專利名稱：：一種高分子材料的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于材料學(xué)、化學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種高分子材料抗菌和抗生物膜方面的新用途。
背景技術(shù)：
：生物材料相關(guān)性感染(biomaterialcenteredinfection,BCI)是臨床治療中的一個(gè)難題。細(xì)菌粘附于生物材料是造成BCI的始動(dòng)環(huán)節(jié)，細(xì)菌在生物材料表面聚集及生長(zhǎng)，繼而形成細(xì)菌生物膜(bacterialbiofilm，BF)，從而使BCI難以治療。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P.a)是BCI的主要致病菌之一，因?yàn)槌Ｓ每股丿煼▽?duì)P.a生物膜引起的感染療效欠佳，所以在高分子生物材料應(yīng)用中，對(duì)BF形成的預(yù)防和控制比BF形成后再利用藥物殺滅它顯得更為重要及有效。在高分子生物材料中加入抗菌技術(shù)，使其延緩或防止BF形成，從而起到了預(yù)防BCI的作用。本項(xiàng)目在成功研制了高分子抗菌材料(NHPAET-1)的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究其抗菌活性及體外對(duì)P.a生物膜形成的影響，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用試驗(yàn)提供理論依據(jù)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，將抗菌集團(tuán)以共建價(jià)形式結(jié)合后，制成的新型高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)是非溶出型抗菌物質(zhì)，有強(qiáng)抗細(xì)菌作用。與涂覆紅霉素氣管導(dǎo)管相比，新型高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)體外能有效抑制BF形成。目前尚未見相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的，在于提供一種新型抗菌和抑制細(xì)菌生物膜形成的新材料，為研制開發(fā)新型抗菌和抗細(xì)菌生物膜的醫(yī)用和生活用品奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案完成，具體內(nèi)容包括采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。觀察新型高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)影響P.a生物膜形成的實(shí)驗(yàn)方法以新型高分子抗菌材料(NHPAET-1)、聚丙烯(PP)氣管導(dǎo)管、聚氯乙烯(PVC)氣管導(dǎo)管、涂覆紅霉素PP氣管導(dǎo)管、涂覆紅霉素pVC氣管導(dǎo)管作為BF載體，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件并在同等條件下制作P.a體外BF模型，3天及7天后計(jì)數(shù)載體表面粘附的活菌數(shù)并用銀染法及在電子掃描顯微鏡(SEM)下觀察BF的形成情況。NH2C1X十NH~fCH2VNH—C—NH4^Z式I:抗菌集團(tuán)分子結(jié)構(gòu)式具體實(shí)施例方式1材料1.1聚氯乙烯(PVC)氣管導(dǎo)管(江蘇如皋市晨光醫(yī)療器材有限公司提供)。課題組前期課題研究自制了以共價(jià)鍵結(jié)合抗菌功能團(tuán)的高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)和普通3聚丙烯(PP)氣管導(dǎo)管。用手術(shù)刀片將導(dǎo)管切割成lcmX1.2cm，75X酒精浸泡15分鐘后再以無(wú)菌雙蒸水清洗掉殘余酒精。處理后置于2mlMH肉湯(Muller-HintonBroth，MHB)37°C培養(yǎng)24小時(shí)，肉湯仍清澈，提示已達(dá)到消毒效果。1.2菌株實(shí)驗(yàn)菌株是P.a粘液型菌株，檢驗(yàn)號(hào)為5542號(hào)，是從廣西醫(yī)科大學(xué)一附院呼吸內(nèi)科住院的慢性支氣管炎患者痰標(biāo)本中分離鑒定所得。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，由廣西醫(yī)科大學(xué)一附院臨床實(shí)驗(yàn)中心細(xì)菌室提供。銅綠假單胞菌野生型PA01由丹麥哥本哈根大學(xué)醫(yī)院臨床微生物科提供。大腸桿菌ATCC8099由北京菌種保存中心提供。2溶出性實(shí)驗(yàn)2.IEM對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的最低抑菌濃度(MIC)用試管二倍稀釋法測(cè)定EM藥物MIC的同時(shí)平行測(cè)定其對(duì)質(zhì)控菌株ATCC27853的MIC作質(zhì)量控制。