專利名稱：具有抗－ks和抗hiv活性的化合物的制作方法
背景技術(shù)：
(a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及表現(xiàn)出抗-KS和抗-HIV活性的化合物，含有該化合物的藥物組合物及其治療方法。
(b)現(xiàn)有技術(shù)的描述卡波西肉瘤(KS)是受高死亡率困擾的AIDS患者中最常見的腫瘤(Friedman-Kien AE等，1990，J Am Acad Dermatol 221237-1250)。其攻擊性較小的形式也出現(xiàn)于地中海地區(qū)和赤道非洲的非-AIDS患者以及經(jīng)免疫抑制藥物治療后的腎移植患者中(Friedman-Kien AE等，1990，J Am AcadDermatol 221237-1250)。KS的發(fā)病機(jī)制及療法仍是未知的(Bais C等，1998，自然，39186)。男性中的KS發(fā)病率比女性中的要高，其原因不明。例如，在西方，約95％的AIDS-KS患者為男性。已經(jīng)就糖皮質(zhì)激素和類維生素A(retinoid)描述了KS的激素依賴性(Guo WX等，1996，Am J Pathol1481999-2008；Guo WX等，1995，Am J Pathol 146727-734；Guo WX等，1995，癌癥研究55823-829)，但是，性類固醇似乎并不直接參與KS的發(fā)病機(jī)制。最近，據(jù)Lunardi-Iskandar等(Lunardi-Iskandar Y等，1995，自然，37564-68)報道，胎盤激素人絨毛膜促性腺激素(HCG)表現(xiàn)出抗-KS活性，并可預(yù)防免疫缺損的小鼠中的腫瘤。這一初步發(fā)現(xiàn)潛在地具有明顯的治療作用，臨床試驗(yàn)已證明了這一點(diǎn)(Gill PS等，1996，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志3351261-1310；Gill PS等，1997，J.Natl.Cancer Inst，891797)，該發(fā)現(xiàn)有助于對此疾病，尤其是性二態(tài)性問題的基本理解。盡管HCG的作用主要是保胎，但人們逐漸明白該激素(可能與其它活性分子一起)決定著大量其它的現(xiàn)象。HIV難以穿過胎盤(Prober CG等，1991，Ped Infect Dis J10684-695)以及卡波西肉瘤在婦女(包括以前曾被病毒感染過的婦女)中的低發(fā)病率導(dǎo)致人們懷疑懷孕和/或生殖激素(如相關(guān)的LH，見Lunardi-Iskandar Y等，1995，自然37721-22)可能參與抑制病毒的繁殖。Bourinbaiar的研究(Bourinbaiar AS等，1995，Immunol Lett 4413-18)表明激素HCG或其β亞單位可能具有抗HIV的作用。HCG對性腺細(xì)胞的作用是由與G蛋白偶聯(lián)的跨膜受體介導(dǎo)的，該受體以很高的親和性和特異性與二聚體激素(α和β復(fù)合物)相互作用(參見Segaloff DL等，1993，Endocr Rev 14324-347)。眾所周知，在該系統(tǒng)中，α和β亞單位中的任一個對膜結(jié)合受體的反應(yīng)性都極低(Pierce JG等，1981，Ann Rev Biochem 50465-495；Sairam MR，1983，激素蛋白質(zhì)和肽，Li C.H編，第1-79頁)，但兩個亞單位的適當(dāng)(1∶1)重組可重新獲得完整的活性。Lunardi-Iskandar和Bourinbaiar的數(shù)據(jù)(Lunardi-Iskandar Y等，1995，自然37564-68；Bourinbaiar AS等，1995，Immunol Lett 4413-18)表明HCG“非常規(guī)”的作用模式參與了KS。實(shí)際上，他們報道了βHCG的生物活性，該觀點(diǎn)與一般為人接受的范例，即激素的二聚體形式是引發(fā)標(biāo)準(zhǔn)靶組織中的激素反應(yīng)所必需的相矛盾。盡管引起了爭論(Lunardi-Iskandar Y等，1995，自然37721-22；Berger P等，1995，自然37721；Rabkin CS等，1995，自然，37721-22；Krown SE，1996，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，3351309-1310)，但這些發(fā)現(xiàn)引起了有趣的新問題。
據(jù)天然藥物(第4卷，第7期，1998年7月)報道，hCG粗制品的抗KS活性仍然是個迷。
