本發(fā)明系關于一種豬第二型環(huán)狀病毒(Porcinecircovirustype2,PCV2)次單位疫苗，特別是指一種可以被大量表現(xiàn)的PCV2ORF2蛋白質片段做為抗原蛋白質，以及加入適當?shù)妮d劑或佐劑而形成的豬第二型環(huán)狀病毒次單位疫苗。

背景技術：
豬第二型環(huán)狀病毒已知與離乳后多系統(tǒng)消耗性綜合癥(PostweaningMultisystemicWastingSyndrome,PMWS)、豬皮膚炎腎病癥候群(PorcineDermatitisAndNephropathySyndrome,PDNS)有關。PMWS最早于1991在加拿大發(fā)現(xiàn)，且之后于全世界各地陸續(xù)有被報導。該病對于全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重損失，其主要病征為患豬體重漸進性喪失(progressiveweightloss)、急性呼吸癥(tachypnea)、呼吸困難(dyspnea)、黃疸(jaundice)等。病理學上，肉眼及組織病變有淋巴球性肉芽腫性浸潤(lymphocyticandgranulomatousinfiltrate)、淋巴結病(lymphadenopathy)、淋巴球性肉芽腫性肝炎(lymphocyticandgranulomatoushepatitis)及腎炎(nephritis)。豬環(huán)狀病毒(porcinecircovirus,PCV)最早于1982年在豬腎細胞株(PK-15,ATCCCCL31)中被發(fā)現(xiàn)，雖然會持續(xù)感染該細胞，但是并不產生細胞病變效應(cytopathiceffect,CPE)，另外該病毒雖會感染豬只，但是并不造成任何病變，該病毒株系命名為PCV1。PCV1病毒為一環(huán)狀單股、全長1759bp的正二十面體(icosahedron)病毒，在1995年被歸類為環(huán)狀病毒科(Circoviridae)的一員。自PK-15細胞中分離出的PCV1被認定是不具備病源性，而于1997年自罹患離乳后多系統(tǒng)消耗性綜合癥(PostweaningMultisystemicWastingSyndrome,PMWS)豬只體內，分離出對豬只具有病原性的突變豬環(huán)狀病毒，該病毒株命名為PCV2。離乳后多系統(tǒng)消耗性綜合癥(PMWS)是一種具有高度傳染力的豬只疾病，該病主要感染幼豬及懷孕母豬，嚴重影響豬只健康。PCV2病毒直徑大小為17nm，具有環(huán)狀單股DNA，DNA大小為1.76Kb，基因組序列經軟體分析后發(fā)現(xiàn)順時針加上逆時針共有11個開放閱讀區(qū)(openreadingframe,ORF)，其中ORF1、ORF2是2個最主要的基因。ORF1可轉錄出Rep及Rep’蛋白，和該病毒的復制有關(Mankertzetal.,2001)。已知ORF2本身是PCV2病毒的免疫性結構殼體蛋白(immunogenicstructurecapsidprotein)，用以誘導生物體產生免疫反應。最常見的市售PCV2疫苗為PCV2死毒疫苗，然而死毒疫苗研發(fā)上需取得無其他病毒感染的細胞株，且其最大的缺點在于無法確保在制備死毒疫苗過程中，化學藥劑是否完全不活化病毒株；而另一缺點在于以化學藥劑來殺死病原菌很有可能會改變病原菌的抗原結構，使得所誘發(fā)出來的免疫反應無法中和病原菌的毒性，因此造成該死毒疫苗無法保護豬只避免感染此疾??；由此可知，死毒疫苗產品發(fā)展不易、成本高，且其安全性堪慮。相對于死毒疫苗是以整株病毒作為疫苗的抗原，次單位疫苗則是取病原菌中一部分的蛋白質作為抗原蛋白質，并將該抗原蛋白質作為疫苗接種到動物或人體中，使接種后的動物或人體可產生免疫力。它的制備方式是先選殖病原菌中的抗原蛋白質的基因，然后以遺傳工程的技術將此抗原蛋白質大量生產。其最大的優(yōu)點是安全性高，因為它只是病原菌的一個部分，所以注射到豬只體內的并不是一個完整的病原菌，不會有病原菌不活化不完全的顧慮。習用PCV2次單位疫苗系使用ORF2蛋白片段作為抗原蛋白質；然而ORF2的全長蛋白質在原核生物表現(xiàn)系統(tǒng)中表現(xiàn)量很低，不符制備疫苗的需求。