專利名稱：：取代苯甲酰胺的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種取代苯甲酰胺，優(yōu)選鹵代苯甲酰胺的制備方法。本發(fā)明更具體地涉及通過生物水解制備2，6-二氟苯甲酰胺的方法。2，6-二氟苯甲酰胺是一種用于制備殺蟲劑產(chǎn)品，尤其是除蟲脲的已知中間體(參見GB-A-1324293)。通過化學(xué)合成途徑制備2，6-二氟苯甲酰胺存在著問題，這是因為2，6-二氟芐腈的水解是在極其酸性的介質(zhì)中，具體如在60％濃硫酸存在下進(jìn)行。事實上不但收率不是很高，不超過80％，而且這種方法令人不滿意之處還在于因生成大量鹽類副產(chǎn)物，從而造成污染并使純化困難且成本高。此外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)由于使用大量硫酸，致使需要采取中和步驟。此外，F(xiàn)R-A-2294999公開了一種通過生物水解完成的酰胺類水解方法。所以，按照Bergey所述通過在短桿菌屬細(xì)菌的作用下水解芐腈可以得到苯甲酰胺。但應(yīng)注意，R312菌株的活性對于脂肪族腈類是特異性的因此它對芐腈的活性較低(60μmol/h.mg酶)，由于生產(chǎn)效率極低，使其無法適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)。出乎意料的是，業(yè)已發(fā)現(xiàn)在酶的作用下，優(yōu)選在短桿菌屬細(xì)菌且更優(yōu)選在R312菌株及其突變株A4的作用下2，6-二氟苯甲酰胺可被水解。具體而言，本發(fā)明的主題是一種通過酶促水解取代芐腈來制備取代苯甲酰胺的方法，其特征在于在結(jié)構(gòu)為α2β2的四聚體酶存在下取代芐腈發(fā)生水解，所述四聚體酶具有至少50％，優(yōu)選高于80％的同源性且具有下列氨基酸序列-α鏈MSVTIDHTTENAAPAQAPVSDRAWALFRALDGKGLVPDGYVEGWKKTFEEDFSPRRGAEL60VARAWTDPEFRQLLLTDGTAAVAQYGYLGPQGEYIVAVEDTPTLKNVIVCSLCSCTAWP119ILGLPPTWYKSFEYRARVVREPRKVLSEMGTEIASDIEIRVYDTTAETRYMVLPQRPAG178TEGWSQEQLQEIVTKDCLIGVAIPQVPTV207-β鏈MDGVHDLAGVQGFGKVPHTVNADIGPTFHAEWEHLPYSLMFAGVAELGAFSVDEVRYV58VERMEPRHYMMTPYYERYVIGVATLMVEKGILTQDELESLAGGPFP104LSRPSESEGRPAPVETTTFEVGQRVRVRDEYVPGHIRMPAYCRGRVGTI153SHRTTEKWPFPDAIGHGRNDAGEEPTYHVKFAAEELFGSDTDGGSVVVDLFEGYLEPAA212在本申請中，氨基酸的縮寫與本
技術(shù)領(lǐng)域：
慣用的含義相對應(yīng)，并且具體公開在AlbertL.Lehinger等人所著的《生物化學(xué)原理》(第2版，F(xiàn)1ammarion醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，113頁)中。具體而言，它們是指甘氨酸＝G，丙氨酸＝A，纈氨酸＝V，亮氨酸＝L，異亮氨酸＝I，脯氨酸＝P，苯基丙氨酸＝F，酪氨酸＝Y(jié)，色氨酸＝W，絲氨酸＝S，蘇氨酸＝T，半胱氨酸＝C，甲硫氨酸＝M，天冬酰胺＝N，谷氨酰胺＝Q，門冬氨酸＝D，谷氨酸＝E，賴氨酸＝K，精氨酸＝R，組氨酸＝H本申請中的術(shù)語“取代”是指，在芐腈類起始反應(yīng)物中，芳環(huán)上5個氫原子中的至少一個被非氫原子取代。具體可以被鹵素、碳、氧或氮原子取代。根據(jù)本發(fā)明，通過生物水解可以完全令人滿意的方式制備2，6-二氟芐腈。由于在現(xiàn)有技術(shù)中，酶促水解芐腈似乎很困難，所以2，6-二氟芐腈恐怕無法被生物水解。人們尚無法預(yù)見可以水解2，6-二氟芐腈且獲得良好的水解效果。根據(jù)本發(fā)明方法，取代芐腈，優(yōu)選2，6-二氟芐腈在具有上述定義氨基酸序列的酶存在下水解。