提供表現(xiàn)出抗KS和抗HIV活性的化合物是極其需要的。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一個目的是提供表現(xiàn)出抗KS和抗HIV活性的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了具有抗KS和抗HIV藥物活性的化合物，其含有HCG樣抑制蛋白及其片斷，該蛋白質(zhì)及其片斷分離自APL-HCG的生物活性級分，其中所述蛋白質(zhì)的分子量約為3,500或13,000道爾頓，其中所述蛋白質(zhì)及其片斷被吸附于聚丙烯塑料支持物，如試管或吸管等上。
優(yōu)選的聚丙烯塑料管包括Sarstedt(Numbreht，德國)出售的cat#57.512和cat#68.752。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了具有抗KS和抗HIV藥物活性的純化的蛋白質(zhì)及其衍生物及其片斷，其為吸附于聚丙烯塑料支持物上的HCG樣抑制蛋白及其衍生物及其片斷，其中所述蛋白質(zhì)具有選自下列的氨基酸序列
Ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Glu-Arg-Pro-Ile-Asn*Ala-Thr-Leu-Ala-Val-Glu-LysSEQ ID NO1；和Ala-Pro-Asp-Val-Gln-Asp-Lys-Phe-Thr-Arg-Gln-Ile-MetSEQ ID NO2本發(fā)明的純化蛋白質(zhì)指的是HIP或HCG樣抑制蛋白。
在其它實(shí)施方案中，衍生物含有一個或多個D-氨基酸或非天然氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了預(yù)防和/或治療卡波西肉瘤(KS)和/或HIV的藥物組合物，其含有治療有效量的至少一種本發(fā)明的化合物以及藥物可接受的載體。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了預(yù)防和/或治療卡波西肉瘤(KS)和/或HIV的藥物組合物，其含有治療有效量的至少一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)以及藥物可接受的載體。
在其它實(shí)施方案中，藥物組合物被配制成控釋制劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了預(yù)防和/或治療卡波西肉瘤(KS)和/或HIV的藥物組合物，其含有治療有效量的具有抗KS和抗HIV藥物活性的蛋白質(zhì)衍生物以及藥物可接受的載體，其中所述衍生物為吸附于聚丙烯塑料支持物上的HCG樣抑制蛋白，其中所述蛋白質(zhì)具有選自下列的氨基酸序列Ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-Asn*-Ala-Thr-Leu-Ala-Val-Glu-LysSEQ ID NO1；和Ala-Pro-Asp-Val-Gln-Asp-Lys-Phe-Thr-Arg-Gln-Ile-MetSEQ ID NO2根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了預(yù)防，治療和/或減少AIDS患者中的卡波西肉瘤和/或HIV表達(dá)的方法，所述方法包括給所述患者施用治療有效量的本發(fā)明的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了預(yù)防，治療和/或減少AIDS患者中的卡波西肉瘤和/或HIV表達(dá)的方法，所述方法包括給所述患者施用治療有效量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了預(yù)防，治療和/或減少AIDS患者中的卡波西肉瘤和/或HIV表達(dá)的方法，所述方法包括給所述患者施用治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了純化本發(fā)明的化合物或蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括步驟a)使APL-HCG的生物活性級分或含有所述化合物或蛋白質(zhì)的尿提取物與聚丙烯塑料支持物接觸一段足以吸附所述化合物或蛋白質(zhì)的時間；和b)洗滌支持物并釋放其上吸附的化合物或蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了評價抗KS和抗HIV化合物的抑制活性的方法，所述方法包括測定AP1基因活性。
