專利名稱：：人豬重配輪狀病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用生物技術(shù)的構(gòu)建、定性以及操作豬輪狀病毒重組株的方法l人體減毒豬輪狀病毒株。2覆蓋Gl,G2，G3,G4，G5，G6，G8，G9,G10及P1A,P1B，P2A基因型。
背景技術(shù)：
：輪狀病毒腹瀉對(duì)發(fā)展中國(guó)家，甚至于發(fā)達(dá)國(guó)家都是一個(gè)巨大的健康負(fù)擔(dān)。小于5歲的兒童每年約有592，000的死亡病例，在發(fā)展中國(guó)家比例最大。盡管發(fā)達(dá)國(guó)家死于輪狀病毒感染的人數(shù)較少，但是從整體看，輪狀病毒疾病引起的醫(yī)療負(fù)擔(dān)也是巨大的。在美國(guó)每年有20例死亡，50，OOO例醫(yī)療救治，500，OOO例醫(yī)生出診，以及大于1億美元的經(jīng)濟(jì)損失。因此一個(gè)有效且安全的輪狀病毒疫苗，對(duì)世界公眾衛(wèi)生是一個(gè)重大突破。目前己經(jīng)開(kāi)發(fā)的輪狀病毒疫苗，無(wú)論是天然的，或是人工重組獲得的，大都是口服疫苗，都能有效預(yù)防系列輪狀病毒疾病。這些產(chǎn)品包括猿猴四價(jià)疫苗，牛三價(jià)輪狀病毒疫苗，單價(jià)人輪狀病毒疫苗，單價(jià)羊輪狀病毒疫苗，這些疫苗均在世界各地，不同人種間進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)。輪狀病毒外殼蛋白中的VP7和VP4，已被驗(yàn)證可以獨(dú)立的誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，進(jìn)行免疫保護(hù)及預(yù)防疾病。200多年前，Jenner率先利用病毒在人體內(nèi)被限制性復(fù)制的特性，采用來(lái)源動(dòng)物基因的減毒疫苗做預(yù)防人類相關(guān)的疾病，開(kāi)創(chuàng)動(dòng)物疫苗免疫。這類疫苗在人體是減毒的，在預(yù)防人類疾病方面顯示具有較高的活性。豬輪狀病毒在哺乳動(dòng)物和禽類輪狀病毒中是獨(dú)特的，它與人類輪狀病毒具有特殊的關(guān)系。例如1、利用RNA-DNA雜交技術(shù)可以判定豬輪狀病毒與人輪狀病毒在基因型上具有緊密聯(lián)系。2、人輪狀病毒10個(gè)糖蛋白中有8個(gè)在豬中檢測(cè)到，而在牛和猿猴中只檢測(cè)到四個(gè)。3、10個(gè)蛋白激酶中有四個(gè)在豬中檢測(cè)到，而在牛和猿猴中分別只有兩個(gè)和零個(gè)被檢測(cè)到。有趣的是，豬輪狀病毒在Jennerian的方法中還沒(méi)被應(yīng)用。輪狀病毒株VP4基因P(6)與各種G型結(jié)合，開(kāi)始時(shí)被鑒定在新生嬰兒中有極少的癥狀，現(xiàn)在被鑒定在新增嬰兒及兒童中顯著增加。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了輪狀病毒重配株的免疫機(jī)制和在人體應(yīng)用的方法。描述的重配是將單價(jià)重配豬輪狀病毒和人輪狀病毒結(jié)合，以提供與臨床中A組人輪狀病毒血清型最密切的，至少能誘導(dǎo)人體輪狀病毒抗體產(chǎn)生的基因配方。本發(fā)明采用具有獨(dú)特性質(zhì)的豬輪狀病毒gottfried株，特別是血清型為P[6],G4的gottfried株。VP7G4G4血清型與牛輪狀病毒UKVP7血清型P[5]G6同樣代表了，在全球傳染中占重要比例的人類輪狀病毒的一種G血清型。同時(shí)，豬輪狀病毒VP4的中和性質(zhì)與人輪狀病毒VP4的中和性質(zhì)接近，并具有重要的臨床作用。通過(guò)RNA-RNA雜交，表明豬輪狀病毒goUfried株和人輪狀病毒基因型接近。特性證明含有可與人輪狀病毒編碼抗原產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng)的豬輪狀病毒gottfried株，其臨床表現(xiàn)為P7血清型l，2，3，4，5，6，8，9，10和/或VP4血清型1A和1B的免疫組分，很有效用。圖l顯示了人輪狀病毒RNA通過(guò)10。