因此，研發(fā)可以在生物表現(xiàn)系統(tǒng)中表現(xiàn)量高的PCV2ORF2疫苗抗原片段，將有助于PCV2次單位疫苗的商業(yè)應用。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種PCV2病毒ORF2蛋白片段的DNA序列，該DNA序列可于生物表現(xiàn)系統(tǒng)中表現(xiàn)出大量的PCV2病毒ORF2蛋白片段。本發(fā)明并提供一種PCV2次單位疫苗，系以可在生物表現(xiàn)系統(tǒng)中大量表現(xiàn)的PCV2病毒ORF2蛋白片段作為疫苗的抗原蛋白，使該疫苗在施打于動物體后，可以誘導動物體產生足以抵抗PCV2病毒感染的免疫力。本發(fā)明并提供一種利用基因重組技術所研發(fā)的次單位疫苗，以生產制程簡單、成本低、純度高、安全性佳的PCV2次單位疫苗。由于PCV2病毒ORF2蛋白全長片段難以在生物系統(tǒng)中大量表現(xiàn)，為達成上述發(fā)明目的，本案發(fā)明人利用基因重組技術，將PCV2病毒中編碼ORF2全長蛋白(如SEQIDNO:2所示)的DNA序列(如SEQIDNO:1所示)，進行不同長度的切割，再將所形成的各DNA片段分別構筑至蛋白表達載體上，于生物系統(tǒng)中表現(xiàn)蛋白質，以決定于生物系統(tǒng)中可產生高量蛋白質的DNA片段。經蛋白質序列分析以及蛋白表現(xiàn)量試驗結果顯示，PCV2病毒ORF2全長蛋白共有約30個精氨酸(Arginine)，其中三分之二以上的精氨酸集中于ORF2蛋白的氨基端(aminoterminal，N端)，當ORF2蛋白N端的精氨酸數(shù)目被去除的越多，ORF2蛋白片段在生物表現(xiàn)系統(tǒng)中的表現(xiàn)量就越多；而去除編碼ORF2蛋白的DNA序列5’端234bp后所剩的DNA片段(即5’端235bp至終止密碼子(stopcodon)之間的片段)，可以在生物表現(xiàn)系統(tǒng)中大量表現(xiàn)。是以，本發(fā)明所提供的PCV2次單位疫苗，包括一PCV2抗原蛋白質片段，以及適當?shù)妮d劑或佐劑；該抗原蛋白質片段可于生物表現(xiàn)系統(tǒng)中大量表現(xiàn)，系為PCV2病毒的ORF2非富含精氨酸肽(non-Arginine-richpeptide)，該PCV2ORF2非富含精氨酸肽的精氨酸數(shù)量系為該PCV2ORF2全長肽的N端富含精氨酸區(qū)域(Arginine-richdomian)的精氨酸數(shù)量的二分之一(1/2)以下；于一實施例中，當該PCV2ORF2的N端富含精氨酸區(qū)域的精氨酸數(shù)量為20時，則于該PCV2ORF2非富含精氨酸肽的精氨酸數(shù)量等于0或1至10之間的正整數(shù)；于另一實施例中，當該PCV2ORF2的N端富含精氨酸區(qū)域的精氨酸數(shù)量為21時，則于該PCV2ORF2非富含精氨酸肽的精氨酸數(shù)量等于0或1至10之間的正整數(shù)；于又一實施例中，當該PCV2ORF2的N端富含精氨酸區(qū)域的精氨酸數(shù)量為22時，則于該PCV2ORF2非富含精氨酸肽的精氨酸數(shù)量等于0或1至11之間的正整數(shù)。于一實施例中，該富含精氨酸區(qū)域為該PCV2ORF2全長肽的氨基端(N端)第1-78個氨基酸的區(qū)域(相當于DNA序列的5端第1-234個核苷酸之間的區(qū)域)；于一實施例中，該非富含精氨酸肽為該PCV2ORF2全長肽的氨基端(N端)第79個氨基酸至羧基端(C端)最后一個氨基酸間的肽(相當于DNA序列的5’端第235個核苷酸至3’端終止密碼子之間的區(qū)域)。該PCV2ORF2全長肽與如SEQIDNo:2、SEQIDNo:16、SEQIDNo:20、SEQIDNo:51及SEQIDNo:53所示的序列其中之一具有至少80％序列同源性(homology)，較佳者，具有85％序列同源性，更佳者，具有90％序列同源性，甚至是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同源性。于一較佳實施例中，該PCV2ORF2全長肽系為如SEQIDNo:2、SEQIDNo:16、SEQIDNo:20、SEQIDNo:51及SEQIDNo:53所示的序列其中之一。