專利名稱：大分子的口服傳送的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與未改性的大分子或多糖類相比具有提高的疏水性的包括多糖衍生物在內(nèi)的大分子的衍生物。更具體的說，本發(fā)明涉及諸如兩親肝素衍生物這樣的疏水大分子和兩親多糖衍生物的口服傳送和吸收，其中大分子或多糖的生物活性得到保護。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，疏水大分子和兩親多糖衍生物具有大于1000的分子量而可以在口服給藥后被吸收。
背景技術(shù)：
肝素是由硫酸化D-葡糖胺和D-葡糖醛酸殘基組成的多糖。肝素因其大量可電離的硫酸根部分而帶有強負(fù)電性。它是易形成水溶性鹽、例如肝素鈉的相對強的酸。在肥大細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)它且可以從許多器官、特別是那些富含肥大細(xì)胞的器官中提取。肝和肺中尤其富含肝素。循環(huán)血液中不含肝素，但不包括肥大細(xì)胞深度破碎后的情況。肝素具有許多生理作用，諸如抗凝血作用、抑制平滑肌細(xì)胞增殖作用等。特別是，肝素是與抗凝血酶III(A TIII)發(fā)生強相互作用以防止血纖蛋白凝塊形成的有效抗凝劑。肝素是用于治療和預(yù)防深度靜脈血栓形成和肺栓塞的最有效抗凝劑之一。然而，在體內(nèi)肝素的應(yīng)用極為有限。肝素因其親水性和高負(fù)電性而不能從胃腸道、鼻部和口腔粘膜層等中有效吸收。因此，臨床上僅有的給藥途徑是靜脈內(nèi)和皮下注射。此外，由于肝素只相對溶于幾種溶劑，所以難以用于涂敷醫(yī)療裝置表面或在轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中使用。
為了改善肝素的特性，R.J.Linhardt等在83《藥物科學(xué)雜志》(J.Pharm.Sci.)，1034-1039(1994)中使月桂基(C12)和硬脂?；?C18)與單肝素鏈偶聯(lián)，從而產(chǎn)生了具有提高的疏水性、但抗凝活性較低的衍生的肝素。這一結(jié)果表明使小直鏈脂族鏈與肝素偶聯(lián)不能在有效強化肝素的疏水性的同時保持肝素活性。因此，已知的肝素衍生物不能有效保持抗凝活性。
T.M.Rivera等在“肝素與N-[8-(2-羥基苯甲?；?氨基]辛酸鈉聯(lián)用的口服傳送藥理學(xué)因素”(Oral Delivery of Heparin in Combination withSodium N-[8-(2-Hydroxybenzolyl)amino]caprylatePharmacologicalConsiderations)14《藥物研究》(Pharm.Res.)，1830-1834(1997)中公開了使用混有N-[8-(2-羥基苯甲?；?氨基]辛酸鈉的肝素進行肝素的口服傳送的可能性。M.Dryjski等在“對靜脈內(nèi)和口服給藥后低分子量肝素血漿活性的研究”(Investigations on Plasma Activity of Low MolecularWeight Heparin after Intravenous and Oral Administrations)-28《英國臨床藥理學(xué)雜志》(Br.J.Clin.Pharma.)，188-192(1989)中描述了使用增強劑口服吸收低分子量肝素的可能性。
一般認(rèn)為，具有大于1000分子量的分子在口服給藥后的胃腸(GI)道中難以吸收。例如，J.G.Russell-Jones在百科全書第1卷《控釋藥物傳送》173、175(1 Encyclopedia of Controlled Drug Delivery 173，175)(EdithMathiowitz編輯，1999)“載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運、口服藥物傳送”(Carrier-mediated Transport，oral Drug Delivery)描述了W.Kramer等的工作(269《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)，10621-10627(1994))提示了可以通過膽汁酸轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運的肽的最大尺寸是4個氨基酸或約為600Da。作為另一個實例，P.W.Swaan等在“通過與膽酸結(jié)合對肽的增強的跨上皮運輸”(Enhanced Transepithelial Transport of Peptides by Conjugation toCholic Acid)-8 Bioconjugate Chemistry，520-525(1997)中報導(dǎo)了具有最多達6個氨基酸(即約900Da)的膽汁酸結(jié)合物對腸膽汁酸轉(zhuǎn)運體表現(xiàn)出親和性，但通過膽汁酸載體不能轉(zhuǎn)運測試的僅6個氨基酸的膽汁酸結(jié)合物。