/。聚丙烯酰氨電泳的結(jié)果。第一道D株。第二道重組株GottxD,第三道豬輪狀病毒gottfried株，第四道重組株GottxDS-1，第五道重組人輪狀病毒DS-1，第六道人輪狀病毒M株，第七道重組GottxM，第八道豬輪狀病毒gottfried株，第九道重組株Gottx,第十道人輪狀病毒ST3，第i^一道輪狀病毒IAL28，第十二道重組GottxIAL28，第十三道豬輪狀病毒gottfried株。電流為13mA,電泳15h后通過(guò)銀染直觀比較。圖2顯示了牛輪狀病毒RNA電泳圖譜。第一道牛輪狀病毒UK株。第二道重組株GottxUK,第三道豬輪狀病毒gottfried株，第四道重組株Gottx1290-1，第五道人輪狀病毒1290，第六道人輪狀病毒AU32株，第七道重組GottxAU32，第八道豬輪狀病毒gottfried株，第九道重組株GottxKC-l，第十道牛輪狀病毒KC-1，第H^—道人輪狀病毒Mo，第十二道重組Moxgott，第十三道豬輪狀病毒gottfried株。第十四道重組DS-lxGott，，第十五道人輪狀病毒DS-1，電流為13mA,電泳15h后通過(guò)銀染直觀比較。本發(fā)明提供供人體使用的重配輪狀病毒疫苗。組分是通過(guò)結(jié)合單價(jià)的重配動(dòng)物輪狀病毒和一個(gè)人輪狀病毒或者是別的能與人抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的抗原的動(dòng)物病毒，來(lái)提供與人輪狀病毒A組臨床研究關(guān)系最密切的血清型之一，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生人輪狀病毒特異性抗體反應(yīng)。本發(fā)明的組成成分包含一個(gè)重配的豬輪狀病毒株和一個(gè)可以在生理上接受的載體。體現(xiàn)在，采用目前與在世界各地最為流行的人輪狀病毒血清型相近的豬輪狀病毒重配株。該免疫組分可以免疫嬰兒、孩子或成人，產(chǎn)生防御輪狀病毒的免疫球蛋白，從而產(chǎn)生針對(duì)人輪狀病毒血清型的特異免疫反應(yīng)。該組分可以預(yù)防重的輪狀病毒感染引發(fā)的疾病，如腹瀉。反應(yīng)己經(jīng)通過(guò)動(dòng)物模型展示了。本發(fā)明疫苗在臨床上還未發(fā)現(xiàn)有發(fā)熱，不良反應(yīng)等。免疫后，可在機(jī)體血清檢測(cè)到中和輪狀病毒血清型的免疫抗體。本發(fā)明的多價(jià)免疫組分能夠有效的，在目前不同地區(qū)分離到的人輪狀病毒A組引發(fā)的臨床反應(yīng)起防御作用。還可以應(yīng)用在將來(lái)臨床中可能出現(xiàn)的人輪狀病毒血清型的預(yù)防。本發(fā)明中的豬輪狀病毒重配株免疫組分是通過(guò)分離純化得到的。分離意味著是將其它細(xì)胞和病毒重組產(chǎn)物中分離得到的。例如野毒株，母體毒株，以及其他的細(xì)胞培養(yǎng)或系統(tǒng)中的異質(zhì)成分。普遍意義上來(lái)說(shuō)，輪狀病毒重配株是將動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞敏感病毒如豬，牛，及人輪狀病毒等共感染。典型的如非洲綠猴腎細(xì)胞(AGMK)作為受體細(xì)胞。共感染后，篩選期望的病毒重配株，通過(guò)其中和針對(duì)與人輪狀病毒替換后的動(dòng)物輪狀病毒基因表達(dá)蛋白特異性抗體而確定。如針對(duì)VP7或VP4的多克隆血清或是單克隆抗體。經(jīng)過(guò)幾輪的蝕斑純化和傳代培養(yǎng)，可以確定篩選的重配株的血清型和基因型。血清型是通過(guò)蝕斑中和減少數(shù)確定或是酶聯(lián)反應(yīng)。基因型是通過(guò)凝膠電泳和RNA-RNA雜交技術(shù)。VP7或Vp4基因是用來(lái)篩選輪狀病毒重配株的。期望的重配株包含VP7或Vp4基因的毒株。具體的如人豬輪狀病毒重配株具有人輪狀病毒Vp4(P1A,P1B，P2A0)基因和人輪狀病毒Vp7基因(Gl，G2，G3'G4，G5,G6，G8，G9，G10)。一般的，輪狀病毒重配株的生產(chǎn)是采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞感染培養(yǎng)。