專利名稱：：帶cd4引誘物受體的細胞以及相關(guān)分子和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一些CD4片段的受體，該受體結(jié)合HIV但不易使宿主細胞發(fā)生HIV感染。因此，本發(fā)明提供了新的有效的HIV治療方法。發(fā)明背景T細胞通過T細胞受體識別抗原是許多免疫學現(xiàn)象的基礎(chǔ)。T細胞引發(fā)所謂細胞介導的免疫。這種免疫牽涉到破壞外源組織細胞或受感染的細胞。T細胞有各種各樣的，包括調(diào)節(jié)免疫反應的“輔助”和“抵制”細胞，以及細胞毒細胞(或“殺傷細胞”)，它們能直接殺死不正常細胞。T細胞識別并結(jié)合了在另一種細胞表面上的特異性抗原時便成為激活的細胞；然后增殖，并且如果它是細胞毒細胞，它可以殺死結(jié)合的細胞。HIV和免疫發(fā)病機理在1984年，已研究指出了HIV和AIDS的致病因素。從那時起至今AIDS的定義已改變了很多次，該定義關(guān)系到在診斷中所應包括的標準。但是，盡管診斷參數(shù)有所改變，而簡單的常見的AIDS的共同特性是HIV感染，隨后持續(xù)發(fā)展成全身的癥狀而成為以AIDS為定義的疾病，如二級感染，腫瘤和神經(jīng)病。見哈里森的內(nèi)科學原理(第12版，McGrawHill(1991))。HIV是慢病毒屬中人的反轉(zhuǎn)錄病毒。四種已知的人反轉(zhuǎn)錄病毒屬于兩個不同的屬人的T嗜淋巴細胞的(或白血病)反轉(zhuǎn)錄病毒，HTLV-1和HTLV-2；以及人的免疫缺陷型病毒，HIV-1和HIV-2。前者是轉(zhuǎn)化病毒，而后者是致細胞病變的病毒。HIV-1已經(jīng)被認定為是引起全世界AIDS的最常見病因。HIV-2和HIV-1之間的序列同源性為約40％，HIV-2與猴的免疫缺陷型病毒(SIV)屬中的某些成員更相近。見Curran等人的科學(Science)3291357-1359(1985；Weiss等人，自然(Nature)324572-575(1986)。HIV有常見的反轉(zhuǎn)錄病毒基因(env，gag，和pol)以及與該病毒的復制和其他生物活性有關(guān)的6個額外的基因。如前所述，AIDS的共同特性主要是細胞介導免疫的深度免疫抑制。所述免疫抑制導致各種機會病病，特別是某些感染和腫瘤。AIDS免疫缺陷的主要原因是胸苷-衍生的(T)淋巴細胞亞組即T4種群在數(shù)量和質(zhì)量上的缺陷。通過存在的CD4表面分子來從表型上定義該細胞亞組，現(xiàn)已證實CD4表面分子是HIV的細胞受體。見Dalgleish等人，自然312763(1984)。盡管T4細胞是HIV感染的主要細胞類型，但基本上任何在其表面上表達CD4分子的人細胞均能夠結(jié)合HIV并被HIV所感染。傳統(tǒng)上，認為CD4+T細胞有輔助/誘導劑的作用，表明其給B細胞提供活化信號或者使攜帶互換CD8標記的T淋巴細胞誘發(fā)成為細胞毒/抑制細胞。見ReinherzandSchlossman，細胞19821-827(1980，Goldstein等人，免疫學綜述(Immunol.Rev).685-42(1982)。HIV以特異性和高度的親和性通過病毒包膜(gp120)中的一段氨基酸與位于其N-末端附近CD4分子的一部分V1區(qū)結(jié)合。結(jié)合后，病毒與靶細胞膜融合，然后內(nèi)化。內(nèi)化后，它用反轉(zhuǎn)錄酶將其基因組RNA轉(zhuǎn)錄成DNA，然后整合到細胞DNA中，在細胞DNA中它作為“原病毒”存在于細胞生命中。該原病毒是潛伏的，或被激活后轉(zhuǎn)錄mRNA和基因組RNA，從而進行蛋白質(zhì)合成、組裝、形成新的病毒顆粒、以及從細胞表面進行病毒的芽殖。盡管尚未確定病毒誘導細胞死亡的精確機制，但認為主要機制是病毒從細胞表面大量芽殖，導致質(zhì)膜的破壞并造成滲透失衡。在感染過程中，宿主生物體產(chǎn)生抗病毒蛋白的抗體，包括主要的包膜糖蛋白gp120和gp41。盡管這是體液免疫，但疾病逐漸發(fā)展，導致以多發(fā)性機會感染、寄生物血癥、癡呆和死亡為特征的致命的免疫抑制。宿主抗病毒體不能阻止疾病的發(fā)展，這是最麻煩和緊急的感染，并預示采取常規(guī)接種方法不會有效。在免疫缺陷型病毒的體液應答效力方面可能有兩種因素起作用。第一，象其他RNA病毒一樣(而且特別象反轉(zhuǎn)錄病毒一樣)，在應答宿主免疫監(jiān)測中，免疫缺陷型病毒有高突變率。第二，包膜糖蛋白本身是高度糖基化的分子，在其上幾乎沒有適用于高親和性抗體結(jié)合的表位。病毒包膜上只有很少的抗原靶，使得宿主幾乎沒有機會通過特異性抗體的產(chǎn)生來限制病毒感染。被HIV病毒感染的細胞在其表面上表達gp120糖蛋白。gp120通過與該病毒進入未感染細胞相似的反應來介導CD4+細胞之間的融合作用，從而形成短命的多核巨細胞。合胞體的形成依賴于gp120包膜糖蛋白與CD4蛋白質(zhì)的相互直接作用。見Dalgleish等人，同上文；Klatzman等人，自然312763(1984)；McDougal等人，科學231382(1986)；Sodroski等人，自然322470(1986)；Lifson等人，自然323725(1986)；Sodroski，自然321421(1986)。有跡象表明，CD4-gp120的結(jié)合是引起帶CD4抗原的細胞感染的主要原因，該跡象包括在gp120和CD4之間形成特異性的復合物(McDougal等人，同上文)。其他研究人員發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染并表達人的CD4cDNA基因后，可將無HIV感染性的細胞系轉(zhuǎn)變成可感染的細胞系。見Maddon等人，細胞46333-348(1986)?，F(xiàn)已經(jīng)提出的治療方案是以可溶性CD4為被動試劑去干擾病毒吸附和合胞體介導的細胞傳遞，并由許多小組成功地進行了體外試驗(Deenetal.，自然33182-84(1988)；Fisheretal.，自然33176-78(1988)；Husseyetal.，自然33178-81(1988)；Smithetal.，科學2381704-1707(1987)；Trauecheretal.，自然33184-86(1988)；隨后發(fā)展了具有長半衰期和適度生物學活性的CD4免疫球蛋白融合蛋白(Caponetal.，自然337525-531(1989)；Trauecheretal.，自然339，68-70(1989)；Byrnetal.，自然334667-670(1990)；Zettlmeissletal.，DNA細胞生物學(DNACellBiol.)9347-353(1990))。盡管CD4免疫毒性軛合物或融合蛋白在體外對感染的細胞有強細胞毒性(Chaudharyetal.，自然335369-372(1988)；Tilletal.，科學2421166-1168(1988))，但是免疫缺陷型癥狀的潛伏狀態(tài)使它不可能用任何單一治療方法來有效消除病毒負擔，而外源融合蛋白的抗原性可能限制其接受重復劑量的治療。用患有SIV的猴子進行的試驗表明，可溶性CD4如果用于沒有明顯CD4血細胞減少癥的動物，可以降低SIV效價并改善骨髓電位的體外測量值(Watanabeetal.，自然337267-270(1989))。但在停止治療后觀察到很快有病毒再出現(xiàn)，表明需要長期用藥以抑制進行性免疫系統(tǒng)衰弱。T細胞和Fc受體在細胞表面表達T細胞抗原受體(TCR)的最高豐度形式需要共表達至少6種不同的多肽鏈(Weissetal.，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med.)1601284-1299(1984)；Orloffhanshietal.自然316606-609(1985)；Berkhoutetal.，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2638528-8536(1988)；Sussmanetal.，細胞5285-95(1988))、α/β抗原結(jié)合鏈、CD3復合物的三種多肽、和ζ。如果不存在這些鏈中的任何一條，則不可能接著穩(wěn)定表達所述復合物的其他成員。ζ是限制多肽表面表達整個復合物(Sussmanetal.，細胞5285-95(1988))，而且認為它介導了至少部分有配體的受體識別而引發(fā)的細胞活化作用(Weissmanetal.，歐洲分子生物學雜志(EMBOJ.)83651-3656(1989)；Franketal.，科學249174-177(1990))。32kDaI型整膜同二聚體，ζ有一個9個殘基人細胞外區(qū)，該區(qū)沒有用于加入N-連接的聚糖的位點，還有一個112個殘基(小鼠)或113個殘基(人)細胞內(nèi)區(qū)(Weissmanetal.，科學2381018-1020(1988)；Weissmanetal.，美國國家科學進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)859709-9713(1988))。一種稱為η的ζ同種型(Baniyashetal.，J.BiolChem.生物化學期刊639874-9878(1988)；Orloffetal.，生物化學期刊.26414812-14817(1989)，它是從其他mRNA剪接途徑得到的(Jinetal.，美國國家科學進展873319-3323(1990))，在表達抗原受體的細胞中少量存在。認為ζ-η異二聚體介導了肌醇磷酸的形成以及受體-啟動的細胞程序性死亡稱為細胞凋亡(Mercepetal.，科學242571-574(1988)；Mercepetal.，科學2461162-1165(1989))。象ζ和η一樣，在含有其他多肽的細胞表面復合物中表達Fc受體-相關(guān)的γ鏈，它們中有些是介導配體的識別，其他的功能還不確定。γ帶有一個同二聚結(jié)構(gòu)，所有的識別作用很相似于ζ，并是這樣一種組分即肥大細胞/嗜堿性細胞高親和度IgE受體、FcεRI(它由至少三種不同多肽鏈組成)(Blandetal.，自然337187-189(1989)；Raetal.，自然241752-754(1989)、和低親和度IgG受體之一，在小鼠中用FcγRIIα來表示(Raetal.，生物化學雜志26415323-15327(1989))，而在人中用有巨噬細胞和自然殺傷細胞表達的CD16亞型、CD16TM(CD16跨膜)(Lanieretal.，自然342803-805(1989)；Andersonetal.美國國家科學進展872274-2278(1990)和一未鑒定功能度多肽(Andersonetal.，美國國家科學進展872274-2278(1990))。最近報道由小鼠T細胞系、CTL表達γ，其中它形成同二聚體還形成γ-ζ和γ-η異二聚體(Orloffetal.，自然347189-191(1990))。Fc受體介導免疫復合物的吞噬作用、跨細胞作用(transcytosis)和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)(RavetchandKinet，免疫學綜述年鑒(Annu.Rev.Immunol.)9457-492(1991)；Unkelessetal.，免疫學綜述年鑒6251-281(1988)；和Mellman，目前免疫學動態(tài)(Curr.Opin.Immunol.)116-25(1988))。最近已經(jīng)表明，鼠低親和性Fc受體同種型之一FcRγIIIB1介導Ig-包被的靶的內(nèi)化作用而形成披有網(wǎng)格蛋白的小窩，而另一低親和性受體FcRγIIIA則通過其與“引發(fā)劑”小家族的一個或多個成員(Meittinenetal.，細胞58317-327(1989)；和HunzikerandMellman，細胞生物學雜志(J.CellBiol.)1093291-3302(1989))相連而介導ADCC。這些引發(fā)劑分子、T細胞受體(TCR)ζ鏈、TCRη鏈，和Fc受體γ鏈，與不同免疫系統(tǒng)受體的配體識別區(qū)相互作用，可以在聚集后自發(fā)啟動細胞效應程序，包括細胞溶解以及緊接的聚集(Samelsoneta1.，細胞43223-321(1985)；Weissmanetal.，科學2391018-1020(1988)；Jinetal.，美國國家科學進展873319-3323(1990)；Blanketal.，自然337187-189(1989)；Lanieretal.，自然342803-805(1989)；KurosakeandRavetch，自然342805-807(1989)；Hibbsetal.，科學2461608-1611(1989)；Andersonetal.，美國國家科學進展872274-2278(1990)；andIrving和Weiss，細胞64891-901(1991))。然而，在進行鼠和人低親和性Fc受體家族之間的比較時，顯然人FcRIIA和C同種型沒有鼠配對物。其部分原因是它們的功能尚未確定。由于僅以CD4為基礎(chǔ)的體液藥物可能已限制了在體內(nèi)的實用性，所以以前的工作研究了增加抗HIV的細胞免疫的可能性。已經(jīng)鑒定了制備蛋白質(zhì)嵌合體，其中將CD4的細胞外區(qū)與T細胞受體、IgGFc受體或B細胞受體信號傳導元件的跨膜和/或細胞內(nèi)區(qū)融合(U.S.S.N.07/847,566和07/665,961，引入本文作為參考)。表達嵌合體的溶解細胞的T細胞對表達HIV包膜蛋白的細胞靶有有效的MHC-獨立性破壞作用，所述嵌合體包含細胞外CD4區(qū)。該方法一個極為重要和新的組成部分是鑒定了單個T細胞受體、Fc受體、和B細胞受體鏈，它們的聚集足以引發(fā)細胞應答。該方法的一體特別有用的專利申請是CD4和ζ、η或γ之間嵌合體的發(fā)明，該嵌合體引導溶解細胞的T淋巴細胞去識別并殺傷表達HIVgp120的細胞(U.S.S.N.07/847,566和07/665,961，引入本文作為參考)。發(fā)明簡述概括地說，本發(fā)明的技術(shù)特征是引導哺乳動物中抗HIV-感染的細胞的細胞免疫應答的方法。所述方法包括給哺乳動物施用有效量的治療性細胞，所述治療細胞表達膜結(jié)合的蛋白質(zhì)類嵌合受體，含有(a)一個細胞外部分，該部分包括一個能夠特異性識別并結(jié)合HIV-感染的細胞但不介導HIV感染的CD4片段和(b)一個細胞內(nèi)部分，它能夠給治療細胞發(fā)出信號以破壞受體-結(jié)合的HIV-感染的細胞。一方面，本發(fā)明的特征是表達蛋白質(zhì)類膜結(jié)合的嵌合受體的細胞，所述嵌合受體含有(a)一個細胞外部分，該部分包括一個能夠特異性識別并結(jié)合HIV-感染的細胞但不介導HIV感染的CD4片段和(b)一個細胞內(nèi)部分，它能夠給治療性細胞發(fā)出信號以破壞受體-結(jié)合的HIV-感染的細胞。在第二個方面，本發(fā)明的特征是治療哺乳動物中HIV的方法，包括給哺乳動物施用有效量的治療性細胞，所述治療性細胞表達膜結(jié)合的蛋白質(zhì)類嵌合受體，所述嵌合受體含有一個細胞外部分，該部分包括能夠特異性識別并結(jié)合HIV-感染的細胞但不介導HIV感染的CD4片段。本發(fā)明有關(guān)的特征一方面是表達膜結(jié)合的蛋白質(zhì)嵌合受體的細胞，所述嵌合受體含有一個細胞外部分，該部分包括一個能夠特異性識別并結(jié)合HIV-感染的細胞但不介導HIV感染的CD4片段。在第一和第二方面的優(yōu)選實施方案中，CD4片段是CD4的氨基酸1-394，或CD4的氨基酸1-200；該CD4片段通過在圖26中所示的CD7跨膜區(qū)或圖25中所示的人IgG1分子的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)，將它與細胞內(nèi)部分分離；并且該CD4片段與治療性細胞至少相隔48埃(優(yōu)選至少72埃)。在第一方面的優(yōu)選實施方案中，細胞內(nèi)部分是T細胞受體蛋白質(zhì)(例如ζ)、B細胞受體蛋白質(zhì)或Fc受體蛋白質(zhì)的信號傳導部分；而治療性細胞選自(a)T淋巴細胞；(b)細胞毒T淋巴細胞；(c)自然殺傷細胞；(d)嗜中性細胞；(e)粒細胞；(f)巨噬細胞；(g)肥大細胞；(h)HeLa細胞；和(i)胚胎干細胞(ES)。在其他相關(guān)的方面，本發(fā)明的特征是編碼本發(fā)明嵌合受體的DNA；和包含該嵌合受體DNA的載體。盡管本發(fā)明的具體實施方案是CD4和ζ之間的嵌合體，但任何一種與在例如粒細胞或B淋巴細胞中的這些分子有相似功能的受體鏈均能用于本文公開的目的。所需要的免疫細胞引發(fā)分子的顯著特征包括有自發(fā)表達的能力(即作為信號鏈)、與細胞外CD4區(qū)融合以使所得的嵌合體存在于治療細胞表面的能力、和在發(fā)生聚集兩次與靶配體相遇后啟動細胞效應程序的能力。目前，將嵌合體傳遞到免疫系統(tǒng)細胞的最方便的方法是通過某些基因治療手段。但是，通過將細胞與適宜穩(wěn)定化的純化嵌合蛋白混合而重建含有嵌合受體的免疫系統(tǒng)細胞還會導致形成基因工程的細胞種群。該細胞種群能與HIV-感染的靶物進行反應。類似的方法現(xiàn)在已經(jīng)采用，例如將CD4分子導入紅細胞中以達到治療目的。在這種情況下，該基因工程細胞種群不能自我更新。本發(fā)明涉及CD4片段與T細胞受體、B細胞受體和Fc受體亞單位之間的功能性的和簡化的嵌合體，所述亞單位是能夠引導免疫細胞識別并溶解HIV-感染的細胞。引導哺乳動物中細胞應答的方法包括給所述哺乳動物施用有效量的治療細胞(例如細胞毒T淋巴細胞)，所述細胞能夠識別并破壞HIV感染的細胞。本發(fā)明還包括能引導細胞毒T淋巴細胞去識別并溶解HIV-感染的細胞的嵌合受體蛋白質(zhì)、用含有嵌合受體的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞、以及抗嵌合受體的抗體。從本發(fā)明的下列詳細描述來看是顯而易見的，對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說本發(fā)明的這些和其他非限制實施方案是清楚而顯見的。在下列的詳細描述中，將參考分子生物學和免疫學領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的各種方法學。對于有這些已知方法學的出版物和其他材料，均將它們作為整體全部引用和列入本發(fā)明參考文獻中。列出重組DNA技術(shù)一般原理的標準參考著作包括Watson等人，基因的分子生物學，I和II卷，Benjamin/CumingsPublishingCompany，Inc.，Publisher，MenloPark，CA(1987)；Darnell等人，分子細胞生物學，ScientificAmericanBooks，Inc.，Publisher，NewYork，N.Y.(1986)；Lewin，基因II，JohnWiley&amp;Son，Publishers，NewYork，N.Y.(1985)；Old等人，基因操作原理基因工程介紹，第2版，UniversityofCaliformiaPress，publisher，Berkeley，CA(1981)；Maniatis等人，分子克隆實驗室手冊，第2版，ColdSpringHarborLaboratory，publisher，ColdSpringHarborNY(1989)；和Ausubel等人的分子生物學的最新方法，WileyPress，NewYork，NY(1989)。