專利名稱：：2型t輔助細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及維生素A類(lèi)拮抗劑(包含具有選擇性視黃酸受體(RAR)拮抗活性、維生素A類(lèi)X受體(RXR)拮抗活性或混合的RAR-RXR拮抗活性的維生素A類(lèi))在制備用于治療2型T輔助細(xì)胞(Th2)介導(dǎo)的免疫病(例如免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的變應(yīng)性疾病)的藥劑方面的應(yīng)用，還涉及所述活性物質(zhì)在治療這類(lèi)疾病方面的應(yīng)用。維生素A類(lèi)是一類(lèi)在結(jié)構(gòu)上與維生素A相關(guān)的化合物，它們包括天然化合物和合成化合物。已發(fā)現(xiàn)維生素A類(lèi)在臨床上適用于治療皮膚病和腫瘤病。人們認(rèn)為維生素A類(lèi)的活性是由核維生素A類(lèi)受體RARα、β、γ和RXRα、β、γ介導(dǎo)的，所述受體屬于類(lèi)固醇、甲狀腺激素、維生素D、過(guò)氧化物酶體增殖物活化的受體[Pfahl等，維生素和激素(VitaminsandHormones)49,327-382(1994)]的總科。具有受體興奮活性的維生素A類(lèi)結(jié)合并活化受體，但具有受體拮抗活性的維生素A類(lèi)結(jié)合受體卻不活化它們。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了具有維生素A類(lèi)受體興奮活性的維生素A類(lèi)不但在治療皮膚病和腫瘤病的模型系統(tǒng)中有活性，而且在治療免疫病的模型中有活性。具有維生素A類(lèi)受體興奮活性的維生素A類(lèi)分別在治療佐劑性關(guān)節(jié)炎[Brinckerhoff等，科學(xué)(Science)221,756～758(1983)]和實(shí)驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎[Massacesi等，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)88,1331～1337(1991)；Racke等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)154,450～458(1995)]、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型中有活性。認(rèn)為這兩類(lèi)病屬于Th1介導(dǎo)的、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病。實(shí)驗(yàn)上，具有維生素A類(lèi)受體拮抗活性的維生素A類(lèi)(維生素A類(lèi)拮抗劑)能有效地對(duì)抗具有維生素A類(lèi)受體興奮活性的維生素A類(lèi)(維生素A類(lèi)興奮劑)的很多特性，例如細(xì)胞增殖的抑制、細(xì)胞分比的誘導(dǎo)、編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)和血管發(fā)生的抑制[Bollag等，國(guó)際癌雜志(Int.J.Cancer)70,470～472(1997)]。維生素A類(lèi)拮抗劑還抑制維生素A類(lèi)興奮劑的毒性副作用，例如維生素A過(guò)多綜合征和畸形發(fā)生的跡象和癥狀[Standeven等，毒物學(xué)與應(yīng)用藥理學(xué)(Toxicol.Appl.Pharmacol.)138,169～175(1996)；Eckhardt和Schmitt,毒物學(xué)通訊(Toxicol.Letters)70,299～308(1994)]。因此，它們可能在臨床上適用于預(yù)防或治療由維生素A類(lèi)興奮劑引起的副作用。已提議將維生素A類(lèi)拮抗劑臨床用于預(yù)防和治療維生素A類(lèi)引起的毒性和副作用、尤其是所謂的維生素A過(guò)多綜合征。還提議將維生素A類(lèi)拮抗劑與維生素A類(lèi)受體興奮劑或其它核受體興奮劑組合用于預(yù)防和治療腫瘤發(fā)生前的損傷或腫瘤損傷、玻璃體視網(wǎng)膜病和視網(wǎng)膜脫離。此外，維生素A類(lèi)拮抗劑可作為單一作用劑(基于它們的抗增殖效果)用于治療某些對(duì)維生素A類(lèi)受體興奮劑不敏感的腫瘤[WO97/09297]?，F(xiàn)在首次很意外地發(fā)現(xiàn)了維生素A類(lèi)拮抗劑能有效地治療2型T輔助細(xì)胞(Th2)介導(dǎo)的免疫病，例如免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的變應(yīng)性疾病或者由Th2相關(guān)的細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病。在本發(fā)明范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“維生素A類(lèi)拮抗劑”被用于表示具有RAR、RXR或混合的RAR-RXR拮抗活性的維生素A類(lèi)或化合物。