鑒于上述原因，所以應(yīng)理解開發(fā)在口服給藥后獲得具有大于1000分子量的大分子吸收的方法在本領(lǐng)域中是顯著的進步。還應(yīng)理解開發(fā)在口服給藥后獲得疏水或兩親肝素衍生物吸收的方法是本領(lǐng)域中另一個顯著的進步。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供在口服給藥后使具有大于1000分子量的分子得到吸收的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供通過口服給藥兩親肝素衍生物獲得抗凝血的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供可以從胃腸道吸收的肝素衍生物，由此有利于防凝血的口服傳送。
本發(fā)明的另一個目的是提供肝素衍生物，其包括與諸如脫氧膽酸或甘氨膽酸這樣的膽汁酸或諸如膽固醇或鏈烷酸這樣的疏水劑結(jié)合的肝素。
可以通過提供治療需要抗凝療法的患者的方法來達到這些和其它目的，所述的方法包括口服給藥有效量的組合物，該組合物包括與疏水劑共價結(jié)合的肝素，所述的疏水劑選自膽汁酸、固醇類和鏈烷酸及其混合物。該組合物還可以包括藥用載體。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述的疏水劑是選自膽酸、脫氧膽酸、鵝膽酸、石膽酸、熊膽酸(ursocholic acid)、熊去氧膽酸、異熊去氧膽酸、兔脫氧膽酸(lagodeoxycholic acid)、甘氨膽酸、牛磺膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨鵝膽酸、脫氫膽酸、豬膽酸(hyocholic acid)、豬脫氧膽酸及其混合物等的膽汁酸。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的疏水劑是選自膽甾烷醇、糞醇、膽固醇、表膽固醇、麥角固醇、麥角鈣化醇及其混合物等的固醇。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的疏水劑是含有約4-20個碳原子的鏈烷酸。優(yōu)選的鏈烷酸包括丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸及其混合物等。
優(yōu)選所述的肝素含有至少約3000且更優(yōu)選至少約6000的分子量。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述的肝素含有約小于12,000的分子量。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案包括促進大分子試劑口服給藥的方法，該方法包括下列步驟(a)使所述的大分子試劑與選自膽汁酸、固醇類、鏈烷酸及其混合物的疏水劑結(jié)合而產(chǎn)生疏水大分子試劑；和(b)對需要它的患者口服給藥有效量的所述疏水大分子試劑。
優(yōu)選所述的大分子試劑是選自肝素、硫酸乙酰肝素、磺?；嗵?、類肝素類、多糖衍生物及其混合物等的成員。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的大分子試劑是肽，諸如胰島素或降鈣素。
附圖簡述

圖1表示通過對大鼠口服給藥后肝素-DOCA結(jié)合物的aPTT試驗測定的凝血時間分布圖□-100mg/kg原料肝素(對照組)；◆-肝素(200mg/kg)與DOCA(200mg/kg)的物理20混合物；-50mg/kg肝素-DOCA結(jié)合物；▲-80mg/kg肝素-DOCA結(jié)合物；■-100mg/kg肝素-DOCA結(jié)合物；和●-200mg/kg肝素-DOCA結(jié)合物；將數(shù)據(jù)繪制為平均值±SD，n＝9。
圖2表示通過對大鼠口服給藥后肝素-DOCA結(jié)合物的Fxa試驗測定的濃度分布圖□-100mg/kg原料肝素(對照組)；-50mg/kg肝素-DOCA結(jié)合物；▲-80mg/kg肝素-DOCA結(jié)合物；■-100mg/kg肝素-DOCA結(jié)合物；和●-200mg/kg肝素-DOCA結(jié)合物；將數(shù)據(jù)繪制為平均值±SD，n＝9。
圖3表示作為DOCA與肝素摩爾比函數(shù)的肝素-DOCA結(jié)合物在大鼠中的凝血時間分布圖-原料肝素，▲-2.5摩爾比，■-5.0摩爾比，和●-10.0摩爾比；將數(shù)據(jù)繪制為平均值±SD，n＝9。
圖4表示作為疏水劑與肝素摩爾比函數(shù)的肝素衍生物在大鼠中的凝血時間分布圖
-肝素-月桂酸結(jié)合物；▲-肝素-棕櫚酸結(jié)合物，■-肝素-膽固醇結(jié)合物，和●-肝素-DOCA結(jié)合物；將數(shù)據(jù)繪制為平均值±SD，n＝9。
圖5表示口服給藥100mg/kg肝素-DOCA結(jié)合物后從大鼠體內(nèi)分離的蘇木精和伊紅染色的胃腸道組織的顯微照片A、B、C和D組分別表示0、1、2和3小時后胃的橫切面；E、F、G和H組分別表示0、1、2和3小時后十二指腸的橫切面；I、J、K和L組分別表示0、1、2和3小時后空腸的橫切面；和M、N、O和P組分別表示0、1、2和3小時后回腸的橫切面；在全部組中的原始放大倍數(shù)均為100x。
圖6口服給藥100mg/kg肝素-DOCA結(jié)合物后從大鼠體內(nèi)分離的胃腸道組織中膜或微絨毛的電子顯微照片A、B、C和D組分別表示0、1、2和3小時后胃的橫切面；E、F、G和H組分別表示0、1、2和3小時后十二指腸的橫切面；I、J、K和L組分別表示0、1、2和3小時后空腸(jejunum)的橫切面；和M、N、O和P組分別表示0、1、2和3小時后回腸的橫切面；在全部組中的原始放大倍數(shù)均為25,000x。