此外，本發(fā)明并利用綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A(exotoxinA)的受體結合區(qū)(receptorbindingdomainI)及運輸結構區(qū)(transmembranetargetingdomainII)的蛋白(即PE蛋白)以及內質網回收訊號(ERretentionsignal，即KDEL蛋白質訊號序列(signalpeptide))的特性，提供一種PCV2ORF2融合蛋白抗原片段。綠膿桿菌PE蛋白系可作為目標蛋白的引導媒介，其作用的方式為：首先，綠膿桿菌外毒素A的受體結合區(qū)蛋白負責與目標細胞(CD8+T細胞)的細胞膜上的細胞受體(receptor)結合，經由細胞內噬作用(endocytosis)進入細胞的內膜體(endosome)中，當綠膿桿菌外毒素A被內膜體中的蛋白酶切割后，綠膿桿菌外毒素A的運輸結構區(qū)蛋白會將剩余的蛋白片段(含運輸結構區(qū)蛋白及其后所連接的目標蛋白)由內膜體位移至細胞質內，與高基氏體(Golgibody)及內質網(endoplasmicreticulum,ER)結合，進而將目標蛋白引導至目標細胞中。另外，若一目標蛋白的C端具有一KDEL蛋白質訊號序列(signalpeptide)，則在該KDEL蛋白質訊號序列的作用下，目標蛋白會被回收至內質網，進而進入內質網進行作用。因此，本發(fā)明進一步利用PE蛋白及KDEL蛋白質訊號序列的特性，提供一種PCV2ORF2融合蛋白抗原片段，系于PCV2病毒ORF2蛋白片段的N端加上PE蛋白，且于該PCV2病毒ORF2蛋白片段的C端加上KDEL蛋白質訊號序列(signalpeptide)，以產生抗原融合蛋白(PE-ORF2片段-KDEL)，使該疫苗在施打于動物體后，可以誘導動物體產生足以抵抗PCV2病毒感染的免疫力。于部分實施態(tài)樣中，本發(fā)明所用的抗原蛋白包含但不限于PCV2病毒ORF2蛋白片段，該ORF2蛋白片段系與如SEQIDNo:6、SEQIDNo:8、SEQIDNo:10、SEQIDNo:12、SEQIDNo:18、SEQIDNo:22、SEQIDNo:55及SEQIDNo:57所示的序列其中之一具有至少80％序列同源性，較佳者，具有85％序列同源性，更佳者，具有90％序列同源性，甚至是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同源性。于一較佳實施例中，該PCV2病毒ORF2蛋白片段系為如SEQIDNo:6、SEQIDNo:8、SEQIDNo:10、SEQIDNo:12、SEQIDNo:18、SEQIDNo:22、SEQIDNo:55及SEQIDNo:57所示的序列其中之一，該蛋白片段系藉由基因轉殖方式而得；分別將編碼PCV2病毒ORF2蛋白片段的DNA序列(SEQIDNO:5,7,9,11,17,21,54,56)選殖到表現(xiàn)載體中，各形成含有編碼抗原蛋白的DNA序列的質體，再將該質體轉殖到生物表現(xiàn)宿主中，經蛋白質表現(xiàn)后而得到的抗原蛋白。本發(fā)明所用的抗原融合蛋白(PE-ORF2片段-KDEL)系藉由基因轉殖方式而得，系將上述編碼PCV2ORF2的DNA部分片段序列(SEQIDNO:5,7,9,11,17,21,54,56)、編碼PE蛋白質訊號序列的DNA片段序列(如SEQNo:34所示)，以及編碼KDEL蛋白質訊號序列的DNA片段序列(如SEQNo:30所示)選殖到表現(xiàn)載體系統(tǒng)中，形成含有編碼抗原融合蛋白的DNA序列的質體，再將該質體轉殖到表現(xiàn)宿主中，經蛋白質表現(xiàn)后而得到的抗原融合蛋白。該表現(xiàn)載體系統(tǒng)包含但不限于pET載體系統(tǒng)以及pGEX載體系統(tǒng)等；于一實施例中，該表現(xiàn)載體為pET24a；該生物表現(xiàn)系統(tǒng)(宿主)包含但不限于：原核表現(xiàn)系統(tǒng)(如：大腸桿菌(Escherichiacoli))、真核表現(xiàn)系統(tǒng)(如：動物細胞(CHOcell)、植物細胞)，于一實施例中，該表現(xiàn)系統(tǒng)為大腸桿菌(E.coli)。