在其它實(shí)施方案中，通過測定與DNA反應(yīng)元件的結(jié)合來測定所述AP1基因的活性。
本發(fā)明中使用了下列術(shù)語，其定義如下“HIP”HCG-樣抑制蛋白；“HPLC”高壓液相色譜；和“APL”Wyeth-Ayerst出售的臨床級HCG cat.#DIN 02168936的商品名。
術(shù)語“衍生物及其片斷”指的是本發(fā)明蛋白質(zhì)的任何衍生物和片斷，它們表現(xiàn)出抗KS和抗HIV藥物活性，能有效預(yù)防，治療和/或減少AIDS患者的卡波西肉瘤。衍生物可包括一個或多個D-氨基酸或非天然的氨基酸。衍生物和片斷是功能性的并基本上表現(xiàn)出本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物活性。
附圖簡述

圖1顯示了不同商業(yè)來源的HCG對KS-Y1細(xì)胞增殖的影響；圖2顯示了APL-HCG的分級分離和活性分布圖；圖3顯示了APL-HCG的時程對抑制KSY-1細(xì)胞中的AP-1結(jié)合的影響；圖4顯示了使用反相-HPLC純化HIP；圖5顯示了經(jīng)HPLC分離之后收集的級分的生物測定；圖6顯示了級分D的質(zhì)譜分析結(jié)果；和圖7顯示了級分A+B+C+E的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖8顯示了另一個低分子量級分的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖9顯示了HIP對HIV表達(dá)的影響；和圖10A和10B顯示了本發(fā)明的純化HIP蛋白質(zhì)的潛在的部分序列。
發(fā)明詳述目前，受高死亡率困擾的AIDS患者的性二態(tài)性疾病卡波西肉瘤(KS)仍無法得到有效的治療。最近的報道(Lunardi-Iskandar Y等，1995，自然37564-68)表明胎盤糖蛋白激素，即人絨毛膜促性腺激素(HCG)及其β亞單位在小鼠異種移植體中可抑制卡波西肉瘤細(xì)胞的致瘤性和轉(zhuǎn)移。隨后，在臨床試驗(yàn)中闡明了商購HCG的抗KS效力(Gill PS等，1996，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志3351261-1310；Gill PS等，1997，J.Natl.Cancer Inst.891797)。另外，Bourinbaiar(Bourinbaiar AS等，1992，F(xiàn)EBS.Lett.30982-84；Bourinbaiar AS等，1995，Immunol Lett 4413-18)和Gallo小組(Lunardi-Iskandar Y等，1998，天然藥物4428-434)的早期研究表明HCG的β亞單位(或其衍生的肽)具有抗HIV作用。
本申請人花了幾年的時間研究激素調(diào)控KS的細(xì)胞和分子方面。申請人實(shí)驗(yàn)室的最新研究證實(shí)商購的HCG制品(已知約為25％純)以依賴于劑量的方式表現(xiàn)出顯著的抑制作用。然而，純的和生物活性的HCG對培養(yǎng)中的卡波西肉瘤的生長不起作用，這表明雜質(zhì)(或降解產(chǎn)物)可能是活性劑。
申請人根據(jù)分子大小對商購的HCG制品進(jìn)行了再次分級分離，檢測每個級分抑制KS細(xì)胞生長，HCG放射性受體結(jié)合和類固醇生成生物活性的情況。申請人的結(jié)果表明抗KS活性是由低分子量的組分而不是大分子的HCG引起的。有趣的是，申請人已鑒定出轉(zhuǎn)錄因子，該因子可能是抗KS組分調(diào)控的靶。申請人得出結(jié)論商購HCG制品中存在的尚未鑒定出的分子決定著以前被錯誤地歸功于HCG的生長抑制作用。
令人驚奇地是，本發(fā)明鑒定出具有抗KS和抗HIV藥物活性的純化的HIP蛋白質(zhì)。此蛋白質(zhì)是HCG樣抑制蛋白，并被吸附至聚丙烯塑料支持物上，其具有選自下列的氨基酸序列ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-Asn*-Ala-Thr-Leu-Ala-Val-Glu-LysSEQ ID NO1；和Ala-Pro-Asp-Val-Gln-Asp-Lys-Phe-Thr-Arg-Gln-Ile-MetSEQ ID NO2HCG的來源檢測了兩個商購的HCG樣品，第一個是由Wyeth-Ayerst，Montreal提供的，其商品名為APL(Lot#C84662A是受人惠贈的，cat#DIN-02168936是購買的)，應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是早期研究中使用了APL(Lunardi-Iskandar Y等，1995，自然37564-68；Gill PS等，1996，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志3351261-1310)。兩個樣品也購自Sigma，St-Louis，Mo(lot#26H 1040)。純的HCG二聚體以及α-HCG和β-HCG得自NIDDK(Bethesda，MD)。重組的HCG得自O(shè)rganon，Oss，荷蘭。將經(jīng)凍干儲存的所有HCG樣品溶解于PBS中，并冷凍成等分試樣。