它包括具有受體中性拮抗活性的化合物(中性拮抗劑)、受體反向激動(dòng)活性的化合物(反向激動(dòng)劑)和負(fù)激素活性的化合物(負(fù)激素)[Klein等，生物學(xué)與化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)271,22692～22696(1996)]。在本發(fā)明范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“維生素A類(lèi)拮抗劑”包括下列結(jié)構(gòu)式的化合物a)下列各式的RARα-拮抗劑其中，R1是C5-10烷基，R2和R3彼此獨(dú)立地是氫或氟；這些化合物被描述于美國(guó)專利No.5391766和藥物化學(xué)雜志(J.Med.Chem.)1997,40,2445中；b)下列各式的RARα、β拮抗劑其中，R4是金剛烷基(diamantyl)，X是O或NH,R5是苯基或芐基，以及其中，任選存在環(huán)A或環(huán)B；這些化合物被描述于藥物化學(xué)研究(Med.Chem.Res.)1991,1,220；生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Com.)1997,231,243；藥物化學(xué)雜志1994,37,1508中；c)下式的RARβ、γ拮抗劑其中，R6和R7彼此獨(dú)立地是羥基、C1-4烷氧基、任選支化的C1-5烷基或金剛烷基；這些化合物被描述于藥物化學(xué)雜志1995,38,4993中；d)下列各式的RARγ拮抗劑這些化合物被描述于癌研究(CancerRes.)1995,55,4446中；e)下列各式的RARα、β、γ拮抗劑其中，Y是-CH2-或硫，Z是-CH=或氮，R8是氫或C1-4烷基；這些化合物被描述于藥物化學(xué)雜志1995,38,3163和4764；生物學(xué)與化學(xué)雜志1996,271,11897和22692中；f)下列各式的RXR拮抗劑其中，虛線鍵是任選的；并且，當(dāng)虛線鍵存在時(shí)，R9是甲基且R10是氫；當(dāng)虛線鍵不存在時(shí)，R9和R10一起是構(gòu)成一個(gè)順式取代的環(huán)丙基環(huán)的亞甲基；R11是C1-4烷氧基；這些化合物被描述于EP專利申請(qǐng)No.97107843.1；藥物化學(xué)雜志1996,39,3229，和自然(Nature)1996,383,450中。按本發(fā)明，就這樣發(fā)現(xiàn)了施用維生素A類(lèi)拮抗劑、其藥物上可接受的鹽和藥物上可接受的可水解酯能有效地治療患有2型T輔助細(xì)胞(Th2)介導(dǎo)的疾病的患者。還發(fā)現(xiàn)了施用維生素A類(lèi)拮抗劑能有效地治療患有由Th2相關(guān)的細(xì)胞因子(例如白細(xì)胞介素-4(IL-4)和(IL-5))介導(dǎo)的疾病的患者。因此，本發(fā)明一方面涉及維生素A類(lèi)拮抗劑、它們的藥物上可接受的鹽或藥物上可接受的可水解酯在制備用于治療2型T輔助細(xì)胞(Th2)介導(dǎo)的免疫病的藥劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明另一方面涉及維生素A類(lèi)拮抗劑、它們的藥物上可接受的鹽或藥物上可接受的酯在制備用于治療由Th2相關(guān)的細(xì)胞因子(例如IL-4和IL-5)介導(dǎo)的疾病的藥劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種治療患有2型T輔助細(xì)胞(Th2)介導(dǎo)的免疫病的患者的方法，它包括給所述人患者施用一種選自維生素A類(lèi)拮抗劑、其藥物上可接受的鹽和藥物上可接受的可水解酯的化合物，所述化合物以有效治療所述疾病的量施用。術(shù)語(yǔ)“治療”包括預(yù)防性治療和/或治療性治療。本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“2型T輔助細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病”指涉及免疫球蛋白E(IgE)和肥大細(xì)胞(由于變應(yīng)原特異性Th2細(xì)胞的形成和活化)的疾病，它包括變應(yīng)性疾病，例如特應(yīng)性皮炎，與特應(yīng)性相關(guān)的其它皮膚病；過(guò)敏性鼻炎或枯草熱，變應(yīng)性支氣管哮喘(呈其急性或慢性、輕度的或嚴(yán)重的形式，伴有或沒(méi)有急性或慢性支氣管炎)。免疫球蛋白E(IgE)血清含量的增高和嗜酸細(xì)胞增多癥可能與這些疾病有關(guān)。維生素A類(lèi)拮抗劑對(duì)所有那些涉及Th2細(xì)胞活性的增大和相關(guān)細(xì)胞因子(例如IL-4和IL-5)分泌的增多的免疫病都有效。維生素A類(lèi)拮抗劑的治療效果是由于下列現(xiàn)象的結(jié)果Th2細(xì)胞活性的降低，相關(guān)細(xì)胞因子(例如IL～4和IL-5)分泌的減少，和/或Th1細(xì)胞活性的增大(由于活化骨髓單核細(xì)胞生產(chǎn)IL-12的增強(qiáng))。