定義“克隆”指用體外重組技術(shù)將特定的基因或其他DNA序列插入到載體分子中?！癱DNA”指通過DNA-依賴的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)的作用，按照RNA模板生產(chǎn)的互補或復制的DNA。因此“cDNA克隆”指在克隆載體中攜帶的，與所需RNA分子互補的雙螺旋DNA序列?！癱DNA文庫”指含cDNA插入片段的重組DNA分子的收集，所述插入片段含有在制備cDNA文庫時由細胞表達的mRNA的DNA拷貝。用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法，如由Ausubel等人(同上文)和Maniatis等人(同上文)描述的那些方法制備所述cDNA文庫?？傊紫葟纳矬w的細胞中分離RAN，需要從所述生物體的基因組中克隆特定的基因。本發(fā)明所述目的優(yōu)選的是哺乳動物(特別是人)的淋巴細胞系，目前用于該目的優(yōu)選的載體是牛痘病毒W(wǎng)R菌株?！拜d體”指從質(zhì)粒、噬菌體、或哺乳動物或昆蟲病毒衍生的DNA分子，可以將所述DNA片段插入或克隆到其中。載體中含有一個或多個特異的限制性位點，而且能夠在確定的宿主或載體生物體中自主復制，以便再生產(chǎn)克隆的序列。因此“DNA表達載體”指能夠指導重組肽合成的任何自主元件。所述DNA表達載體包括細菌質(zhì)粒、噬菌體、哺乳動物和昆蟲質(zhì)粒和病毒?！盎旧霞兊摹笔侵敢环N化合物(如蛋白質(zhì)、多肽或抗體)，它基本上沒有與其天然相伴的組分。通常，當樣品中總物質(zhì)的至少60％，優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選至少為90％是所需的化合物時，該化合物就是基本上純的?？梢杂萌魏芜m宜的方法，如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、或HPLC分析等方法測量純度。從核酸的意義上說，“基本上純的”是指不立即與兩個編碼序列相連(即共價相連)的一種核酸序列、區(qū)段或片段，該編碼序列在衍生本發(fā)明DNA的生物體里天然存在的基因組中是立即與其鄰接的(即一個接在5′末端，一個接在3′末端)。分子“片段”如本發(fā)明的任何cDNA序列是指所述分子任何相鄰的核苷酸亞組。分子的“類似物”是指與完整分子或其某一片段基本上相似的非天然分子。如果兩個分子的氨基酸序列基本上相同，則認為一個分子與另一個分子“基本上相似”。具體地說，“基本上相似”的氨基酸序列是指與天然或參考序列至少有50％，優(yōu)選85％，最優(yōu)選為95％的氨基酸序列相同性的序列和/或只有保守氨基酸的取代不同于天然或參考氨基酸序列的序列?；旧舷嗨频陌被岱肿訒哂心骋幌嗨频纳飳W活性。如本文所用的，當一分子含有不是所述分子的正常的化學部分時，此分子被認為是該分子的“化學衍生物”。所述部分可以提高所述分子的溶解性、吸附能力、生物半衰期等。另外，所述部分還可以降低所述分子的毒性，消除或減弱所述分子任何不需要的副作用等。如在Remington＇s藥物學科學(Remington＇sPharmaceuticalScience)，16thed.，MackPublishingCo.，Easton，PA.(1980)中已公開了能夠介導所述作用的部分。本發(fā)明受體嵌合體基因的“功能衍生物”包括所述基因的“片段”或“類似物”，它們在核苷酸序列上是“基本上相似的”?！盎旧舷嗨啤钡暮怂峋幋a基本上相似的氨基酸序列(如上所定義的)，而且還可包括在適宜雜交條件下，能夠與天然或參考核酸序列雜交的任何核酸序列(參見例如Ausubeletal.，分子生物學現(xiàn)代的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，WileyPress，NewYork，NY(1989)有關(guān)適宜的雜交嚴謹條件)?！盎旧舷嗨啤钡那逗鲜荏w具有與“野生型”T細胞、B細胞或Fc受體嵌合體相似的活性。所述衍生物有最優(yōu)選90％，更優(yōu)選70％，優(yōu)選40％的野生型受體嵌合體的活性。功能性的嵌合受體衍生物的活性包括與HIV-感染的細胞特異性結(jié)合(用其細胞外CD4部分)，從而導致那個細胞的死亡；另外，嵌合受體并不能使帶受體的細胞對HIV易受感染?？梢杂美绫疚拿枋龅娜魏芜m宜的方法檢測嵌合受體的活性。按常規(guī)技術(shù)，可以將編碼本發(fā)明CD4受體嵌合體，或其功能衍生物的DNA序列與載體DNA重組，包括制成用于連接的平整末端或參差末端、限制酶消化以提供適宜的末端、按需補平粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免不需要的連接、以及用適宜的連接酶連接。由Maniatis等人(同上文)公開了用于所述操作的技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的。如果核酸分子(如DNA)含有包含轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信息的核苷酸序列，而且所述序列與編碼多肽的核苷酸序列可操作性地連接，則認為核酸分子“能夠表達”多肽?？刹僮麈I是使DNA調(diào)節(jié)序列和要表達的DNA序列以一種能夠表達基因的方式相連的鍵?；虮磉_所需的調(diào)節(jié)區(qū)的精確性質(zhì)隨生物體的不同而不同，但總的來講，應包括啟動子區(qū)，在原核生物中該區(qū)含有啟動子(指導RNA轉(zhuǎn)錄的啟動)和DNA序列，該序列轉(zhuǎn)錄成RNA后，發(fā)出啟動蛋白質(zhì)合成信號。所述區(qū)通常包括與轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動有關(guān)的那些5′非編碼序列，如TATA盒，帽序列，CAAT序列等。如果需要，用上述方法還可以得到編碼蛋白質(zhì)之基因序列的3′非編碼區(qū)。通常保持該區(qū)的轉(zhuǎn)錄終止調(diào)節(jié)序列，如終止和多聚腺苷酸化。因此通過保留與編碼蛋白質(zhì)DNA序列天然相連的3′區(qū)，可以提供轉(zhuǎn)錄終止信號。若轉(zhuǎn)錄終止信號在表達宿主細胞中不能有令人滿意的功能，那么宿主細胞中的3′功能區(qū)可被取代。如果兩個DNA序列之間鍵的性質(zhì)不(1)導致誘導移碼突變，(2)干擾啟動子區(qū)序列指導受體嵌合體基因序列轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)干擾由啟動子區(qū)序列轉(zhuǎn)錄受體嵌合體基因序列的能力，則認為這兩個DNA序列(如啟動子區(qū)序列和CD4-受體嵌合體編碼序列)是可操作相連的。如果啟動子能夠影響DNA序列的轉(zhuǎn)錄，則可將啟動子區(qū)與DNA序列可操作相連。因此要表達蛋白質(zhì)，需要有由適宜宿主識別的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號。本發(fā)明包括在原核或真核細胞中表達CD4-受體嵌合體蛋白質(zhì)(或其功能衍生物)，盡管真核(而且特別是人淋巴細胞)表達是優(yōu)選的。可以用各種方法制備本發(fā)明的抗體。例如，可以將表達CD4-受體嵌合體蛋白質(zhì)或其功能衍生物的細胞施用給動物以便誘導產(chǎn)生含能夠結(jié)合所述嵌合體之多克隆抗體的血清。在優(yōu)選的方法中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體，可以用雜交瘤技術(shù)(Kohleretal.，自然256495(1975)；Kohleretal.，歐洲免疫學雜志(Eur.J.immunol.)6511(1976)；Kohleretal.，歐洲免疫學雜志6292(1976)；Hammerlingetal.，單克隆抗體和T細胞雜交瘤(MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas)，Elsevier，N.Y.，pp.563-684(1981))制備所述單克隆抗體?？偠灾龇椒òㄓ肅D4-受體嵌合體抗原免疫動物。提取所述動物的脾細胞，然后與適宜的骨髓瘤細胞系融合。在本發(fā)明中可以使用任何適宜的骨髓瘤細胞系。融合后，將所得的雜交瘤細胞選擇性地保持在HAT培養(yǎng)基中，然后用Wands等人所述方法(Gastroenterology80225-232(1981)限制稀釋克隆。然后對通過所述選擇而得到的雜交瘤細胞進行檢測，以鑒定能夠分泌結(jié)合所述嵌合體之抗體的克隆。本發(fā)明的抗體還可以是多克隆的，或優(yōu)選的特異性的多克隆抗體區(qū)?？梢杂每贡景l(fā)明CD4-受體嵌合體的抗體監(jiān)測患者體內(nèi)的嵌合受體(或帶嵌合受體的細胞)。所述抗體很適用于本領(lǐng)域已知的標準免疫診斷檢測中，包括所述免疫測量或“夾心”檢測如前向夾心、后向夾心和同時夾心的檢測。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以不需進行過分試驗就能使用抗體確定任何數(shù)量的組合以測定免疫檢測的可接受的特異性、敏感性和精確性。列出了免疫學原理的標準參考著作包括Roitt，基礎(chǔ)免疫學(EssentialImmunology)，6thed.，BlackwellscientificPublications，publisher，Oxford1988)；Kimball，免疫學導論(IntroductiontoImmunology)，2nded.，MacmillanPublishingCo.，publisher，NewYork(1986)；Roittetal.，免疫學(Immunology)，GowerMedicalPublishing；Ltd.publisher，London，(1985)；Campbell“單克隆抗體技術(shù)”(“MonoclonalAntibodyTechnology”，)inBurdonetal.，eds.，生物化學和分子生物學的實驗室技術(shù)(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology)，13卷Elsevier，Publisher，Amsterdam(1984)；Kldin，免疫學自體-非自體識別的科學(Immunologythescienceofself-NonselfDiscrimination)，JohmWiley&amp;Sons，publisher，NewYork(1982)；以及kennettetal.，eds.，單克隆抗體，雜交瘤生物學分析中的新標準(MonoclonalAntibodies，HybridomaANewDimensionInBiologicalAnalyses)，PlenumPress，publisher，NewYork(1980)。“檢測”包括確定一種物質(zhì)是否存在或確定一種物質(zhì)的量。因此該術(shù)語指運用本發(fā)明的物質(zhì)、組合物和方法來進行定性和定量的確定。本發(fā)明的抗體和基本上純化的抗原對于制備試劑盒是很理想的。所述試劑盒可含有被分成密封小室的載體裝置，在這種封閉的小格中含有一個或多個容器如小瓶，試管等，每個所述容器含有用于檢測的不同元素?？杀唤M合成試劑盒形式的檢測類型有很多，例如包括競爭性和非競爭性檢測。可以利用本發(fā)明抗體的典型實例是放射性免疫檢測(RIA)、酶免疫檢測(EIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、和免疫測量(immunometric)或夾心的免疫檢測。術(shù)語“免疫測量檢測”或“夾心免疫檢測”指包括同時夾心，前向夾心，反向夾心免疫檢測。這些術(shù)語是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員還理解本發(fā)明的抗體還可用于目前已知或未來可發(fā)展的檢測其他變更形式中。這些也應包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?！疤禺愋宰R別和結(jié)合”是指抗體識別并結(jié)合嵌合受體多肽，但基本上并不識別和結(jié)合生物學樣品中的其他不相關(guān)的分子?！爸委熂毎笔侵赣靡呀?jīng)用本發(fā)明的CD4-受體嵌合體轉(zhuǎn)化的一種細胞，因而它能夠識別并破壞HIV-感染的細胞；優(yōu)選的所述治療細胞是造血系統(tǒng)的細胞。“細胞外”是指所述分子至少有一部分暴露在細胞表面?！凹毎麅?nèi)”是指所述分子至少有一部分暴露在治療細胞的胞質(zhì)內(nèi)?！翱缒ぁ笔侵杆龇肿又辽儆幸徊糠挚缭|(zhì)膜。本文所用的“細胞外部分”，“細胞內(nèi)部分”以及“跨膜部分”可包括延伸到細胞連接區(qū)內(nèi)的側(cè)氨基酸序列。“寡聚”指與其他蛋白質(zhì)形成二聚體、三聚體、四聚體或其他更高級的聚集復合物。所述寡聚物可以是同寡聚物或異寡聚物?！肮丫鄄糠帧笔侵敢龑秃衔?即寡聚物)形成的分子區(qū)。“溶解細胞的”指能夠破壞細胞(如HIV-感染的細胞)或能夠破壞感染性因素(如HIV病毒)。“免疫缺陷型病毒”是指某種反轉(zhuǎn)錄病毒，該病毒在野生型形式中，能夠感染靈長類宿主的T4細胞并具有病毒形態(tài)發(fā)生以及慢性病毒亞類的形態(tài)學特征。所述術(shù)語包括但不限于HIV和SIV的所有變異體，包括HIV-1，HIV-2，SIVmac，SIVagm，SIVmnd，SIVsmm，SIVman，SIVmand和SIVcpz。“MHC獨立性的”(非依賴性的組織相容性抗原)是指細胞的細胞溶解反應不需要MHCII性抗原存在于靶細胞的表面上?！肮δ芗毎芙庑盘杺鲗а苌铩笔侵改撤N功能衍生物(如上所定義的)，它能帶有至少40％，優(yōu)選為70％或最優(yōu)選為至少90％的野生型分子的生物學活性。如本文所用的，“功能細胞溶解信號傳導衍生物”可以通過直接給治療細胞發(fā)出信號以破壞受體-結(jié)合的因子或細胞(如細胞內(nèi)嵌合受體部分)可發(fā)揮作用或通過間接促進與治療細胞的細胞溶解信號傳導蛋白質(zhì)(如跨膜區(qū))的寡聚也可發(fā)揮作用。可以用中本文描述的體外檢測方法檢測所述衍生物的效力。“功能HIV包膜-結(jié)合的衍生物”是指能夠結(jié)合任何HIV包膜蛋白質(zhì)的功能衍生物(如上所定義的)。可以用例如本文描述的體外檢測方法鑒定功能衍生物。治療手段本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細胞可用于免疫缺陷型病毒的治療。目前施用所述轉(zhuǎn)化細胞的方法包括接受的免疫治療法或細胞轉(zhuǎn)移治療。這些方法可以使轉(zhuǎn)化后的免疫系統(tǒng)細胞返回到血液中。見Rosinberg，科學美國人(Sci.Am)，62(May1990)；Rosinberg等人，英國新醫(yī)學雜志(N.Eng1.J.Med.)323570(1990)。可以將本發(fā)明的藥物組合物施用給任何可以體驗本發(fā)明化合物有益作用的動物。所述動物中，最主要的是人，盡管本發(fā)明不限于此。發(fā)明詳細描述首先描述附圖。附圖的簡要描述圖1A是CD4(殘基1-369)和不同受體鏈(SEQINNOS38-41)之間融合位點的氨基酸序列。劃線的序列表示BamHI位點內(nèi)用于融合構(gòu)建編碼的氨基酸序列。用垂直棒表示跨膜區(qū)的開始。在氨基末端η序列與ζ序列相同，但在羧基末端不同(Jinetal.，美國國家科學進展873319-3323(1990))。圖1B表示在CV1細胞中，表面表達的CD4，CD4ζ，CD4γ和CD4η的流式細胞計數(shù)分析。用表達CD4嵌合體或CD16PI的病毒感染細胞，在37℃孵育9小時，然后用藻紅蛋白-軛合的抗-CD4MAbLeu2A染色。圖2表示在CD16TM(密點)單獨或與表達CD4γ(虛線)或CD4ζ(實線)的病毒共感染后，CD16TM的表面表達。稀點，僅用CD4ζ感染，用3G8染色(Fleitetal.，美國國家科學進展793275-3279(1982))的細胞(抗-CD16MAb)。圖3表示用表達CD16TM和以下的ζ嵌合體CD4ζ(粗線)，CD4ζC11G(實線)；CD4ζ(虛線)；CD4ζC11G/D15G(密點)；非共感染(僅CD16TM，稀點)的病毒共感染后，CD16TM的表面表達。將細胞與抗CD16Mab3G8及藻紅蛋白-軛合的抗小鼠IgG的Fab′山羊體一起孵育。所分析的不同突變體的ζ嵌合體的表達水平基本相同，而且用表達CD16TM和ζ嵌合體的病毒共感染的細胞，其嵌合體的表面表達沒有明顯變化。圖4A-D表示在T細胞系內(nèi)突變的ζ嵌合體交聯(lián)后，細胞內(nèi)游離的鈣離子增加。用重組牛痘病毒感染JurkatE6細胞(Weissetal.，免疫學雜志(J.Immunol.)133123-128(1984))，然后進行流式細胞計數(shù)分析。所列的結(jié)果是柵CD4+種群的，以致僅分析了表達相關(guān)嵌合蛋白的細胞。紫到藍Indo-1熒光的平均率反映了整個種群中細胞內(nèi)游離鈣離子的濃度，而應答細胞的百分比反映了超過預先確定閥值的細胞比率(設(shè)定10％的未處理細胞是陽性)。圖4A和圖4B表示那些表達CD4ζ(實線)或CD16ζ(虛線)的Jurkat細胞它們暴露于抗CD4MabLeu3a(藻紅蛋白軛和物)，然后與抗小鼠IgG的山羊抗體交聯(lián)。點線表示未感染的細胞對抗-CD3MabOKT3的反應。圖4C和4D表示按圖4A和4B處理并分析的表達CD4ζD15G(實線)；CD4ζC11G/D15G(虛線)；或CD4ζC11G(點)的Jurkat細胞。圖5A-C表示CD4ζ，CD4η和CD4γ受體可以使溶解細胞的T淋巴細胞(CTL)殺傷表達HIVgp120/41的靶細胞。圖5A實圈，與表達gp120/41的HeLa細胞孵育的表達CD4ζ的CTL；空圈，與未感染的HeLa細胞孵育的表達CD4ζ的CTL；實方塊，與表達gp120/41的HeLa細胞孵育的未感染的CTL；空方塊，與未感染的HeLa細胞孵育的未感染的CTL。圖5B實圈，與表達gp120/41的HeLa細胞孵育的表達CD4η的CTL；空圈，與表達gp120/41的HeLa細胞孵育的表達CD4γ的CTL；空方塊，與表達gp120/41的HeLa細胞孵育的表達C11G/D15G雙突變體CD4ζ的CTL。圖5C流式細胞計數(shù)分析用圖5B的CTL所表達的CD4。為了更正靶與效應物的比例，通過直方圖疊加，減去成比例的負(未感染的)種群，可以確定表達CD4嵌合體的細胞的百分比；為了進行比較，在該圖中設(shè)未感染的細胞是一個隨機的范圍，它與用直方圖減法所得的其他細胞種群的正的部分大致相同。圖6A-B表示CD4-指導的細胞溶解作用的特異性。圖6A實圈，與表達CD16PI的HeLa細胞孵育的表達CD4ζ的CTL；空圈，與表達gp120的HeLa細胞孵育的表達CD4的CTL；實方塊，與表達gp120/41的HeLa細胞孵育的表達CD16ζ的CTL；空方塊，與表達gp120/41的HeLa細胞孵育的表達CD16PI的CTL。圖6B實圈，與Raji(MHCII+型)孵育的表達CD4ζ的CTL；空圈，與RJ2.2.5(MHCII-型Raji突變體)孵育的未感染的CTL細胞；實方塊，與Raji(MHCII+型)孵育的未感染的CTL細胞；空方塊，與RJ2.2.5(MHCII-型)孵育的表達CD4ζ的CTL。擴大坐標級。圖7A-B表示CD16ζ嵌合受體的表征。