根據(jù)本發(fā)明，既可以使用含有所述酶的微生物細(xì)胞，也可以采用非細(xì)胞酶的制劑，但在后一情況中，由于必需進(jìn)行酶的提取，致使生產(chǎn)成本增高。在本申請中，術(shù)語“酶”應(yīng)代表表達(dá)酶的細(xì)胞以及分離的酶。優(yōu)選使用細(xì)胞而不是分離的酶。所述酶可以得自短桿菌屬微生物，更具體地可以得自短桿菌R312菌株或其突變株短桿菌spA4。R312菌株及其突變株A4屬于公知并且尤其被公開在FR-A-2294999中和NicolasBernet呈交給蒙勃里耶國立高等農(nóng)藝學(xué)校的論文(1989年6月30日)中。R312和A4在荷蘭voorShimmel培養(yǎng)物保藏中心以保藏號CBS71773和CBSLMD792保藏。所述突變株的特征在于，該菌株喪失了水解多數(shù)酰胺類的能力，但同時卻保留下與野生型短桿菌sp.R312菌株相同的腈水合酶活性。通過在含有碳源如葡萄糖、磷酸鹽和氨、鎂和亞鐵離子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)可以得到短桿菌菌株。上述培養(yǎng)基可以富含有機(jī)氮源如酵母提取液或胨。所述酶或菌株通過聚集可以被固定在例如載體如二氧化硅上或凝膠中，這同樣屬于本發(fā)明范圍。載體固定技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且具體可以參考GordonF.Bickerstaff的著作《酶和細(xì)胞的固定方法》。本發(fā)明優(yōu)先適用于水解2，6-二氟芐腈，但本發(fā)明方法也可采用更具體地對應(yīng)于下式(I)的取代芐腈類的其它反應(yīng)物式(I)中R1表示氫原子，鹵素原子，優(yōu)選氟、氯或溴原子，或鹵代烷基，優(yōu)選全氟代烷基，或任何其他基團(tuán)R，R2與R1相同或不同，表示氫原子，鹵素原子，優(yōu)選氟、氯或溴原子，或鹵代烷基，優(yōu)選全氟代烷基，或任何其他基團(tuán)R，R1和R2中至少一個不是氫原子，n等于1-4。本發(fā)明方法優(yōu)選的并且是鹵代芐腈類的反應(yīng)物更具體地如式(Ia)所示式(Ia)中R1表示鹵素原子，優(yōu)選氟、氯或溴原子；或鹵代烷基，優(yōu)選全氟代烷基，R2與R1相同或不同，表示氫原子；鹵素原子，優(yōu)選氟、氯或溴原子；或鹵代烷基，優(yōu)選全氟代烷基，或任何其他基團(tuán)R，n等于1-4。在式(I)和(Ia)中，具有一個或多個R1和R2基團(tuán)位于氰基的鄰位、對位或間位。優(yōu)選基團(tuán)R1和R2位于氰基的鄰位。R1和R2表示鹵素原子，但也可表示優(yōu)選含有1-12個碳原子和1-7個鹵素原子的鹵代烷基。優(yōu)選的基團(tuán)是含有1-5個碳原子且優(yōu)選含有1-7個鹵素原子的全鹵代烷基，優(yōu)選全氟代烷基。作為鹵代烷基的更具體實例，可提及氟代烷基，例如氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、氟代乙基、1，1，1-三氟乙基、五氟乙基、氟代丙基、氟代丁基或三氟戊基。優(yōu)選三氟甲基。式(I)中的基團(tuán)R1和R2以及式(Ia)中的基團(tuán)R2可以具有符號R所示的其它含義?；鶊F(tuán)R可以具備任一種特性，條件是R不干擾水解反應(yīng)。例如，可以提及羥基；含有1-6個碳原子，優(yōu)選含有1-4個碳原子的烷基或烷氧基；氨基或被一個或兩個含有1-6個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子的烷基所取代的氨基。優(yōu)選的化合物是其中R1代表氟原子、氯原子或三氟甲基同時R2與R1相同或不同地表示氫原子、氟原子、氯原子或三氟甲基的式(I)或(Ia)所示化合物。作為適用于本發(fā)明方法的式(I)或(Ia)反應(yīng)物的例子，可以提及-鄰羥基芐腈，-對羥基芐腈，-鄰甲氧基芐腈，-對甲氧基芐腈，-鄰溴代芐腈，-鄰氯代芐腈，-對氯代芐腈，-間氯代芐腈，-間三氟甲基芐腈，-2，6-二氯芐腈，-2，6-二氟芐腈，-對甲基芐腈，-對氨基芐腈，在式(I)或(Ia)所示化合物中，優(yōu)選的反應(yīng)物是2，6-二氟芐腈和間三氟甲基芐腈。根據(jù)本發(fā)明方法，取代芐腈，優(yōu)選2，6-二氟芐腈在所述酶存在下進(jìn)行水解。