圖7A和7B表示對大鼠口服給藥后肝素-DOCA結(jié)合物的凝血時間分布圖(圖7A)和濃度分布圖(圖7B)▲-LMWH(3K)-DOCA；●-LMWH(6K)-DOCA；■-肝素-DOCA(此處也稱作UFH-DOCA)。
圖8A和8B表示對大鼠口服給藥后LMWH(6K)-DOCA的凝血時間分布圖(圖8A)和濃度分布圖(圖8B)◆-20mg/kg的LMWH(6K)對照；-100mg/kg的LMWH(6K)對照；▲-20mg/kg LMWH(6K)-DOCA；■-50mg/kg LMWH(6K)-DOCA；●-100mg/kg LMWH(6K)-DOCA。
發(fā)明詳述在前，公開并描述了獲得口服傳送的疏水大分子和兩親多糖組合物的吸收的本發(fā)明的方法。應(yīng)理解本發(fā)明并非限于本文公開的特定構(gòu)造、工序和材料，因為這類構(gòu)造、工序和材料可以稍微的改變。還應(yīng)理解本文所用的技術(shù)僅用于描述特定實施方案的目的而不用來起限定作用，因為本發(fā)明的范圍僅由待批的權(quán)利要求及其等同范圍來限定。
作為本說明書和待批的權(quán)利要求中所用的，必須注意除非上下文中清楚地說明，則單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)對象。因此，例如，涉及的＂膽汁酸＂包括兩種或多種這類膽汁酸的混合物；涉及的＂鏈烷酸＂包括涉及的一種或多種這類鏈烷酸；且涉及的＂固醇＂包括涉及的兩種或多種固醇的混合物。
在描述和要求保護本發(fā)明的過程中，按照下列設(shè)定的定義使用下列術(shù)語。
本文所用的“膽汁酸類”指的是天然和合成的甾類化合物、膽烷酸衍生物，包括、但不限于膽酸、脫氧膽酸、鵝膽酸、石膽酸、熊膽酸、熊去氧膽酸、異熊去氧膽酸、兔脫氧膽酸、甘氨膽酸、?；悄懰?、甘氨脫氧膽酸、甘氨鵝膽酸、脫氫膽酸、豬膽酸、豬脫氧膽酸及其混合物等。
本文所用的“固醇類”指的是結(jié)構(gòu)上與甾類化合物相關(guān)的醇類，包括、但不限于膽甾烷醇(eholestanol)、糞醇、膽固醇、表膽固醇、麥角固醇、麥角鈣化醇及其混合物等。
本文所用的“鏈烷酸類”指的是約4-20個碳原子的飽和脂肪酸。舉例的鏈烷酸類包括、但不限于丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸(eapricacid)、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸及其混合物等。
本文所用的“疏水肝素衍生物”和“兩親肝素衍生物”可以互換使用。肝素是極為親水性的物質(zhì)。肝素通過結(jié)合疏水劑而增加疏水性產(chǎn)生了本文稱作的兩親肝素衍生物或疏水肝素衍生物。兩術(shù)語均是恰當(dāng)?shù)?，因為肝素衍生物與天然肝素相比疏水性增加且肝素衍生物帶有親水部分和疏水部分，由此是兩親的物質(zhì)。
本文所用的“aPTT”指的是活化部分促凝血酶原激酶的時間；“Fxa”指的是因子Xa。
本文所用的“DOCA”指的是脫氧膽酸，“肝素-DOCA”指的是肝素與脫氧膽酸的結(jié)合物。
本文所用的“大分子”指的是具有一般大于1000分子量的多肽、多糖和核酸聚合物。
本文所用的“肽”指的是任意長度的肽且包括蛋白質(zhì)。除非描述了特定的大小，則在本文中使用術(shù)語“多肽”和“寡肽”沒有任何具體指定大小的限制?？梢允褂玫牡湫碗倪x自催產(chǎn)素、加壓素、促腎上腺皮質(zhì)激素、表皮生長因子、催乳激素、促黃體素釋放素或黃體素釋放激素(luteinising hormone releasing hormone)、生長激素、生長激素釋放因子、胰島素、促生長素抑制素、胰高血糖素、干擾素、胃泌素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素(urogastroine)、促胰液素、降鈣素、腦啡肽類、內(nèi)啡肽類、血管緊張肽類、凝乳酶、緩激肽、桿菌肽類、多粘菌素(polymixins)、粘菌素類、短桿菌酪肽、短桿菌肽類及其合成類似物、改性物和藥物活性片段、單克隆抗體和可溶性疫苗。對可以使用的肽或蛋白質(zhì)藥物的唯一限定是功能性之一。
本文所用的“有效量”指的是無毒性但在合理有益效果/危害的比率下足以提供所需局部或全身作用和性能的參與任何醫(yī)學(xué)治療的藥物活性劑的用量。因此，例如，肝素-DOCA結(jié)合物的有效量是足以提供所選擇的抗凝活性的用量。
眾所周知肝素用作抗血栓形成劑以防止凝血。肝素因諸如由磺酸和羧酸基團提供的高密度負(fù)電荷而是高度親水性的。由于這種親水性，所以通常通過靜脈內(nèi)或皮下注射給藥肝素。本文描述了具有輕度疏水特性或兩親特性并具有高度生物活性的肝素衍生物。使諸如膽汁酸類例如脫氧膽酸(DOCA)；固醇類例如膽固醇；和鏈烷酸類例如月桂酸和棕櫚酸這樣的疏水劑與肝素結(jié)合。脫氧膽酸和膽固醇都是無毒性的，因為它們是在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的天然存在的化合物。肝素的胺基與所述疏水劑的羧基結(jié)合。將DOCA、月桂酸和棕櫚酸上的末端羧基直接用于偶聯(lián)反應(yīng)，而通過在偶聯(lián)前與氯乙酸反應(yīng)活化膽固醇的羥基。確定了使這類疏水部分與肝素的胺基結(jié)合對肝素的生物活性幾乎沒有或沒有影響。通過經(jīng)FT-IR和13C-NMR分析檢測所得酰胺鍵來證實肝素與疏水劑之間的偶聯(lián)。
偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)率約為70-80％，且通過改變疏水劑或進料摩爾比不會顯著改變這一產(chǎn)率。就肝素-DOCA結(jié)合物而言，當(dāng)進料比例增加時，結(jié)合物中DOCA的量也增加。當(dāng)肝素與DOCA的進料摩爾比為1∶200時，肝素-DOCA中DOCA的重量％為24％。該摩爾比遠高于肝素中胺基與DOCA的比例。因此，估計這種進料比為DOCA過量。
根據(jù)本發(fā)明的疏水肝素衍生物可以具有許多醫(yī)療應(yīng)用。例如，可以經(jīng)口服給藥疏水肝素?？诜o藥肝素可以顯著擴大肝素作為抗凝藥的應(yīng)用。使用諸如本領(lǐng)域中眾所周知的藥用載體來配制肝素衍生物。作為另一個實例，可以將疏水肝素衍生物用作諸如導(dǎo)管、心肺分流環(huán)路(cardiopulmonary bypass circuits)、心肺氧合器、腎透析儀、用于防止再狹窄的斯滕特固定模或氣囊涂層等的醫(yī)療裝置的涂敷材料。一般將疏水肝素衍生物與載體混合，然后通過諸如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的薄膜鑄塑技術(shù)涂敷在醫(yī)療裝置表面上。
在改性后，還發(fā)現(xiàn)了肝素-疏水劑在快速蛋白液相色譜法(FPLC)中具有表現(xiàn)出與疏水介質(zhì)發(fā)生相互作用的傾向，正如在Phenyl Sepharose(用硫酸銨緩沖液而非磷酸鹽緩沖液洗脫)色譜所證實的。當(dāng)與未改性的肝素相比時，這些肝素衍生物表現(xiàn)出增強的結(jié)合親和性。改性的肝素衍生物與Phenyl Sepharose的增加的相互作用是因其疏水性增強，所述疏水性增強是存在疏水官能團的結(jié)果。這些結(jié)果提示可以通過使膽汁酸、固醇或鏈烷酸與肝素結(jié)合而獲得疏水肝素。在溶解性試驗中，極性溶劑或有機溶劑適合于溶解肝素-疏水劑結(jié)合物。例如，肝素-脫氧膽酸結(jié)合物在65％的丙酮溶液(35％水)中表現(xiàn)出良好的溶解性。最終，確定了改性的肝素衍生物的生物活性不易受到與疏水劑結(jié)合的影響。關(guān)于如通過抗凝和因子Xa試驗所測定的肝素的兩種生物活性研究結(jié)合肝素的疏水劑的作用。盡管疏水性與一定程度的降低抗凝活性和抗因子Xa活性有關(guān)，但是并不認(rèn)為生物活性嚴(yán)重下降。這些結(jié)果表明封閉肝素的胺基對其生物活性幾乎沒有影響。然而，當(dāng)結(jié)合物中疏水劑的量超過20重量％時，肝素疏水劑結(jié)合物中肝素的生物活性表現(xiàn)出進行性下降。在結(jié)合物中疏水劑低于20重量％時，該結(jié)合物的生物活性高于未改性的肝素生物活性的80％。提示疏水肝素中80％的生物活性足以支持醫(yī)療應(yīng)用中的生物活性。
實施例1肝素-DOCA結(jié)合物的合成將5ml的N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu，92mg/5ml)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液與5ml的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(165mg/5ml)的DMF溶液混合，隨后添加5ml DOCA(196mg/5ml)的DMF溶液。DOCA、HOSu和DCC的摩爾比為1∶1.6∶1.6。HOSu和DCC的濃度稍高于DOCA的濃度以完全活化DOCA。使所得溶液在室溫下和真空中反應(yīng)5小時，然后除去反應(yīng)過程中沉淀的副產(chǎn)物二環(huán)己基脲(DCU)。通過滴加蒸餾水并過濾除去未反應(yīng)的DCC。再通過添加15ml蒸餾水除去剩余的HOSu。沉淀活化的DOCA然后凍干。隨后將活化的DOCA溶于DMF并在室溫下與肝素反應(yīng)4小時。在這類反應(yīng)中所用的肝素量為40-400mg。反應(yīng)后，存在兩種類型的產(chǎn)物水溶性產(chǎn)物和水不溶性產(chǎn)物。通過經(jīng)0.45μm膜濾器過濾分離這些產(chǎn)物，并在真空烘箱中干燥水不溶性產(chǎn)物(即活化的DOCA)。使用膜(MWCO 3,500)將水溶性產(chǎn)物(即肝素-DOCA)用水透析1天，然后將肝素-DOCA凍干。
通過反相色譜法進一步純化合成的肝素-DOCA。分別用100ml蒸餾水、40ml的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)、含1.7M硫酸銨的40ml的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)和40ml的50mM磷酸鹽緩沖液洗滌苯基-瓊脂糖CL-4B柱(HR16/30I.D.)。使5ml肝素-DOCA溶液(1mg/ml)上柱并通過用硫酸銨溶液逐步洗脫對肝素-DOCA進行分級分離。用磷酸鹽緩沖液洗脫20分鐘，隨后用硫酸銨溶液(50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)+1.7M硫酸銨)以1ml/分鐘的流速洗脫。肝素-DOCA被洗脫在硫酸銨溶液中。將純化的肝素-DOCA溶液在蒸餾水中透析并凍干。