細(xì)胞增殖的評估KS-Y1(Lunardi-Iskandar Y等，1995，自然37564-68)分離自HIV患者，而原始KS-SLK細(xì)胞系的被稱為N-1506的亞系(Lunardi-Iskandar Y等，1995，自然37564-68)來源于免疫抑制的受試者(Herndier BG等，1994，AIDS 8575-581)。這些細(xì)胞系是由Lunardi-Iskandar博士(N.I.H.，Bethesda)提供的。在上述任何HCG樣品的存在或缺乏下將KS細(xì)胞傳代24-96小時，每隔1天更換1次培養(yǎng)基。按文獻(xiàn)所述(Guo WX等，1996，Am J Pathol1481999-2008；Guo WX等，1995，Am J Pathol 146727-734)測定3H-胸苷的摻入。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)被表示為4次測定結(jié)果的平均值±SEM。由斯氏t-檢驗(yàn)測定統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果。
在SEPHADEXTMG-100上分級分離APL通過溶解于1.5ml 0.05M NH4HCO3收集3管APL(10000 IU/管)以用于分級分離。將透明的溶液上樣于已用相同溶劑平衡過的SEPHADEXTMG-100柱(Pharmacia，Baie d’Urfe，Qc)(1.5×90cm)。收集1.7ml級分并集中成7個級分(見圖3)。從各級分中各取出一小部分以評估HCG當(dāng)量活性，將各級分的其它部分凍干。
HCG受體結(jié)合活性與LH受體有效結(jié)合的激素HCG的方便試驗(yàn)是按文獻(xiàn)詳述(Sairam MR，1983，激素蛋白質(zhì)和肽，Li C.H編，p1-79；Manjunath P等，1982，生物化學(xué)雜志，2577109-7115)使用成年豬睪丸的膜制品進(jìn)行放射性受體試驗(yàn)。按文獻(xiàn)所述(Sairam MR，1983，激素蛋白質(zhì)和肽，Li C.H編，p1-79)檢測標(biāo)準(zhǔn)(NICHD，Bethesda的CR-125 HCG)或受試樣品的125I-HCG結(jié)合。計算7個級分中每一個的總結(jié)合活性，表示為μg HCG當(dāng)量/級分。
類固醇生成活性HCG是很有效的類固醇生成激素，因此，一個可靠的生物測定法是將小鼠間質(zhì)(Leydig)腫瘤細(xì)胞(MA-10，最初得自M.Ascoli博士，Iowa)與上述受試樣品一起溫育(Sairam MR，1983，激素蛋白質(zhì)和肽，Li C.H編，p1-79)。通過放射性免疫測定法估計培養(yǎng)基中的孕酮(Sairam MR，1983，激素蛋白質(zhì)和肽，Li C.H編，p1-79)。
電泳遷移率凝膠移位分析(EMSA)根據(jù)Smeal的原始方法(Smeal T等，1989，基因進(jìn)展，32091-2100)由KSY-1細(xì)胞培養(yǎng)物制備核提取物。按文獻(xiàn)所述(Smeal T等，1989，基因進(jìn)展，32091-2100，Saatcioglu F等，1994，Semin.Cancer Biol，5347-359)進(jìn)行AP-1位點(diǎn)(TRE，TPA反應(yīng)元件)的結(jié)合反應(yīng)。用32P-ATP末端標(biāo)記序列5’-GGATCCGATGAGTCAGCCA-3’的合成膠原酶TRE寡核苷酸探針，并按文獻(xiàn)所述(Smeal T等，1989，基因進(jìn)展，32091-2100)進(jìn)行EMSA。通過使用100摩爾過量的未經(jīng)標(biāo)記的TRE以確定特異性。通過使用MolecularDynamics(Sunnyvale，CA)的軟件進(jìn)行磷圖象儀分析以定量信號。