圖7A是CD16ζ融合蛋白的圖示。將單體CD16的磷脂酰肌醇連接形式的細胞外部分與二聚的ζ就在跨膜區(qū)的外部相連。在底部列出了融合連接處的蛋白質(zhì)序列(SEQINNOS42，43)。圖7B表示在TCR正或TCR負細胞系中，交聯(lián)CD16ζ嵌合體后，鈣動員的流式細胞計數(shù)分析。列出了在時間為0時用抗體處理的細胞種群中，紫到藍熒光的平均比(相對鈣離子濃度的測量)。實方塊，Jarkat細胞對抗-CD3MAbOKT3的反應；實三角，CD16ζ對在REX33ATCR-突變體中交聯(lián)的抗-CD16Mab3G8的反應；空方塊，對在JarkatTCR-突變體系JRT3.5中交聯(lián)的CD16ζ的反應；空三角，對在Jarkat細胞中交聯(lián)的CD16ζ的反應；十字，在Jarkat細胞中，對非嵌合CD16的反應；點，在REX33ATCR細胞系中，對非嵌合的CD16的反應。圖8A-B表示細胞溶解潛力的缺失分析。圖8A表示ζ缺失端點的位置。在ζ中任何位置的突變用原殘基-位置-突變殘基的慣例來表示，例如D66★表示末端密碼子對Asp-66的取代。圖8B表示未缺失的CD16ζ和顯著ζ缺失的細胞溶解檢測結(jié)果。用51Cr負載表達CD16表面抗體的雜交瘤細胞，然后與增加量的殺傷性T細胞(CTL)孵育。該殺傷性T細胞感染表達CD16ζ嵌合體的牛痘重組體。將釋放的51Cr的百分比表示為效應物(CTL)對靶(雜交瘤)細胞比例(e/t)的函數(shù)。實圈，由表達CD16ζ(mfi18.7)的細胞介導的細胞溶解；實方塊，由表達CD16ζAsp66★(mfi940.2)的細胞介導的細胞溶解；空方塊，由表達CD16ζGlu60★(mfil6.0)的細胞介導的細胞溶解；空圈，由表達CD16ζTyr51★(mfi17.4)的細胞介導的細胞溶解；實三角，由表達CD16ζPhe34★(mfi17.8)的細胞介導的細胞溶解；空三角，由表達非嵌合的CD16(mfi591)的細胞介導的細胞溶解。盡管在該試驗中，CD16ζAsp66★的表達與其他融合蛋白的表達不匹配，但在相同試驗中，相同水平的表達CD16ζ的細胞的細胞溶解與表達CD16ζAspp66之細胞的結(jié)果基本相同。圖9A-D表示由跨膜作用引起的電位的消除表明短ζ片段能夠介導細胞溶解。圖9A圖示說明單聚的由兩部分和三部分構(gòu)成的嵌合體。頂上的是在65位殘基截斷的并沒有跨膜的Cys和Asp殘基的CD16ζ構(gòu)建體。下面的是CD16CD5ζ和CD16CD7ζ構(gòu)建體和相關(guān)對照物。下面列出了細胞內(nèi)區(qū)的肽序列(SEQIDNOS45-47)。圖9B表示單聚嵌合體缺失突變體的細胞溶解活性。將表達CD16ζ的細胞的細胞溶解活性(實圈；mfi495)與表達CD16ζAsp66★(實方塊；mfi527)或突變體CD16ζCys11Gly/Asp15Gly/Asq66★(空方塊；mfi338)以及CD16ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60★(實三角；mfi259)的細胞溶解活性相比較。圖9C表示由三部分構(gòu)成的融合蛋白介導的細胞溶解活性。實三角，CD16ζAsp66★；空方塊，CD165ζ(48-65)；實方塊，CD167ζ(48-65)；空三角，CD167ζ(48-59)；空圈，CD165；實圈，CD167。圖9D表示在TCR-JurkatJRT3.T3.5突變體細胞系中，突變體和三部分構(gòu)成的嵌合體的鈣流動性。空圈，表達二聚CD16ζAsp66★細胞的反應；實方塊，表達CD16ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66★的細胞的反應；空方塊，表達CD16ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60★的細胞的反應；實三角，表達CD167ζ(48-65)的細胞的反應；和空三角，表達CD167ζ(48-59)的細胞的反應。圖10A-F表示單個氨基酸對18殘基的細胞溶解信號傳導基元的影響。圖10A和10B表示細胞溶解活性，圖10C表示由帶靠近羧基末端的Tyr(Y62)點突變的嵌合體介導的鈣離子流動性。圖10A和10B表示分別從表達低和高量的CD16ζ融合蛋白質(zhì)的細胞收集的數(shù)據(jù)。用于鈣流動和細胞溶解試驗的符號相同，在右邊用一個密碼子表示。實圈，表達CD16ζ(mfi在A，21；B，376)的細胞；實方塊，表達CD167ζ(48-65)(mfi在A，31，B，82)的細胞；空方塊，CD167ζ(48-65)Glu60Gln(mfi在A，33，B，92)；十字，CD167ζ(48-65)Asp63Asn(mfi在A，30，B，74)；實三角，CD167ζ(48-65)Tyr62Phe(mfi在A，24，B，88)；空圈，CD167ζ(48-65)GluGln(mfi在A，20，B，62)；空三角，CD167ζ(48-65)Tyr62Ser(mfiB，64)。圖10D和10E表示細胞溶解活性，圖10F表示由帶靠近氨基末端的Tyr(Y51)點突變的嵌合體介導的鈣離子流動性。用于鈣流動和細胞溶解試驗的符號相同，在右邊用一個密碼子表示。實圈，表達CD16ζ(mfi在D，21.2；E，672)的細胞；實方塊，表達CD167ζ(48-65)(mfi在D，31.3；E，179)的細胞；實三角，CD167ζ(48-65)Asn48Ser(mfiD，22.4；E，209)；空方塊，CD167ζ(48-65)Leu50Ser(mfiD，25.0；E，142)；和空三角，CD167ζ(48-65)Tyr51Phe(mfiD，32.3；E，294)。圖11A-B表示ζ內(nèi)部重復片段的排列以及其支持細胞溶解能力的比較。圖11A圖示說明通過將ζ細胞內(nèi)區(qū)分成三份，然后與CD167嵌合體的跨膜區(qū)相連而形成的嵌合體。在下面表明了細胞內(nèi)區(qū)的序列(SEQIDNOS48-50)，有用框框起來的共有的殘基，和用星號表明的相關(guān)殘基。圖11B表示三個ζ亞區(qū)的細胞溶解潛力。實圈，表達CD16ζ(mfi476)的細胞；實方塊，CD167ζ(33-65)(mfi68)；空方塊表示CD167ζ(71-104)(mfi114)；和實三角，CD167ζ(104-138)(mfi104)。圖12是CD16FcRγII嵌合體的圖示說明。圖13A-B表示是CD4FcRγII和CD16FcRγII嵌合體交聯(lián)后鈣的流動。圖13A表示有鈣敏感性熒光團Indo-1負載的細胞發(fā)出的紫到藍熒光的比例，表示為CD16細胞外區(qū)與抗體交聯(lián)后的時間函數(shù)。圖13B表示相似分析即在與抗體交聯(lián)后，帶CD4FcRγII嵌合體的細胞發(fā)出的紫到藍熒光比例的增加。圖14A-B表示是CD4FcRγII和CD16FcRγII嵌合體的細胞溶解測定。圖14A表示抗細胞暴露于增加量的表達CD16FcRγII嵌合體的細胞毒T淋巴細胞(效應物細胞)時，從抗-CD16雜交瘤細胞(靶物)釋放的51Cr的百分比。圖14B表示相似地分析抗表達HIV包膜糖蛋白之靶細胞的由CD4FcRγII嵌合體介導的細胞毒性。圖15A-E鑒定對于細胞溶解很重要的在FcRγIIA尾部的殘基。圖15A圖示說明缺失構(gòu)建體。圖15B和15C表示CD16FcRγIIA羧基末端缺失變異體的鈣流動和細胞溶解作用。圖15D和15E表示由三部分構(gòu)成的嵌合體的鈣流動和細胞溶解作用，所述嵌合體逐漸減少CD16FcRγIIA細胞內(nèi)尾的氨基末端。圖16(SEQIDNO24)表示CD3δ受體蛋白質(zhì)的氨基酸序列；框起來的序列表示優(yōu)選的細胞溶解信號傳導部分。圖17(SEQIDNO25)表示T3γ受體蛋白質(zhì)的氨基酸序列；框起來的序列表示優(yōu)選的細胞溶解信號傳導部分。圖18(SEQIDNO26)表示mbl受體蛋白質(zhì)的氨基酸序列；框起來的序列表示優(yōu)選的細胞溶解信號傳導部分。圖19(SEQIDNO27)表示B29受體蛋白質(zhì)的氨基酸序列；框起來的序列表示優(yōu)選的細胞溶解信號傳導部分。圖20圖示表示CD4嵌合體。分子“A”是CD4(D1-D4)IgCD7；分子“B”是CD4(D1，D4)IgCD7分子“C”是CD4(D1-D4)IgCD7ζ；分子“D”是CD4(D1，D2)IgCD7ζ；以及分子“E”是CD4ζ。將對應于前體氨基酸1-394的人CD4分子的細胞外區(qū)通過一個BanHI位點與上述(Zettlmeissletal.，核酸細胞生物學(DNACellBiol)9347(1990))人IgG1的鉸鏈，CH1和CH2區(qū)相連，除施用人Ig序列的cDNA以在牛痘病毒重組體中表達外，在CD4前體CDNA的特有NheI位點(對應于氨基酸200)插入BamHI銜接器來產(chǎn)生CD4嵌合體的兩區(qū)版本。所述膜粘附序列由從人膜結(jié)合的IgG1的第一個外顯子的22個殘基組成，接著CD7的146-203殘基。從ζ的氨基酸55-163是由四部分構(gòu)成的構(gòu)建體(C和D)的引發(fā)基元。在含ζ鏈的由四部分構(gòu)成的構(gòu)建體中，用市售的抗細胞內(nèi)區(qū)(Coulter)的抗體為ζ的細胞內(nèi)表達提供資料。圖21表示用表達各種CD4延伸的嵌合體的細胞毒T細胞克隆，WH3作為效應物分子來介導表達HIV-1包膜糖蛋白之靶細胞的細胞溶解作用。為了進行細胞毒性檢測，在前述用10％人血清補充的IMDM中保持人CD8+CD4-HLAB44限制的T細胞系，WH3。用含γ輻射(3000rad)B44的單核細胞和1μg/ml植物凝血素(PHA)刺激細胞。刺激1天后，通過加入新鮮的培養(yǎng)基將PHA稀釋到0.5μg/ml；3天后完全更換培養(yǎng)基。在用于細胞毒性試驗前，要使細胞至少生長10天。用本文上述用于vPE16的適宜重組牛痘病毒感染細胞。在完全培養(yǎng)基中繼續(xù)感染3-4小時，此后通過離心收集細胞，并以1×107/ml的密度重懸浮。將100μl加到每孔含100μl完全培養(yǎng)基的U-底微滴定板的各孔中，然后在系列步驟中倍比稀釋。每種樣品的兩個孔不含淋巴細胞以自發(fā)釋放Cr，并測量攝取的總Cr。用vPE16在10cm平皿中，按上述感染靶細胞，HeLa亞系S3(HeLa-S3，ATCC)。用PBS和1mMEDTA分離106感染的細胞，離心并于37℃時，重懸在100μl51Cr鉻酸鈉(在PBS中1mCi/ml)中1小時，然后用PBS洗滌三次。將100μl標記了的靶細胞加到各孔中。以750xg將微滴定板離心1分鐘，然后在37℃孵育4小時。在孵育期結(jié)束時，輕輕移液重懸各孔中的細胞，取出樣品以確定摻入的結(jié)合總計數(shù)，以750xg將微滴定板離心1分鐘。取出等份(100μl)上清液，用γ射線閃爍計數(shù)器計數(shù)。校正效應物靶物比例以用于用流式細胞計數(shù)測量的感染細胞的百分比。圖22表示在轉(zhuǎn)染細胞系中復制HIV-1。在人胚胎腎細胞系293的亞系中建立穩(wěn)定表達野生型CD4和各種重組嵌合體的細胞系。HIV-1IIIB分離物的病毒原液的制備用按施用人T細胞系C8166作指標的終點稀釋方法測量(約等于106感染顆粒/ml的滴定度指標)。在37℃，以約1MOI經(jīng)8-12小時完成感染。1天后，用PBS將細胞洗滌三次，胰酶消化，再鋪在新平皿中，取上清培養(yǎng)液樣進行p24滴定(定為0天)。此后以3-4天的間隔，收集細胞培養(yǎng)上清液，以進行p24分析。用含100μg/ml潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基補充細胞。培養(yǎng)上清液用市售的ELISA-基的HIV-1p24抗原檢測試劑盒(Coulter)，分析過程按供應商的說明。結(jié)果表示相似過程的兩個獨立試驗。圖23表示CD4的D1-D4區(qū)(CD4Bam)的核酸序列(SEQIDNO28)和氨基酸序列(SEQIDNO29)。圖24表示CD4的D1-D2區(qū)(CD4Nhe)的核酸序列(SEQIDNO30)和氨基酸序列(SEQIDNO31)。圖25表示人IgG1的鉸鏈，CH2和CH3區(qū)(Igh23Bam)的核酸序列(SEQIDNO32)和氨基酸序列(SEQIDNO33)。圖26表示CD7跨膜區(qū)(TM7BamMlu)的核酸序列(SEQIDNO34)和氨基酸序列(SEQIDNO35)。圖27表示細胞內(nèi)區(qū)(ζMluNot)的核酸序列(SEQIDNO36)和氨基酸序列(SEQIDNO37)。圖28表示合成的α螺旋的DNA序列(SEQIDNO51)和一級氨基酸序列(SEQIDNO52)。實施例I構(gòu)建人IgG1受體嵌合體通過將CH3區(qū)中的序列與從抗體mRNA的跨膜形成的3′末端延伸的cDNA片段連接而指示人IgG1重鏈序列。通過用扁桃體cDNA文庫為底物和有下列序列的寡核苷酸的聚合酶鏈反應制備3′端片段，CGCGGGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGC(SEQIDNO7)和CGCGGGGATCCGTCGTCCAGAGCCCGTCCAGCTCCCCGTCCTGGGCCTCA(SEQIDNO8)，分別對應于所需DNA片段的5′和3′末端。5′寡核苷酸與人IgG1CH1區(qū)的位點互補，而3′寡核苷酸與編碼跨膜區(qū)序列的5′位點互補。用BstXI和BamHI消化PCR產(chǎn)物，然后連接在帶可變和恒定區(qū)的半合成IgG1抗體基因的BstXI和BamHI位點之間。插入BstXI和BamHI片段后，通過限制片段交換，將構(gòu)建體擴增部分取代到CH3中的SmaI位點，以便從PCR反應中僅衍生SmaI位點和3′寡核苷酸之間的部分。為了得到人IGgG1ζ嵌合受體，將編碼BamHI位點重鏈基因與下文所述ζ嵌合體的BamI位點相連，以便抗體序列形成細胞外部分。用編碼所述嵌合體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細胞的流式細胞計數(shù)表明當表達編碼輕鏈cDNA的質(zhì)粒被共轉(zhuǎn)染時，高水平表達抗體決定基，而當不存在輕鏈表達質(zhì)粒時，適度表達抗體決定基。用標準分子生物學技術(shù)，按上述構(gòu)建相似的嵌合體，所述嵌合體包含與η或γ(見下文)或任何T細胞受體或Fc受體蛋白質(zhì)的信號傳導部分相融合的人IgG1。為了產(chǎn)生可以從單個啟動子表達的重鏈和輕鏈的單個表達轉(zhuǎn)錄單位，從重鏈和輕鏈編碼序列以及編碼78kD葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(也稱為grp78或BiP)之mRNA的5′非翻譯部分產(chǎn)生編碼雙順反子mRNA的質(zhì)粒。通過人基團組DNA的PCR法得到grp78序列，其引物有下列序列CGCGGGCGGCCGCGACGCCGGCCAAGACAGCAC(SEQIDNO9)和CGCGTTGACGAGCAGCCAGTTGGGCAGCAGCAG(SEQIDNO10)分別在5′和3′末端。這些寡核苷酸在10％二甲亞砜存在下完成聚合酶鏈反應。用NotI和HincII消化PCR得到的片段，然后插入到人IgG1編碼序列下游的NotI和HpaI位點之間。然后將編碼人IgGκ輕鏈cDNA的序列插入到grp78前導區(qū)的下游，使用在載體中的HincII位點和另一位點。從這些操作中得到的表達質(zhì)粒組成了半合成的重鏈基團，然后是grp78前導序列，κ輕鏈cDNA序列，從SV40DNA片段衍生的多聚腺苷酸化信號。與只編碼重鏈決定基的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，用表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS細胞明顯提高了重鏈決定基的表達。為了得到含有重鏈/受體嵌合體和輕鏈的雙順反子基因，可以用本文所述任何嵌合重鏈/受體基因取代重鏈序列的上游。實施例II構(gòu)建CD4受體嵌合體從HPB-ALL腫瘤細胞系(Aruffo等人，美國國家科學進展848573-8577(1987b))和人自然殺傷細胞制備的文庫，通過聚合酶鏈反應分離人ζ(Weissman等人，美國國家科學進展859709-9713(1988b))和γ(Kuster等人，生物化學雜志2656448-6452(1990))cDNAs，而從鼠胸腺細胞文庫分離ηcDNA(Jin等人，美國國家科學進展873319-3323(1990))。將ζ，η和γcDNA與CD4的工程形式的細胞外區(qū)相連，所述CD4的工程形式在跨膜區(qū)的上游有一BamHI位點(Aruffo等人，美國國家科學進展848573-8577(1987b)；Zettlmeiss等人，DNA細胞生物學9347-353(1990))，所述跨膜區(qū)在跨膜區(qū)上游幾個殘基的相似位置處與在ζ和η中天然存在的BamHI位點相連(SEQIDNOS1，3，4和6)。為了與γ形成融合蛋白，將一BamHI位點在約相同的位置加到序列中(SEQIDNO2和5)。將融合基因?qū)氲脚６徊《颈磉_質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒含有大腸桿菌gpt基因作為可選擇標記，然后通過同源重組插入到牛痘WR菌株的基因組中，接著在霉酚酸中選擇生長(Falkneretal.，病毒雜志(J.Virol.)621849-1854(1988)；Boyleetal.，基因(Gene)65123-128(1988))。流式細胞計數(shù)分析表明牛痘重組體指導在細胞表面生產(chǎn)豐富的CD4ζ和CD4γ融合蛋白質(zhì)，而CD4η的表達較差(圖1B)。后者的發(fā)現(xiàn)與最近的報道一致，該報道認為將ηcDNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到鼠雜交瘤細胞系實質(zhì)上要比可比的ζ表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染所得的表達水平低(Claytonetal.，實驗醫(yī)學雜志1721243-1253(1990))。免疫沉降以牛痘重組體感染的細胞表明與天然產(chǎn)生的CD4抗原不同，融合蛋白質(zhì)形成共價二聚體。單體的CD4ζ和CD4γ融合蛋白以及天然CD4的分子量分別為63、55和53KD。較大質(zhì)量的融合蛋白約與較長的細胞內(nèi)區(qū)一致，它比天然CD4多75(CD4ζ)和5(CD4γ)個殘基。實施例IIICD4嵌合體可與其它受體鏈相連通過用鼠(Kurosakeetal.，自然342805-807(1989))或人(Hibbsetal.，科學2461608-1611(1989))γ以及用人ζ(Lanieretal.，自然342803-805(1989))共轉(zhuǎn)染，促進了在轉(zhuǎn)染體上人FcγRIII(CD16TM)巨噬細胞/自然殺傷細胞形式的細胞表面表達。與這些報告一致，當通過共轉(zhuǎn)染或用重組牛痘病毒共感染而傳遞到靶細胞時，嵌合體的表達也可以使得CD16TM在表面上表達(圖2)。在檢測的細胞系中，用ζ比用γ更顯著地促進CD16TM的表面表達(圖2)，而天然CD4不能增強CD16TM表面表達。實施例IVAspζ突變體與Fc受體無關(guān)為了產(chǎn)生與現(xiàn)有抗原或Fc受體無關(guān)的嵌合體，制備沒有膜內(nèi)Asp或膜內(nèi)Cys殘基或兩者均無的突變體ζ融合蛋白。