肽導(dǎo)向的蛋白敲低的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】肽導(dǎo)向的蛋白敲低 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及可被用于調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白表達(dá)的重組核酸 和蛋白構(gòu)建體。具體地，本發(fā)明的方面涉及采用將靶向蛋白引導(dǎo)至溶酶體進(jìn)行降解的構(gòu)建 體的肽介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞蛋白的敲低（knockdown)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 用于改變內(nèi)源性蛋白的表達(dá)水平的快速和可逆的方法，不僅對(duì)于研宄復(fù)雜的生物 系統(tǒng)是不可或缺的工具，而且可以潛在地推動(dòng)許多疾病治療的新療法的研發(fā)。通過(guò)靶向DNA 或mRNA來(lái)操作蛋白表達(dá)和功能的技術(shù)已經(jīng)被證明是強(qiáng)大的工具，但通常被如缺乏特異性、 速度、可逆性和可調(diào)性的問(wèn)題困擾另外，它們的在治療人類(lèi)疾病中的治療用途可能被缺 乏有效的全身遞送系統(tǒng)所阻礙 2。
[0004] 為了克服基于DNA和mRNA的蛋白操作的缺點(diǎn)2,已經(jīng)嘗試?yán)茫╤arness)細(xì)胞蛋 白降解系統(tǒng)來(lái)降低感興趣的蛋白的水平3_6。這些建議的系統(tǒng)中許多要求蛋白的遺傳操作以 便于它們靶向和經(jīng)特異性細(xì)胞蛋白降解系統(tǒng)進(jìn)行降解、
[0005] 細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu)域（CMPDs)(也稱(chēng)作細(xì)胞穿透肽（CPPs)或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (PTDs))是介導(dǎo)穿過(guò)細(xì)胞膜的易位的蛋白結(jié)構(gòu)域，如來(lái)自HIV-1病毒的Tat蛋白和黑腹果蠅 (Drosophilamelanogaster)觸足（Antennapedia)同源結(jié)構(gòu)域（homeodomain)38'39'40。 [0006] 發(fā)明概述
[0007]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及基于肽的系統(tǒng)，其能夠通過(guò)采用內(nèi)源性溶酶體依賴(lài)的 自噬系統(tǒng)、分子伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA)產(chǎn)生非遺傳修飾的天然蛋白的快速和可逆的敲 低（圖la)。CMA是一類(lèi)導(dǎo)致底物蛋白以一個(gè)分子接著一個(gè)分子為基礎(chǔ)的選擇性攝取 的自噬作用。這種特異性是通過(guò)CMA-靶向信號(hào)（CTS)實(shí)現(xiàn)的，其在一些實(shí)例中可以涉 及五肽基序KFERQ。CTS對(duì)于誘導(dǎo)CMA是必須的，并被發(fā)現(xiàn)于迄今為止CMA的所有底物 蛋白中。為了將CMA用于靶蛋白降解，本發(fā)明的肽包含能夠特異性識(shí)別并結(jié)合至靶蛋 白的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域被融合至能夠?qū)㈦?蛋白復(fù)合體遞送進(jìn)入溶酶體進(jìn) 行降解的CTS。本發(fā)明的肽可以進(jìn)一步包含能夠?qū)㈦倪f送穿過(guò)質(zhì)膜的細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu) 域（CMPD)(如圖1中所示的實(shí)施例）。CMPD可以是HIV-lTat蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域， GRKKRRQRRRPPQ;黑腹果蠅觸足結(jié)構(gòu)域Antp(第43-58位氨基酸），RQIKWFQNRRMKWKK;抗 菌肽BuforinII，TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK;hClock-(第 35-47 位氨基酸）（人Clock 蛋白DNA結(jié)合肽），KRVSRNKSEKKRR;MAP(模型兩親肽），KLALKLALKALKAALKLA;K-FGF， AAVALLPAVLLALLAP;Ku70 衍生的肽，包含選自以下的肽：VPMLKE、VPMLK、PMLKE或PMLK;朊 病毒（Prion)，小鼠Prpe(第 1-28 位氨基酸），MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP;pVEC， LLIILRRRIRKQAHAHSK;P印-1，KETWWETffffTEWSQPKKKRKV;SynBl，RGGRLSYSRRRFSTSTGR;轉(zhuǎn)運(yùn) 素（Transportan)，GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL;轉(zhuǎn)運(yùn)素-10,AGYLLGKINLKALAALAKKIL; CADY，Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-半胱胺（cysteamide) ;P印-7,SDLWEMMMVSLACQY;HN-1， TSPLNIHNGQKL;VT5,DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD;pISL，RVIRVWFQNKRCKDKK;或任何其它 已知的CMTO。