純的HCG對KS細(xì)胞沒有抑制活性(圖1)設(shè)計最初的實(shí)驗(yàn)是為了證實(shí)HCG的抑制作用。比較了對兩個不同KS細(xì)胞系的作用。在經(jīng)商購的HCG制品(Sigma或APL)預(yù)先處理過的細(xì)胞中，在所有的KS細(xì)胞系中都引發(fā)了抑制作用(p＜0.05)。在初步實(shí)驗(yàn)中，注意到對細(xì)胞生長的劑量依賴型抑制作用。
檢測了兩個商購的HCG產(chǎn)品(APL和Sigma)，得到幾乎相同的抑制作用(圖1，右邊的兩個方塊)。然而，一些HCG貨品的效力比其它的更強(qiáng)。
所用樣品的當(dāng)量濃度為50U/ml(圖1)。相對于經(jīng)載體處理的細(xì)胞(C)而言，用Sigma-HCG(S)或Ayerst-HCG(APL)處理之后的KS細(xì)胞的生長顯著受阻。與之形成對照的是，使用高度純化的HCG制品沒有產(chǎn)生抑制作用。圖中符號1＝二聚體HCG；2＝αHCG；3＝βHCG；4＝不相關(guān)的人尿蛋白質(zhì)收集物；*P＜0.05。
接著，證實(shí)了被清楚表征的純的二聚體HCG，純的α或β亞單位和重組HCG的抗KS活性。這些純的HCG中無一能抑制KS生長(圖1，#1-3)。通過在經(jīng)培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)類固醇生成以檢查這些化合物的生物活性。如所預(yù)期的，重組或純的HCG引發(fā)了典型的生物反應(yīng)，而α或βHCG都未顯示出任何的類固醇生成作用。
粗HCG的分子篩分(圖2)一般而言，經(jīng)生物活性和生化分析評價，臨床所用的裝入安瓿瓶中的孕激素中HCG的純度僅約為25％(Manjunath P等，1982，生物化學(xué)雜志2577109-7115)。使用SEPHADEXTM層析將商購的HCG(APL)分成7個不同的級分(圖2)。
將3管臨床級APL(各為10,000 IU)中的內(nèi)容物溶解于0.05M NH4HCO3中，在SEPHADEXTMG-100柱(1.5×90cm)上進(jìn)行分子篩分。在A230nm處監(jiān)測(E組)的經(jīng)洗脫的蛋白質(zhì)/肽級分被分成7個收集物，即X軸上的級分收集物#1-7?？偣彩占?20管(1.75ml/管)，在KS培養(yǎng)基(不含血清)中重構(gòu)每個收集物的凍干物，評價其對細(xì)胞增殖的影響(A組實(shí)驗(yàn))。測定豬睪丸膜中的HCG受體結(jié)合情況(B組實(shí)驗(yàn))和MA-10細(xì)胞中的類固醇生成活性(C組實(shí)驗(yàn))。D組實(shí)驗(yàn)條形圖顯示出AP-1結(jié)合的定量光密度掃描，插入部分表示級分(fr)2，4和7的實(shí)際EMSA蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物；nd＝未測定。用當(dāng)量濃度為100U/ml的指定試劑將KSY-1細(xì)胞處理4天，觀察到對性腺細(xì)胞的HCG激素活性(收集物2)和對KS細(xì)胞的抑制作用(收集物7)有明顯的差異，*p＜0.05。
從最初2個集中的級分中回收到85％以上的HCG受體結(jié)合活性(圖2B)，其中會出現(xiàn)大小與純的HCG相同的高分子量蛋白質(zhì)。早期的主要級分(收集物#2)的Ve/Vo比率對應(yīng)于大分子的HCG。除了粗提取物中存在的其它未被鑒定的物質(zhì)外，這些級分還含有激素亞單位(α/β)或其降解產(chǎn)物。以前的研究(Sairam MR，1983，激素蛋白質(zhì)和肽，Li C.H編，p1-79)表明級分#7由相對較小的肽以及APL制劑中存在的其它試劑組成。在第2個級分中(圖2B和C)，HCG(而不是其亞單位)的特征，即類固醇生成或結(jié)合活性是最高的。這些結(jié)果與受體結(jié)合檢測的結(jié)果一致，在該檢測中，僅有二聚體的(α-β結(jié)合的)HCG而不是各個亞單位或其裂解產(chǎn)物是具有生物活性的(Sairam MR，1983，激素蛋白質(zhì)和肽，Li C.H編，p1-79；Manjunath P等，1982，生物化學(xué)雜志，2577109-7115)。與此相反，只有級分#7含有KS抑制活性。