按照本領(lǐng)域中眾所周知的方法通過FT-IR和NMR表征根據(jù)該步驟制備的肝素衍生物，以證實肝素與疏水劑之間成功偶聯(lián)。Y.Lee，H.T.Moon & Y.Byun，“可以用于聚合物制劑中溶劑鑄塑的輕度疏水肝素衍生物的制備”(Preparation of Slightly Hydrophobic Heparin Derivatives WhichCan Be Used for Solvent Casting in Polymeric Formulation)，92《血栓研究》(Thromb.Res.)，149156(1998)。
實施例2肝素-膽固醇結(jié)合物的制備通過與氯乙酸反應(yīng)活化膽固醇的羥基以產(chǎn)生游離羧基。然后按照實施例1的步驟使這種改性的膽固醇與HOSu和DCC的10ml DMF溶液反應(yīng)。膽固醇、HOSu和DCC的摩爾比為1∶1.6∶1.6，反應(yīng)在室溫下進行5小時。為了除去未反應(yīng)的DCC和HOSu，加入水并用0.45μm膜過濾該溶液。接下來，使活化的膽固醇與肝素溶液反應(yīng)4小時。從該反應(yīng)中得到兩種產(chǎn)物水溶性產(chǎn)物和水不溶性產(chǎn)物。按照上述實施例1中的步驟處理這些產(chǎn)物。
實施例3肝素-鏈烷酸結(jié)合物的合成按照實施例1的步驟使月桂酸和棕櫚酸與肝素偶聯(lián)。使鏈烷酸的羧基與肝素的胺基偶聯(lián)而形成酰胺鍵。偶聯(lián)試劑還有HOSu和DCC。
實施例4肝素-膽酸結(jié)合物的合成在本實施例中，除了用膽酸取代DOCA，按照實施例1的步驟進行。
實施例5肝素-鵝膽酸結(jié)合物的合成在本實施例中，除了用鵝膽酸取代DOCA，按照實施例1的步驟進行。
實施例6肝素-麥角固醇結(jié)合物的合成在本實施例中，除了用麥角固醇取代膽固醇，按照實施例2的步驟進行。
實施例7
胰島素-DOCA結(jié)合物的合成在本實施例中，除了用胰島素取代肝素，按照實施例1的步驟進行。使胰島素的胺基、即GlyA1、PheB1和LysB29與DOCA的羧基偶聯(lián)。
實施例8降鈣素-DOCA結(jié)合物的合成在本實施例中，除了用降鈣素取代肝素，按照實施例1的步驟進行。使降鈣素的胺基與DOCA的羧基偶聯(lián)。
實施例9肝素衍生物生物活性的測定就按照實施例1-3步驟制備的肝素-DOCA、肝素膽固醇和肝素-鏈烷酸而言，產(chǎn)率、分子量和肝素與疏水劑之間的結(jié)合摩爾比根據(jù)反應(yīng)試劑的摩爾比而改變。肝素-DOCA結(jié)合物的產(chǎn)率為71-77％。通過從測定的各肝素衍生物分子量中扣除肝素的分子量(即通過光散射測定的12,386道爾頓)來計算改性的肝素衍生物中疏水劑的量。當(dāng)脫氧膽酸與肝素的進料摩爾比從1∶6增加至1∶200時，肝素-DOCA結(jié)合物中DOCA的量從7％增加至24％。就肝素-膽固醇結(jié)合物而言，產(chǎn)率也在73-78％的范圍。然而，這類疏水肝素結(jié)合物中膽固醇的量稍低于肝素-DOCA結(jié)合物中DOCA的量。在肝素-月桂酸和肝素-棕櫚酸結(jié)合物中，使相似量的鏈烷酸與肝素偶聯(lián)。
通過aPTT試驗和FXa顯色試驗測定肝素衍生物的抗凝活性。通過aPYF試驗測定在防止血纖蛋白凝塊形成過程中肝素衍生物的活性。在37℃下將含有肝素標(biāo)準(zhǔn)品的不含血小板的血漿(0.1-0.7U/ml，0.1ml)和含有肝素衍生物的血漿樣品(0.1ml)與0.1ml的aPTT試劑一起保溫2分鐘。保溫后，加入0.1ml的0.02M氯化鈣并從該點開始記錄時間，直到形成血纖蛋白凝塊為止。通過將凝血時間與肝素標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較來計算肝素衍生物的生物活性。凝血時間與血漿中肝素的活性呈線性比例關(guān)系。
還通過FXa顯色試驗測定肝素衍生物的活性和濃度。將肝素標(biāo)準(zhǔn)品和含有肝素衍生物的血漿樣品各自(25μl)與200μl的AT III溶液(0.1IU/ml)混合，其中AT III的濃度超過肝素濃度。將該溶液在37℃下保溫2分鐘并加入200μl的FXa(4nkcat/ml)。然后將所得溶液再保溫1分鐘。FXa的濃度也超過肝素濃度。隨后加入FXa底物(200μl，0.8μmol/ml)并在37℃下保溫5分鐘。通過添加200μl乙酸(50％溶液)終止該反應(yīng)。根據(jù)405nm處的吸光度計算血漿樣品中肝素的生物活性和濃度。將這些數(shù)據(jù)概括在表I中。
表I
a疏水劑與肝素的摩爾比實施例10肝素-DOCA的口服給藥給藥前使Sprague-Dawley大鼠(雄性，250-260g)禁食12小時。用乙醚麻醉大鼠，然后通過口服管飼即謹(jǐn)慎經(jīng)食道到達胃給予單劑量的肝素衍生物。該灌胃管(gavage)由具有平整末端的不銹鋼制成以避免在組織表面造成損害。在碳酸氫鈉緩沖液(pH7.4)中制備含有肝素衍生物的溶液?？傆嫿o藥的含肝素衍生物的溶液體積為0.3ml。該劑量分別以50、80、100和200mg/kg改變。每組中有9只大鼠。在每一時間點處用毛細(xì)管從眼眶后叢(retro-orbital plexus)連續(xù)采血(450μl)，并直接與50μl檸檬酸鈉(3.8％溶液)混合。立即于4℃以2500xg將血樣離心5分鐘。分別通過aPTT試驗和FXa試驗測定凝血時間和血漿中肝素衍生物的濃度。