[0008] 因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了敲低靶向肽組合物，其包含融合至蛋白結(jié) 合結(jié)構(gòu)域（PBD)的CMA-靶向信號(hào)（CTS)，其中所述蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域是能夠選擇性結(jié) 合至內(nèi)源性蛋白的多肽序列，從而在細(xì)胞環(huán)境中將所述敲低靶向肽與所述內(nèi)源性蛋白 的接觸會(huì)引起內(nèi)源性蛋白的溶酶體降解。所述靶向肽組合物可以進(jìn)一步包含細(xì)胞膜 穿透結(jié)構(gòu)域（CPMD)。CMPD可以是HIV-lTat蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，GRKKRRQRRRPPQ; 黑腹果蠅觸足結(jié)構(gòu)域Antp(第43-58位氨基酸），RQIKWFQNRRMKWKK;BuforinII， TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK;hClock-(第 35-47 位氨基酸）（人Clock蛋白DNA結(jié)合肽）， KRVSRNKSEKKRR;MAP(模型兩親肽），KLALKLALKALKAALKLA;K-FGF，AAVALLPAVLLALLAP; Ku70衍生的肽，包含選自以下的肽：VPMLKE、VPMLK、PMLKE或PMLK;骯病毒，小鼠Prpe(第 1-28 位氨基酸），MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP;pVEC，LLIILRRRIRKQAHAHSK; P印-1，KETWWETffffTEWSQPKKKRKV;SynBl，RGGRLSYSRRRFSTSTGR;轉(zhuǎn)運(yùn)素（Transportan)， GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL;轉(zhuǎn)運(yùn)素-10，AGYLLGKINLKALAALAKKIL;CADY， Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-半胱胺（cysteamide) ;Pep-7,SDLWEMMMVSLACQY;HN-1， TSPLNIHNGQKL;VT5,DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD;pISL，RVIRVWFQNKRCKDKK;或任何其它 已知的CMTO。
[0009] 因此，本發(fā)明提供了肽，其包含CMA-靶向信號(hào)結(jié)構(gòu)域、選擇性結(jié)合至靶蛋白的蛋 白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述靶蛋白是內(nèi)源性靶蛋 白。在另一個(gè)方面，所述肽是被全身施用至動(dòng)物，以降低內(nèi)源性靶蛋白的細(xì)胞表達(dá)水平。
[0010] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于在體外或體內(nèi)降低有需要的動(dòng)物中靶蛋白的 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的方法。當(dāng)被體外使用時(shí)，所述方法包括靶蛋白和包含CTS結(jié)構(gòu)域和選擇 性結(jié)合至靶蛋白的PBD的肽的共表達(dá)。所述體內(nèi)方法包括給有需要的動(dòng)物施用本文所述的 肽，其包括CTS結(jié)構(gòu)域、選擇性結(jié)合至靶蛋白的PBD，以及細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu)域。
[0011] 還提供了包含CTS結(jié)構(gòu)域、選擇性結(jié)合至靶蛋白的PBD以及細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu)域的 肽用于體外或體內(nèi)降低靶蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的用途。還提供了本文所述的肽用于制備 降低靶蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的藥物的用途。在另一個(gè)方面，提供了用于在體外或體內(nèi)降 低靶蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的本文所述的肽。