通過HCG組分下調(diào)AP-1結(jié)合(圖3)激活蛋白-1(AP-1)是由12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)腫瘤啟動子、幾個生長因子和多個細(xì)胞外刺激物所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活物(參見SaatciogluF等，1994，Semin.Cancer Biol，5347-359)。AP-1由jun和fos家族的蛋白質(zhì)組成，它們連接形成同-(jun/jun)或異二聚體(jun/fos)，并識別AP-1調(diào)控基因上存在的已知為TPA反應(yīng)元件(TRE)的共有序列5’-TGAG/C TCA-3’。據(jù)認(rèn)為AP-1復(fù)合物在如生長刺激，分化，神經(jīng)元興奮和轉(zhuǎn)化的幾個信號傳導(dǎo)途徑中起著重要作用(Saatcioglu F等，1994，Semin.Cancer Biol，5347-359)。APL-HCG和級分7中的組分顯著抑制KSY-1細(xì)胞中AP-1與TRE的結(jié)合(圖2D)。處理3，6和12小時之后，APL-HCG分別抑制AP-1結(jié)合達(dá)1.5，3和2倍(圖3)。
將細(xì)胞與50IU/ml APL-HCG(+)或載體(-)溫育指定的時間段(圖3)。制備核提取物并進(jìn)行EMSA。所示結(jié)果是3個實(shí)驗(yàn)的代表。箭頭指向游離的探針。100ex＝100倍過量的未標(biāo)記探針。圖3的上部顯示出實(shí)際的凝膠移位，而圖3的下部提供了主要帶(箭頭所指)的定量磷圖象儀測定結(jié)果；*表示相對于經(jīng)載體處理的細(xì)胞而言，p＜0.05。
也觀察了劑量-反應(yīng)，在約100IU/ml時觀察到接近最大的效應(yīng)。因此，抑制AP-1可能是抑制KSY-1細(xì)胞的重要途徑。
使用反相-HPLC純化HIP(圖4)APL購自Wyeth-Ayerst Cat.#DIN 02168936，其被裝入配有冷凍劑的絕熱的盒子中。收到貨品之后，將APL儲存于4℃。室溫下，用隨APL安瓿一起出售的1ml試劑重構(gòu)1管APL(其含有干產(chǎn)物)lot#JA(L)3YYF-AB并在1小時之內(nèi)進(jìn)行HPLC處理。粉末易于溶解產(chǎn)生均勻的“溶液”。將該“溶液”注入裝配有7.8×300mm C-18TM柱的WaterTMHPLC裝置。使用漸增線性等梯度的乙腈(溶于含0.1％三氟乙酸的水中)進(jìn)行柱洗脫。梯度從5％增加至75％乙腈。在洗脫的過程中以220波長監(jiān)測吸光度，并將級分手工收集至硅烷化的聚丙烯管中。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)的(即未經(jīng)硅烷化的)試管時，會出現(xiàn)生物活性丟失的現(xiàn)象。收集之后，立即將級分置于SavantTMSpeed-vac裝置中以干燥樣品。圖4中顯示出梯度；右側(cè)或Y軸顯示出％乙腈(％B；B溶于含0.1％三氟乙酸的水中的80％乙腈)，X軸表示時間(分鐘)。在Y軸上記錄220nm的吸光度。隨后發(fā)現(xiàn)箭頭表示的兩個峰(D和E)含有KS抑制活性(見下面的圖5)。
HPLC分離之后對收集的級分進(jìn)行生物檢測(圖5)凍干圖4中箭頭所示的級分(峰)，用1ml RPMI培養(yǎng)基(不含血清)重構(gòu)每個級分并使用KS-Y1細(xì)胞檢測其生物活性。由于最初的原料是以10,000IU HCG提供的，依此類推，任意假定一個級分應(yīng)任意含有10,000IU的抗KS活性。根據(jù)這種假設(shè)，貫穿本申請的始末一直對劑量進(jìn)行評價。在缺乏(0)或存在不同劑量(10，100和200IU/ml)的情況下檢測生物活性。以“mix”表示的級分代表通過將等量的級分A-E混合而制得的1個收集物。從圖5可以看出級分D，E和“mix”顯示出抑制活性。
通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析活性級分(HIP)(圖6和7)簡單地說，將各個樣品的等分試樣包埋于低分子量的UV-吸附基質(zhì)(α-氰基-4-羥基肉桂酸)以增強(qiáng)樣品的離子化，然后在Voyager-DelayedExtraction系統(tǒng)(Perseptive Biosystem，F(xiàn)ramingham，MA)中進(jìn)行MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight)質(zhì)譜分析。
觀察到一個主要的峰含有約為13000道爾頓的組成成分(圖6)。為了進(jìn)行比較，也顯示出級分A-C和E的質(zhì)譜分析(圖7)，注意到在級分D和E中都存在13000道爾頓的組成成分(圖6)。