按照50-200mg/kg的劑量測定肝素-DOCA在胃腸道中的吸收情況。在本實驗中，肝素-DOCA結(jié)合物中結(jié)合的DOCA與肝素的摩爾比為10。當(dāng)對大鼠口服給藥原料肝素時，由aPTT試驗測定的凝血時間約為18秒，且這一數(shù)值隨著時間的流逝不會改變?；€平均值為18秒，表明原料肝素在胃腸道中不被吸收。當(dāng)口服給藥肝素與DOCA的物理混合物或混合物時，aPTT值約為20秒且該數(shù)值隨著時間的流逝不會改變。另一方面，當(dāng)口服給藥肝素-DOCA結(jié)合物時，凝血時間如圖1中所示增加。由于在1小時間隔采血樣且在1小時的時間點處顯示出最長凝血時間，所以不能測定實際的最長凝血時間。然而，在1小時的時候的凝血時間隨劑量的增加呈線性增加。當(dāng)以50、80、100和200mg/kg給藥肝素-DOCA結(jié)合物時，在1小時的時候的凝血時間分別為25.8±2.6、43.1±4.0、51.2±9.3和136±33秒。當(dāng)以200mg/kg給藥肝素-DOCA結(jié)合物時，在1小時的時候的凝血時間顯著增加，為基線的7倍以上。由于肝素的治療時限(therapeutic window)為基線的1.5-2.5倍，所以在80-100mg/kg劑量下可以觀察到治療作用。因此，肝素-DOCA結(jié)合物顯著增加了肝素在胃腸道中的吸收，這一結(jié)果與DOCA和肝素以物理混合物方式混合不會增加肝素吸收的結(jié)果相反。
通過FXa試驗測定血漿中肝素-DOCA結(jié)合物的濃度，正如圖2中所示。
肝素-DOCA結(jié)合物隨著時間流逝的濃度分布與圖1中所示aPTT試驗的結(jié)果相似。吸收的肝素-DOCA濃度隨劑量的增加而增加。治療靶范圍在0.1-0.2IU/ml。就200mg/kg劑量的肝素-DOCA結(jié)合物而言，在1小時處的平均峰值濃度約為基線的9-10倍且該時間處的濃度約為1.0IU/ml。3小時后肝素-DOCA結(jié)合物的血漿濃度恢復(fù)至基線。因此證實了肝素-DOCA在胃腸道中吸收。
實施例11肝素-DOCA結(jié)合物在大鼠胃腸道中的吸收為了測定作為DOCA與肝素之比函數(shù)的肝素-DOCA結(jié)合物在胃腸道中的吸收值，如實施例1中所述用DOCA肝素為2.5、5.0和10.0的摩爾比合成肝素-DOCA結(jié)合物。正如表1中所示，當(dāng)DOCA與肝素的摩爾比增加時，肝素-DOCA結(jié)合物的生物活性輕度下降。然而，由于肝素-DOCA的分子量在DOCA對肝素的摩爾比增加時增加，所以作為摩爾比函數(shù)的肝素-DOCA結(jié)合物的生物活性僅下降了約5％。即肝素和肝素-DOCA結(jié)合物(10∶1摩爾比)的生物活性分別為1,734和1,632±7IU/mol。
圖3表示依照DOCA與肝素的結(jié)合摩爾比凝血時間的改變。在本實驗中，肝素-DOCA結(jié)合物的劑量為100mg/kg。正如表1中所示，當(dāng)結(jié)合的DOCA對肝素的摩爾比增加時，肝素-DOCA結(jié)合物的生物活性輕度下降，而最長凝血時間增加。這一結(jié)果表明肝素-DOCA結(jié)合物有利于肝素在大鼠胃腸道中吸收。
實施例12與肝素結(jié)合的疏水劑對大鼠胃腸道吸收的作用為了說明與肝素結(jié)合的疏水劑對胃腸道吸收的作用，測試按照實施例1-3制備的肝素-DOCA、肝素-膽固醇、肝素-棕櫚酸和肝素-月桂酸。正如表1中所示，將疏水劑對肝素的摩爾比控制在4-4.5的范圍。這些肝素衍生物的生物活性彼此相似，即在113-123IU/mg的范圍。圖4表示口服給藥100mg/kg這些肝素衍生物后得到的吸收值。正如通過aPTT試驗所測定的，給藥后1小時的最長凝血時間就肝素-膽固醇而言為32±6.1秒、就肝素-棕櫚酸而言為29±8.3秒，且就肝素-月桂酸而言為25.9±6.6秒。膽固醇、棕櫚酸和月桂酸的碳原子數(shù)分別為24、16和12，且疏水劑的疏水性與碳原子數(shù)成比例。因此，最長凝血時間隨結(jié)合的疏水劑的疏水性增加。這一結(jié)果表明肝素衍生物的疏水性是增加肝素在胃腸道中吸收的重要特性。然而，即使膽固醇比DOCA更疏水，肝素-DOCA結(jié)合物也顯示出比肝素-膽固醇結(jié)合物更長的凝血時間。對這一觀測可能的解釋包括(1)可以改善肝素衍生物在胃腸壁中的滲透性的肝素-DOCA結(jié)合物的兩親性；和(2)肝素-DOCA結(jié)合物的DOCA部分和DOCA受體在胃腸壁、尤其在回腸中的相互作用，其可以增加肝素-DOCA結(jié)合物對胃腸壁的粘附，從而增加吸收的可能性。
實施例13胃腸道的組織學(xué)評價在本實施例中，按照實施例10的步驟通過口腔管飼對大鼠給藥肝素-DOCA結(jié)合物。肝素-DOCA結(jié)合物中結(jié)合的DOCA對肝素的摩爾比為10。即，10個分子的DOCA與1個分子肝素結(jié)合。劑量為200mg/kg。給藥后1、2和3小時，用乙醚麻醉大鼠并通過切斷隔膜處死大鼠。從大鼠體內(nèi)取出胃、十二指腸、空腸和回腸組織并固定在中性福爾馬林緩沖液中處理。制備給藥肝素-DOCA結(jié)合物前取樣的胃腸組織作為對照樣品。用乙醇洗滌組織樣本以除去任何水。給樣本灌注有色的硅氧烷并包埋在石蠟中。在-20℃下使用切片機將包埋的樣本切成5μm切片并置于載玻片上。然后分別用二甲苯和無水乙醇洗滌組織切片以除去石蠟。隨后用蘇木精和伊紅(H&E)按照本領(lǐng)域眾所周知的步驟染色制備的5μm切片。將至少4只大鼠用于每次處理。