該反應(yīng)在經(jīng)緩沖的含水介質(zhì)中完成。在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，反應(yīng)原料含有高達(dá)3mol/l芐腈反應(yīng)物。以干細(xì)胞重量計，微生物的存在濃度是1-50g/l，優(yōu)選2-10g/l。反應(yīng)物介質(zhì)已被緩沖，優(yōu)選pH在6-8的范圍內(nèi)且更優(yōu)選約為7。為了獲得預(yù)期的pH，可以參見文獻(xiàn)，具體如Rex.M.C，Davison等人所著的《(生物化學(xué)研究數(shù)據(jù)》(第3版，牛津科學(xué)出版社，1986，第432頁)。在本發(fā)明方法中，采用常規(guī)方法，具體地相對于每升尤其是由磷酸氫鉀鈉制成的溶液含有1-500mmolPO4＝離子的磷酸鹽緩沖溶液。為了在操作溫度下獲得預(yù)期的pH，借助適宜濃度的氫氧化鈉或碳酸氫鈉緩沖液將pH調(diào)至適當(dāng)水平。事實上，本發(fā)明方法簡便并且易于實施。在攪拌下，將反應(yīng)物和分離形式的或微生物細(xì)胞載帶的酶加入到被調(diào)至適當(dāng)pH的緩沖介質(zhì)中。加熱適宜在10℃-40℃，優(yōu)選10℃-30℃的范圍內(nèi)進(jìn)行。反應(yīng)溫度需維持一段時間，通常是4小時-20小時。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，得到沉淀形式的取代苯甲酰胺，優(yōu)選鹵代苯甲酰胺。以常規(guī)方式按照液體/固體的慣用分離技術(shù)，優(yōu)選通過過濾進(jìn)行回收。如果需要，用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑進(jìn)行提純。本發(fā)明方法的優(yōu)越性在于可以通過不生成任何鹽類化合物且生產(chǎn)效率高的水解方法制得苯甲酰胺。下列實施例舉例說明但不限定本發(fā)明。在實施例中，縮寫具有以下的含義-DFBN＝2，6-二氟芐腈-DFBZ＝2，6-二氟苯甲酰胺-DC＝干細(xì)胞實施例1細(xì)胞的生產(chǎn)在下列培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生腈水合酶的微生物短桿菌sD.A4-緩沖液(Na2HPO4/KH2PO4)pH750mmol/l-FeSO4·7H2O0.01g/l-MgSO4·H2O0.5g/l-鹽酸硫胺0.002g/l-葡萄糖10g/l-NH4Cl5g/l分別制備含有不同組分的水溶液并且利用高壓滅菌法滅菌，但鐵溶液和硫胺溶液通過過濾法滅菌(微孔濾膜，HA型，0.45μm)。用于短桿菌sp.A4的高密度細(xì)胞培養(yǎng)的制得的培養(yǎng)基含有上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基并補(bǔ)充Difco酵母提取液和葡萄糖。短桿菌sp.A4在錐形瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)物填充到錐形瓶體積的五分之一處，以確保培養(yǎng)基換氣。在28℃下，這些錐形瓶在工作臺上以150rpm振蕩攪拌(振幅5cm)。首先，用Columbia培養(yǎng)基制備的(Difco)瓊脂皿被接種上存在于液氮中的細(xì)胞原種。第一預(yù)培養(yǎng)物是用培養(yǎng)皿在50ml培養(yǎng)基中制備。約20小時后，接種第二培養(yǎng)物。15小時后這種培養(yǎng)達(dá)到指數(shù)生長期。為了獲得更多細(xì)胞，其生產(chǎn)是在2升的發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行。培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定如下-pH7-氧的分壓調(diào)整至50％在持續(xù)攪拌下，通過打開進(jìn)氣閥來調(diào)整分壓。閥門最大開至1.5vvm，以便不造成換氣過度；-攪拌開始時300rpm(在發(fā)酵過程中加速)；-溫度28℃。細(xì)胞的回收將細(xì)胞離心，用生理鹽水或含有20％甘油的生理鹽水洗滌，再次離心。