[S.Romagnani，免疫學(xué)評(píng)論紀(jì)事(Ann.Rev.Immunol)12,227～257(1994)；Romagnani編輯，Th1andTh2CellsinHealthandDisease，化學(xué)與免疫學(xué)(Chem.Immunol.),Karger,Basel,63,pp.187～203(1996)；Abbas等，自然383,787～793(1996)]。按本發(fā)明，維生素A類(lèi)拮抗劑的效能可通過(guò)它們的如下能力表現(xiàn)上調(diào)Th1細(xì)胞活性或者誘導(dǎo)/刺激細(xì)胞因子(例如IL-12,IFNγ、TNF)的產(chǎn)生；和/或下調(diào)Th2細(xì)胞活性，或者抑制細(xì)胞因子(例如IL-4和IL-5)的產(chǎn)生。維生素A類(lèi)拮抗劑在變應(yīng)性支氣管哮喘的治療中顯示活性。與哮喘病相關(guān)的炎癥特點(diǎn)有活化嗜酸性粒細(xì)胞的存在、氣道敏感性的增大(反應(yīng)性過(guò)高)、水腫、粘液分泌過(guò)多和咳嗽。該炎性過(guò)程是由Th2型細(xì)胞的產(chǎn)生和活化介導(dǎo)的。維生素A類(lèi)拮抗劑促進(jìn)Th1型響應(yīng)從而抑制Th2型響應(yīng)的能力被認(rèn)為是作為這些化合物在變應(yīng)性肺部炎癥/哮喘中的效能的基礎(chǔ)的作用機(jī)制。在抑制變應(yīng)性肺部炎癥/哮喘的跡象和癥狀時(shí)，維生素A類(lèi)拮抗劑作用于Th1型細(xì)胞[Gavett等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)182,1527～1536(1995)；Kips等，Am.J.Respir.Crit.CareMed.153,535～539(1996)]。它們?cè)诳乖?變應(yīng)原(例如卵清蛋白)敏化和攻擊的動(dòng)物中顯示活性。如果通過(guò)氣溶膠全身地或部局地施藥，維生素A類(lèi)拮抗劑能有效地減弱、抑制或逆轉(zhuǎn)支氣管收縮、氣道水腫和粘液分泌過(guò)多、氣道炎癥、分別在支氣管肺泡組織和支氣管肺泡灌洗中出現(xiàn)的嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的累積，以及氣道對(duì)非特異性刺激的反應(yīng)性過(guò)高。就治療來(lái)說(shuō)，所述活性化合物(即維生素A類(lèi)拮抗劑)、其藥物上可接受的鹽或藥物上可接受的可水解酯被全身地或者局部地施用。所述化合物優(yōu)選作為組合物施用，該組合物含所述活性化合物和藥物上可接受的、與所述活性化合物相容的載體或稀釋劑。在制備這樣的組合物時(shí)，可應(yīng)用任意常規(guī)的藥物上可接受的載體。當(dāng)經(jīng)口施藥時(shí)，通常定期(就便在吃飯時(shí)間或每天一次)施藥。已證實(shí)了，當(dāng)經(jīng)口給藥或者當(dāng)局部給藥時(shí)，該化合物在不表現(xiàn)或只表現(xiàn)輕度的副作用的劑量時(shí)是有效的。因此，經(jīng)口或局部施用該活性化合物通常是優(yōu)選的。至于治療皮膚、口、鼻、咽、喉、支氣管等的疾病，也可以有利地采用經(jīng)口施藥與局部施藥組合。在2型T輔助細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病的治療中，當(dāng)經(jīng)口施藥時(shí)，維生素A類(lèi)拮抗劑不會(huì)引起屬于維生素A過(guò)多的中毒性綜合征的副作用(例如粘膜皮膚的、肌與骨骼的、神經(jīng)的表現(xiàn)以及轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯和膽固醇的升高)。此外，與臨床上適用于治療皮膚病和腫瘤病的受體興奮性維生素A類(lèi)[例如全反式視黃酸(維A酸)、13-順式視黃酸(異維A酸)、阿維A酯和阿維A]相比，它們不引起畸形或更少地引起畸形。在治療2型T輔助細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病時(shí)，維生素A類(lèi)拮抗劑、其藥物上可接受的鹽或藥物上可接受的可水解酯可以單獨(dú)用或者與其它手段組合，例如與其它藥物活性物質(zhì)(諸如局部的或系統(tǒng)的皮質(zhì)類(lèi)固醇、抗組胺藥和支氣管舒張劑)組合。如果與其它物質(zhì)組合應(yīng)用，維生素A類(lèi)拮抗劑和所述其它物質(zhì)可被獨(dú)立地施用或者以有效量摻入一種藥物組合物中。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“藥物上可接受的鹽”包括本領(lǐng)域中對(duì)維生素A類(lèi)拮抗劑來(lái)說(shuō)化學(xué)上允許的并且以藥物上可接受的制劑適合人患者的任意鹽。可應(yīng)用維生素A類(lèi)拮抗劑的任何這種常用的藥物上可接受的鹽。