敏感性分類和質(zhì)量控制均采用美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)[NCCLS(2002)]推薦標(biāo)準(zhǔn)。EM對(duì)細(xì)菌的MIC齒株MICEM(ug/ml)銅綠假單胞菌臨床粘液株5542256銅綠假單胞菌ATCC278532562.2導(dǎo)管涂覆EM方法將導(dǎo)管載體浸入100倍MIC的EM溶液中30min，取出備用。2.3抗菌材料的溶出性測(cè)試方法(暈圈法)。2.3.1試樣準(zhǔn)備取1.5cmX1.5cm樣品4_6塊，75%酒精浸泡15分鐘后再以無(wú)菌雙蒸水清洗掉殘余酒精，備用。2.3.2接種菌液準(zhǔn)備將大腸桿菌ATCC8099連續(xù)轉(zhuǎn)接后。用接種環(huán)從培養(yǎng)基上取少量(刮l-2環(huán))新鮮細(xì)菌，加入培養(yǎng)液中，選擇菌液濃度為(1.0-5.0)X106cfu/ml作為試驗(yàn)用菌液。取O.1ml菌液均勻涂抹在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上。2.3.3貼試樣將試樣平貼在培養(yǎng)基上，用無(wú)菌鑷子輕壓樣片，各樣片相距1.5cm以上，與平皿邊緣也相隔1cm以上.37"下培養(yǎng)16-18h。2.3.4測(cè)量測(cè)量抑菌圈外沿總寬度及試樣總寬度，求出平均值。2.3.5判斷標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)空白試樣，抑菌圈寬度D=O，則判定實(shí)驗(yàn)有效。抑菌圈寬度D〉lmm，可以判定為溶出型抗菌物質(zhì)，若D《lmm，則可以判定為非溶出型抗菌物質(zhì)。氣管導(dǎo)管溶出性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品溶出性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)細(xì)齒檢測(cè)結(jié)果聚丙烯(PP)氣管導(dǎo)管D=0聚氯乙烯(PVC)氣管導(dǎo)管抗齒物質(zhì)的溶山性人腸桿齒D=0高分子抗齒氣管導(dǎo)管測(cè)試方法暈圈法ATCC8099DK)非溶岀型EM涂覆PP氣管導(dǎo)管D=4.5mm溶山荊EM涂覆PVC氣管導(dǎo)管_D=4mm溶出荊3抗菌材料抗細(xì)菌性能實(shí)驗(yàn)方法3.1樣品準(zhǔn)備陰性對(duì)照樣品編號(hào)A，是滅菌平皿的內(nèi)平板?？瞻讓?duì)照樣品編號(hào)B，是未添加抗菌成分的PP(與抗菌檢測(cè)樣基材相同)?？咕鷺悠肪幪?hào)C，是添加抗菌成分的樣品。所有樣品在試驗(yàn)前用消毒劑(70%乙醇溶液)擦拭樣品表面，lmin后用無(wú)菌水沖洗，自然干燥。洗脫液含0.80%NaCl的生理鹽水，加入少量無(wú)菌表面活性劑(如吐溫80)，用0.Imol/LNaOH溶液或0.lmol/LHCl溶液調(diào)節(jié)pH值，使滅菌后為7.0-7.2，分裝后滅菌。3.2菌種復(fù)蘇后，制成(5.0-10.0)X105cfu/ml的菌液。3.3樣品實(shí)驗(yàn)分別取0.2ml上述P.a菌液滴加在陰性對(duì)照樣品(A)、空白對(duì)照樣品(B)和抗菌材料樣品(C)上。每個(gè)樣品做5個(gè)平行。將無(wú)菌覆蓋膜分別覆蓋在樣品(A)、樣品(B)和樣品(C)上，371\相對(duì)濕度朋>90%條件下培養(yǎng)2處。取出培養(yǎng)24h的樣品，分別加入20ml洗脫液，分別反復(fù)沖洗樣品(A)、樣品(B)、樣品(C)及覆蓋膜，在37t:下培養(yǎng)(24-48)h后活菌計(jì)數(shù)，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次?？辜?xì)菌率計(jì)算公式為R(%)=(B-C)/BX100式中R-抗細(xì)菌率(X)B-空白對(duì)照樣品平均回收菌數(shù)(cfu/片)C-抗菌材料樣品平均回收菌數(shù)(cfu/片)高分子抗菌氣管導(dǎo)管對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌性能檢測(cè)結(jié)果5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注抗菌材料的抗細(xì)菌性能評(píng)價(jià)符合以下的規(guī)定<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注抗細(xì)菌率符合I>99%的抗菌材料可以報(bào)告有強(qiáng)抗細(xì)菌作用；抗細(xì)菌率符合II》90%的抗菌材料可以報(bào)告有抗細(xì)菌作用。4抑制細(xì)菌生物膜形成的研究4.1P.a體外BF模型的復(fù)制將實(shí)驗(yàn)菌株接種于40mlLB液中，37。