流式細胞計數(shù)表明，由不同突變體嵌合體進行的細胞表面表達的密度與未突變的嵌合前體沒有明顯的不同，免疫沉降試驗表明所述嵌合體的總表達是相似的。正如所期望的，發(fā)現(xiàn)沒有跨膜Cys殘基的突變嵌合體不形成二硫鍵連接的二聚體。沒有Asp的兩個突變嵌合體不能支持CD16TM的表面表達，而沒有Cys但帶Asp的單體嵌合體可使CD16TM得到共表達，但效率比親本二聚體的低(圖3)。實施例V突變的受體保留了啟始鈣應答的能力為了確定融合蛋白質(zhì)的交聯(lián)是否使細胞內(nèi)的游離鈣離子以類似于已知的發(fā)生在T細胞抗原受體的方式進行積累，用牛痘重組體感染人T細胞白血病細胞系的細胞(JurkatE6細胞)(ATCC存放號為TIB152，美國典型培養(yǎng)物保藏，Rockville，MD)并在細胞外的區(qū)域與抗體交聯(lián)后測定細胞漿的相對鈣濃度。對載有鈣敏感染料Indo-1的細胞進行流式細胞計數(shù)測定(Grynkiewiczetal.，生物化學雜志2603340-3450(1985)；Rabinovitchetal.，免疫學雜志137952-961(1986))。圖4A-D顯示用CD4ζ和ζ的Asp-及Cys-突變體感染的細胞的鈣通量試驗的結(jié)果。嵌合體的交聯(lián)可重復性地增加細胞內(nèi)的鈣量。CD4η和CD4γ類似地使受感染細胞中細胞內(nèi)的鈣積累。Jurkat細胞在其細胞表面表達低水平的CD4，然而，在有或沒有CD16ζ存在的情況下天然CD4的交聯(lián)均不改變細胞內(nèi)的鈣水平(圖4A-B)。實施例VICD4ζ、η和γ嵌合體介導的表達HIVgp120/41的靶細胞的細胞溶解。為了確定嵌合的受體是否起動效應物細胞溶解程序，基于CD4對HIV包膜gp120/41復合體的識別制備了模型靶效應物系統(tǒng)模型。用表達gp120/gp41的重組的牛痘病毒對Hela細胞進行感染(Chakrabartietal.，自然320535-537(1986)；Earletal.，病毒學雜志642448-2451(1990))，并用51Cr對其進行標記。將標記的細胞與來自人同種特異性的(CD8+、CD4-)細胞毒性T淋巴細胞系的細胞一起孵育，所述的細胞毒性T淋巴細胞系的細胞是已經(jīng)被牛痘重組體感染過的，該重組體表達CD4ζ、CD4η、或CD4γ嵌合體、或CD4ζCys11GlyAsp15Gly雙突變嵌合體。圖5A-C顯示表達gp120/41的Hela細胞被表達CD4嵌合體的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)特異性地溶解。未被感染的Hela細胞不受帶有CD4ζ嵌合體的CTL的攻擊，并且表達gp120/41的Hela細胞也不被未受感染的CTL識別。為比較各種不同嵌合體的效能，通過流式細胞術(shù)以測得表達CD4嵌合體的CTL的分數(shù)和表達gp120/41的Hela細胞的分數(shù)，來對效應物與靶細胞的比值進行校準。圖5C顯示表達CD4的CTL的細胞計數(shù)分布，所述的CTL用于圖5A和5B所示的細胞溶解試驗。雖然表面CD4ζ的平均密度大大超過了CD4η的平均密度，表達兩者中任一種形式抗原的細胞的細胞溶解效力是相似的。校正成表達gp120的靶細胞的分數(shù)，由CD4ζ和CD4η蛋白質(zhì)介導的細胞溶解的效力可與已報道過的特異的T細胞受體靶細胞效應物對(表達CD4ζ的T細胞釋放50％時，效應物與靶細胞的平均比值為1.9±0.99，n＝10)的最佳效力相比。CD4γ融合體的活性較弱，如同CD4ζ融合體一樣，CD4γ融合體缺乏轉(zhuǎn)膜(transmembrane)Asp和Cys殘基。然而，在這兩種情況下均觀察到了明顯的細胞溶解作用(圖5B-C)。為了控制牛痘感染會提高CTL假識別的可能性，對被牛痘重組體感染的靶細胞進行了類似的細胞溶解試驗，所述的牛痘重組體表達磷酯酰肌醇結(jié)合形的CD16(CD16PI)，并用51Cr對感染的靶細胞進行標記，且用表達CD16PI或CD16ζ的對照重組體對CTL進行感染。圖6A顯示表達非-CD4嵌合體的T細胞不識別天然Hela細胞或表達gp120/41的Hela細胞，與此相似，表達CD4嵌合體的T細胞不識別表達其它牛痘-編碼的表面蛋白質(zhì)的Hela細胞。另外，表達非-嵌合體的CD4的CTL不明顯溶解表達gp120/41的Hela細胞(圖6A)。實施例VII帶有II類MHC的細胞不是嵌合體攻擊的目標人們認為CD4與MHCII類抗原表達的非多態(tài)序列發(fā)生相互作用(Gayetal.，自然328626-629(1987)；Sleckmanetal.，自然328351-353(1987))。雖然對于純化的蛋白質(zhì)來說從未有過CD4與II類抗原間發(fā)生特異性地相互作用的文獻報道，在特定條件下，可證明在表達CD4的細胞與表達II類分子的細胞之間有粘附作用(Doyleetal.，自然330256-259(1987)；Claytonetal.，實驗醫(yī)學雜志1721243-1253(1990)；Lamarreetal.，科學245743-746(1989))。下一步試驗檢查的是可否檢測到對帶有II類MHC的細胞的殺傷作用。圖6B顯示RajiB細胞系沒有由CD4ζ引導的進攻而顯示特異的細胞溶解現(xiàn)象，RajiB細胞系表達大量的II類抗原。雖然觀察到了少量的(≈5％)細胞溶解，Raji的II類抗原陰性的突變體(RJ2.2.5)(Accolla，實驗醫(yī)學雜志1571053-1058(1983))表現(xiàn)出相似的易感性，如同與未被感染的T細胞一起孵育時所顯示的結(jié)果一樣。實施例VIII被T細胞抗原/Fe受體ζ鏈誘導細胞溶解的序列要求雖然CD4和ζ鏈間的嵌合體可使細胞毒T淋巴細胞(CTL)殺傷表達HIVgp120的靶細胞，但人們尋求另一種CD4以準確地比較引入到人T細胞系的ζ嵌合體的性質(zhì)。這樣的細胞系可以表達CD4，使人難以特異地確定鈣流動的類型或程度與不同嵌合體的細胞毒性潛能間的關(guān)系。圍繞這一點，制備了ζ與CD16間的嵌合體，在該嵌合體中CD16的細胞外區(qū)域附著于ζ的跨膜序列和細胞內(nèi)的序列(圖7A)。將該基因融合體引入到牛痘病毒表達質(zhì)粒中，該表達質(zhì)粒帶有作為選擇標記的E.Coligpt基因，并通過同源重組及在霉酚酸中進行選擇性生長使所述基因融合體插入到牛痘WR株中(Falkner和Moss，病毒學雜志，621849(1988)；Boyle和Coupar，基因65123(1988))。用牛痘重組體對T細胞系進行感染，并在細胞外的區(qū)域與抗體進行交聯(lián)后，測定細胞漿內(nèi)的游離鈣離子的相對濃度。對負載有染料Indo-1的細胞進行熒光分光光度測定(大群體)和流式細胞計數(shù)測定(單個細胞)(Grynkiewiczetal.，生物化學雜志2603440(1985)；Rabinovitchetal.，免疫學雜志137952(1986))。圖7B顯示，對來自Jurkat人T細胞白血病細胞系的細胞收集的數(shù)據(jù)的分析，所述的細胞系是被表達CD16ζ融合蛋白質(zhì)的牛痘重組體感染過的。嵌合體的交聯(lián)可重復性地提高細胞內(nèi)的鈣濃度，而對表達非嵌合的CD16的細胞進行的類似處理卻幾乎或根本沒有作用。當嵌合體在缺乏抗原受體或?qū)D16抗體不能產(chǎn)生強應答的突變的細胞系中表達時，可觀察到交聯(lián)，所述的突變細胞系為REX33A(Breitmeyeretal.，免疫學雜志138726(1987)；Sanchoetal.，生物化學雜志26420760(1989))、或者Jurkat突變體JRT.3.T.5(Weissetal.，免疫學雜志135123(1984))。同樣的數(shù)據(jù)收集亦見于REX20A突變細胞系(Breitmeyeretal.，同上文，1987；Blumbergetal.，生物化學雜志26514036(1990))和本實驗室建立的JurkatCD3/Ti陰性的突變細胞系。用表達CD16ζ的重組體感染并不能使細胞對抗-CD3抗體恢復應答，表明融合蛋白質(zhì)不能通過援救細胞內(nèi)的CD3復合體鏈而起作用。為了評估嵌合體再次引起細胞介導的免疫的能力，用表達CD16嵌合體的牛痘重組體對CTL進行感染，該CTL用于特異性地裂解表達膜結(jié)合的抗-CD16抗體的雜交瘤細胞。該試驗是雜交瘤細胞毒性試驗的延伸，所述的雜交瘤細胞毒性試驗最初是為分析帶有Fc受體的細胞的效應物機制而開發(fā)出來的(Graziano和Fanger，免疫學雜志138945，1987；Graziano和Fanger，免疫學雜志13935-36，1987；Shenetal.，分子免疫學26959，1989；Fangeretal.，免疫學的今天1092，1989)。圖8B顯示在細胞毒性T淋巴細胞內(nèi)表達CD16ζ使該CTL可殺傷3G8(抗-CD16；Fleitetal.，美國國家科學進展793275，1982)雜交瘤細胞，而表達磷脂酰肌醇連結(jié)形式的CD16的CTL卻是失活的。帶有CD16ζ的CTL也不能殺傷表達不相關(guān)抗體的雜交瘤細胞。為了鑒定出細胞溶解作用所必需的最小的ζ序列，制備了一系列的缺失突變體，在此突變體中，漸多的ζ的細胞內(nèi)區(qū)域(SEQIDNO44)被連續(xù)地從羧基端去掉了(圖8A)。大部分的ζ鏈的細胞內(nèi)區(qū)域被去除后對于細胞溶解的可能性幾乎不產(chǎn)生影響；完整長度的嵌合體CD16ζ的功效與在65位殘基處缺失的嵌合體CD16ζAsp66*的功效基本上相等(圖8B)。可以觀察到ζ的第59位殘基的缺失(嵌合體CD16ζGlu60*)其細胞毒性明顯降低，而若使第50位的殘基進一步缺失，導致其活性稍有降低。然而，即使當細胞內(nèi)的區(qū)域被減少到僅剩3個殘基的跨膜固定錨(anchor)時，也未觀察到活性的全部喪失(圖8B)。因為ζ是二硫化物連結(jié)的二聚體，對于保留細胞溶解活性的一個解釋是內(nèi)源性的ζ與嵌合的ζ缺失突變體形成了雜合二聚體，因而重新具有了活性。為檢驗該想法，將ζ的第11位的Asp和第15位的Cys殘基分別變換成Gly(Cys11Gly/Asp15Gly)，并接如下進行免疫沉降。用重組的牛痘以至少為10的感染倍數(shù)(moi)，在不含血清的DME培養(yǎng)基中對約2×106個CV1細胞進行感染1小時。感染后6-8小時，用PBS/1mMEDTA將該細胞從培養(yǎng)板中取出，用乳過氧化物酶和H2O2，通過Clark和Einfeld的方法(LeukocyteTypingII，PP155-167，Springer-Verlag，NY，1986)，以每2×106個細胞0.2mCi的125I對細胞進行表面標記。離心收集標記的細胞，并使之在1％NP-40、0.1％SDS、0.15MNaCl、0.05MTris(pH8.0)、5mMMgCl2、5mMKCl、0.2M碘乙酰胺、和1mMPMSF中裂解。離心去核，用抗體3G8(Fleitetal.，(同上)1982；Medarex)和抗-鼠IgG瓊脂糖(Cappel，Durham，NC)將CD16蛋白質(zhì)免疫沉降下來。使樣品在非還原條件下電泳通過8％的聚丙烯酰胺/SDS凝膠或在還原條件下通過10％的凝膠。這些免疫沉降證實了CD16ζCys11Gly/Asp15Gly嵌合體與二硫化物連結(jié)的二聚體結(jié)構(gòu)無關(guān)。還測試了突變受體的細胞溶解活性。在細胞溶解試驗中，第65位殘基缺失的突變嵌合體(CD16ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66*)的活性比未突變的嵌合體(CD16ζAsp66*)的活性要低2-8倍，依賴于試驗的條件，后者的活性通常在CD16ζ活性的兩倍以內(nèi)，或者與CD16ζ的活性沒有區(qū)別(圖9B)。突變嵌合體的活性的降低與從具有相似結(jié)構(gòu)(參見上文)的CD4嵌合體中觀察到的降低具有可比性，并且很可能是歸因于ζ單體比二聚體效力低的原因。與此形成對照，第59位的殘基缺失的Asp-、Cys-突變嵌合體設(shè)有細胞溶解活性(圖9B)，支持了這樣的假說由跨膜殘基Cys和/或Asp介導的與其它鏈的締合導致了在比65位殘基有更多氨基末端缺損的突變體中，還保留有微弱的細胞溶解活性。流式細胞計數(shù)的研究表明缺乏跨膜殘基Asp和Cys的缺失突變體仍能促進應答抗體的細胞內(nèi)游離鈣離子的增多，該抗體交聯(lián)于TCR-突變的Jurkat細胞系(圖9D)。從在親代Jurkat細胞系表達的嵌合體中也得到了類似的結(jié)果。對于CD16ζCys11Gly/Asp15Glu/Glu60*，這些數(shù)據(jù)表明介紹鈣應答的能力可由支持細胞溶解的能力突變得來。為了最后消除ζ鏈跨膜殘基可能有的作用，分別用該跨膜的編碼序列、CD5或CD7抗原的頭14個或頭17個胞質(zhì)殘基置換ζ鏈的跨膜殘基及其頭17個胞質(zhì)殘基(圖9A)。所得三分的融合蛋白質(zhì)CD165ζ(48-65)及CD167ζ(48-65)并不形成二硫化物連結(jié)的二聚體(而CD16ζ嵌合體形成二硫化物連接的二聚體)，這是因為它們在ζ鏈跨膜區(qū)缺少了半胱氨酸殘基。上述兩個三分的嵌合體均能動員Jurkat和TCR陰性細胞系內(nèi)的鈣(圖9D)并使之對CTL產(chǎn)生細胞溶解應答(圖9C，數(shù)據(jù)未示出)。然而，將嵌合體CD167ζ(48-59)內(nèi)的ζ鏈截短到第59位殘基將使三分融合體的某些能力喪失。此能力包括引導TCR陽性或陰性Jurkat細胞的鈣應答反應和成熟CTL細胞的細胞溶解作用(圖9C和9D，數(shù)據(jù)未示出)。為檢查在18-殘基基元內(nèi)殘基的各自作用，我們通過定點誘變制備了許多突變的變異體，并且對它們在嵌合受體低表達(圖10A和10D)或高表達(圖10B和10E)的條件下介導受體-引起的殺傷作用的能力進行評估。圖10A-F顯示，盡管在許多貫穿59-63位殘基的相對保守的取代(即，用其同系的酰胺來取代酸性殘基，或者用苯丙氨酸取代酪氨酸)使細胞溶解功效受到了輕度的損害，各變異體在總體上還保留了動員鈣的能力。然而，總而言之，這些殘基含有重要的亞基元，它們?nèi)笔r，細胞溶解活性喪失。將62位的Tyr轉(zhuǎn)變成Phe或Ser，均使細胞毒性應答和鈣應答的能力喪失。在18個殘基片段的氨基端，把51位的Tyr換成Phe，將使鈣起動和細胞溶解活性均喪失，而將50位的Leu用Ser取代，使鈣的應答喪失而細胞溶解作用僅受到部分損害。在不被特定的假說束縛的前提下，人們猜想，Leu50Ser突變體在短期的流式細胞計數(shù)試驗中的不能動員鈣的能力沒有完全反映它能在時間較長的細胞溶解試驗中介導細胞內(nèi)的游離鈣離子明顯升高的能力。然而，對于一些溶細胞性的T細胞系，已有鈣-不敏感性的細胞溶解活性的報道，并且還沒有排除本文所述結(jié)果亦有類似現(xiàn)象的可能性。將Asn48用Ser置換，在一些試驗中使細胞毒性受到了部分損害，而在另一些試驗中卻幾乎沒有影響。為研究多余序列元件的潛在的作用，將ζ鏈的細胞內(nèi)的區(qū)域分成3個片段，分別為自第33至第65位殘基、自第71至第104位殘基、和自第104至第138位殘基片段。通過在遠離CD7的細胞內(nèi)區(qū)域的基本膜錨固定序列的位置處引入的MLuI位點，將這些片段的每一個與CD16CD7嵌合體相連接(參見下文；圖11A)。對這三個片段的細胞溶解功效的比較表明，它們基本上是等效的(圖11B)。序列比較(圖11A)表明在酪氨酸之間第二個基元含11個氨基酸殘基，而第1個和第3個基元含有10個氨基酸殘基。雖然還沒有T細胞活化過程的確切記述，但已清楚的是抗原受體的聚集、或者帶有ζ鏈的細胞內(nèi)序列的受體嵌合體的聚集，引發(fā)了鈣流動、細胞因子和顆粒的釋放、以及活化時的細胞表面標志的出現(xiàn)。ζ鏈的活性粒點(一個線性短肽序列)可能太小以至于其不具有天然的酶活性，它可能是與一個或者最多與幾個蛋白質(zhì)相互作用來介導細胞的活化。由于介導細胞溶解的能力可突變地與介導鈣積累的能力分開，游離鈣離子的動員其本身不足以引起細胞活化，這一點是也清楚的。正如本文所述，將ζ鏈的細胞內(nèi)區(qū)域的18個殘基引入到兩個無關(guān)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域和細胞內(nèi)區(qū)域內(nèi)，使所得的嵌合體再次引導針對靶細胞的細胞溶解活性，所述的靶細胞與融合蛋白質(zhì)的細胞外的部分結(jié)合。雖然帶有18個殘基基元的嵌合體的活性比具完整長度ζ鏈的嵌合體的活性小將近8倍，但活性的減小可歸因于跨膜相互作用的喪失，所述相互作用一般使野生型的ζ鏈形成二硫化物連結(jié)的二聚體。也就是說，具有與基元相同的羧基端和缺乏跨膜Cys和Asp殘基的ζ缺失的構(gòu)建體，顯示出的活性常常比僅含有18個殘基基元的嵌合體的活性略低。我們一直強調(diào)的細胞溶解受感元件具有2個酪氨酸，而沒有絲氨酸和蘇氨酸，這使磷酸化活化作用的可能性受到了限制。兩個酪氨酸的任何一個突變都會破壞活性，然而，雖然初步的試驗沒有指出在含有18個殘基基元的嵌合體表面抗原交聯(lián)后發(fā)生了明顯的酪氨酸的磷酸化作用，但是不能排除在低水平上有這種磷酸化作用參與的可能性。除了兩個酪氨酸殘基的作用外，在低受體密度的條件下，許多在基元羧基末端的氨基酸的取代使基元的活性削弱。與ζ鏈活性基元相似的序列可在其它幾種跨膜蛋白的胞質(zhì)區(qū)內(nèi)找到，這些蛋白質(zhì)包括CD3ζ和γ分子、表面IgM相關(guān)蛋白質(zhì)mb1和B29、及高親和力IgE受體(Fc∈RI)的β和γ鏈(Reth，自然338383，1989)。雖然這些序列的功能還不清楚，但如果充分表達的話，每種蛋白質(zhì)都能進行自主的T細胞活化，而且所述的活化可在ζ陰性突變細胞系中觀察到的殘留的TCR應答反應里得到解釋(Sussmanetal.，細胞5285，1988)。ζ鏈本身帶有3個這樣的序列，它們大約間隔相等，大體上分成三部分的細胞內(nèi)區(qū)域表明每一部分都能啟始細胞溶解應答。η是ζ的同型剪接物(Jinetal.，同上文1990；Claytonetal.，美國國家科學進展885202，1991)，η缺乏第三個基元的羧基的一半殘基。因為去掉第一個基元的羧端的一半殘基會使活性喪失，看起來η鏈的絕大部分的生物學效應可能歸因于頭兩個基元。雖然經(jīng)過不同的測量，在促進抗原介導的細胞因子釋放方面(Baueretal.，美國國家科學進展883842，1991)或在重新引導細胞溶解方面(參見上文)，η與ζ的活性相等，但是在應答受體的刺激時，η不被磷酸化(Baueretal.，同上文，1991)。因此，或者磷酸化需要三個基元均存在，或者第三個基元代表了未被鑒定的硌氨酸激酶的最適宜底物。實施例IX通過人Fc受體傳遞細胞溶解信號為評估不同的人Fc受體亞型的作用，制備了嵌合分子，在這些分子中，人CD4、CD5或CD16抗原的細胞外的區(qū)域與FcRIIνA、B1、B2、和C亞型(Ravetch和Kinet命名法，免疫綜述年鑒9457，1991)的跨膜區(qū)和細胞內(nèi)區(qū)連接起來。具體地講，用下列合成的寡聚核苷酸探針，從已存在的克隆PC23或人扁桃體cDNA文庫(以標準技術(shù)構(gòu)建的)對前述的FcRIIA、B1、和B2同型(蛋白質(zhì))的跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)cDNA序列進行擴增CCCGGATCCCAGCATGGGCAGCTCTT(SEQIDNO18；FcRIIA正向)；CGCGGGGCGGCCGCTTTAGTTATTACTGTTGACATGGTCGTT(SEQIDNO19；FcRIIA反向)；GCGGGGGGATCCCACTGTCCAAGCTCCCAGCTCTTCACCG(SEQIDNO20；FcRIIB1和FcRIIB2正向)；和GCGGGGCCGGCCGCCTAAATACGGTTCTGGTC(SEQIDNO21；FcRIIB1和FcRIIB2反向)。