特別的是AGMK(非洲綠猴腎細(xì)胞)。動(dòng)物和人輪狀病毒株感染后，采用針對(duì)人輪狀病毒基因編碼蛋白的中和抗體來(lái)篩選出期望的重配株。特別是采用針對(duì)VP7/VP4的多克窿血清或單克窿抗體。通過(guò)幾個(gè)循環(huán)的純化和再培養(yǎng)，選出的重配株就被確定血清型和基因型。血清型是通過(guò)噬斑減少中和或是酶聯(lián)免疫吸附確定，基因型是通過(guò)凝膠電泳或RNA-RNA雜交確定。人輪狀病毒通過(guò)分離用做本發(fā)明的免疫組分。主要的人輪狀病毒Dstrain(PlA[8]，Gl)，Mstrain.ST3(P2A[6]，G4)，Mo(P1A[8]，G1),DS-1(P1B[4]，G2)'IAL28(P1A[8],G5),1290(P[4]'G8)，AU32(P1A[8],G9),被用做人豬輪狀病毒的構(gòu)建。為了獲得人輪狀病毒VP7G10血清型，牛輪狀病毒KC-1及人VP7G10血清型被構(gòu)建到人豬輪狀病毒中。同時(shí)，為了獲得VP7G6血清型，將牛UK及人VP7G6血清型構(gòu)建到人豬輪狀病毒中。在可選擇的構(gòu)建體中，一個(gè)特異的血清型可以采用先前獲得的重配株產(chǎn)生。例如，包含有人輪狀病毒VP7血清型的GottaD株用來(lái)制備能與人VP7G2,G3,G4,G5,G6,G8,G9,G10血清型交叉反應(yīng)的豬Gottfried重配株。重組輪狀病毒的增殖可通過(guò)支持輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)。在釆用細(xì)胞培養(yǎng)增殖前，需要進(jìn)行一級(jí)或二級(jí)的AGMK(非洲綠猴腎細(xì)胞)細(xì)胞，二倍體FRhl-2(恒河猴二倍體細(xì)胞)及合適的Vero細(xì)胞的培養(yǎng)。病毒感染復(fù)數(shù)為0.1-1或更多，在病毒適宜的條件下增殖培養(yǎng)3-5天或者更長(zhǎng)時(shí)間，達(dá)到合適的病毒滴度后收獲輪狀病毒，然后通過(guò)諸如離心方法將輪狀病毒從細(xì)胞碎片中分離出來(lái)。純化可以采用該領(lǐng)域里成熟的技術(shù)，選擇合適的純化方法進(jìn)行制備。本發(fā)明中的多價(jià)豬輪狀病毒重配株免疫組分可以有效的預(yù)防目前臨床中最普遍的人輪狀病毒VP7血清型。人豬輪狀病毒重配株的每個(gè)劑量可以形成104-101()的蝕斑形成單位。免疫組分可以在可接受的載體或結(jié)合物時(shí)被引入宿主，如人。使用的載體有檸檬酸-碳酸緩沖液，鹽緩沖液?；旌系囊后w可以直接包裝或是凍干，凍干疫苗應(yīng)在4'C保存。凍干粉應(yīng)與無(wú)菌注射用水在注冊(cè)前包裝。這項(xiàng)發(fā)明中的豬輪狀病毒重配株至少含有一個(gè)目前臨床最普遍的人輪狀病毒VP7的血清型。每個(gè)劑量為104-1(T噬斑形成單位。致免疫成分可以采用一些載體，如擰檬酸-碳酸緩沖液，鹽緩沖液等導(dǎo)入人體，?；旌系囊后w可以直接包裝或是凍干，凍干疫苗應(yīng)在4"C保存。成分中可以含有藥學(xué)上允許的輔助成分以提供適當(dāng)?shù)奈锢項(xiàng)l件需要，如pH調(diào)節(jié)和緩沖試劑，例如醋酸鈉，乳酸鈉，氯化鉀，氯化鈣等。如果是口服，還需要提供單獨(dú)的緩沖液來(lái)中和胃酸保證疫苗可以流至腸道。緩沖液包括碳酸鈉，檸檬酸-碳酸或類似的。對(duì)與人豬輪狀病毒重配株，特別是口服制品，宿主的免疫應(yīng)答主要是通過(guò)產(chǎn)生自身分泌物和血清抗體。目前，發(fā)明中成分的安全及初始有效性實(shí)驗(yàn)可以采用各式動(dòng)物模型。特別是采用無(wú)菌豬作為動(dòng)物模型。這個(gè)模型中，輪狀病毒株不僅可以感染豬還可以致其腹瀉。這樣可以模擬豬模型中的免役機(jī)制，同時(shí)模擬預(yù)防人輪狀病毒株的感染。無(wú)菌豬模型在主動(dòng)及被動(dòng)免疫人輪狀病毒疫苗中有好于其它動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)。