HIP對HIV表達(dá)的影響(圖9)較早顯示出可抑制KS細(xì)胞增殖的低分子量的級分#7(Kachra等，1997，Endocrinology，1384038-4041)，檢測該級分的抗HIV活性。按文獻(xiàn)所述(Tremblay等，1994，EMBO J，13774)用病毒HIV-IIIB感染原代培養(yǎng)的人淋巴細(xì)胞。感染后立即每天用1-250IU當(dāng)量的指定劑量的受試物(HCG級分或重組的HCG)處理細(xì)胞達(dá)10天。隨后，裂解細(xì)胞，按文獻(xiàn)所述(Tremblay等，1994，EMBO.J，13774)檢測HIV病毒蛋白質(zhì)p24的表達(dá)。注意到用高劑量的含HIP的級分處理之后p24表達(dá)顯著降低，而重組的HCG未顯示出顯著的影響(圖9)。
對HIP級分中所含的蛋白質(zhì)進(jìn)行測序(圖10A和10B)HPLC分離之后，按上述檢測級分的生物活性(圖4和5)。使用自動測序裝置(Applied Biosystem生產(chǎn)的比475型先進(jìn)的470型氣相測序儀)對含有最高生物活性的2個級分進(jìn)行蛋白質(zhì)測序。使用的內(nèi)標(biāo)由pTH-Nor-Leu組成。最初的生產(chǎn)效力約為50±20pmol。15輪循環(huán)之后，使用常規(guī)的蛋白質(zhì)分析檢查所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。將推定的氨基酸序列與公開的GenBankTM數(shù)據(jù)庫相比較。發(fā)現(xiàn)兩個序列與HCG的α和β亞單位具有顯著的同源性。
結(jié)論本發(fā)明的結(jié)果提供證據(jù)表明存在一種潛在重要的化合物，該化合物可能通過AP-1途徑的信號傳導(dǎo)抑制KS生長。盡管目前正在對純化的活性分子進(jìn)行測序，但很明顯該活性分子既不是HCG也不是其典型未知的亞單位中的任一種。
由其凝膠滲透層析洗脫結(jié)果判斷，其大小相對較小，可能低于10,000-14,000。為了獲得進(jìn)一步的分離，使用了HPLC技術(shù)，將蛋白質(zhì)分成獨(dú)立的和不同的峰。發(fā)現(xiàn)特定的單峰具有抗KS活性。為了得到其它數(shù)據(jù)，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著進(jìn)行銀染色以分析單峰。當(dāng)能肉眼看到蛋白質(zhì)時，觀察到“模糊的”帶，這表明蛋白質(zhì)包括密切相關(guān)的種類。
此時，人們僅可推測是否它作為一裂解肽衍生自HCG。實(shí)際上，已知糖蛋白激素被代謝成更小的多肽(Sairam MR，1983，激素蛋白質(zhì)和肽，LiC.H編，p1-79)。推定的裂解物(或相關(guān)產(chǎn)物)會經(jīng)由修飾的HCG受體產(chǎn)生作用。實(shí)際上，已知HCG受體基因可以受發(fā)育調(diào)節(jié)的方式被表達(dá)成選擇剪接的變體轉(zhuǎn)錄物(Segaloff DL等，1993，Endocr Rev 14324-347)，產(chǎn)生了這樣一種可能性，即推定的產(chǎn)物可介導(dǎo)激素作用的不同方面。平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步強(qiáng)化了這一假說，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明KS組織和細(xì)胞系表達(dá)顯著水平的HCG受體，其大小和細(xì)胞內(nèi)的分布不同于典型的靶細(xì)胞(Cao H.，Sairam M.R和Antakly T.，美國癌癥研究協(xié)會1996年會，摘要#1543)?；蛘撸钚晕镔|(zhì)可能是β-HCG亞單位的降解產(chǎn)物(例如但不限于β-核)，其在三維結(jié)構(gòu)上與幾個生長因子同源(Lapthorn AJ等，1994，自然369455-461)。由于KS細(xì)胞的啟動和增殖在很大程度上依賴于生長因子，β-核片斷可能用作生長因子受體的拮抗劑(參見Guo WX等，1996，美國病理學(xué)雜志1481999-2008)。
本發(fā)明所含的部分序列支持這樣一個觀點(diǎn)，即HIP蛋白可能衍生自hCG，作為1)α或β亞單位的選擇表達(dá)；或2)hCG亞單位的酶解加工。
盡管結(jié)合具體的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解也能對本發(fā)明進(jìn)行其它修飾，本申請欲覆蓋根據(jù)本發(fā)明的原理的任何變動、用途或修改，并包括本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)已知或常規(guī)實(shí)踐所得的相對于本申請公開內(nèi)容的偏離，這一點(diǎn)也適用于上文所述的必要技術(shù)特征，它們都包括在所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.具有抗KS和抗HIV藥物活性的化合物，其含有HCG樣抑制蛋白及其片斷，該蛋白質(zhì)及其片斷分離自APL-HCG的生物活性級分，其中所述蛋白質(zhì)的分子量約為3,500或13,000道爾頓，其中所述蛋白質(zhì)及其片斷被吸附于聚丙烯塑料支持物上。