這些引物分別含有BamHI和NotI酶的切割位點，切割后產(chǎn)生5′端6個殘基的缺口。NotI位點的后面緊接著的是反義終止密碼子，即CTA和TTA。所有的引物含有與目的片段的5′和3′端互補的18個或更多的殘基。通過重疊PCR技術(shù)，運用下列序列的引物TCAGAAAGAGACAACCTGAAGAAACCAACAA(SEQIDNO22)和TTGTTGGTTTCTTCAGGTTGTGTCTTTCTGA(SEQIDNO23)由定點突變來產(chǎn)生對應于FcRIIγC胞質(zhì)區(qū)的cDAN片段，該FcRIIγC胞質(zhì)區(qū)與IIA同型物僅有一個氨基酸殘基的差異(在第268位P變成了L)。將PCR片段插入到分別含有CD16或CD4的細胞外區(qū)域的牛痘病毒表達載體中，接下來通過在胸苷激酶位點的重組，將PCR片段插入到野生型牛痘中，選擇與Ecolgpt共整合的病毒有助于所需重組子的鑒定。所有同型物的一致性通過雙脫氧測定得到證實(圖12所示)。嵌合受體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生由免疫沉降研究進一步證實。以至少為10的感染復數(shù)，在無血清的IMDM培養(yǎng)基中，用重組的牛痘對將近107個JRT3.T3.5細胞感染1小時。感染后12個小時，收獲細胞，并使用乳過氧化物酶/葡萄糖氧化酶方法(Clark和Einfeld，同上文)，以每107個細胞0.5mCi125I的量對細胞進行表面標記。離心收集標記的細胞，使之在1％NP-40、0.1mMMgCl2、5mMKCl、0.2M碘乙酰胺和1mMPMSF的溶液中裂解。離心去除細胞核，用抗體4G8和抗-鼠IgG瓊脂糖對CD16融合蛋白質(zhì)進行免疫沉降。在還原條件下對樣品進行電泳。所有免疫沉降的嵌合受體分子均是所預期的分子量大小。為測試嵌合受體介導胞質(zhì)游離鈣離子增多的能力，用重組的病毒感染TCR-突變的Jurkat細胞系JRT3.T3.5(如本文所述)，并在受體細胞外的區(qū)域與單克隆抗體3G8或Len-3A(如本文所述)交聯(lián)后，測量細胞內(nèi)的胞質(zhì)游離鈣離子。這些試驗揭示在細胞外區(qū)發(fā)生交聯(lián)后，F(xiàn)cRγIIA和C的細胞內(nèi)區(qū)能夠介導胞質(zhì)游離鈣離子的增加，而在可比較的條件下，F(xiàn)cRγIIB1和B2的細胞內(nèi)區(qū)域卻是沒有活性的(圖13A和13B)。CD4、CD5和CD16與FcRγIIA的雜合體促進鈣應答的能力基本上相等(圖13A-B)。來自單核細胞和淋巴細胞譜系的其它細胞系，能對由細胞外區(qū)的交聯(lián)所引發(fā)的信號進行應答。為探尋不同的FcRγII的細胞內(nèi)區(qū)域涉及細胞溶解的程度，用表達CD16FcRγIIA、B1、B2、和C嵌合體的牛痘重組體感染人細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。然后將受感染的細胞與51Cr-標記的雜交瘤細胞(即，3G810-2細胞)共同培養(yǎng)，所述的雜交瘤細胞表達抗CD16的細胞表面抗體。在該試驗中，如果嵌合體的CD16的細胞外區(qū)域已經(jīng)與能活化淋巴細胞效應物程序的細胞內(nèi)的片段結(jié)合在了一起，帶有CD16嵌合體的CTL將會殺傷雜交瘤靶細胞；該細胞溶解試驗將于下文詳細描述。圖14A顯示帶有CD16FcRγIIA和C，而不是FcRγIIB1或B2的CTL能將表達細胞表面抗-CD16抗體的靶細胞溶解。為排除特異性的細胞溶解是在一定程度上歸因于與CD16部分的相互作用的可能性，進行細胞溶解實驗，在該實施中，F(xiàn)cRγII的細胞內(nèi)區(qū)粘附于CD4的細胞外區(qū)，在該實驗中，靶細胞是表達HIV包膜gp120/41蛋白質(zhì)的Hela細胞，具體地講，Hela細胞是受牛痘載體vPE16(可從theNationalInstituteofAllergyandInfectionDiseaseAIDSDepository，Bethesda，MD得到)感染過的。正如在CD16系統(tǒng)中的一樣，表達HIV包膜的靶細胞易于被表達CD4FcRγIIA嵌合體的T細胞溶解，而不被表達FcRγIIB1或B2的T細胞溶解(圖14B)。FcRγIIA和C的細胞內(nèi)區(qū)域不與任何其它蛋白質(zhì)共有可觀的序列同源性，包括擴展的FcRγ/TCRζ家族中的成員。為確定誘導細胞溶解作用的序列元件，制備了有5′和3′端缺失的細胞內(nèi)區(qū)的編碼序列(描述于下，示于圖15A)，并在鈣動員和細胞溶解的檢測(如本文所述)中，估測了它們的功效。在去除了細胞內(nèi)區(qū)的氨基末端部分的實驗中，用無關(guān)的CD7抗原的跨膜區(qū)域取代FcRγII的跨膜區(qū)域，以消除由跨膜區(qū)域介導的可能的相互作用的影響。圖15B和15C顯示，將14個羧基末端殘基包括298位的酪氨酸去除，會導致溶解細胞能力的完全喪失和鈣動員潛能的顯著下降。而在282位酪氨酸之前的進一步的缺失亦導致同樣的表型(圖15B和15C)。自細胞內(nèi)區(qū)域的N-末端至第268位殘基的缺失，對于鈣曲線的輪廓或溶解細胞的潛能均設(shè)有實質(zhì)的影響，而至第275位殘基的缺失，卻對游離鈣離子的釋放產(chǎn)生明顯的損害，但對細胞溶解作用幾乎沒有影響(圖15D和15E)。至第282位殘基的進一步的缺失，會使FcRγII帶有尾結(jié)構(gòu)，該尾結(jié)構(gòu)既缺乏動員鈣的能力又無引發(fā)細胞溶解作用的能力(圖15D和15E)。由這些原始測量結(jié)果所確定的“活性元件”相對地較大(36個氨基酸)并包括由16個殘基隔開的二個酪氨酸。實施例X通過帶有不支持感染的嵌合CD4受體的淋巴細胞而定向的細胞溶解作用正如上面所討論的，可從遺傳工程獲得效應物分子，該分子以MHC-不依賴的方式重新引導CTL的細胞溶解活性。例如，由CD4的細胞外區(qū)與人CTL克隆的ζ鏈融合組成的嵌合體，即WH3，特異地殺傷表達HIV-1表面包膜糖蛋白，gp120的靶細胞。但因CD4分子的細胞外區(qū)域使其易于被HIV感染，帶CD4的CTL可成為該病毒的靶子，導致其潛能的下降(Dalgleishetal.，自然312767(1984)；Klatzmannetal.，自然312767(1984))。為防止產(chǎn)生這樣的結(jié)果，以CD為基礎(chǔ)來設(shè)計嵌合的效應物分子，使這些分子在特異性地以H2V-感染的細胞為靶物進行細胞-介導的有效的殺傷作用，但它卻不易于被HIV感染。通過遺傳工程將CD4的細胞外區(qū)域(圖23)附著于人IgG1重鏈的鉸鏈區(qū)、第二和第三恒定區(qū)(Zettlmeissleal.，DNA細胞生物學9347(1990))(圖25)，來制備三分融合蛋白質(zhì)，在此情形下，它們與人膜-結(jié)合的IgG1的第一跨膜外顯子的一部分相連，接下來是人CD7抗原的一部分，所述CD7抗原由在單個的類Ig區(qū)和跨膜區(qū)后的轉(zhuǎn)移終止序列之間的序列組成(Aruffo和Seed，歐洲分子生物實驗雜志63313(1987))(圖26)。CD7片段的細胞外部分的一級氨基酸序列由富含脯氨酸的區(qū)域組成，這就意味著莖(Stalk)-樣結(jié)構(gòu)的存在，該結(jié)構(gòu)使類Ig區(qū)域伸出細胞表面(Aruffo和Seed，歐洲分子生物實驗雜志63313(1987))(圖26)。制備了重組的牛痘病毒來表達上述結(jié)構(gòu)及其(如本文所述)相關(guān)的嵌合體。具體地講，重組的痘苗病毒在CV-1細胞中通過同源性重組產(chǎn)生。在制備高滴度的CV-1細胞貯備液之前，對每一貯備液進行至少兩輪的OKT4或Leu3a的噬菌斑顯現(xiàn)試驗，然后進行噬菌斑的純化。三分嵌合體(CD4(D1-D4)IgCD7)(圖20，分子“A”)顯示出有效的細胞表面表達作用，并對之在痘苗基的合胞體形成試驗(Lifsonetal.，自然232725(1986)；Ashornetal.，病毒學雜志642149(1990))中，測試了其作為HIV受體的能力。將用重組的痘苗病毒(vPE16)感染的Hela細胞與由CD4、或者CD4ζ、或者CD4(D1-D4)IgCD7感染的Hela細胞共同培養(yǎng)，所述的vPE16編碼HIV-1包膜糖蛋白(Earletal.，病毒學雜志(J.Virol)642448(1990))。在無血清培養(yǎng)基中，以大約為10的感染復數(shù)(MOI)，對6cm培養(yǎng)皿中的50％融合的Hela細胞(ATCC，Rockville，MD)感染1小時，將該細胞在完全培養(yǎng)基中再孵育5-6小時，然后用含有1mMEDTA的磷酸緩沖液(PBS)將其從培養(yǎng)基分離。以1∶1的比率混合表達包膜的細胞和CD4嵌合體的細胞，并用完全培養(yǎng)基置換6cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基。共培養(yǎng)后6-8小時，計數(shù)合胞體并拍照。CD4和vPE16的其培養(yǎng)導致易于檢測的多核巨細胞的形成。而且，由CD4的細胞外的區(qū)域與TCR的ζ鏈融合形成的嵌合體(圖27)(CD4ζ)也能介導合胞體的形成，而表達CD4(D1-D4)IgCD7的細胞卻未示出任何細胞融合的跡象。因為在另一篇文章中已表明，CD4的氨基末端的兩個區(qū)域?qū)τ诒籋IV的感染是必需的(Landanetal.，自然334159(1988))，我們對僅表達CD4的第一和第二區(qū)域的構(gòu)建體(圖24)CD4(D1、D2)IgCD7(圖20，分子“B”)做了試驗。該分子也被證明對HIV-誘導的合胞體的形成無易感性。結(jié)合用可溶性125I-標記的gp120所做的研究得出結(jié)論CD4(D1-D4)IgCD7和CD4(D1、D2)IgCD7兩者對gp120有強的親和性。接下來我們進行的測定是，如果嵌合分子具有如本文所述的引發(fā)部分，抗合胞體形成的嵌合體分子是否能使細胞的殺傷作用改向，我們將ζ鏈的細胞內(nèi)區(qū)域(圖27)與CD4(D1-D4)IgCD7的3′末端及CD4(D1、D2)IgCD7的3′末端融合，制備了相應的重組痘苗病毒。這些構(gòu)建體CD4(D1-D4)IgCD7ζ和CD4(D1、D2)IgCD7ζ(圖20，分子“C”和“D”)在人CTL克隆WH3中表達，對其靶定向和殺傷表達HIV的表面包膜糖層白的Hela細胞的能力進行了測試(使用本文所述的方法)。圖21顯示，ζ鏈的細胞內(nèi)區(qū)無論與CD4(D1-D4)IgCD7還是與CD4(D1、D2)IgCD7融合，都具有殺傷能力；缺乏ζ鏈的構(gòu)建體卻不能介導該活性。與CD4(D1-D4)IgCD7ζ(圖21)相比，CD4ζ(陽性對照)介導的細胞毒性效力稍強，而CD4(D1、D2)IgCD7ζ的效力卻低些。然而，已明確的是，CD4(D1-D4)IgCD7ζ和CD4(D1、D2)IgCD7ζ兩種嵌合體都能介導在其表面表達HIV包膜蛋白的細胞特異的殺傷作用。在痘苗基的試驗中，這些四分嵌合體卻一直不能介導合胞體的形成。我們也已經(jīng)證明了，圖11A所示的那類單個的ζ基元是足以賦予CD4(D1-D4)嵌合體的細胞溶解活性。放射免疫沉降實驗表明，融合分子如果不全部是二聚體的話，其絕大部分是二聚體。在這些實驗中，用蛋白質(zhì)-A瓊脂糖珠來免疫沉降代謝標記的Hela細胞的溶解性抽提物，所述Hela細胞是用表達CD4(D1-D4)IgCD7ζ和CD4(D1、D2)IgCD7ζ嵌合體感染過的。在還原和非還原條件下，對經(jīng)免疫沉降所得的物質(zhì)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳以使之進行分級分離。具體言之，如上所述，以適當?shù)呐６徊《举A備液，使大約5×106個Hela-S3細胞被上述的vPE16感染。在半胱氨酸和甲硫氨酸缺乏的培養(yǎng)基中，以200μCi/ml的Tran35S-Label(ICNRadiochemicals，Irvine，CA)對細胞進行代謝標記6-8小時，接著用含1mMEDTA的磷酸緩沖液(PBS)自培養(yǎng)基分離。隨后沉降細胞并使之在150mMNaCl、50mMTris(pH7.5)、5mMEDTA、0.5％NP-40、0.1％SDS、5mMEDTA、1mMPMSF中裂解。離心去除細胞核后，在4℃，使各細胞提取液的五分之一在洗滌過的結(jié)合蛋白質(zhì)-A的瓊脂糖珠上吸附2小時。接著，用含1％NP-40的PBS洗滌上述瓊脂糖珠，并在有或沒有巰基乙醇存在的條件下，以含SDS的樣品緩沖液對之進行洗脫。這些實驗的結(jié)果表明，在非還原條件下，免疫沉降得的CD4(D1-D4)IgCD7ζ和CD4(D1、D2)IgCD7ζ嵌合體的絕大部分以有著預期分子量的二聚體形式存在。為直接評估表達CD4融合分子的細胞支持HIV感染的能力，我們對表達CD4(D1-D4)IgCD7和CD4(D1、D2)IgCD7的轉(zhuǎn)染子進行了長期感染性研究。在293細胞亞系中制備了CD4(D1-D4)IgCD7、CD4(D1、D2)IgCD7和CD4的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子，所述293細胞亞系是易被感染的人胚腎原細胞系。將嵌合分子亞克隆到雙向載體中，在該載體中，濕霉素(hygromycin)B基因由單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子驅(qū)動。通過磷酸鈣共沉降法，用10μg的該質(zhì)粒DNA對60-70％融合的10cm培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前，在唯一的SfiI位點使質(zhì)粒線性化，末端用T4DNA聚合酶補平。轉(zhuǎn)染后24小時時，細胞分裂了兩次，在轉(zhuǎn)染后48小時時，將細胞置于400μg/ml的濕霉素B(Sigma，St.Louis，Mo)中進行選擇。每3-4天，給細胞換用含有濕霉素的新鮮培養(yǎng)基。挑選出抗性克隆，擴增之，使用熒光素-結(jié)合的抗-人IgGFc(OrganonTeknika，WestChester，PA)或Q4120(與人的GD4(Sigma)起反應的抗體)，利用間接免疫熒光法估測其表達，然后進行流式細胞術(shù)測定(Coulter，Hialeah，F(xiàn)L)。選擇兩個獨立的克隆進行分析，每一克隆內(nèi)的構(gòu)建體具有的細胞表面CD4的量的水平可與其它細胞系所顯示的量的水平相比。圖22表明，暴露于HIV后，早在感染后第3天就可在CD4穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子的培養(yǎng)物中檢測到了P24。在這些培養(yǎng)物中，而多核巨細胞及特征性的膨脹(ballooning)則早在感染后第5天明顯出現(xiàn)。在培養(yǎng)32天之后，既沒在未轉(zhuǎn)染的親代細胞系中，也沒在2個獨立衍生的轉(zhuǎn)染子的分離物(CD4(D1-D4)IgCD7和CD4(D1、D2)IgCD7)中檢測到顯著的P24水平及多核巨細胞的存在(圖22)。侵染性研究完成后，對細胞進行細胞表面CD4表達的分析。在受感染的表達CD4的培養(yǎng)物中，CD4表面決定簇的密度明顯降低，這與病毒的下向-調(diào)節(jié)作用一致，但在表達CD4(D1-D4)IgCD7和CD4(D1、D2)IgCD7的培養(yǎng)物中，決定族的密度不受影響。這些實驗說明構(gòu)建帶有CD4的兩個頂端區(qū)域的嵌合分子是可能的，當這些分子與T細胞受體ζ鏈融合時，具有靶定向和殺傷HIV-感染的細胞的能力，但是都不支持CD4-介導的HIV感染。另外的實驗提示，是在CD4分子的細胞外區(qū)與雙脂層分子膜之間的自然距離賦予了抗HIV感染的能力。在第一個實驗中，我們構(gòu)建帶有CD7莖缺失和跨膜區(qū)缺失的嵌合分子；所述缺失去掉了CD7跨膜部分的脯氨酸富集區(qū)。當所述的嵌合區(qū)與CD4分子的細胞外區(qū)融合時，它仍保留了有效地錨定CD4分子的細胞外區(qū)的能力，這正如細胞表面CD4分子的表達所測得的一樣(如本文所述)。然而，抗由HIV包膜糖蛋白誘導的形成合胞體的能力卻喪失了。因此，CD7分子的脯氨酸富集區(qū)(可能形成α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū))的缺失，有效地縮短了CD4的細胞外區(qū)與脂雙層分子膜間的距離，就使嵌合體抗合胞體形成的能力喪失了。在第二個實驗中，我們證明了抗HIV-誘導的合胞體形成的能力可能是通過CD4/CD5嵌合體賦予的，據(jù)以前的報道，CD4/CD5嵌合體用作CD4細胞外區(qū)的跨膜錨，但它不具有抗HIV-誘導的合胞體形成的能力。在本實驗中，將人IgG1重鏈的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)插入到CD4/CD5分子中；所得的嵌合體可抵抗合胞體的形成，再次提示由免疫球蛋白的區(qū)域提供的距離足以使細胞抵抗HIV-誘導的合胞體的形成。在第三個實驗中，使用合成的不同長度的α螺旋，使CD4區(qū)域與細胞膜間延伸至不同的距離。具體來講即是，設(shè)計代表了賴氨酸和谷氨酸殘基重復的α螺旋基元的寡聚核苷酸，所述基元的側(cè)部為2個丙氨酸殘基(關(guān)于一級核酸序列和氨基酸序列，參見圖28)。在以前的研究中，發(fā)現(xiàn)在α螺旋產(chǎn)生這樣的氨基酸序列有很高的頻率，這提示如此重復的基元會形成α螺旋的構(gòu)象，將這樣的α螺旋置于跨膜區(qū)和CD4的細胞外區(qū)之間，會使CD4遠遠地伸出細胞膜外。通過改變α螺旋片段的長度，基于α螺旋升轉(zhuǎn)(riseandturn)的已知的數(shù)值，確定了抗HIV侵入所必需的伸出距離的計算值。這些結(jié)果列于表1表1</tables>a合胞體數(shù)目或者表達thy-1的細胞數(shù)目明顯減少。在該表中，除非有另外的說明，“CD4”代表CD4(D1-D4)，“H”、“CH2”、和“CH3”分別代表人IgG1重鏈的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)；“CD7tm和stk”代表CD7跨膜區(qū)和莖區(qū)；“CD7tm長型”和“CD7tm短型”分別代表CD7跨膜區(qū)和缺失了脯氨酸富集區(qū)(如上文所討論的)CD7跨膜區(qū)；“CD5tm”代表CD5跨膜區(qū)；及“CD34tm”代表CD34跨膜區(qū)。J-L欄內(nèi)，α螺旋區(qū)的長度以埃(A)表示；這些數(shù)據(jù)基于這樣的事實，即每一圈α螺旋內(nèi)有3.6個殘基，相當于5.4埃(或每個殘基相當于1.5埃)。因此，16個殘基的α螺旋將伸出CD4的細胞外的區(qū)域24埃。將Bsty1片段在該片段獨一的BamH1位點連續(xù)地連環(huán)化(參見圖28)，接著進行適宜的定向和克隆選擇，來構(gòu)建48埃和72埃的α螺旋。