為了通過透射電鏡(TEM)進行評價，用1％四氧化鋨的PBS溶液(0.1M，pH7.4)固定胃、十二指腸、空腸和回腸，然后通過將醇的濃度從50％逐步改變至100％進行水化。用氧化丙烯浸透水化的組織，并用epon混合物包埋。將包埋的組織切成約50-60nm厚度的切片。用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對這些切片極輕度地染色1分鐘，并通過TEM(Hitachi 7100，Tokyo，日本)進行觀察。
圖5表示在胃、十二指腸、空腸或回腸的任何部位上沒有諸如偶然的上皮細(xì)胞脫落、絨毛融合、粘膜毛細(xì)管充血或病灶損傷這樣胃腸壁受損的證據(jù)。這些結(jié)果證實通過破壞胃腸上皮不會使肝素衍生物的吸收增加。
圖6表示與肝素衍生物接觸后微絨毛的電鏡形態(tài)。對照樣品顯示出健康緊密的連接、微絨毛和線粒體。1、2和3小時后，所有切片中的細(xì)胞外觀均顯示出損害征兆，諸如微絨毛融合、溶解、具有多孔性的細(xì)胞層失定向或細(xì)胞毒性作用。還發(fā)現(xiàn)與肝素衍生物接觸的微絨毛與對照組同樣健康。不存在組織損害表明結(jié)合的DOCA對肝素在胃腸道吸收的促進作用并非是通過改變組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的。
實施例14較低分子量肝素與DOCA的結(jié)合按照實施例1的步驟合成肝素與DOCA的結(jié)合物，除了使用未分級分離的肝素(“UFH”)，即上述實施例中簡稱為“肝素”化合物，6000分子量肝素(“LMWH(6K)”)和3000分子量肝素(“LMWH(3K)”)。然后表征得到的結(jié)合物UFH-DOCA、LMWH(6K)-DOCA和LMWH(3K)-DOCA，如表2中所示。
表2
a通過光散射測定當(dāng)UFH對DOCA的進料比為1∶200時，UFH-DOCA中得到的DOCA對肝素的最大比值為10。在這些條件下，使用較低分子量肝素得到的比值就LMWH(3K)-DOCA而言為1.3，就LMWH(6K)-DOCA而言為3.6。
DOCA對肝素的摩爾比隨肝素分子量的減小而減小，這是因為可利用較少的胺基來結(jié)合DOCA。肝素-DOCA結(jié)合物的生物活性也隨肝素分子量的減小而下降，盡管經(jīng)Fxa試驗證實所有的肝素-DOCA結(jié)合物均表現(xiàn)出相似的生物活性，其范圍在116.9±1.6-134.3±0.8。與DOCA結(jié)合后，所有的肝素-DOCA結(jié)合物均表現(xiàn)出高于未改性肝素70％以上的相對生物活性。
實施例15較低分子量肝素-DOCA結(jié)合物的口服吸收按照實施例10的步驟在口服給藥后測試實施例14中制備的較低分子量肝素-DOCA結(jié)合物在大鼠胃腸道中的吸收。圖7表示肝素的分子量對肝素-DOCA結(jié)合物在胃腸道中吸收的作用。通過口腔管飼以100mg/kg的劑量分別給藥LMWH(3K)-DOCA、LMWH(6K)-DOCA和UFH-DOCA(即肝素-DOCA)。LMWH(3K)-DOCA和UFH-DOCA的凝血時間低于LMWH(6K)-DOCA的凝血時間；在1小時的時候的平均aPTT時間分別為31.0±6.01和51.0±8.7(p＜0.005)。這些數(shù)據(jù)提示LMWH(6K)-DOCA的凝血時間分別大于LMWH(3K)-DOCA和UFH-DOCA凝血時間的1.5-倍和3-倍。肝素-DOCA結(jié)合物的濃度隨時間的分布與aPTT試驗的結(jié)果相似。當(dāng)以100mg/kg劑量給藥UFH-DOCA時，血漿的峰值濃度為4.10±1.3μg/ml，它遠低于LMWH(6K)-DOCA在相同劑量水平下的濃度。
按照20-100mg/kg的劑量范圍測定LMWH(6K)-DOCA在胃腸道中的吸收，如圖8中所示。當(dāng)對大鼠口服給藥100mg/kg的LMWH(6K)時，通過aPTT試驗測定的凝血時間在給藥后1小時的時候約為30秒。這種曲線在給藥后2小時下降至基線。另一方面，LMWH(6K)-DOCA的口服傳送如高度升高的aPTT值所證實，使肝素在大鼠體內(nèi)的吸收增加。當(dāng)以100mg/kg給藥LMWH(6K)-DOCA時，峰值血漿aPTT值約為87.8±11.1秒(基線aPTT值平均為20秒)。以20mg/kg和50mg/kg給藥肝素衍生物分別得到52.5±4.7和68.4±7.2秒的平均峰值aPTT響應(yīng)(p＜0.005)。在aPTT中約為基線1.5-2.5倍的肝素治療范圍與20mg/kg劑量相當(dāng)，正如圖8A中所示。
可以使用抗FXa試驗測定血漿中肝素衍生物的濃度。當(dāng)口服給藥100mg/kg的LMWH(6K)-DOCA時，LMWH(6K)的濃度為1.34±0.28μg/ml。低值促進了抗凝活性。然而，如圖8B中所示，在100mg/kg劑量下LMWH(6K)-DOCA的最高峰值為8.21±1.6μg/ml。治療靶范圍在0.1-0.2IU/ml。平均峰值濃度約為基線的9-10倍。這些結(jié)果提示肝素衍生物可以作為口服抗凝藥對處于深度靜脈血栓和肺栓塞危險中的患者起作用。