2.具有抗KS和抗HIV藥物活性的純化的蛋白質(zhì)及其衍生物及其片斷，其為吸附于聚丙烯塑料支持物上的HCG樣抑制蛋白及其衍生物及其片斷，其中所述蛋白質(zhì)具有選自下列的氨基酸序列Ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-Asn*-Ala-Thr-Leu-Ala-Val-Glu-Lys SEQ ID NO1；和Ala-Pro-Asp-Val-Gln-Asp-Lys-Phe-Thr-Arg-Gln-Ile-MetSEQ ID NO2
3.權(quán)利要求2的純化的蛋白質(zhì)，其中所述衍生物含有一個或多個D-氨基酸或非天然氨基酸。
4.預(yù)防和/或治療卡波西肉瘤(KS)和/或HIV的藥物組合物，其含有治療有效量的至少一種權(quán)利要求1的化合物以及藥物可接受的載體。
5.預(yù)防和/或治療卡波西肉瘤(KS)和/或HIV的藥物組合物，其含有治療有效量的至少一種權(quán)利要求2或3的蛋白質(zhì)以及藥物可接受的載體。
6.權(quán)利要求4或5的藥物組合物，其被配制成控釋制劑。
7.預(yù)防和/或治療卡波西肉瘤(KS)和/或HIV的藥物組合物，其含有治療有效量的具有抗KS和抗HIV藥物活性的蛋白質(zhì)衍生物以及藥物可接受的載體，其中所述衍生物為吸附于聚丙烯塑料支持物上的HCG樣抑制蛋白，其中所述蛋白質(zhì)具有選自下列的氨基酸序列Ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-Asn*-Ala-Thr-Leu-Ala-Val-Glu-Lys SEQ ID NO1；和Ala-Pro-Asp-Val-Gln-Asp-Lys-Phe-Thr-Arg-Gln-Ile-MetSEQ ID NO2
8.預(yù)防，治療和/或減少AIDS患者中的卡波西肉瘤和/或HIV表達(dá)的方法，所述方法包括給所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
9.預(yù)防，治療和/或減少AIDS患者中的卡波西肉瘤和/或HIV表達(dá)的方法，所述方法包括給所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求2或3的蛋白質(zhì)。
10.預(yù)防，治療和/或減少AIDS患者中的卡波西肉瘤和/或HIV表達(dá)的方法，所述方法包括給所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求4，5，6或7的藥物組合物。
11.純化權(quán)利要求1的化合物或權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括步驟a)使APL-HCG的生物活性級分或含有所述化合物或蛋白質(zhì)的尿提取物與聚丙烯塑料支持物接觸一段足以吸附所述化合物或蛋白質(zhì)的時間；和b)洗滌支持物并釋放其上吸附的化合物或蛋白質(zhì)。
12.評價抗KS和抗HIV化合物的抑制活性的方法，所述方法包括測定AP1基因活性。
13.權(quán)利要求12的方法，其中通過測定與DNA反應(yīng)元件的結(jié)合來測定所述AP1基因的活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗KS和抗HIV藥物活性的化合物,其含有HCG樣抑制蛋白及其片斷或衍生物,該蛋白質(zhì)及其片斷分離自APL－HCG的生物活性級分,其中所述蛋白質(zhì)的分子量約為3,500或13,000道爾頓,其中所述蛋白質(zhì)及其片斷被吸附于聚丙烯塑料支持物上。預(yù)防和/或治療卡波西肉瘤(KS)和HIV的藥物組合物,其含有治療有效量的至少一種本發(fā)明的化合物以及藥物可接受的載體。預(yù)防,治療和/或減少AIDS患者中的卡波西肉瘤和HIV表達(dá)的方法,所述方法包括給所述患者施用組合物。
文檔編號C07K14/59GK1271365SQ98809398
公開日2000年10月25日 申請日期1998年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月1日
發(fā)明者托尼·安塔克利, 拉姆·M·賽拉姆 申請人:阿爾塔切姆法爾馬有限公司