在可應(yīng)用的常規(guī)鹽中，有堿鹽，例如包括堿金屬鹽(諸如鈉鹽或鉀鹽)、堿土金屬鹽(諸如鈣鹽或鎂鹽)，以及銨鹽或烷基銨鹽。按本發(fā)明，維生素A類(lèi)拮抗劑還可呈其藥物上可接受的可水解酯的形式施用。任何藥物上可接受的可水解酯都可被用于本發(fā)明的組合物和方法中。優(yōu)選的酯有芳族酯，例如芐基酯(其中，芐基部分未被取代或者被低級(jí)烷基、鹵、硝基、硫基或取代硫基所取代)；或者低級(jí)烷基酯，例如乙酯、叔丁酯、環(huán)戊酯、環(huán)己酯或環(huán)庚酯；或者9-芴基甲酯。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“烷基”表示直鏈的、支化的或環(huán)狀的烷基，尤其是含1～12個(gè)碳原子的那些，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、叔丁基、癸基、十二烷基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基等。術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷基”表示含1～7個(gè)碳原子的烷基。前述維生素A類(lèi)、它們的鹽和酯特別適用于藥物上可接受的經(jīng)口或局部方式。這些藥物組合物含與相容性藥物上可接受的載體物質(zhì)組合的所述活性化合物?？蓱?yīng)用任意常規(guī)載體物質(zhì)。該載體物質(zhì)可以是適合口服的有機(jī)或無(wú)機(jī)惰性載體物質(zhì)。合適的載體包含水、明膠、阿拉伯膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、植物油、聚亞烷基二醇、凡士林等。此外，該藥物活性制劑可含其它藥物活性劑。另外，按藥物配制公認(rèn)的習(xí)慣做法，可添加添加劑，例如調(diào)味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑等。該藥物制劑可配制成任何常規(guī)劑型，尤其包括(a)口服固體劑型，例如片劑、膠囊(例如硬的或軟的明膠膠囊)、丸劑、囊劑、粉末、顆粒等；(b)局部施藥的制劑，例如溶液、懸浮劑、軟膏、乳膏、凝膠、微粉化粉末、噴霧劑、氣溶膠等。該藥物制劑可被滅菌和/或可包含佐劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、用于改變滲透壓的鹽和/或緩沖劑。至于對(duì)皮膚或粘膜局部施藥，前述衍生物優(yōu)選被制備成軟膏、酊劑、乳膏、凝膠、溶液、洗劑、噴霧劑；供吸入的氣溶膠和干粉末、懸浮劑、洗發(fā)劑、洗發(fā)皂、香水等。實(shí)際上，任何常規(guī)組合物都可被用于本發(fā)明中。在應(yīng)用含本發(fā)明作用劑的組合物的優(yōu)選方法中，該組合物呈軟膏、凝膠、乳膏、洗劑、噴霧劑；供吸入的氣溶膠或干粉末的形式。用于對(duì)皮膚局部施藥的藥物制劑可通過(guò)將前述活性組分與無(wú)毒的、治療上惰性的常用于這類(lèi)制劑的固體或液體載體混合來(lái)制備。這些制劑通常含基于組合物總重量為0.01～5.0wt％、優(yōu)選0.1～1.0wt％的活性組分。在制備上述局部制劑時(shí)，可應(yīng)用局部制劑的配藥技術(shù)中常用的添加劑，例如防腐劑、增稠劑、香料等。此外，可將常規(guī)抗氧化劑或常規(guī)抗氧化劑混合物摻入含前述活性劑的局部制劑中。可被用于這些制劑中的常規(guī)抗氧化劑包括N-甲基-α-生育胺、生育酚、丁羥茴醚、丁羥甲苯、乙氧喹等。本發(fā)明應(yīng)用的含活性劑的乳膏基藥物配方是由水性乳液組成的，該乳液包含脂肪酸醇(fattyacidalcohol)、半固態(tài)石油烴、乙二醇和乳化劑。含本發(fā)明的活性劑的軟膏配方包含半固態(tài)石油烴與該活性物質(zhì)的溶劑分散液的摻和物。含有用于本發(fā)明的活性組分的乳膏組合物優(yōu)選包含由下列相構(gòu)成的乳液保濕劑、粘度穩(wěn)定劑和水的水相，脂肪酸醇、半固態(tài)石油烴和乳化劑的油相，以及含分散于穩(wěn)定劑-緩沖劑水溶液中的活性劑的相。可在局部制劑中添加穩(wěn)定劑。按本發(fā)明可應(yīng)用任何常規(guī)穩(wěn)定劑。在油相中，脂肪酸醇組分起穩(wěn)定劑的作用。這些脂肪酸醇組分起穩(wěn)定劑作用。這些脂肪酸醇組分是從含至少14個(gè)碳原子的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸還原而得的。還有，按本發(fā)明可利用通常用于頭發(fā)的局部制劑的常規(guī)香料和洗劑。此外，如果需要的話，在本發(fā)明的局部制劑中可應(yīng)用常規(guī)乳化劑。至于局部治療過(guò)敏性鼻炎和變應(yīng)性支氣管哮喘，就要應(yīng)用鼻用氣溶膠和吸入氣溶膠。這類(lèi)氣溶膠的配方被描述于“藥物和藥物科學(xué)”(DrugsandPharmaceuticalSciences),MarcelDekker,NewYork,1996,Vol.72,pp.547～574中。