7μmol/kg，167μmol/kg；試驗組：RGDV100nmol/kg，A-RGDV1nmol/kg，0.1nmol/kg，0.01nmol/kg；空白對照為生理鹽水。麻醉劑為烏拉坦20g/100ml，7ml/kg，腹腔注射。抗凝劑為肝素鈉50IU/ml。以上均用生理鹽水配制。2)實驗動物Wister大鼠，255-302g，每組12只。3)制備旁路旁路插管為硅烷化過的聚乙烯膠管，分三段，中段為聚乙烯膠管，長6.0cm，內(nèi)徑3.5mm；兩端為相同的聚乙烯管，管長10.0cm，內(nèi)徑1.0mm，外徑2.0mm，該管的一端拉成尖管(用于插入大鼠頸動脈或靜脈)外徑為1.0mm。欲插大鼠頸動脈的一端套上一根充滿肝素鈉生理鹽水溶液的注射器，將旁路中充滿肝素鈉，同時保證注射器中還留有足夠的肝素鈉。4)實驗方法麻醉大鼠仰臥位固定，分離右頸總動脈和左頸總靜脈，結(jié)扎頸總動脈遠(yuǎn)心端，結(jié)扎頸總靜脈遠(yuǎn)心端，剪一小口，將一根充滿肝素鈉生理鹽水溶液的聚乙烯管插入頸總靜脈并固定，按1mL/kg的劑量推注肝素鈉生理鹽水溶液。拔下肝素鈉注射器，換上吸有計算量藥液的藥液注射器，將藥品緩緩?fù)迫氪笫篌w內(nèi)。用動脈夾夾住頸總動脈近心端，在頸總動脈遠(yuǎn)心端剪一小口，將聚乙烯管另一端插入頸總動脈并固定。松開動脈夾，血流從右側(cè)頸總動脈經(jīng)聚乙烯管流入左側(cè)頸總靜脈，形成旁路循環(huán)。15min后小心取出取出絲線，在濾紙上輕輕蘸掉血滴，精確稱重并記錄血栓濕重。統(tǒng)計各組的血栓濕重并做t檢驗。5)實驗結(jié)果16.7μmol/kg阿司匹林和100nmol/kgRGDV無抗栓活性。0.1和1nmol/kgA-RGDV有明顯的抗栓活性，且抗栓活性存在劑量依賴性。阿司匹林的無效劑量(16.7μmol/kg)是A-RGDV的有效劑量(0.1nmol/kg)的16700倍。圖11表示，不同劑量阿司匹林，RGDV和不同劑量A-RGDV的體內(nèi)抗栓活性。實驗結(jié)果說明，A-RGDV具有優(yōu)秀的抗栓活性，這與它能靶向定位于被激活的血小板，釋放阿司匹林作用于被激活的血小板，同時能抑制血栓形成有關(guān)。實驗例11A-RGDV對GPIIb/IIIa表達(dá)水平的影響1)實驗方法大鼠取血，按1/9的比例加入3.8％檸檬酸鈉水溶液，迅速離心(160×g，15min)，收集富血小板血漿(PRP)。往600μLPRP中加入5400μL稀釋液，制得PRP樣品。往960μLPRP中加入濃度為0.4mM的A-RGDV或RGDV的NS溶液20μL，37℃孵育5min，加入20μL濃度為0.15mg/ml的AA的NS溶液，37℃孵育3min。以上作為A-RGDV或RGDV處理PRP的受試樣品。往960μLPRP中加入20μLNS溶液，37℃孵育5min，然后加入20μL濃度為0.15mg/ml的AA的NS溶液，37℃孵育3min作為空白對照。往包被了酶的空白孔和受試孔中分別加入50μLNS處理過的PRP和50μLNS處理過的PRP。將板在37℃孵育30min后，棄去孔中試劑，用300μL洗劑清洗5次，每次300μL。往空白孔中加入50μLNS，往受試孔中加入50μL酶標(biāo)記液。將板在37℃孵育30min后，棄去孔中試劑，用300μL洗劑清洗5次，每次300μL。往各孔中依次加入50μL染色劑A和50μL染色劑B，37℃避光輕輕混合并染色15min。往各孔中加入50μL終止劑終止染色10min。450nm波長下測得各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算GPIIb/IIIa的表達(dá)水平。測試前樣品可在-20℃保存不超過10天。2)實驗結(jié)果用ELISA試劑盒檢測RGDV和A-RGDV處理過的血小板的GPIIb/IIIa的表達(dá)水平，考察RGDV對A-RGDV與GPIIb/IIIa受體相互作用的影響，結(jié)果如圖12。0.4mM濃度下RGDV和A-RGDV都顯著抑制了GPIIb/IIIa表達(dá)。另一方面，A-RGDV的抑制活性顯著高于RGDV。該比較說明，GPIIb/IIIa同時是RGDV和A-RGDV的受體，阿司匹林和RGDV的綴合物明顯增強了RGDV和GPIIb/IIIa的相互作用。