相比較小鼠和小牛，其腸道物理環(huán)境，體形大小，被動(dòng)免疫方式等都與人類嬰兒類似，總之，人輪狀病毒致豬敏感并能導(dǎo)致其腹瀉。人豬重配輪狀病毒的劑量在使用中需根據(jù)病人的年齡，健康狀況及體重，注射的形式，復(fù)合液的性質(zhì)等決定。但是基本范圍為每個(gè)劑量為104-101()噬斑形成單位。優(yōu)化的單位為105-108噬斑形成單位。任何使用中，均要保證使用的人豬重配輪狀病毒疫苗的量可以提供預(yù)防輪狀病毒感染的量。在一些情況下，可以將本發(fā)明中的疫苗與其它的腸道病毒疫苗共同使用。例如，將人豬重組輪狀病毒VP7血清型1，2，3，4，5，9與可以與人VP41A或1B血清型交叉反應(yīng)的輪狀病毒豬牛重組輪狀病毒聯(lián)合使用。本發(fā)明中的單個(gè)或多個(gè)免疫組分可以同時(shí)進(jìn)行。新生嬰兒，多重給藥可能引發(fā)高效的免疫，特別是源與母體的高水平的輪狀病毒抗體。給藥可以在最初的2-4月內(nèi)，然后間隔l-2月再免疫。給藥也可以在出生后的四周內(nèi)以預(yù)防腸套疊的出現(xiàn)。在此種給藥下，再次給藥不早于免疫后三周。暴露后的成人、小孩的日常護(hù)理，需要進(jìn)行多次免疫以建立免疫保護(hù)體系。誘導(dǎo)的免疫可以通過(guò)輪狀病毒特異性抗體檢測(cè)或血清型中和抗體檢測(cè)。下面結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。圖1是顯示了人輪狀病毒RNA通過(guò)10%聚丙烯酰氨電泳的結(jié)果示意圖。圖2是顯示了牛輪狀病毒RNA電泳圖譜。具體實(shí)施例方式以下例子中豬輪狀病毒重配株已被構(gòu)建和定性。在預(yù)防人輪狀病毒野株感染時(shí)可以混合使用輪狀病毒重配株以誘導(dǎo)VP7或VP4的免疫反應(yīng)。以下例子主要介紹豬輪狀病毒重配株的構(gòu)建和性質(zhì)。從感染的無(wú)菌小豬大便獲得的豬輪狀病毒株。用AGML細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)，傳代11次包括一次噬斑純化。感染人輪狀病毒D株或M株的豬大便的10%懸液連續(xù)用AGMK細(xì)胞傳代10次。AGMK細(xì)胞主要用做基因重排，噬斑純化及病毒擴(kuò)增。綠猴腎細(xì)胞系MA104用做病毒滴度和噬斑減少中和實(shí)驗(yàn)。補(bǔ)充0.5ug/ml胰酶及抗生素的EMEM培養(yǎng)基用做維持液，補(bǔ)充抗生素的L-15培養(yǎng)基用做制作病毒或血清稀釋液。噬斑減少中和實(shí)驗(yàn)采用50-60PFU/250ul的上述提到的病毒，瓊脂是該實(shí)驗(yàn)中的固化試劑。超免疫抗血清生產(chǎn)用沒(méi)有任何輪狀病毒中和抗體的無(wú)病原體guniea豬，血清在使用前需56。C熱處理30min針對(duì)VP4、Vp7抗體反應(yīng)和人豬輪狀病毒配組Gottfried株的有效保護(hù)性通過(guò)豬動(dòng)物模型進(jìn)行檢測(cè)了。人豬Gottfried輪狀病毒重配株等用做免疫豬崽。切除子宮的豬被隨機(jī)的分成六組并在無(wú)菌的條件下保存。小豬在限菌的條件下用商業(yè)化的嬰兒處方的食品作為基本食物，沒(méi)有母體來(lái)源的抗體并隔絕外源免疫。所有的小豬在第3-5天口服第一劑量的疫苗。在第一次免疫三周后再次口服大約106ID50(表一)的人輪狀病毒來(lái)評(píng)價(jià)保護(hù)效用。表一Gottx或GottxM重組疫苗對(duì)感染W(wǎng)a或M病毒的無(wú)菌豬保護(hù)效力<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表二幾尼豬超免血清中和抗體分析法評(píng)價(jià)VP7或VP4單基因替代重組Gottx株的抗原特性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1、一種人豬重配輪狀病毒，其特征是免疫組分至少包含一種輪狀病毒重配株，每個(gè)輪狀病毒重配株至少包含一個(gè)編碼與人血清型交叉反應(yīng)蛋白的基因，至少保留編碼豬輪狀病毒Gottfried株一個(gè)蛋白的基因。