此外，所述活性化合物可通過(guò)干粉吸入送遞。這類(lèi)配方和裝置被描述于“藥物技術(shù)”(PharmaceuticalTechnology),1997年6月，PP.117～125中。優(yōu)選的口服劑型包括片劑、丸劑、囊劑或者硬明膠或軟明膠、甲基纖維素或易溶于消化道的另一合適的物質(zhì)的膠囊。每個(gè)片劑、丸劑、囊劑或膠囊可優(yōu)選包含約5～約200mg、更優(yōu)選約20-約100mg活性組分。本發(fā)明預(yù)期的口服劑量將根據(jù)個(gè)體患者的需要而變(由開(kāi)處方醫(yī)師確定)。不過(guò)，一般說(shuō)來(lái)，每kg患者體重應(yīng)用的日劑量為0.05～20mg、優(yōu)選0.1～7mg、最優(yōu)選約0.3mg～約1.5mg。該劑量可按醫(yī)師根據(jù)患者的需要確定的任何劑量計(jì)劃表施用。治療的劑量一般取決于施藥途徑，個(gè)體的年齡、體重和疾病狀況。合適的劑型是本技術(shù)中已知的或者可容易地按本來(lái)已知的方法獲得。特別適合本發(fā)明范圍的或者可容易地按上述啟示調(diào)節(jié)的下列劑型的配方都屬于該領(lǐng)域洗劑、凝膠、乳膏、噴霧劑；供吸入的氣溶膠和干粉末、硬的和軟的明膠膠囊、片劑和囊劑。實(shí)施方法Ⅰ.體外檢測(cè)維生素A類(lèi)拮抗劑誘導(dǎo)的IL-12從美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTissueCultureCollection)得到THP-1細(xì)胞并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了檢測(cè)IL-12產(chǎn)生，用S.aureusCowan株(SAC)(1/1000)和人重組干擾素-γ(huIFN-γ)(1000U/ml)刺激THP-1細(xì)胞(1.25×106個(gè)細(xì)胞/ml)[Ma等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志183,147～157(1996)]。也可用huIFN-γ(1000U/ml)在37℃下引發(fā)0.5×106個(gè)人外周血單核細(xì)胞(PBMC)(1ml培養(yǎng)物于48孔板中)達(dá)16小時(shí)，然后用SAC(1/1000)刺激。48小時(shí)后收集上清液，在-20℃下冷凍直到檢測(cè)[Panina-Bordignon等，臨床研究雜志100,1513～1519(1997)]。通過(guò)特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定了IL-12生產(chǎn)，即應(yīng)用2.5μg/ml于包被緩沖液中的20C2抗體(大鼠抗人IL-12異源二聚體p40-p35)和250ng/ml于檢測(cè)緩沖液中的過(guò)氧化物酶綴合的4D6抗體(大鼠抗人IL-12)按文獻(xiàn)中描述的方法[Zhang等，臨床研究雜志93,1733～1739(1994)]測(cè)定。將標(biāo)準(zhǔn)物(重組人IL-12,800pg/ml至6pg/ml)和用檢測(cè)緩沖液稀釋后的樣品(100μl)加到雙份孔中。在450～650nm處讀取吸光度。從相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取未知的樣品IL-12濃度并乘以相應(yīng)的稀釋系數(shù)。最大IL-12產(chǎn)量在200～400pg/ml之間變化。在黃光下在冰上以2mM的濃度將凍干的維生素A類(lèi)拮抗劑稀釋在DMSO中。用完全RPMI培養(yǎng)基配制系列稀釋液(1μM～1pM)。各取10μl稀釋液加到1ml培養(yǎng)物上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)試的維生素A類(lèi)拮抗劑影響IL-12生產(chǎn)。具體地說(shuō)，測(cè)試的維生素A類(lèi)拮抗劑通過(guò)活化的人單核細(xì)胞而刺激IL-12生產(chǎn)，見(jiàn)表Ⅰ和Ⅱ。表Ⅰ維生素A類(lèi)拮抗劑通過(guò)活化的單核細(xì)胞特異性地提高IL-12產(chǎn)量表Ⅱ維生素A類(lèi)拮抗劑通過(guò)已用IFNγ引發(fā)并用SAC刺激的PBMC和THP-1細(xì)胞提高IL-12產(chǎn)量<tablesid="table2"num="002"><table>化合物受體特異性活性刺激物時(shí)間*(小時(shí))PBMCTHP-1IL-12(pg/ml)ARARα拮抗劑IFNγ+SAC016503306401ndBRARα,β,γ拮抗劑IFNγ+SAC016371364367ndCRXR拮抗劑IFNγ+SAC016568577367nd無(wú)無(wú)IFNγ+SAC＜12＜2360275</table></tables>*在0時(shí)刻與IFNγ共同添加或者在16小時(shí)后與SAC共同添加維生素A類(lèi)拮抗劑(1μg)化合物A對(duì)-[(E)-2-[3′,4′-二氫-4′,4′-二甲基-7′-(庚氧基)-2′H-1-苯并噻喃-6′-基]丙烯基]苯甲酸1′,1′-二氧化物化合物B4-(7,7,10,10-四甲基-1-吡啶-3-基甲基-4,5,7,8,9,10-六氫-1H-萘并[2,3-g]吲哚-3-基)-苯甲酸化合物C(2E,4E,6Z)-7-[2-丁氧基-3,5-二(1,1-二甲基乙基)苯基]-3-甲基-2,4,6-辛三烯酸Ⅱ.