實施例16對口服給藥較低分子量肝素-DOCA結(jié)合物后胃腸道的組織學(xué)評價按照實施例13的步驟對來自給藥了100mg/kg單劑量按照實施例14制備的較低分子量肝素-DOCA結(jié)合物的大鼠的胃腸道組織進行組織學(xué)檢查。結(jié)果基本上與實施例13的結(jié)果相似。即，沒有檢測到任何胃腸壁組織受到損害的證據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種治療需要抗凝療法的患者的方法，該方法包括口服給藥有效量的組合物，該組合物包括與疏水劑共價結(jié)合的肝素，所述疏水劑選自膽汁酸類、固醇類和鏈烷酸類及其混合物。
2.權(quán)力要求1的方法，其中所述疏水劑是膽汁酸，該膽汁酸選自膽酸，脫氧膽酸，鵝膽酸，石膽酸，熊膽酸，熊去氧膽酸，異熊去氧膽酸，兔脫氧膽酸，甘氨膽酸，?；悄懰?，甘氨脫氧膽酸，甘氨鵝膽酸，脫氫膽酸，豬膽酸，豬脫氧膽酸及其混合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述膽汁酸是脫氧膽酸。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述疏水劑是固醇，該固醇選自膽甾烷醇，糞醇，膽固醇，表膽固醇，麥角固醇，麥角鈣化醇及其混合物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述疏水劑是含有約4-20個碳原子的鏈烷酸。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述鏈烷酸是選自丁酸，戊酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕櫚酸，硬脂酸及其混合物的成員。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物進一步包括一種藥用載體。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述肝素含有至少約3000的分子量。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述肝素含有至少約6000的分子量。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述肝素含有少于約12,000的分子量。
11.一種增強大分子試劑口服給藥的方法，該方法包括(a)使所述大分子試劑與一種疏水試劑結(jié)合，所述疏水試劑選自膽汁酸類，固醇類，鏈烷酸類及其混合物，以產(chǎn)生疏水大分子試劑；和(b)對需要它的患者口服給藥有效量的所述疏水大分子試劑。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述疏水劑是一種膽汁酸，該膽汁酸選自膽酸，脫氧膽酸，鵝膽酸，石膽酸，熊膽酸，熊去氧膽酸，異熊去氧膽酸，兔脫氧膽酸，甘氨膽酸，牛磺膽酸，甘氨脫氧膽酸，甘氨鵝膽酸，脫氫膽酸，豬膽酸，豬脫氧膽酸及其混合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述膽汁酸是脫氧膽酸。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述疏水劑是一種固醇，該固醇選自膽甾烷醇，糞醇，膽固醇，表膽固醇，麥角固醇，麥角鈣化醇及其混合物。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述疏水劑是含有約4-20個碳原子的鏈烷酸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述鏈烷酸是選自丁酸，戊酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕櫚酸，硬脂酸及其混合物的成員。
17.權(quán)利要求11的方法，其中所述大分子試劑是選自肝素，硫酸乙酰肝素，磺酰基多糖，多糖衍生物及其混合物的成員。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述大分子試劑是肝素。
19.權(quán)利要求11的方法，其中所述大分子試劑是一種肽。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述大分子試劑是胰島素。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述大分子試劑是降鈣素。
22.一種治療需要抗凝療法的患者的方法，該方法包括口服給藥有效量的一種組合物，該組合物包括選自肝素，硫酸乙酰肝素，磺?；嗵?、類肝素類及其混合物的成員，該成員與選自膽汁酸類，固醇類和鏈烷酸類及其混合物的疏水劑共價結(jié)合。
全文摘要
廣泛用作抗凝藥的多糖類，尤其是肝素臨床上僅通過靜脈內(nèi)和皮下注射給藥，這是由于它們的強親水性和高負(fù)電性所導(dǎo)致的。通過分別與膽汁酸類，固醇類和鏈烷酸類結(jié)合來合成兩親肝素衍生物。這些肝素衍生物具有輕度疏水性，表現(xiàn)出良好的水溶性且具有高度抗凝活性。這些輕度疏水的肝素衍生物在胃腸道中被有效吸收，且可以以口服劑型的形式使用。還公開了用于口服給藥的這些兩親肝素衍生物和類似改性的大分子的使用方法。
文檔編號C08B37/00GK1518452SQ01823199
公開日2004年8月4日 申請日期2001年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月30日
發(fā)明者邊榮魯, 李容圭 申請人:(株)美大富歷壽