在共培養(yǎng)試驗中，用表達來自牛痘病毒vPE-16構(gòu)建體的HIV-1包膜糖蛋白的Hela細胞，計數(shù)合胞體的形成(參見上文)。如下進行Thy-1表達的測定。在HIV-1的hxb.2克隆的基礎(chǔ)上構(gòu)建活的逆病毒載體。在該載體中，大鼠的thy-1編碼序列取代了非必需的nef基因，所述的thy-1為在細胞表面有效表達的分子，它通過磷脂?；?肌醇間的連接被錨定在細胞膜上。來自該分子克隆的病毒(被命名為hxb/thy-1)，通過其細胞病理學的作用及在受感染的C8166細胞(人CD4+白血癥T-細胞系)的培養(yǎng)上清液所產(chǎn)生的P24，證明了它是有感染活性的。另外，暴露于hxb/thy-1后，Hela細胞立即被CD4轉(zhuǎn)染，早在感染后的18個小時時即顯示出thy-1表達的跡象，正如以nef-樣的方式被調(diào)控的信使所預期的一樣。由nef基因編碼的信使通常歸入病毒調(diào)控蛋白類，所述蛋白質(zhì)經(jīng)多次拼接，失去了逆(rev)-應答元件。作為早期病毒基因的產(chǎn)物，這些信使可在胞質(zhì)中組成性地積累。估計thy-1信使亦被類似地調(diào)控，也就是說，這些信使在病毒生活周期的早期產(chǎn)生。簡言之，該系統(tǒng)有助于檢測HIV侵入，將thy-1的表達作為病毒的侵入的替代。用標準的DEAE-葡聚糖方法，將各種不同的基于CD4的嵌合體很快轉(zhuǎn)染到Hela細胞中。在轉(zhuǎn)染后48小時的時候，使受轉(zhuǎn)染的細胞暴露于hxb/thy-1病毒，計數(shù)轉(zhuǎn)染后24-48小時的thy-1的表達。表1所示的結(jié)果中，在感染后24小時，thy-1表達的結(jié)果是用市售的Thy-1單克隆抗體測定的。從表1所列的數(shù)據(jù)，我們得出結(jié)論，CD4的細胞外的區(qū)域應伸出細胞膜至少48埃，優(yōu)選則伸出細胞膜至少72埃，以抵抗HIV-1的感染。用類似于本文所述的總體策略，可構(gòu)建基于抗-HIV包膜抗體的嵌合體，該嵌合體以HIV感染的細胞為目標靶。這種抗體的例子描述于Gorny等的美國國家科學進展861624(1989)和Marasco等的臨床研究雜志(J.ClinInvest)901467(1992)。實施例XI將伸出的CD4分子用作HIV的誘餌正如本文所示明的，帶有伸出細胞表面以外的CD4區(qū)域的細胞可抵抗HIV的感染。因此，這樣的帶CD4的細胞可用作誘餌來結(jié)合循環(huán)系統(tǒng)中的HIV，降低HIV感染的個體內(nèi)的病毒效價。CD4區(qū)優(yōu)選存在于能自然地通過淋巴結(jié)的細胞；有用的宿主細胞包括在免疫細胞清除中起作用的任何細胞，以及天然存在于淋巴結(jié)濾泡中的其它任何細胞。具體的例子包括(但不限于)巨噬細胞、T細胞(例如，輔助T細胞)、B細胞、噬中性白細胞、樹狀細胞、及濾泡樹狀細胞。任何能結(jié)合HIV的CD4區(qū)域，包括本文所述的D1-D4和D1、D2區(qū)域，均可用于本發(fā)明的方法。至少對于某些實施方案來說(例如，上面所述的那些)，嵌合體的細胞內(nèi)和/或跨膜區(qū)部分可選自任何蛋白質(zhì)或任何氨基酸序列。實施例XII另外的T細胞受體和B細胞受體的引發(fā)蛋白質(zhì)根據(jù)本發(fā)明，其它的細胞內(nèi)和跨膜信號傳導區(qū)域可來自T細胞受體蛋白質(zhì)CD3δ和T3γ、以及B細胞受體蛋白質(zhì)mb1和B29。這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于圖16(CD3δ；SEQIDNO24)、圖17(T3γ；SEQIDNO25)、圖18(mb1；SEQIDNO26)、和圖19(B29；SEQIDNO27)。足以引起細胞溶解信號傳導的序列部分(并因此被優(yōu)選包括在本發(fā)明的嵌合受體中)標示于括弧中。包括這些蛋白質(zhì)區(qū)域的嵌合受體被構(gòu)建并用于本發(fā)明的治療方法中，如按上文所述。實施例XIII實驗方法牛痘感染和放射免疫沉降以至少為10的感染復數(shù)(moi)(在CV1細胞上測效價)，在無血清DME培養(yǎng)基中，用重組的牛痘對大約5×106個CV1細胞感染1小時。感染后給細胞更換新鮮的培養(yǎng)基，在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM(Gibco；GrandIsland，NY)中，用每ml35S-甲硫氨酸和半胱氨酸200μCi(Tran35S-標記.ICV；CostoMesaCA)的量對細胞進行6小時的代謝標記。用含有1mMEDTA的PBS將標記的細胞去附著，離心收集細胞，并使之在1％NP-40、0.1％SDS、0.15MNaCl、0.05MTris(pH8.0)、5mMEDTA、和1mMPMSF中裂解。離心去細胞核，用OKTA抗體和抗-鼠IgG瓊脂糖(Cappel，Durham，NC)對CD4蛋白質(zhì)進行免疫沉降。使樣品在非還原條件(NR)和還原條件(R)下，電泳通過8％的聚丙烯酰胺/SDS凝膠。在放射自顯影前，用En3Hance(NewEnglandNuclear，Bosten，MA)使含有35S-標記的樣品的凝膠飽和。通過比較跨膜型的CD16(CD16TM)在僅用CD16Tm感染的CV1細胞中的表達和在用編碼CD16TM的病毒以及ζ或γ嵌合體共感染的細胞內(nèi)的表達來測量CD16TM的易化表達。感染并孵育6個小時或更長的時間后，用PBM、1mMEDTA將細胞從培養(yǎng)板中脫附，通過間接免疫熒光和流式細胞術(shù)測量CD16Tm或嵌合體的表達。鈣通量試驗在無血清的IMDM中，以10的感染復數(shù)，用重組的牛痘病毒對Jurkat亞系E6(Weissetal.，免疫學雜志133123-129(1984)細胞感染1小時，并使細胞在IMDM、10％FBS中孵育3-9小時，離心收集細胞，并以3×106個細胞/ml的密度將細胞重懸于含1mMIndo-1乙酰甲氧基酯的完全培養(yǎng)基中(Grynkiewiczetal.，生物化學雜志2603340-3450(1985))(分子探針)，并使之于37℃孵育45分鐘。分離負載了Indo-1的細胞，并使之以1×106/ml的量重新懸浮于不含血清的IMDM培養(yǎng)基中，并于室溫下避光貯存。用流式細胞計數(shù)術(shù)同時測量細胞所發(fā)出的紫色和藍色熒光，來分析細胞的游離鈣離子(Rabinovitchetal.，免疫學雜志137952-961(1986))。為啟始鈣的流動，可將藻紅蛋白(PE)-連結(jié)的Leu-3A(抗-CD4)(BectonDickinson，LincolnPark，NJ)以1μg/ml的量加入到細胞懸浮液中，接著在0時以10μg/ml的量加入非結(jié)合的羊抗-鼠IgG，或者以1μg/ml的量將非結(jié)合的3G8(抗-CD16)單克隆抗體加入到細胞懸液中，然后在0時以10μg/ml的量加入PE-結(jié)合的Fab2′羊抗-鼠IgG。自PE陽性(感染的)細胞群中收集發(fā)出的紫色熒光/藍色熒光的比值的直方圖(數(shù)據(jù))，所述的陽性細胞通常占所有細胞的40-80％。在未發(fā)生交聯(lián)的情況下，抗體OKT3引發(fā)了在未被感染的細胞內(nèi)的T細胞抗原受體的應答。對于涉及CD16嵌合受體的實驗，將基線移向較低的細胞內(nèi)鈣量(無抗體)方向的樣品排除在分析之外。接著用WriteHandMan(CooperCity，F(xiàn)L)軟件將二分數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ASCII碼，然后借助于FORTRAN程序?qū)χ狈綀D的數(shù)據(jù)進行分析。在加入第二抗體試劑之前的紫/藍發(fā)光比率用于建立正常的起始比率，將之定為標準單位，而設(shè)立的靜止期的閥值比率則定為使10％的靜止細胞群超過閥值。細胞溶解試驗將人T細胞系WH3(CD8+CD4-HLAB44限制性的細胞溶解細胞系)維持于IMDM、10％的含100μ/mlIL-2的人血清中，并用輻照過的(3000rad)HLA-未匹配的外周血淋巴細胞對之進行非特異性的周期性刺激，或者用輻照過的帶有B44的單核細胞對之進行特異性的周期性刺激。非特異性刺激一天之后，用新鮮的培養(yǎng)基將PHA稀釋成0.5μg/ml，3天后，更換培養(yǎng)基。在用于細胞毒性試驗之前，應使細胞在刺激后生長至少10天。在不含血清的培養(yǎng)基中，以至少為10的感染復數(shù)，用重組的痘苗感染細胞1小時，然后使細胞在完全培養(yǎng)基中孵育3小時。離心收獲細胞，并以1×107個細胞/ml的密度使之重新懸浮。將100μl加入到每孔均含有100μl的完全培養(yǎng)基的U-形底的微量滴定板的各孔中。對細胞進行倍比系列稀釋。各樣品有兩個孔不含淋巴細胞，從而使鉻自發(fā)釋放，并測總的鉻吸收。在6.0或10.cm的培養(yǎng)板中，用不含血清的培養(yǎng)基，以大約為10的感染復數(shù)，對來自Hela亞系S3的靶細胞進行感染1時，接著使細胞在完全培養(yǎng)基中孵育3小時。用PBS、1mMEDTA使其從培養(yǎng)皿上解脫下來并計數(shù)。離心106個靶細胞的一個等分部分(對于CD4嵌合受體實驗，是Hela、12aji或RJ2.2.5細胞，對于CD16嵌合受體實驗，是3G810-2細胞，Shenetal.，分子免疫學(Mol.Immunol)26959(1989))，并使細胞于37℃在間歇混合的情況下重新懸浮于50μl的無菌51Cr-鉻酸鈉(1mCi/ml，DuportWilmington，DE)中1小時，然后以PBS洗滌細胞3次。將標記的細胞以105個細胞/ml的量重新懸浮于培養(yǎng)基，每孔加100μl的該標記細胞。以標記Hela細胞同樣的方式標記Raji和RJ2.2.5靶細胞。使微滴定板以750xg的速度離心1分鐘，并在37℃下孵育4小時。在孵育結(jié)束時，通過溫和的吸抽(pipetting)使各孔內(nèi)的細胞重新懸浮，移出樣品以測定摻入的總數(shù)，并使微滴定板以750xg的速率離心1分鐘。取出100μl等分的上清液在γ射線閃爍計數(shù)器上計數(shù)。以流式細胞計數(shù)術(shù)測定的受感染的靶細胞的分數(shù)(通常為50-90％)來校正殺傷百分比。對于被感染的效應物細胞，以被感染的細胞的百分數(shù)(對于CD4嵌合受體實驗通常為20-50％，而對于D16嵌合受體實驗則通常為＞70％)來校正效應物靶細胞的比率。ζ序列的體外誘變?yōu)樵讦菩蛄械牡?1位和第15位氨基酸殘基處產(chǎn)生點突變，制備從ζ鏈跨膜區(qū)的上游的BamHI位點處延伸的合成性寡聚核苷酸引物，使天然ζ鏈的第11位殘基的Gys變成Gly(C11G)或第15位的Asp變成Gly(D15G)或都變成Gly(C11G/D15G)，并將之用于PCR反應中以產(chǎn)生突變的片段，所述的片段被重新插入到野生型CD4ζ構(gòu)建體中。為產(chǎn)生ζ鏈的缺失突變，使用在第50、59、或65位殘基后面設(shè)計成的終止密碼子(UAG)的合成性寡聚核苷酸引物，通過PCR技術(shù)來擴增ζcDNA序列。引物含有NotI酶切割位點，NotI切割產(chǎn)生含5個或6個殘基的5′端缺口，通常以CGCGGGCGGCCGCTA的序列形式存在(SEQIDNO11)，其中最后的3個堿基對應于終止密碼子。跟在NotI和終止密碼子序列的后面是與目的片段的3′末端互補的18個或更多的殘基。所得的嵌合體被分別定名為CD16ζY51*、CD16ζE60*和CD16ζD66*?？缒^(qū)的BamHI位點上游及NotI位點用于產(chǎn)生被重新導入到野生型CD16ζ構(gòu)建體的片段。通過BamHI和SacI對上文所述的Asp-和Cys-CD4ζ構(gòu)建體進行消化來釋放出ζ鏈的跨膜和細胞內(nèi)的近膜端的序列，并將該片段分別插入到CD16ζE60*和CD16ζD66*構(gòu)建體中，這樣就產(chǎn)生單體ζ嵌合體。CD167ζ(48-65)和CD167ζ(48-59)三嵌合體的構(gòu)建為制備CD16ζD66*構(gòu)建體，對應于膜區(qū)域及后面的細胞質(zhì)區(qū)域17個殘基的ζcDNA序列被來自CD5和CD7cDNA的相應的跨膜和胞質(zhì)區(qū)的序列取代。用正向寡聚核苷酸和反向寡聚核苷酸及含有SacI限制酶切割位點的ζ序列，通過PCR，來產(chǎn)生CD5和CD7片段。其中正向寡聚核苷酸含有有BamHI限制酶切割位點且分別對應于CD5和CD7的跨膜區(qū)上游而以下的反向寡聚核苷酸分別將CD5和CD7序列重疊。CD5ζCGCGGGCTCGTTATAGAGCTGGTTCTGGCGCTGCTTCTTCTG(SEQIDNO12)CD7ζCGCGGGGAGCTCGTTATAGAGCTGGTTTGCCGCCGAATTCTTATCCCG(SEQIDNO13)。用BamHI和SacI消化CD5和CD7PCR產(chǎn)物，并與BamHI和SaCI消化的CD16ζE60*連接起來，并用CD7片段取代ζ鏈中自BamHI至SacI間的序列。為制備CD16CD5和CD16CD7構(gòu)建體，以寡聚核苷酸，通過PCR來得到CD5和CD7片段。該寡聚核苷酸含有NotI限制酶切割位點和分別在CD5和CD7的Gln416、Ala193殘基之后的終止密碼子(UAA)。用BamHI和NotI消化該CD5和CD7片段并將之插入到CD16ζAsp66*構(gòu)建體中。ζ細胞溶解信號傳導基元內(nèi)的N-末端殘基的體外誘變?nèi)斯ず铣傻淖驭苹獌?nèi)的SacI位點延伸的寡聚核苷酸引物，使第48位的天然殘基從Asn轉(zhuǎn)變成Ser(N48S)、第50位的殘基從Leu變成Ser(L50S)及第51位的殘基從Tyr變成Phe(Y51F)，將之用于PCR反應，以產(chǎn)生可被重新導入到野生型CD167ζ(48-65)構(gòu)建體中的片段。ζ細胞溶解信號傳導基元內(nèi)的羧基(C)-末端殘基的體外誘變?nèi)斯ず铣傻墓丫酆塑账嵋?，NotI位點的3′延伸至終止密碼子，并使第60位的天然殘基從Glu變成GLn(E60Q)、第61位的殘基從Glu變成Gln(E61Q)、第62位的殘基從Tyr變成Phe或Ser(Y62F或Y62S)及第63位的殘基從Asp變成Asn(D63N)，將這類引物用于PCR反應，以產(chǎn)生可被亞克隆到野生型CD16ζD66*構(gòu)建體的BamHI位點和NotI位點之間的片段。CD167ζ(33-65)、CD167ζ(71-104)、CD167ζ(104-137)嵌合體的構(gòu)建使用序列為GGCGGGGCGGCCACGCGTCCTCGCCAGCACACA(SEQIDNO14)的寡聚核苷酸，利用PCR得到CD7跨膜片段，該跨膜片段帶有在跨膜和細胞內(nèi)區(qū)連結(jié)處的MluI和NotI位點。將所得的PCR片段用BamHI和NotI消化，并使之重新插入到CD167ζ(48-65)構(gòu)建體中。使用在正向引物的5′端含有MluI位點和終止密碼子的引物對，利用PCR得到編碼第33-65位殘基、第71-104位殘基、和第104-137位殘基的ζ片段。密碼子的后面是在反向引物5′端的NotI位點。每一限制位點自引物的5′末端有6個殘基的缺刻，以保證限制酶的切割。ζ33CGCGGGACGCGTTTCAGCCGTCCTCGCCAGCACACA(SEQIDNO15)；ζ71CGCGGGACGCGTGACCCTGAGATGGGGGGAAAG(SEQIDNO16)；andζ104CGCGGGACGCGTATTGGGATGAAAGGCGAGCGC(SEQIDNO17)。FcRγIIA缺失突變體的構(gòu)建利用PCR，以制備全長構(gòu)建體同樣的方式來構(gòu)建羧基末端FcRγIIA缺失的突變體，使在第282和298位的酪氨酸的編碼序列變成終止密碼子(TAA)。使用寡聚核苷酸，利用PCR通過擴增編碼漸小細胞內(nèi)區(qū)的片段，來產(chǎn)生氨基(N)-末端缺失突變體。所述的寡聚核苷酸可使所得的片段被插入到MluI和NotI限制性位點之間，即以前構(gòu)建的表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒編碼與CD7跨膜區(qū)融合的CD16細胞外區(qū)域。所述的CD7跨膜區(qū)終止于MluI位點和跨膜區(qū)與細胞內(nèi)區(qū)間的連結(jié)區(qū)。其它實施方案上述的實施例顯示ζ、η或γ嵌合體的聚集足以引起T細胞中的具有細胞溶解作用的效應器細胞的應答。已知的表達ζ、η或γ的細胞范圍(包括T淋巴細胞、天然殺傷細胞、嗜堿性粒細胞、巨噬細胞、和肥大細胞)提示保守序列基元可能與通常對造血器官細胞敏感的裝置發(fā)生相互作用，并且提示在免疫系統(tǒng)中，宿主防御的重要成分可能由受體聚集情況所介導。細胞溶解應答的潛能和不能對帶有II類MHC受體產(chǎn)生應答，這顯示基于ζ、η或γ的嵌合體形成(通過繼承性免疫療法)對AIDS的遺傳基因干涉的基礎(chǔ)。內(nèi)源性的ζ和γ的廣泛分布以及與γ相關(guān)的Fc受體介導不同細胞種類內(nèi)的細胞毒性的證據(jù)(Fangeretal.，今日免疫學1092-99(1989))使我們?yōu)榇四康目梢钥紤]許多種細胞。例如，嗜中性粒細胞是用于嵌合體表達的很有吸引力的靶細胞。該細胞在循環(huán)中的壽命極短(≈4小時)，且極易被溶解。以HIV對嗜中性粒細胞感染不可能引起病毒的釋放，這些細胞的大量存在(是白細胞中最多的細胞)會增強宿主防御。另外的引人注意的可能的宿主細胞是成熟T細胞-目前一個與逆病毒工程關(guān)系較近的細胞群體(Rosenbery，Sci.Am.(科學美國人)26262-69(1990))。在重組IL-2的幫助下，T細胞群可相對容易地在培養(yǎng)基中擴增，擴增后的群體當再融合時，具有典型的有限的壽命(Roserbergetal.N.Engl.J.Med(新英格蘭醫(yī)學期刊)，323570-578(1990))。在適當?shù)臈l件下，表達CD4嵌合體的細胞對HIV的識別也能產(chǎn)生促有絲分裂刺激物，使帶有嵌合體的細胞群可以動態(tài)地對病毒產(chǎn)生應答。雖然我們已針對在細胞溶解T淋巴細胞內(nèi)的融合蛋白質(zhì)的行為做了強調(diào)，但在輔助淋巴細胞內(nèi)的嵌合體的表達可能是HIV-起動的細胞因子的來源，所述的細胞因子能抵抗AIDS中的輔助細胞的裂解。最近對抗感染工程的幾個方案步驟的描述(而不是對病毒滲入的步驟)(Friedmanetal.，Nature(自然)335452-454(1988)；Greenetal.，Cell(細胞)58215-223(1989)；Malimetal.，Cell(細胞)58205-214(1989)；Tronoetal.，Cell(細胞)59113-120(1989)；Buonocoreetal.，Nature(自然)345625-628(1990))，提示可設(shè)計帶有CD4嵌合體的細胞來阻止病毒的產(chǎn)生，該嵌合細胞表達具有細胞內(nèi)作用位點的適當?shù)脑噭?。通過自主嵌合體將信號傳遞給T淋巴細胞的能力，也提供了調(diào)節(jié)體內(nèi)淋巴細胞的反轉(zhuǎn)錄病毒工程的能力。交聯(lián)刺激(例如由特異性IgM抗體介導的以除去補體-結(jié)合區(qū)的工程)可以使所述淋巴細胞在原位的數(shù)量增加，而同樣處理相似的特異性IgG抗體(例如識別工程化為嵌合鏈的氨基酸變異體)可選擇性地減少工程種群。