體外檢測(cè)由維生素A類(lèi)拮抗劑抑制人原初T細(xì)胞至T輔助2(Th2)細(xì)胞的分化。分離得自臍帶血的原初T細(xì)胞并按文獻(xiàn)中描述的方法[Panina-Bordignon等，臨床研究雜志100,1513～1519(1997)]處理。簡(jiǎn)言之，將得自臍帶血的單核細(xì)胞與抗-CD45RA和抗-CD4單克隆抗體一起保溫。保溫20分鐘后，洗滌細(xì)胞并與山羊抗小鼠Ig包被磁珠一起保溫。分離陽(yáng)性細(xì)胞并以1×106個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種入24孔板，當(dāng)存在或不存在1mM的對(duì)-[(E)-2-[3′,4′-二氫-4′,4′-二甲基-7′-(庚氧基)-2′H-1-苯并噻喃-6′-基]丙烯基]苯甲酸1′,1′-二氧化物(化合物A)或(2E,4E,6Z)-7-[2-丁氧基-3,5-二(1,1-二甲基乙基)苯基]-3-甲基-2,4,6-辛三烯酸(化合物C)時(shí)，與自體粘壁細(xì)胞、PHA和IL-4共同培養(yǎng)5天。然后洗滌細(xì)胞，放回在IL-2(100U/ml)存在下的培養(yǎng)物中。10天后，收集細(xì)胞，用PMA(50ng/ml)和伊屋諾霉素(1μ9/ml)重刺激4小時(shí)。最后2小時(shí)添加布雷菲德菌素A(10μg/ml)。再用4％低聚甲醛固定細(xì)胞，用皂苷透化處理。用FITC-抗IFNγ和PE-抗-IL-4mAbs將固定細(xì)胞染色，進(jìn)行細(xì)胞熒光分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)試的維生素A類(lèi)拮抗劑減小了原初T細(xì)胞至IL-4-分泌Th2細(xì)胞的分化。(表Ⅲ)表Ⅲ通過(guò)維生素A拮抗劑抑制L-4在Th2細(xì)胞中的表達(dá)Ⅲ.變應(yīng)原誘導(dǎo)的氣道炎癥和反應(yīng)性過(guò)高的鼠模型。在第0天和第14天通過(guò)腹膜內(nèi)注射處于0.2ml無(wú)菌鹽水中的10μgOA+1mgAl(OH)3(凝膠懸浮液)，主動(dòng)使C57BL/6小鼠(8～9周齡)對(duì)卵清蛋白(OA)敏感。在第21天，用5.0％OA氣溶膠對(duì)小鼠攻擊18分鐘。該氣溶膠是通過(guò)一個(gè)DeVilbissUltra-Neb90超聲波噴霧器產(chǎn)生的，將它的出口與裝有所述動(dòng)物的小有機(jī)玻璃室連接。在OA攻擊前三天、48小時(shí)、24小時(shí)和恰在攻擊前每天給小鼠施用RXR拮抗劑化合物C(10和30mg/kg，腹膜內(nèi)施藥)。在第21天應(yīng)用動(dòng)物。·氣道炎性細(xì)胞累積在第24天即用OA氣溶膠攻擊的三天后，用尿烷(2.4g/kg)麻醉動(dòng)物并用23號(hào)導(dǎo)管切開(kāi)氣管。用不含Ca++和Mg++的無(wú)菌漢格氏平衡鹽溶液的等分液(2×1ml)灌洗肺。30秒后通過(guò)緩緩地抽吸回收灌洗液并匯集每只動(dòng)物的灌洗液。然后在5℃和2000rpm下將樣品離心15分鐘。用0.5ml蒸餾水溶解形成的粒狀沉淀中的紅細(xì)胞，用5mlHBSS重新溶解粒狀沉淀中殘留的細(xì)胞。第二次在5℃和2000rpm下將樣品離心15分鐘。將形成的粒狀沉淀懸浮于1mlHBSS中。應(yīng)用血球計(jì)從一份細(xì)胞懸浮液等分液測(cè)定總細(xì)胞數(shù)。就細(xì)胞制品來(lái)說(shuō)，將細(xì)胞固定在用改良瑞特染液染色了的細(xì)胞離心玻片上。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)判據(jù)對(duì)至少300個(gè)細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)而將細(xì)胞分類(lèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)試的維生素A類(lèi)拮抗劑抑制變應(yīng)原誘導(dǎo)的氣道炎性細(xì)胞的累積(表Ⅳ)表Ⅳ維生素A類(lèi)拮抗劑在變應(yīng)原誘導(dǎo)的氣道炎癥的小鼠模型中抑制氣道炎性細(xì)胞累積·氣道反應(yīng)性過(guò)高在第24天即用OA氣溶膠攻擊的三天后，用戊巴比妥鈉(100mg/kg，腹膜內(nèi))麻醉動(dòng)物并切開(kāi)氣管(PE-190)。用一條sylastictubing對(duì)頸靜脈插管，供靜脈內(nèi)送遞藥物。