該佐劑包含但不限于水性氫氧化鋁膠、明礬、Freund氏不完全佐劑、油質佐劑、水溶性佐劑、或水包油包水雙相佐劑(water-in-oil-in-water,W/O/W)；于一實施例中，該佐劑為油質佐劑。本發(fā)明所提供的免疫組合物，進一步可包含PCV2其他開放閱讀區(qū)(openreadingframe,ORF)的抗原蛋白，該PCV2其他ORF的抗原蛋白包含但不限于：ORF1、ORF3。此外，該免疫組合物可進一步包含一種病原抗原，該病原抗原系選自由下列群組所組成者：豬流感病毒(SIV)抗原、豬繁殖與呼吸癥候群病毒(PRRSV)抗原、豬霉?jié){菌(Mycoplasma)、豬小病毒(Parvovirus,PPV)、豬丹毒(Erysipelas)，以及偽狂犬病(Aujeszky'sdisease)。另，本發(fā)明所提供的免疫組合物可進一步包含一或多種選自于下者：載劑、溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤滑劑、界面活性劑、佐劑、生物型載體。本說明書中所述的所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同了解的意義。本發(fā)明系以下面的實施例予以示范闡明，但本發(fā)明不受下述實施例所限制。附圖說明圖1為豬第二型環(huán)狀病毒(PCV2)基因組序列的親緣樹分析圖。圖2為PCV2ORF2分段表現(xiàn)示意圖，其中pF1、pF2、pF3、pF4、pR1、pR2、pR3為PCR引子。圖3為以SDS-PAGE分析以大腸桿菌分別表現(xiàn)PCV22a-ORF2各片段重組蛋白的結果；將大腸桿菌以IPTG誘導6小時后，收集全菌蛋白，以15％SDS-PAGE分析；其中第1道為標準分子量(molecularweightladder)；第2道為pET24a載體(負對照組)；第3道為PCV2ORF22a-F1片段(12.7KDa)；第4道為PCV2ORF22a-F2片段(11.6KDa)；第5道為PCV2ORF22a-F3片段(12.1KDa)；第6道為PCV2ORF22a-F4片段(16.5KDa)；第7道為PCV2ORF22a-F5片段(21.4KDa)；第8道為PCV2ORF22a-F6片段(20.8KDa)；第9道為PCV22a-ORF2全長片段(27.5KDa)。圖4為以西方墨漬法檢測PCV22a-ORF2各片段重組蛋白表現(xiàn)的結果；其中第1道為標準分子量(molecularweightladder)；第2道為pET24a載體(負對照組)；第3道為PCV2ORF22a-F1片段(12.7KDa)；第4道為PCV2ORF22a-F2片段(11.6KDa)；第5道為PCV2ORF22a-F3片段(12.1KDa)；第6道為PCV2ORF22a-F4片段(16.5KDa)；第7道為PCV2ORF22a-F5片段(21.4KDa)；第8道為PCV2ORF22a-F6片段(20.8KDa)；第9道為PCV22a-ORF2全長片段(27.5KDa)。圖5為大鼠分別以各不同長度片段的2a-ORF2重組蛋白免疫后，不同時間采集的血液樣本以PCV2ELISA測定抗體力價的結果，*表示p<0.05。圖6為小鼠分別以2a-F2重組蛋白以及PE-2a-F2-KDEL重組蛋白免疫后，不同時間采集的血液樣本以PCV2ELISA測定抗體力價的結果，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；#表示p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。圖7為小鼠分別以PE-2a-F2-KDEL重組蛋白以及PCV2全病毒疫苗免疫后，不同時間采集的血液樣本以PCV2ELISA測定抗體力價的結果，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；#表示p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。