[0012] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了期望敲低特定內(nèi)源性蛋白的細(xì)胞表達(dá)的治療疾病 的方法，所述方法包括給患有或被懷疑患有這樣的疾病的對(duì)象施用治療有效量的敲低靶向 肽，其中所述敲低靶向肽包含融合至蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PBD)的CMA-靶向信號(hào)（CTS)，其中 所述蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域是能夠選擇性結(jié)合至內(nèi)源性蛋白的多肽序列。所述敲低靶向肽可以進(jìn) 一步包含能夠?qū)⑺鲭倪f送穿過(guò)質(zhì)膜的細(xì)胞膜穿透結(jié)構(gòu)域（CPMD)。CMPD可以是HIV-lTat 蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，GRKKRRQRRRPPQ;黑腹果蠅觸足結(jié)構(gòu)域Antp(第43-58位氨基酸）， RQIKWFQNRRMKWKK;BuforinII，TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK;hClock-(第 35-47 位氨基酸） (人Clock蛋白DNA結(jié)合肽），KRVSRNKSEKKRR;MAP(模型兩親肽），KLALKLALKALKAALKLA; K-FGF，AAVALLPAVLLALLAP;Ku70 衍生的肽，包含選自以下的肽：VPMLKE、VPMLK、PMLKE或 PMLK;朊病毒，小鼠Prpe(第 1-28 位氨基酸），MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP;pVEC， LLIILRRRIRKQAHAHSK;P印-1，KETWWETffffTEWSQPKKKRKV;SynBl，RGGRLSYSRRRFSTSTGR;轉(zhuǎn)運(yùn) 素（Transportan)，GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL;轉(zhuǎn)運(yùn)素-10,AGYLLGKINLKALAALAKKIL; CADY，Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-半胱胺；P印-7,SDLWEMMMVSLACQY;HN-1，TSPLNIHNGQKL; VT5,DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD;pISL，RVIRVWFQNKRCKDKK;或任何其它已知的CMPD。 [0013] 在另一個(gè)方面，提供了包含CTS結(jié)構(gòu)域、選擇性結(jié)合至內(nèi)源性靶蛋白的PBD以及細(xì) 胞膜穿透結(jié)構(gòu)域的肽用于降低動(dòng)物中內(nèi)源性靶蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平以治療所述動(dòng)物的 疾病的用途。還提供了本文所述的肽用于制備降低內(nèi)源性靶蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平以治療 所述動(dòng)物的疾病的藥物的用途。在另一個(gè)方面，提供了用于在體外或體內(nèi)降低內(nèi)源性靶蛋 白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平以治療所述動(dòng)物的疾病的本文所述的肽。
[0014] 本文所述的化合物可以被用于體內(nèi)或體外研宄用途（即非臨床的）以研宄期望 敲低內(nèi)源性蛋白的疾病的備選治療。另外，這些分離的多肽可以被單獨(dú)地或作為試劑盒的 一部分用于體內(nèi)或體外研宄以研宄溶酶體降解、編碼所分離的多肽的核苷酸、培養(yǎng)物中和/ 或動(dòng)物模型中所維持的細(xì)胞的機(jī)制。
[0015] 內(nèi)源性革巴蛋白可以是任意內(nèi)源性天然蛋白，其具有結(jié)合伴侶（partner)或其結(jié)合 結(jié)構(gòu)域序列是已知的或能夠獲得的。例如，所述靶蛋白可以是a-突觸核蛋白、突觸后密度 蛋白（PSD95)、死亡相關(guān)蛋白激酶l(DAPKl)或其肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)或者能夠被鑒定的任 何胞漿蛋白激酶。
[0016] 因此，本發(fā)明還涉及能夠靶向并敲低a_突觸核蛋白（涉及神經(jīng)退行性突觸核蛋 白病如帕金森氏病的蛋白）的新的敲低靶向肽組合物。在一個(gè)方面，提供了與SEQIDNO: 1 具有實(shí)質(zhì)性相似性的分離的多肽。在另一個(gè)方面，提供了與SEQIDNO: 1任一具有至少90% 同一性的分離的多肽，其中所述同一性可以針對(duì)序列的整個(gè)長(zhǎng)度進(jìn)行計(jì)算，并且其中所述 分離的多肽引起突觸核蛋白的降解。在另一個(gè)方面，提供了與SEQIDN0:1任一具有 至少95%同一性的分離的多肽，其中所述同一性可以針對(duì)序列的整個(gè)長(zhǎng)度進(jìn)行計(jì)算，并且 其中所述分離的多肽引起突觸核蛋白的降解。在另一個(gè)方面，提供了包含SEQIDN0:1 任一的分離的多肽。
[0017] 所述分離的多肽可以引起a-突觸核蛋白的降解或敲低。所述分離的多肽可以進(jìn) 一步包括綴合至所述分離的多肽的遞送和革G向部分（moiety)。所述遞送和祀向部分可以選 自以下一種或多種：配體；蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)