將動(dòng)物都放入內(nèi)裝了呼吸速度描記器的整體體積描記器中，就在泮庫(kù)溴銨(0.1mg/kg，靜脈內(nèi))處理后立即進(jìn)行機(jī)械抽氣(Vf=150/min,Vt=0.3ml；683型，HarvardApparatus,S.Natic,MA)。應(yīng)用差壓傳感器(ValidyneDP103-08,Northridge,CA)從呼吸流信號(hào)的積分獲得潮氣量。用差壓傳感器(ValidyneDP45-30,Northridge,CA)測(cè)定經(jīng)肺壓力作為氣管內(nèi)壓力與胸膜內(nèi)壓力(從插入肋間隙的導(dǎo)管測(cè)得的)之間的差。應(yīng)用模塊裝置信號(hào)處理系統(tǒng)(ModularInstrumentSignalProcessingSystem)(Malvern,PA)從經(jīng)肺壓力、潮氣量和呼吸流測(cè)量值計(jì)算肺對(duì)美他環(huán)素的遞增劑量(30、100、300、1000μg/kg，靜脈內(nèi))的抗性(cmH2O/ml/s)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，維生素A類(lèi)拮抗劑可預(yù)防或逆轉(zhuǎn)變應(yīng)性氣道炎癥并抑制抗原誘導(dǎo)的支氣管收縮，特別針對(duì)變應(yīng)性氣道疾病(例如變應(yīng)性支氣管哮喘)。制劑的實(shí)例膠囊、片劑、囊劑、洗劑、凝膠、乳膏、供吸入的氣溶膠和干粉。下述實(shí)施例中的活性化合物是對(duì)-[(E)-2-[3′,4′-二氫-4,4′-二甲基-7′-(庚氧基)-2′H-1-苯并噻喃-6′-基]丙烯基]苯甲酸1,1′-二氧化物或者(2E,4E,6Z)-7-[2-丁氧基-3,5-二(1,1-二甲基乙基)苯基]-3-甲基-2,4,6-辛三烯酸實(shí)施例1洗劑(溶液)優(yōu)選的活性化合物0.1-2.0g丙二醇5.00-20.00g10.00gPEG-甘油可可酯*0.00-20.00g10.00g(PEG-GlycerylCocoate)dl-α-生育酚0.001-0.50g0.02g棕櫚酸抗壞血酸酯0.01-0.20g0.10g棓酸丙酯0.001-0.02g0.002g無(wú)水檸檬酸**0.00-0.20g0.01g異丙醇***40.00-90.00g50.00g添加軟化水(Water,dem.ad)100.00g100.00g各為ml數(shù)*或其它表面活性劑**或其它絡(luò)合劑，例如EDTA***或其它醇，例如乙醇實(shí)施例2凝膠優(yōu)選的活性化合物0.1-2.0g丙二醇5.00-20.00g10.00gPEG-甘油可可酯*0.00-20.00g10.00gdl-α-生育酚0.001-0.50g0.02g棕櫚酸抗壞血酸酯0.01-0.20g0.10g棓酸丙酯0.001-0.02g0.002g無(wú)水檸檬酸**0.00-0.20g0.01g異丙醇***40.00-90.00g50.00gHPMC****0.50-5.00g3.00g防腐劑*****適量適量添加軟化水100.00g100.00g各為ml數(shù)*或其它表面活性劑**或其它絡(luò)合劑，例如EDTA***或其它醇，例如乙醇****羥丙基甲基纖維素或其它聚合物，例如中和卡波姆、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉*****防腐劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯)，山梨酸，苯甲酸實(shí)施例3乳膏優(yōu)選的活性化合物0.1-2.0g甘油0.00-10.00g5.00gNa2EDTA0.001-0.50g0.03g甘油酯*5.00-20.00g10.00g十六烷醇0.50-5.00g1.00g十八烷醇0.50-5.00g1.00g甘油單硬脂酸酯1.00-8.00g4.00gCeteareth**0.50-5.00g2.00gdl-α-生育酚0.001-0.50g0.02g防腐劑***適量適量添加軟化水100.00g100.00g*例如辛酸/癸酸/甘油三酯，辛酸/癸酸/亞油酸甘油三酯，天然甘油酯(naturalglycerides)，以及例如丙二醇，二辛酯/二癸酯和蠟(例如硬脂酸十八酯(Stearyl,Stearate)、油基油酸酯(OleylOleate)、肉豆蔻酸異丙酯)**Ceteareth5-30，或其它乳化劑(例如Polysorbase20-80、脂肪酸的山梨糖醇酐酯、PEG的脂肪酸酯)。***防腐劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯)，山梨酸，苯甲酸實(shí)施例4軟明膠膠囊的填充物質(zhì)活性化合物5.0～200.0mg油*1～3份蠟混合物**1～5份填充容量1～6minims*天然植物油(例如豆油、花生油)和合成甘油酯**天然蠟和合成蠟或部分氫化的脂肪的組合物20mg軟明膠膠囊組分mg/膠囊活性化合物20.000dl-α-生育酚0.028氫化蓖麻油4.200辛酸/癸酸/硬脂酸甘油三酯(合成甘油三酯)56.000甘油三酯，中鏈199.772總計(jì)280.000mg實(shí)施例5含20mg活性物質(zhì)的硬明膠膠囊成分一顆膠囊包含活性化合物20.0mg明膠Bloom3070.0mg麥芽糖糊精MD05108.0mgdl-α-生育酚2.0mg抗壞血酸鈉10.0mg微晶纖維素48.0mg硬脂酸鎂2.0mg(重量，膠囊含量)260.0mg方法將活性物質(zhì)在明膠、麥芽糖糊精、dl-α-生育酚和抗壞血酸鈉的溶液中濕法研磨。