具體實施方式實施例一PCV2次單位疫苗抗原蛋白片段的構筑及決定由于PCV2病毒ORF2蛋白全長片段難以在生物表現(xiàn)系統(tǒng)中大量生產，因此本案發(fā)明人將PCV2ORF2蛋白的基因分成不同DNA片段，并將這些不同的DNA片段構筑至載體上，于生物表現(xiàn)系統(tǒng)中表現(xiàn)各DNA片段編碼的蛋白質，并分析各DNA片段在生物表現(xiàn)系統(tǒng)中的蛋白質產量，以決定于生物表現(xiàn)系統(tǒng)中可產生高量蛋白質的較佳DNA片段。以下，系以常用的原核生物表現(xiàn)系統(tǒng)(大腸桿菌)用以分析及說明。1.增幅不同長度PCV2ORF2基因片段本實施例中所使用的PCV2ORF2基因序列全長如SEQIDNo:1所示，根據(jù)Wang等人(Wangetal.,VirusResearch2009,GeneticvariationanalysisofChinesestrainsofporcinecircovirustype2)所提供的序列作為親源關系樹標準序列來分析SEQIDNo:1；結果顯示該PCV2ORF2序列(SEQIDNo:1)屬于PCV22a亞群(subgroup)的一員(如圖1所示)。針對上述PCV22a的ORF2(以下稱為2a-ORF2)基因序列設計可增幅不同長度2a-ORF2基因片段的引子(如表一所示)，以進行聚合酶連鎖反應(polymerasechainreaction,PCR)增幅各片段。如圖2所示，全長的2a-ORF2基因片段以專一性引子pF1(正向引子)及pR1(反向引子)進行PCR增幅，取得全長2a-ORF2基因片段的DNA序列如SEQIDNO:1所示，以下簡稱2a-ORF2；而不同長度的PCV22a-ORF2基因片段則分別命名為2a-F1、2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5及2a-F6。2a-F1片段位于PCV22a-ORF2的5’端第1至234個核苷酸的位置，2a-F1片段的DNA序列如SEQIDNO:3所示。2a-F2片段位于PCV2ORF2的5’端第235至468個核苷酸的位置，2a-F2片段的DNA序列如SEQIDNO:5所示。2a-F3片段位于PCV2ORF2的5’端第469至699個核苷酸的位置，2a-F3片段的DNA序列如SEQIDNO:7所示。2a-F4片段位于PCV2ORF2的5’端第349至699個核苷酸的位置，2a-F4片段的DNA序列如SEQIDNO:9所示。2a-F5片段位于PCV2ORF2的5’端第235至699個核苷酸的位置，2a-F5片段的DNA序列如SEQIDNO:11所示。2a-F6片段位于PCV2ORF2的5’端第1至468個核苷酸的位置，2a-F6片段的DNA序列如SEQIDNO:13所示。所有的正向引子(forwardprimer)均設計具HindIII的限制酶切位，而反向引子(reverseprimer)均設計具XhoI的限制酶切位。表一、用以增幅不同長度的PCV2ORF2基因片段的引子序列表注：序列下方以____標示者為酵素切位HindIII的序列(AAGCTT)，序列下方以標示者為酵素切位XhoI的序列(CTCGAG)。PCR反應條件為：95℃反應5分鐘后，進行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，共25個循環(huán)，最后以72℃反應5分鐘以進行延伸反應(elongation)；所得的PCR產物大小分別為：2a-ORF2為699bp、2a-F1為234bp、2a-F2為234bp、2a-F3為231bp、2a-F4為351bp、2a-F5為465bp、2a-F6為468bp。并以2％洋菜膠電泳(agaroseelectrophoresis)鑒定各PCR產物片段大小。鑒定無誤后，以PCR-M純化套組(Viogene)純化各PCR產物。2.將不同長度PCV2ORF2基因片段構筑于pET24a表現(xiàn)載體分別將1μgPCR產物與1μg的pET24a表現(xiàn)載體(Novagen)，以1μlHindIII及1μlXhoI(NewEnglandBiolabs)兩種限制酶進行限制酶切割反應(RestrictionEnzymeCleavageReaction)，于37℃反應8小時。