2、按照權(quán)利要求1所述的人豬重配輪狀病毒，其特征是重配株包含有10個(gè)來(lái)自于豬輪狀病毒Gottfried株的基因和一個(gè)來(lái)源與人輪狀病毒的可以編碼VP7G1，VP7G2，VP7G3，VP7G4，VP7G5，VP7G6，VP7G8，VP7G9，VP7G10，VP4P1A，VP4P1B,VP4P2A的基因。3、按照權(quán)利要求2所述的人豬重配輪狀病毒，其特征是重配株包含有10個(gè)來(lái)自于豬輪狀病毒Gottfried株的基因和一個(gè)來(lái)源與人輪狀病毒的可以與人VP710，VP76血清型的基因。4、按照權(quán)利要求2所述的人豬重配輪狀病毒，其特征是重配株包含有IO個(gè)來(lái)自于豬輪狀病毒Gottfried株的基因和一個(gè)來(lái)源與人輪狀病毒的可以與人VP710，VP76血清型的基因，人豬輪狀病毒重配株疫苗每劑量含有少于106蝕斑形成單位，人豬輪狀病毒重配株GoUxD，GottDS-1，GottxP,GottxST3，Gottx1290以及GottxAU32和GottxKC-1和GottxUK。5、按照權(quán)利要求2所述的人豬重配輪狀病毒，其特征是重配株組分為人豬輪狀病毒重配株編碼抗原有VP7G1，VP7G2，VP7G3，VP7G4，人豬輪狀病毒重配株組成為GottxD，GottDS-1，GottxST3，Gottx1290以及GottxAU32和GottxIAL28。6、按照權(quán)利要求1所述的人豬重配輪狀病毒，其特征是重配株包至少含GottxD，GottxDS—1，GottxM'GottxST3,GottxIAL28'GottxUK，MoxGott中的一個(gè)。7、按照權(quán)利要求1所述的人豬重配輪狀病毒，其特征是包含有結(jié)合體、包含有機(jī)體可接受的載體，組分為凍干的，人豬輪狀病毒重組株疫苗每劑量提供103-106蝕斑形成單位，人豬輪狀病毒重配株編碼包含有VP7G1,VP7G2，VP7G3，VP7G4，VP7G5，VP7G6，VP7G8，VP7G9，VP7G10，VP4P1A，VP4P1B[4]及人牛重組株編碼的蛋白與人VP710血清型交叉反應(yīng)的組分。8、一種人豬重配輪狀病毒，其特征是多價(jià)人豬輪狀病毒重配株給藥時(shí)至少包含一個(gè)基因，其編碼的蛋白可以與VP7G1，VP7G2，VP7G3，VP7G4，VP7G5，VP7G6，VP7G8，VP7G9，VP7G10，VP4P1A，VP4P1B,VP4P2A產(chǎn)生交叉反應(yīng)。全文摘要本發(fā)明提供了一種人豬重配輪狀病毒，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是來(lái)源動(dòng)物基因的減毒疫苗做預(yù)防人類相關(guān)的疾病。豬輪狀病毒在哺乳動(dòng)物和禽類輪狀病毒中是獨(dú)特的，它與人類輪狀病毒具有特殊的關(guān)系。本發(fā)明的要點(diǎn)是采用具有獨(dú)特性質(zhì)的豬輪狀病毒gottfried株，特別是血清型為P[6]，G4的gottfried株，免疫組分至少包含一種輪狀病毒重配株，每個(gè)輪狀病毒重配株至少包含一個(gè)編碼與人血清型交叉反應(yīng)蛋白的基因，至少保留編碼豬輪狀病毒Gottfried株一個(gè)蛋白的基因。本發(fā)明的作用是通過(guò)結(jié)合單價(jià)的重配動(dòng)物輪狀病毒和一個(gè)人輪狀病毒或者是別的能與人抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的抗原的動(dòng)物病毒，來(lái)提供與人輪狀病毒A組臨床研究關(guān)系最密切的血清型之一，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生人輪狀病毒特異性抗體反應(yīng)。文檔編號(hào)C12N7/01GK101638638SQ20081001252公開(kāi)日2010年2月3日申請(qǐng)日期2008年7月29日優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日發(fā)明者譯張,偉李,艷李,李中興,胡金東,煦譚申請(qǐng)人:遼寧依生生物制藥有限公司