C恒溫?fù)u晃隔夜培養(yǎng)，洗滌細(xì)菌，用生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)(細(xì)菌數(shù)約為5X108—化FU/ml)，再用無(wú)菌生理鹽水以l:50稀釋后充分混勻，以每管5ml分裝至100X10mm玻璃試管，加入lcmX1.2cm已經(jīng)消毒處理的BF載體，37t:恒溫培養(yǎng)，載體表面于第3天形成早期BF，第7天形成成熟BF;培養(yǎng)期間于第24小時(shí)取出BF載體(此時(shí)載體表面經(jīng)SEM證實(shí)已有細(xì)菌粘附)，用lml無(wú)菌生理鹽水從10cm高度沖洗掉未緊密粘附的細(xì)菌后再將BF載體置入含無(wú)菌LB液5ml的試管中繼續(xù)37t:恒溫培養(yǎng)，每48小時(shí)更換LB液，直至BF模型成模。4.2實(shí)驗(yàn)分組新型高分子抗菌氣管導(dǎo)管組(NHPAET-1)、聚丙稀(PP)導(dǎo)管組、聚氯乙烯(PVC)氣管導(dǎo)管組、紅霉素涂覆PP氣管導(dǎo)管組、紅霉素涂覆PVC氣管導(dǎo)管組。每組12份標(biāo)本。其中第3天與第7天各2份用SEM觀察BF的形成情況，余第3天與第7天各4份進(jìn)行載體表面粘附的活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果用X±s表示，并用SEM觀察BF形成情況。2.9銅綠假單胞菌BF形成情況的觀察(銀染法)4.3取高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)(實(shí)驗(yàn)組)，PP氣管導(dǎo)管(空白對(duì)照組)，PVC氣管導(dǎo)管，各剪成lcmX1.2cm大小，每組各6只管，75%酒精清洗消毒，晾干備用。4.4細(xì)菌BF的制備采用生理鹽水_導(dǎo)管系統(tǒng)進(jìn)行BF的培養(yǎng)。取隔夜培養(yǎng)的含有銅綠假單胞菌PA01的肉湯，比濁儀調(diào)定為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，吸?.lml加入含有4.9ml生理鹽水及l(fā)cmXl.2cm導(dǎo)管材料的試管中，37t:培養(yǎng)，隔夜更換生理鹽水。培養(yǎng)3d得到早期BF，培養(yǎng)7d得到成熟BF。4.5細(xì)菌BF的鑒定采用銀染法快速鑒定細(xì)菌BF。培養(yǎng)第3天，顯微鏡下觀察可見PP氣管導(dǎo)管，PVC氣管導(dǎo)管表面有散在分布的灰黑色點(diǎn)狀或斑片樣附著物(圖1-圖6)，初步鑒定為BF，高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)表面未見有灰黑色物形成。培養(yǎng)第7天，顯微鏡下觀察可見PP氣管導(dǎo)管，PVC氣管導(dǎo)管表面灰黑色附著物呈大片狀分布，但是高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)表面未見有片狀灰黑色附著物，初步鑒定高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)有抑制BF形成的作用(圖7-圖12)4.6銅綠假單胞菌BF形成情況的觀察(SEM):用SEM觀察銅綠假單胞菌BF的形成情況。載體在P.a懸液中培養(yǎng)24小時(shí)(圖13-16):可見載體表面有細(xì)菌粘附，但未聚集成堆，而是分散排列，尚無(wú)BF形成。早期BF(圖17和19)和成熟BF(圖18和20):可見在載體表面有銅綠假單胞菌BF呈片狀分布，BF內(nèi)細(xì)菌呈短桿狀，菌體長(zhǎng)短不一，彼此聚集成堆，周圍有凹凸不平的濃厚粘液狀物質(zhì)緊密包繞，細(xì)菌借助這些濃厚的粘液狀物質(zhì)連接成大片BF。高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)表面的變形壞死細(xì)菌(圖21)和PP氣管導(dǎo)管表面的正常形態(tài)細(xì)菌(圖22)。培養(yǎng)第3天，可見部分粘附的細(xì)菌在高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)表面聚集，但是比較松散且細(xì)菌形態(tài)發(fā)生了改變，菌體外緣模糊不清(圖22-28)，細(xì)菌聚集過(guò)程受到抑制，從而抑制了BF的形成。培養(yǎng)第3天，高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)表面細(xì)菌變形，邊緣模糊，活性降低，表面粘附細(xì)菌少，未見有BF形成(圖29-30)，但是PP氣管導(dǎo)管(圖31和32)，PVC氣管導(dǎo)管(圖33和34)，EM涂覆PP氣管導(dǎo)管(圖35-36)，EM涂覆PVC氣管導(dǎo)管(圖37-38)，表面可見片狀的早期BF形成。培養(yǎng)第3天，涂覆紅霉素氣管導(dǎo)管表面可以看到BF形成，但是較PP氣管導(dǎo)管和PVC氣管導(dǎo)管少，紅霉素涂覆氣管導(dǎo)管后對(duì)BF形成有一定的延緩作用。