再以PCR-MCleanupSystem純化套組(Viogene)純化酶切后的PCR產物及pET24a表現(xiàn)載體，接著進行接合反應(ligation)。將各PCR產物選殖到pET24a載體以取得pET24a-2a-F1、pET24a-2a-F2、pET24a-2a-F3、pET24a-2a-F4、pET24a-2a-F5、pET24a-2a-F6及pET24a-2a-ORF2質體，并將上述質體分別利用轉殖作用(transformation)送入表現(xiàn)宿主大腸桿菌(E.coli)中，經選殖挑選出菌株中帶有PCR片段的質體后，進行定序確認增殖的PCR產物序列無誤，以得到含有上述質體的菌株。3.不同長度PCV2ORF2基因片段的蛋白表達及確認先將含有上述質體的菌株以2ml的LB培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)16-18小時，再將菌液以1：50的比例接種至LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有25μg/mlkanamycin，置于37℃、200rpm的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到菌液濃度達O.D600nm為0.6時，加入β-D-thiogalactoside(IPTG)使其最終濃度為1mM，再于37℃、200rpm的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時，吸取1ml菌液，經10,000×g離心后，取離心后的菌塊以B-PERTM細菌蛋白質萃取試劑(B-PERTMBacterialProteinExtraction，購自PIERCE)來確認重組蛋白為可溶性蛋白或是包涵體(inclusionbody)。確認方法為于菌塊中加入40μl的反應試劑，劇烈震蕩(vortex)1分鐘后，10,000×g離心，離心后重組蛋白在上層部份為可溶性蛋白，在下層部份則為包涵體。將可溶性蛋白溶于SDS-PAGE用的1xsamplebuffer，下層的菌塊則加入2x的SDS-PAGEsamplebuffer。以干浴槽100℃煮沸20分鐘后離心之，吸取上層液體部份，以15％的SDS-PAGE確認重組蛋白表現(xiàn)的情況。以IPTG誘導含有上述質體的菌株產生重組蛋白，其中2a-ORF2重組蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示；2a-F1重組蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:4所示，2a-F2重組蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:6所示，2a-F3重組蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:8所示，2a-F4重組蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:10所示，2a-F5重組蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:12所示，2a-F6重組蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:14所示。以SDS-PAGE確認各片段重組蛋白表現(xiàn)的結果如圖3所示，第1道為標準分子量梯度(Molecularweightladder)，第2道為負對照組(pET24a)，第3道為2a-F1重組蛋白(12.7kDa)，第4道為2a-F2重組蛋白(11.6kDa)，第5道為2a-F3重組蛋白(12.1kDa)，第6道為2a-F4重組蛋白(16.5kDa)，第7道為2a-F5重組蛋白(21.4kDa)，第8道為2a-F6重組蛋白(20.8kDa)，第9道為2a-ORF2全長重組蛋白(27.5kDa)。于2a-ORF2的6個片段中，2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5片段都能大量表現(xiàn)(圖3第4、5、6、7道)，其分子量位置與預測的11.6kDa、12.1kDa、16.5kDa、21.4kDa符合。