另外，抗-CD4IgM抗體不需另外的交聯(lián)就可在表達CD4ζ嵌合體的Jurkat細胞中動員鈣。不需重復體外擴增就可調(diào)節(jié)細胞種群的能力實質(zhì)上可擴大基因工程T細胞目前的用途范圍和效力。盡管已與具體實施方案相結(jié)合描述了本發(fā)明，但應明白還可作進一步的修改，而且本申請旨在包括本發(fā)明的各種變異、用途或修改，并包括與本發(fā)明公開的內(nèi)容有所偏離的部分，只要它們在本發(fā)明所屬的領(lǐng)域內(nèi)，或具有本發(fā)明前述的及后附的權(quán)利要求的基本特征，即可被應用。序列表(1)一般資料(i)申請人Seed，Brianetal.(ii)發(fā)明題目用帶嵌合CD4受體的細胞定位溶解HIV-感染的細胞(iii)序列數(shù)52(iv)相關(guān)地址(A)收件人Fish&amp;RichardsonP.C.(B)街道225FranklinStreet(C)城市波士頓(D)州馬薩諸薩(E)國家美國(F)郵編02110-2804(V)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5″盤，1.44Mb(B)計算機IBMPS/2Model50Zor55SX(C)操作系統(tǒng)IBMP.C.DOS(Version3.30)(D)軟件Wordperfect(Version5.0)(vi)當前申請資料(A)申請?zhí)?8/394，388(B)申請日February24，1995(vii)當前申請資料(A)申請?zhí)?8/284，391(B)申請日1994年8月2日(vii)當前申請資料(A)申請?zhí)?8/195，395(B)申請日1994年2月14日(vii)當前申請資料(A)申請?zhí)?7/847，566(B)申請日1992年3月6日(viii)代理人/代理資料(A)姓名KarenF.Lech，Ph.D(B)登記號35，238(C)文獻/文檔號00786/272001(ix)電訊資料(A)電話(617)542-5070(B)電傳(617)542-8906(C)傳真200154(2)SEQIDNO1的資料(i)序列特征(A)長度1728個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO1ATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGC50GCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAAACAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAG100GGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAA150TTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTC200CTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAA250GAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAG300ATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGA350GGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGC400TTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGC450CCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATACAGGGGGGGAA500GACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACAT550GCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTG600GTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGA650ACAGGTGGAGTTCTCCTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGG700GCAGTGGCGAGCTGTGGTGGCAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCT750TGGATCACCTTTGACCTGAAGAACAAGGAAGTGTCTGTAAAACGGGTTAC800CCAGGACCCTAAGCTCCAGATGGGCAAGAAGCTCCCGCTCCACCTCACCC850TGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCC900CTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTGGTGGTGAT950GAGAGCCACTCAGCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCA1000CCTCCCCTAAGCTGATGCTGAGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAG1050GTCTCGAAGCGGGAGAAGCCGGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGAT1100GTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACA1150TCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCACGCGGATCCCAAACTC1200TGCTACTTGCTAGATGGAATCCTCTTCATCTACGGAGTCATCATCACAGC1250CCTGTACCTGAGAGCAAAATTCAGCAGGAGTGCAGAGACTGCTGCCAACC1300TGCAGGACCCCAACCAGCTCTACAATGAGCTCAATCTAGGGCGAAGAGAG1350GAATATGACGTCTTGGAGAAGAAGCGGGCTCGGGATCCAGAGATGGGAGG1400CAAACAGCAGAGGAGGAGGAACCCCCAGGAAGGCGTATACAATGCACTGC1450AGAAAGACAAGATGCCAGAAGCCTACAGTGAGATCGGCACAAAAGGCGAG1500AGGCGGAGAGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGACAGCCACTTCCA1550AGCAGTGCAGTTCGGGAACAGAAGAGAGAGAGAAGGTTCAGAACTCACAA1600GGACCCTTGGGTTAAGAGCCCGCCCCAAAGGTGAAAGCACCCAGCAGAGT1650AGCCAATCCTGTGCCAGCGTCTTCAGCATCCCCACTCTGTGGAGTCCATG1700GCCACCCAGTAGCAGCTCCCAGCTCTAA1728(2)SEQIDNO2的資料(i)序列特征(A)長度1389個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO2ATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGC50GCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAAACAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAG100GGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAA150TTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTC200CTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAA250GAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAG300ATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGA350GGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGC400TTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGC450CCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATACAGGGGGGGAA500GACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACAT550GCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTG600GTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGA650ACAGGTGGAGTTCTCCTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGG700GCAGTGGCGAGCTGTGGTGGCAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCT750TGGATCACCTTTGACCTGAAGAACAAGGAAGTGTCTGTAAAACGGGTTAC800CCAGGACCCTAAGCTCCAGATGGGCAAGAAGCTCCCGCTCCACCTCACCC850TGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCC900CTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTGGTGGTGAT950GAGAGCCACTCAGCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCA1000CCTCCCCTAAGCTGATGCTGAGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAG1050GTCTCGAAGCGGGAGAAGCCGGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGAT1100GTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACA1150TCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCACGCGGATCCGCAGCTC1200TGCTATATCCTGGATGCCATCCTGTTTTTGTATGGTATTGTCCTTACCCT1250GCTCTACTGTCGACTCAAGATCCAGGTCCGAAAGGCAGACATAGCCAGCC1300GTGAGAAATCAGATGCTGTCTACACGGGCCTGAACACCCGGAACCAGGAG1350ACATATGAGACTCTGAAACATGAGAAACCACCCCAATAG1389(2)SEQIDNO3的資料(i)序列特征(A)長度1599個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO3ATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGC50GCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAAACAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAG100GGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAA150TTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTC200CTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAA250GAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAG300ATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGA350GGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGC400TTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGC450CCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATACAAAAACATAC500GACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACAT550GCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTG600GTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGA650ACAGGTGGAGTTCTCCTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTG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GluLysProValTrpValLeuAsnProGluAlaGlyMetTrp355360365GlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeuGluSerAsnIle370375380LysValLeuProThrTrpSerThrProValHisAlaAspPro385390395(2)SEQIDNO30的資料(i)序列特征(A)長度719(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核酸(xi)序列描述SEQIDNO30GCCTGTTTGAGAAGCAGCGGGCAAGAAAGACGCAAGCCCAGAGGCCCTGC50CATTTCTGTGGGCTCAGGTCCCTACTGGCTCAGGCCCCTGCCTCCCTCGG100CAAGGCCACAATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGC150TGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAAACAAAGTGGTGCTG200GGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAA250GAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAA300ATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCT350GACTCAAGAAGAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATCATCAA400GAATCTTAAGATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACC450AGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGAC500ACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGAGCCCCCC550TGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATAC600AGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGC650ACCTGGACATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAAAT700AGACATCGTGGTGCTAGCT719(2)SEQIDNO31的資料(i)序列特征(A)長度203(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型氨基酸(xi)序列描述SEQIDNO31MetAsnArgGlyValProPheArgHisLeuLeuLeuValLeuGlnLeu51015AlaLeuLeuProAlaAlaThrGlnGlyAsnLysValValLeuGlyLys202530LyeGlyAspThrValGluLeuThrCysThrAlaSerGlnLysLysSer354045IleGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGlnIleLysIleLeuGlyAsn505560GlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArgAla65707580AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheProLeuIleIle859095LysAsnLeuLysIleGluAspSerAspThrTyrIleCysGluValGlu100105110AspGlnLysGluGluValGlnLeuLeuValPheGlyLeuThrAlaAsn115120125SerAspThrHisLeuLeuGlnGlyGlnSerLeuThrLeuThrLeuGlu130135140SerProProGlySerSerProSerValGlnCysArgSerProArgGly145150155160LysAsnIleGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGlnLeuGluLeu165170175GlnAspSerGlyThrTrpThrCysThrValLeuGlnAsnGlnLysLys180185190ValGluPheLysIleAspIleValValLeuAla195200(2)SEQIDNO32的資料(i)序列特征(A)長度768(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核酸(xi)序列描述SEQIDNO32GCTAGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCC50CAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA100CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT150GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG200ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC250AACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTG300GCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAG350CCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA400CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGT450CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG500AGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC550GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA600CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG650AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGG700CTGCAACTGGACGAGACCTGTGCTGAGGCCCAGGACGGGGAGCTGGACGG750GCTCTGGACGACGGATCC768(2)SEQIDNO33的資料(i)序列特征(A)長度254(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型氨基酸(xi)序列描述SEQIDNO33GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAla151015ProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysPro202530LysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValVal354045ValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrVal505560AspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGln65707580TyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGln859095AspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAla100105110LeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnPro115120125ArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThr130135140LysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSer145150155160AspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyr165170175LysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyr180185190SerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPhe195200205SerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLys210215220SerLeuSerLeuSerProGlyLeuGlnLeuAspGluThrCysAlaGlu225230235240AlaGlnAspGlyGluLeuAspGlyLeuTrpThrThrAspPro245250(2)SEQIDNO34的資料(i)序列特征(A)長度174(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核酸(xi)序列描述SEQIDNO34CCAAGGGCCTCTGCCCTCCCTGCCCCACCGACAGGCTCCGCCCTCCCTGA50CCCGCAGACAGCCTCTGCCCTCCCTGACCCGCCAGCAGCCTCTGCCCTCC100CTGCGGCCCTGGCGGTGATCTCCTTCCTCCTCGGGCTGGGCCTGGGGGTG150GCGTGTGTGCTGGCGAGGACGCGT174(2)SEQIDNO35的資料(i)序列特征(A)長度58(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型氨基酸(xi)序列描述SEQIDNO35ProArgAlaSerAlaLeuProAlaProProThrGlySerAlaLeuPro151015AspProGlnThrAlaSerAlaLeuProAspProProAlaAlaSerAla202530LeuProAlaAlaLeuAlaValIleSerPheLeuLeuGlyLeuGlyLeu354045GlyValAlaCysValLeuAlaArgThrArg5055(2)SEQIDNO36的資料(i)序列特征(A)長度345(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核酸(xi)序列描述SEQIDNO36ACGCGTTTCAGCAGGAGCGCAGAGCCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAA50CCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT100TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGG150AAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGC200GGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGG250GGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTAC300GACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAGCGGCCGC345(2)SEQIDNO37的資料(i)序列特征(A)長度111(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型氨基酸(xi)序列描述SEQIDNO37ThrArgPheSerArgSerAlaGluProProAlaTyrGlnGlnGlyGln151015AsnGlnLeuTyrAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluTyrAsp202530ValLeuAspLysArgArgGlyArgAspProGluMetGlyGlyLysPro354045ArgArgLysAsnProGlnGluGlyLeuTyrAsnGluLeuGlnLysAsp505560LysMetAlaGluAlaTyrSerGluIleGlyMetLysGlyGluArgArg65707580ArgGlyLysGlyHisAspGlyLeuTyrGlnGlyLeuSerThrAlaThr859095LysAspThrTyrAspAlaLeuHisMetGlnAlaLeuProProArg100105110(2)SEQIDNO38的資料(i)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO38GlnSerPheGlyLeuLeuAspProLysLeuCysTyrLeuLeuAspGly151015(2)SEQIDNO39的資料(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO39ProThrTrpSerThrProValHisAlaAspProLysLeuCysTyrLeu151015LeuAspGly(2)SEQIDNO40的資料(i)序列特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO40LeuGlyGluProGlnLeuCysTyrIleLeuAspAla1510(2)SEQIDNO41的資料(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO41ProThrTrpSerThrProValHisAlaAspProGlnLeuCysTyrIle151015LeuAspAla(2)SEQIDNO42的資料(i)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO42GlnSerPheGlyLeuLeuAspProLysLeuCysTyrLeuLeuAspGly151015(2)SEQIDNO43的資料(i)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO43PheSerProProGlyAlaAspProLysLeuCysTyrLeuLeuAspGly151015(2)SEQIDNO44的資料(i)序列特征(A)長度142個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO44GlnSerPheGlyLeuLeuAspProLysLeuCysTyrLeuLeuAspGly151015IleLeuPheIleTyrGlyValIleLeuThrAlaLeuPheLeuArgVal202530LysPheSerArgSerAlaGluProProAlaTyrGlnGlnGlyGlnAsn354045GlnLeuTyrAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluTyrAspVal505560LeuAspLysArgArgGlyArgAspProGluMetGlyGlyLysProArg65707580ArgLysAsnProGlnGluGlyLeuTyrAsnGluLeuGlnLysAspLys859095MetAlaGluAlaTyrSerGluIleGlyMetLysGlyGluArgArgArg100105110GlyLysGlyHisAspGlyLeuTyrGlnGlyLeuSerThrAlaThrLys115120125AspThrTyrAspAlaLeuHisMetGlnAlaLeuProProArg130135140(2)SEQIDNO45的資料(i)序列特征(A)長度35個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO45ArgValLysPheSerArgSerAlaGluProProAlaTyrGlnGlnGly151015GlnAsnGlnLeuTyrAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluTyr202530AspValLeu35(2)SEQIDNO46的資料(i)序列特征(A)長度32個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO46LysLysLeuValLysLysPheArgGlnLysLysGlnArgGlnAsnGln151015LeuTyrAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluTyrAspValLeu202530(2)SEQIDNO47的資料(i)序列特征(A)長度35個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO47ArgThrGlnIleLysLysLeuCysSerTrpArgAspLysAsnSerAla151015AlaAsnGlnLeuTyrAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluTyr202530AspValLeu35(2)SEQIDNO48的資料(i)序列特征(A)長度35個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO48ArgThrArgPheSerArgSerAlaGluProProAlaTyrGlnGlnGly151015GlnAsnGlnLeuTyrAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluTyr202530AspValLeu35(2)SEQIDNO49的資料(i)序列特征(A)長度36個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO49ArgThrArgAspProGluMetGlyGlyLysProArgArgLysAsnPro151015GlnGluGlyLeuTyrAsnGluLeuGlnLysAspLysMetAlaGluAla202530TyrSerGluIle35(2)SEQIDNO50的資料(i)序列特征(A)長度38個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO50ArgThrArgIleGlyMetLysGlyGluArgArgArgGlyLysGlyHis151015AspGlyLeuTyrGlnGlyLeuSerThrAlaThrLysAspThrTyrAsp202530AlaLeuHisMetGlnAla35(2)SEQIDNO51的資料(i)序列特征(A)長度63個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因(xi)序列描述SEQIDNO51GGATCCCAAGGCCAGGCTAAAGCCGAAGCCGCGAAGGCCGAGGCTAAGGCCGAAGCAGAT60CTG63(2)SEQIDNO52的資料(i)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無關(guān)(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO52AspProLysAlaGluAlaLysAlaGluAlaLysAlaGluAlaLysAla151015GluAlaAspLeu20權(quán)利要求1.一種治療哺乳動物HIV的方法，所述方法包括給所述哺乳動物施用有效量的治療細胞，所述治療細胞表達含細胞外部分的膜結(jié)合的蛋白質(zhì)嵌合受體，所述細胞外部分包含能夠特異性識別并結(jié)合所述HIV感染的細胞但不介導HIV感染的CD4片段。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述CD4片段由氨基酸1-394或氨基酸1-200組成。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述CD4片段通過圖26中所示的CD7跨膜區(qū)或圖25中所示的人IgG1分子的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)與細胞內(nèi)部分離。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述CD4片段與所述治療細胞膜相距至少48?；蛑辽?2埃。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述受體包含CD7跨膜部分、CD5跨膜部分或CD34跨膜部分。6.權(quán)利要求1的方法，其中用一種或多種蛋白質(zhì)α螺旋將所述CD4片段與治療細胞膜分開。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述治療細胞選自T細胞、B細胞、嗜中性細胞、樹狀細胞或濾泡樹狀細胞。8.一種表達含細胞外部分的蛋白質(zhì)膜結(jié)合的嵌合受體的細胞，該細胞外部分包含能夠特異性識別并結(jié)合所述HIV感染的細胞但不介導HIV感染的CD4片段。9.權(quán)利要求8的細胞，其中所述CD4片段由氨基酸1-394或氨基酸1-200組成。10.權(quán)利要求8的細胞，其中所述CD4片段通過圖26中所示的CD7跨膜區(qū)或圖25中所示的人IgG1分子的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)與細胞內(nèi)部分離。11.權(quán)利要求8的細胞，其中所述CD4片段與所述治療細胞膜相距至少48?；蛑辽?2埃。12.權(quán)利要求8的細胞，其中所述受體包含CD7跨膜部分、CD5跨膜部分或CD34跨膜部分。13.權(quán)利要求8的細胞，其中所述CD4片段通過一個或多個蛋白質(zhì)α螺旋將所述CD4片段與所述細胞膜分開。14.權(quán)利要求8的細胞，其中所述細胞選自T細胞、B細胞、嗜中性細胞、樹狀細胞或濾泡樹狀細胞。15.一種含有細胞外部分的膜結(jié)合的蛋白質(zhì)嵌合受體，所述細胞外部分包含能夠特異性識別并結(jié)合所述HIV感染的細胞但不介導HIV感染的CD4片段。16.權(quán)利要求15的受體，其中所述CD4片段由氨基酸1-394或氨基酸1-200組成。17.權(quán)利要求15的受體，其中所述CD4片段通過圖26中所示的CD7跨膜區(qū)或圖25中所示的人IgG1分子的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)與細胞內(nèi)部分離。18.權(quán)利要求15的受體，其中所述CD4片段與所述宿主細胞膜相距至少48埃或至少72埃。19.權(quán)利要求15的受體，其中所述受體包含CD7跨膜部分、CD5跨膜部分或CD34跨膜部分。20.權(quán)利要求15的受體，其中用一種或多種蛋白質(zhì)α螺旋將所述CD4片段與宿主細胞膜分開。21.編碼含有細胞外部分的膜結(jié)合的蛋白質(zhì)嵌合受體的DNA，所述細胞外部分包含能夠特異性地識別并結(jié)合所述HIV感染的細胞但不介導HIV感染的CD4片段。22一種含有權(quán)利要求21嵌合受體DNA的載體。全文摘要本發(fā)明公開的是在哺乳動物中治療HIV的方法，包括給該哺乳動物施用有效量的表達膜結(jié)合的蛋白質(zhì)嵌合受體的治療細胞，所述受體含有一個細胞外部分，它包括能夠特異性識別并結(jié)合HIV-感染的細胞但不會介導HIV感染的CD4片段。還公開了表達這些CD4受體的細胞以及編碼所述受體的DNA和載體。文檔編號C07K19/00GK1158552SQ95195183公開日1997年9月3日申請日期1995年7月26日優(yōu)先權(quán)日1994年8月2日發(fā)明者布賴恩·錫德,巴巴克·巴納波爾,查爾斯·羅密歐,沃爾德馬·科拉納斯申請人:杰納勒爾醫(yī)療公司