以兩條不同途徑冷凍細(xì)胞-將細(xì)胞加入到0.1mol磷酸緩沖液中，均勻地分布在微量離心管中，隨后在-30℃下儲藏；-將細(xì)胞團(tuán)制劑冷凍在液氮中并儲藏在-80℃的冰箱中。對干重的評估從指定體積培養(yǎng)物得到一定量的細(xì)胞，用蒸餾水洗滌并懸浮在蒸餾水中，將懸浮液在100℃的巴氏殺菌器內(nèi)加熱過夜以除去全部痕量水分。得到指定體積的細(xì)胞的干重。實施例22，6-二氟苯甲酰胺的制備將按照Rex.M.C.Davison等人的《生物化學(xué)研究數(shù)據(jù)》(第3版，牛津科學(xué)出版社，1986，432頁)制備的0.1mol、pH為7的磷酸緩沖液加入反應(yīng)器中。再加入35℃的液體DFBN并在介質(zhì)中結(jié)晶，結(jié)晶粘著在反應(yīng)器底部。攪拌加快至500rpm以便使其懸浮并打碎較大的晶粒。在t＝0時加入細(xì)胞懸浮液并將攪拌速率設(shè)定在500-600rpm。在試驗過程中密封反應(yīng)器。所用容器是一種用攪拌體系進(jìn)行充分?jǐn)嚢璧姆磻?yīng)器，所述攪拌體系包括漿葉和平衡槳葉。借助恒溫槽調(diào)節(jié)溫度。操作條件和結(jié)果如表(I)所列</tables>2.5g/l或5g/l的干細(xì)胞濃度在6個小時反應(yīng)時間內(nèi)產(chǎn)生最佳活性。為了在6個小時內(nèi)、于受控pH的培養(yǎng)基中獲得濃度為1.5mol的酰胺，需要5g/l干細(xì)胞。實施例3反應(yīng)產(chǎn)物的作用首先，將不同濃度的粉末酰胺引入到0.1mol/lpH7的磷酸鹽緩沖液中，向其中加入5.3g/l短桿菌sp.A4的干細(xì)胞。在30℃下的1個小時中，在0.5、1、2、3或4mol/DFBZ存在下測定DFBZ(開始時815mmol)的水解活性，其結(jié)果如表(II)所示表(II在高濃度反應(yīng)產(chǎn)物(DFBZ)存在下，短桿菌菌株的活性幾乎未受到不利影響。實施例4分離酶的活性在30℃和攪拌下，令菌株或酶與DFBZ(500-900mmol/l)接觸1小時。所得活性如表(III)所示實施例53-三氟甲基苯甲酰胺的制備將按照Rex.M.C.Davison等人的《(生物化學(xué)研究數(shù)據(jù)》(第3版，牛津科學(xué)出版社，1986，432頁)制備的0.1mol、pH為7的磷酸鹽緩沖液加入管中。以300mmol/l的比例向磷酸鹽緩沖液中加入間三氟甲基芐腈。在t＝0時，加入細(xì)胞懸浮液(最終的反應(yīng)體積＝1ml)并將攪拌速率設(shè)定在500-600rpm。反應(yīng)溫度為30℃。在1小時內(nèi)，用2g/l干細(xì)胞可以將全部腈水解為酰胺。權(quán)利要求1.通過酶促水解取代芐腈制備取代苯甲酰胺的方法，其特征在于取代芐腈在結(jié)構(gòu)為α2β2的四聚體酶存在下水解，所述酶具有至少50％，優(yōu)選高于80％同源性并且具有以下氨基酸序列-α鏈MSVTIDHTTENAAPAQAPVSDRAWALFRALDGKGLVPDGYVEGWKKTFEEDFSPRRGAEL60VARAWTDPEFRQLLLTDGTAAVAQYGYLGPQGEYIVAVEDTPTLKNVIVCSLCSCTAWP119ILGLPPTWYKSFEYRARVVREPRKVLSEMGTEIASDIEIRVYDTTAETRYMVLPQRPAG178TEGWSQEQLQEIVTKDCLIGVAIPQVPTV207-β鏈MDGVHDLAGVQGFGKVPHTVNADIGPTFHAEWEHLPYSLMFAGVAELGAFSVDEVRYV58VERMEPRHYMMTPYYERYVIGVATLMVEKGILTQDELESLAGGPFP104LSRPSESEGRPAPVETTTFEVGQRVRVRDEYVPGHIRMPAYCRGRVGTI153SHRTTEKWPFPDAIGHGRNDAGEEPTYHVKFAAEELFGSDTDGGSVVVDLFEGYLEPAA2122.權(quán)利要求1的方法，其特征在于取代芐腈如下式(I)所示式(I)中R1表示氫原子，鹵素原子，優(yōu)選氟、氯或溴原子，或鹵代烷基，優(yōu)選全氟代烷基，或任何其他基團(tuán)R，R2與R1相同或不同，表示氫原子，鹵素原子，優(yōu)選氟、氯或溴原子，或鹵代烷基，優(yōu)選全氟代烷基，或任何其他基團(tuán)R，R1和R2中至少一個不是氫原子，n等于1-4。