接著以西方墨漬分析法(WesternBlot)確認表達重組蛋白是否為PCV22a-ORF2的片段。將SDS-PAGE電泳分析后的膠體轉印到PVDF尼龍膜(Nylonmembrane)上。轉印后將尼龍膜置于填塞液(Blockingbuffer：5％Skimmilk,inTBST)于室溫作用1小時，以去除非特異性反應。之后，加入第一級抗體：老鼠抗6x組織氨酸的單株抗體[標幟堿性磷酸酶(AP)]于室溫作用1小時，再以TBST液(10mMTris-HClpH8.0,150mMNaCl,0.1％Tween20)清洗6次，每次各5分鐘。洗滌后，加受質(NBT/BCIP,Bio-Rad)呈色約10分鐘后，以清水水洗終止呈色反應。西方墨漬分析法結果如圖4所示，第1道為標準分子量梯度(Molecularweightladder)，第2道為負對照組(pET24a)，第3道為2a-F1重組蛋白(12.7kDa)，第4道為2a-F2重組蛋白(11.6kDa)，第5道為2a-F3重組蛋白(12.1kDa)，第6道為2a-F4重組蛋白(16.5kDa)，第7道為2a-F5重組蛋白(21.4kDa)，第8道為2a-F6重組蛋白(20.8kDa)，第9道為2a-ORF2全長重組蛋白(27.5kDa)。西方墨漬分析法結果與SDS-PAGE分析結果(如圖3所示)相同。2a-ORF2全長重組蛋白(圖4第9道)無法表現(xiàn)；2a-ORF2的6個片段中，2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5片段的蛋白都能被大量表現(xiàn)(圖4第4、5、6、7道)，其分子量位置與預測的11.6kDa、12.1kDa、16.5kDa、21.4kDa符合。然而，2a-F1和2a-F6片段并沒有重組蛋白的表現(xiàn)(圖4第3、8道)，由于2a-F1和2a-F6片段都涵蓋了從PCV22a-ORF2的5’端第1至234個核苷酸的基因片段(請參閱圖2所示)，因此，造成ORF2基因無法大量表現(xiàn)的原因可能是該2a-F1片段內的某些序列，故針對2a-F1片段(PCV22a-ORF2的5’端第1至234個核苷酸，SEQIDNo:3)及2a-F2+2a-F3片段(PCV22a-ORF2的5’端第235至699個核苷酸(不含終止密碼子)，SEQIDNo:11)的氨基酸序列分析后，發(fā)現(xiàn)2a-F1片段氨基酸序列(SEQIDNo:4)的精氨酸(Arginine)含量是2a-F2+2a-F3片段氨基酸序列(SEQIDNo:12)的2倍以上(如表二所示)；本案發(fā)明人進一步將該些精氨酸增加或刪除后，去分析蛋白質表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)將該些過多的精氨酸減少后，確實可增加PCV2ORF2的蛋白表現(xiàn)量。表二、PCV22a-ORF2氨基酸序列中精氨酸的數(shù)量分析實施例二PCV2次單位疫苗抗原蛋白片段的免疫原性(immunogenicity)的決定1.大鼠免疫試驗將實施例一所得到的2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5重組蛋白以弗氏完全佐劑(Freund’scompleteadjuvant)制備為各種PCV2次單位疫苗，并進行大鼠(rats)免疫試驗，以分析各重組蛋白的引發(fā)試驗動物產生抗PCV2抗體的免疫原性。取5～6周齡健康雌性清潔級大鼠15只作為試驗動物，所有大鼠的豬第二型環(huán)狀病毒(PCV2)酵素結合免疫吸附分析(ELISA)抗體皆呈陰性。將這15只大鼠隨機分為5組，每組3只；第1～4組中，每只大鼠分別以皮下注射(subcutaneously,S.C.)注射200μg重組蛋白，注射疫苗總體積為300μL，其中重組蛋白與佐劑的體積比為1：1。第5組則注射300μLPBS作為負對照組。兩周后用相同免疫劑量加強免疫一次；各組隔離飼養(yǎng)觀察，首次免疫后第0、2、4、8周分別采血分離血清，以酵素連結免疫分析(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)測定血清內抗豬第二型環(huán)狀病毒(...