培養(yǎng)第7天，高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)表面細(xì)菌已經(jīng)逐漸變形，碎裂，未見有BF形成(圖39-40)，但是PP氣管導(dǎo)管(圖41-42)，PVC氣管導(dǎo)管(圖43-44)，EM涂覆PP氣管導(dǎo)管(圖45-46)，EM涂覆PVC氣管導(dǎo)管(圖47-48)，表面可見稠厚的片狀BF形成。培養(yǎng)第7天，隨著紅霉素的不斷溶出和丟失，EM涂覆氣管導(dǎo)管的表面可見粘附有較多細(xì)菌，也未能有效抑制BF形成。培養(yǎng)第7天，高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)抑制細(xì)菌活性及BF形成的能力優(yōu)于涂覆EM的氣管導(dǎo)管。4.7載體表面粘附的活菌計(jì)數(shù)方法用連續(xù)稀釋法，將粘附有細(xì)菌的載體用無(wú)菌生理鹽水沖洗掉浮游菌后置于含2ml無(wú)菌生理鹽水的試管中用旋渦混合儀2600rpm震蕩10分鐘，使載體表面BF內(nèi)的細(xì)菌脫落至培養(yǎng)液中形成細(xì)菌懸液，連續(xù)稀釋法活菌計(jì)數(shù)，每次測(cè)定均重復(fù)測(cè)三次計(jì)算平均值。各實(shí)驗(yàn)組載體表面活菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)分組培養(yǎng)第3天105cfu/ml培養(yǎng)第7天105cfu/ml1組pp氣管導(dǎo)管79.58±18.03175.75土26.13T2組抗齒氣管導(dǎo)管0.74±0.29A0.68土0.19A3組PVC氣管導(dǎo)管H5.83±19.15▲167.25±30.32T4組PP氣管導(dǎo)管65.55土18.22A118.28±42.49AT涂覆EM5組PVC氣管導(dǎo)管60.68土16.08A60.53±13.30▲涂覆EMAXomparedwithcontrolgroup:P<0.01y7thdaycomparedwith3rdday:P<0001■Comparedwith1stgroup:P<0.01Comparedwith3rdgroup:P<0.001★Comparedwith4thgroup:P<0.001實(shí)驗(yàn)結(jié)論新型高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)是非溶出型抗菌物質(zhì)，有強(qiáng)抗細(xì)菌作用。與涂覆紅霉素氣管導(dǎo)管相比，新型高分子抗菌氣管導(dǎo)管(NHPAET-1)體外能有效抑制BF形成。圖1PP導(dǎo)管在N.S中培養(yǎng)第3天表面形貌400X圖2PP導(dǎo)管在菌液中培養(yǎng)第3天表面形貌400X圖3PVC導(dǎo)管在N.S中培養(yǎng)第3天表面形貌400X圖4PVC導(dǎo)管在菌液中培養(yǎng)第3天表面形貌400X圖5抗菌導(dǎo)管在N.S中培養(yǎng)第3天表面形貌400X圖6抗菌導(dǎo)管在菌液中培養(yǎng)第3天表面形貌400X圖7PP導(dǎo)管在N.S中培養(yǎng)第7天表面形貌400X圖8PP導(dǎo)管在菌液中培養(yǎng)第7天表面形貌400X圖9PVC導(dǎo)管在N.S中培養(yǎng)第7天表面形貌400X圖10PVC導(dǎo)管在菌液中培養(yǎng)第7天表面形貌400X圖11抗菌導(dǎo)管在N.S中培養(yǎng)第7天表面形貌400X圖12抗菌導(dǎo)管在菌液中培養(yǎng)第7天表面形貌400X圖13PVC氣管導(dǎo)管背景SEMX7500圖14PP氣管導(dǎo)管背景SEMX7500圖15抗菌氣管導(dǎo)管背景SEMX7500圖16PVC氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)24小時(shí)SEMX7500(覃雪軍提供)圖17PVC氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天(早期BF)SEMX7500圖18PVC氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天(成熟BF)SEMX7500圖19PP在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天(早期BF)SEMX7500圖20PP在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天(成熟BF)SEMX7500圖21抗菌氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天變形壞死細(xì)菌SEMX7500圖22PP氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天正常細(xì)菌SEMX7500圖23抗菌導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX1000圖24抗菌導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX1500圖25抗菌導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX2000圖26抗菌導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX3500圖27抗菌導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX5000圖28抗菌導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX7500圖29抗菌氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX5000圖30抗菌氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX7500圖31PP氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX5000圖32PP氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX7500圖33PVC氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX5000圖34PVC氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX7500圖35EM涂覆PP在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX5000圖36EM涂覆PP在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX7500圖37EM涂覆PVC在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX5000圖38EM涂覆PVC在P.a菌懸液中培養(yǎng)3天SEMX7500圖39抗菌氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天SEMX5000圖40抗菌氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天SEMX7500圖41PP氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天SEMX5000圖42PP氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天SEMX7500圖43PVC氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天SEMX5000圖44PVC氣管導(dǎo)管在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天SEMX7500圖45EM涂覆PP在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天SEMX5000圖46EM涂覆PP在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天SEMX7500圖47EM涂覆PVC在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天SEMX5000圖48EM涂覆PVC在P.a菌懸液中培養(yǎng)7天SEMX7500。9權(quán)利要求一種新型高分子材料，其中包含抗菌功能集團(tuán)，該集團(tuán)分子式是C16H18O9結(jié)構(gòu)如式I所示式I抗菌集團(tuán)分子結(jié)構(gòu)式。F2009101146902C00011.tif2.依照權(quán)利要求1所述的化合物在制備具抗菌和抑制細(xì)菌生物膜材料及其產(chǎn)品的用途，其中所述的材料中包含高分子物質(zhì)，以及一種或多種在藥學(xué)上可接受的材料復(fù)合品。3.如權(quán)利要求1所述的化合物，或以該化合物為主要有效成分為復(fù)方材料之一，在制備具抗菌作用及其抗細(xì)菌生物膜作用材料中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求2所述的包含該化合物的醫(yī)用或生活用材料。全文摘要本發(fā)明涉及高分子材料抗菌作用及其抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，可制成具抗菌、抑制生物膜形成的作用的醫(yī)用或生活用新材料。文檔編號(hào)C08G73/02GK101768267SQ200910114690公開日2010年7月7日申請(qǐng)日期2009年12月31日優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日發(fā)明者溫紅俠,王恒壯,陳一強(qiáng)申請(qǐng)人:廣西醫(yī)科大學(xué)