噴霧干燥該濕法研磨的懸浮液。將噴霧干燥后的粉末與微晶纖維素和硬脂酸鎂混合。每份取260mg該混合物填入適當(dāng)尺寸和顏色的硬明膠膠囊。實(shí)施例6含20mg活性物質(zhì)的片劑組成片劑核活性化合物20.0mg無(wú)水乳糖130.5mg微晶纖維素80.0mgdl-α-生育酚2.0mg抗壞血酸鈉10.0mg聚乙烯吡咯烷酮K305.0mg硬脂酸鎂2.5mg(核重)250.0mg膜衣羥丙基甲基纖維素3.5mg聚乙二醇60000.8mg滑石粉1.3mg氧化鐵黃0.8mg二氧化鈦0.8mg(膜重)7.4mg方法將所述化合物與無(wú)水乳糖和微晶纖維素混合。將該混合物與聚乙烯吡咯烷酮、dl-α-生育酚和抗壞血酸鈉的溶液/分散液在水中造粒。將該顆粒物質(zhì)與硬脂酸鎂混合后壓成250mg重的片核。將片核包覆上述組成的溶液/懸浮液的膜衣。實(shí)施例7含活性物質(zhì)的囊劑組成活性化合物200.0mg乳糖，細(xì)粉末990.0mg微晶纖維素1250.0mg羧甲基纖維素鈉14.0mgdl-α-生育酚5.0mg抗壞血酸鈉20.0mg聚乙烯吡咯烷酮K3010.0mg硬脂酸鎂10.0mg實(shí)施例8供吸入的氣溶膠，計(jì)量劑量吸入劑活性化合物0.5％(0.1-0.2％)失水山梨醇三油酸酯5％dl-α-生育酚0.4％噴射劑(三氯氟甲烷和二氯二氟甲烷的混合物)94.1％實(shí)施例9干粉末吸入劑活性化合物*0.5mg(0.1mg-2.0mg)乳糖一水合物25mg*射流研磨、噴霧干燥權(quán)利要求1．選自維生素A類(lèi)拮抗劑、其藥物上可接受的鹽和藥物上可接受的可水解酯的化合物作為活性組分在制備藥劑方面的應(yīng)用，所述藥劑用于治療2型T輔助細(xì)胞(Th2)介導(dǎo)的免疫病，例如免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的變應(yīng)性疾病，或者用于治療由Th2相關(guān)的細(xì)胞因子例如IL-4和IL-5介導(dǎo)的疾病。2．權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中，所述活性組分是與藥物上可接受的載體組合應(yīng)用的。3．權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中，所述藥劑為供經(jīng)口或局部施藥而制備。4．權(quán)利要求1～3的應(yīng)用，其中，所述藥劑被制成片劑、膠囊、丸劑、囊劑、軟膏、乳膏、洗劑、噴霧劑；鼻用氣溶膠和供吸入的氣溶膠或干粉。5．權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，所述藥劑被制成含5～200mg、優(yōu)選20～100mg活性組分的片劑、膠囊、丸劑或囊劑。6．權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，所述藥劑被制備而供口服日劑量為每kg體重0.05mg～20mg、優(yōu)選0.3mg～1.5mg。7．權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，所述藥劑被制成含0.01～Swt％、優(yōu)選0.1～1.0wt％活性組分的軟膏、乳膏、洗劑、噴霧劑；鼻用氣溶膠和供吸入的氣溶膠或干粉。8．權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，所述活性組分選自維生素A類(lèi)拮抗劑及其堿金屬鹽、堿土金屬鹽、芐基酯、低級(jí)烷基酯和9-芴基甲酯。9．權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，制備所述藥劑用于治療免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的變應(yīng)性疾病，例如特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏性鼻炎或變應(yīng)性支氣管哮喘。全文摘要發(fā)現(xiàn)了具有維生素A類(lèi)受體拮抗活性的維生素A類(lèi)(稱為維生素A類(lèi)拮抗劑)、其藥物上可接受的鹽和藥物上可接受的可水解酯能有效地治療2型T輔助細(xì)胞(Th2)介導(dǎo)的免疫病,例如免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的變應(yīng)性疾病。文檔編號(hào)C07C57/42GK1301156SQ98811132公開(kāi)日2001年6月27日申請(qǐng)日期1998年11月5日優(yōu)先權(quán)日1997年11月12日發(fā)明者W·博爾拉格,M·克勞斯,P·帕尼納－伯迪格農(nóng),F·西尼加格利亞申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司