3.權(quán)利要求1的方法，其特征在于取代芐腈是下式(Ia)所示的鹵代芐腈式(Ia)中R1表示鹵素原子，優(yōu)選氟、氯或溴原子；或鹵代烷基，優(yōu)選全氟代烷基，R2與R1相同或不同，表示氫原子；鹵素原子，優(yōu)選氟、氯或溴原子；或鹵代烷基，優(yōu)選全氟代烷基，或任何其他基團(tuán)R，n等于1-4。4.權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代芐腈中，R1和R2中的一個基團(tuán)位于氰基的鄰位、對位或間位，但優(yōu)選位于鄰位。5.權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代芐腈中R1和R2表示鹵素原子和/或含有1-12個碳原子和1-7個鹵原子的鹵代烷基。7.權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代芐腈中R1和R2表示含有1-5個碳原子且優(yōu)選含有1-7個鹵原子的全鹵代烷基。8.權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代芐腈中R1和R2表示鹵代烷基，優(yōu)選氟代烷基，例如氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、氟代乙基、1，1，1-三氟乙基、五氟乙基、氟代丙基、氟代丁基或三氟戊基。9.權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代芐腈中R1和R2表示鹵代烷基，優(yōu)選三氟甲基。10.權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代芐腈中R表示羥基；含有1-6個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子的烷基或烷氧基；氨基或被一個或兩個含有1-6個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子的烷基所取代的氨基。11.權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于式(I)或(Ia)所示取代芐腈中R1表示氟或氯原子或三氟甲基，而R2與R1相同或不同，表示氫原子、氟原子、氯原子或三氟甲基。12.權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于取代芐腈是2，6-二氟芐腈或間三氟甲基芐腈。13.權(quán)利要求1-12中任一項的方法，其特征在于所述酶來自短桿菌屬微生物。14.權(quán)利要求13的方法，其特征在于所述酶來自菌株短桿菌R312或短桿菌spA4。15.權(quán)利要求1-14中任一項的方法，其特征在于取代芐腈的水解過程在6-8的pH范圍內(nèi)，優(yōu)選在約7的pH下進(jìn)行。16.權(quán)利要求1-15中任一項的方法，其特征在于取代芐腈的水解過程在經(jīng)緩沖的培養(yǎng)基，優(yōu)選磷酸鹽緩沖的培養(yǎng)基中進(jìn)行。17.權(quán)利要求16的方法，其特征在于水解反應(yīng)溫度為10℃-40℃，優(yōu)選10℃-30℃。18.權(quán)利要求1-17中任一項的方法制得的鹵代苯甲酰胺。19.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的方法通過2，6-二氟芐腈水解得到的2，6-二氟苯甲酰胺。全文摘要本發(fā)明涉及一種取代苯甲酰胺,優(yōu)選鹵代苯甲酰胺的制備方法。具體而言,本發(fā)明涉及通過生物水解制備2,6－二氟苯甲酰胺的方法。本發(fā)明涉及一種通過酶促水解取代芐腈來制備取代苯甲酰胺的方法,其特征在于將取代芐腈在結(jié)構(gòu)為α文檔編號C07C233/65GK1277637SQ9881050公開日2000年12月20日申請日期1998年10月23日優(yōu)先權(quán)日1997年10月24日發(fā)明者L·查西奧,C·珠爾答特,D·派特勒申請人:羅狄亞化學(xué)公司