專利名稱：13－脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物及其制備方法。所述13-蒽環(huán)類抗生素衍生物沒(méi)有對(duì)心臟毒性副作用。
背景技術(shù)：
與所有其它癌化學(xué)治療劑相比，蒽環(huán)類抗生素具有最廣譜的抗人癌活性。最周知的蒽環(huán)類抗生素類抗癌藥是含13-酮基的阿霉素和柔紅霉素。其中，美國(guó)專利No.3,590,028中公開(kāi)的阿霉素具有廣譜抗癌療效，除白血病、淋巴瘤和實(shí)體腫瘤之外是對(duì)肉瘤和癌最有效的藥物之一。
美國(guó)專利No.3,616,242中公開(kāi)的接近的結(jié)構(gòu)類似物柔紅霉素對(duì)肉瘤和癌無(wú)效，這種差異似乎是由于柔紅霉素缺少14-OH。然而，柔紅霉素可用于治療急性白血病。
但蓄積性心臟毒性限制了這些藥物的應(yīng)用?；谶@些原因，心臟毒性通常將用常用劑量的阿霉素進(jìn)行治療的持續(xù)時(shí)間限制至約9個(gè)月。阿霉素或柔紅霉素的總累積劑量不能超過(guò)550 mg/m2(E.A.Lefrak等，Cancer，32302，1973)。即使是或接近推薦的最大總累積劑量(430-650mg/m2)，在60％的患者中也出現(xiàn)顯著和持續(xù)的心臟功能失調(diào)，14％的患者出現(xiàn)充血性心力衰竭(A.Dresdale等，Cancer，5251，1983)。因此，雖然這些藥物可用于抑制癌生長(zhǎng)，但其嚴(yán)重的心臟毒性副作用使患者可能死于充血性心力衰竭。
除化合物自身的心臟毒性作用之外，已知的制備蒽環(huán)類抗生素化合物的方法產(chǎn)率較低，約為30％左右(參見(jiàn)Smith等，J.Med.Chem.，21280-283，1978)。
阿霉素在消除腫瘤上的成功及其在臨床應(yīng)用上的限制已是全世界研究人員開(kāi)發(fā)更好的阿霉素的根據(jù)?；谶@些原因，長(zhǎng)期以來(lái)，人們需要一種阿霉素類似物，它不受蓄積性不可逆性心臟毒性的限制。雖然在過(guò)去的25年里，已合成了2000個(gè)以上的類似物，但阿霉素沒(méi)有顯著的改進(jìn)(R.B.Weiss，我們究竟能否發(fā)現(xiàn)更好的阿霉素？(The anthracyclinesWill we ever find a betterdoxorubicin？)，Seminars in Oncology，19670-686，1992)。
在過(guò)去的25年里已進(jìn)行了全面的研究以探明蒽環(huán)類抗生素心臟毒性的機(jī)理。曾提出的一種廣為接受的理論是自由基理論。根據(jù)該理論，蒽環(huán)類抗生素的心臟毒性源于由蒽環(huán)類抗生素分子的苯醌部分產(chǎn)生的自由基(J.Dorowshow等，J.Clin.Invest.，681053，1981；D.V.Unverferth等，Cancer Treat.Rev.，9149，1982；J.Goodman等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，77797，1977 ；J.L.Zweier，J.Biol.Chem.，2596056，1984)。
然而，該理論由于自由基清除劑和抗氧化劑未能預(yù)防蓄積性心臟毒性而令人失望(D.Propper和E.Maser，阿霉素在家兔肝和心臟中的羰基還原(Carbonylreduction of daunorubicin in rabbit liver and heart)，Pharmacology and Toxicology，80240-245，1997；J.F.Van Vleet等，Am.J.Pathol.，9913，1980；D.V.Unverferth等，Am.J.Cardiol.，56157，1985；C.Myers等，Seminars in Oncology，1053，1983；R.H.M.Julicher等，J.Pharm.Pharmacol.，38277，1986；和E.A.Porta等，Res.Comm.Chem.Pathol Pharmacol.，41125，1983)。
換言之，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，抑制自由基的產(chǎn)生不能消除這些蒽環(huán)類抗生素的心臟毒性(P.S.Mushlin等，F(xiàn)ed.Proc.，45809，1986)。Richard D.Olson博士和PhillipS.Mushlin博士在過(guò)去的15年時(shí)間中研究了蒽環(huán)類抗生素誘發(fā)的心臟毒性機(jī)理并提出了“代謝物理論”，該理論目前被認(rèn)為是會(huì)成為一種流行的理論(R.D.Olson和P.S.Mushlin，阿霉素心臟毒性流行假設(shè)的分析(DoxorubicincardiotoxicityAnalysis of prevailing hypotheses)，F(xiàn)ASEB Journal，43076-3086，1990)。根據(jù)該理論，蒽環(huán)類抗生素心臟毒性是由母體化合物的13-OH代謝物介導(dǎo)的。
該研究顯示，表現(xiàn)為心肌收縮性減小的阿霉素和柔紅霉素心臟毒性與13-酮基部分被代謝性還原成13-二氫代謝物相關(guān)。在阿霉素沒(méi)有明顯代謝的試驗(yàn)體系，僅在非常高的濃度(200-400μg/mL)時(shí)才能觀察到13-二氫化合物的心臟毒性作用(P.S.Mushlin等，F(xiàn)ed.Proc.，441274，1985；R.D.Olson等，F(xiàn)ed.Proc.，45809，1986)。
如果讓阿霉素即使是短時(shí)間地留在試驗(yàn)體系中，也會(huì)出現(xiàn)某些代謝轉(zhuǎn)換并有足夠量的13-二氫代謝物形成，使得心臟毒性開(kāi)始顯現(xiàn)(L.Rossini等，Arch.Toxicol.Suppl.，9474，1986；M.Del Tocca等，Pharmacol.Res.Commun.，171073，1985)。因此，已積累了阿霉素和柔紅霉素等藥物的心臟毒性來(lái)源于它們的13-二氫代謝物產(chǎn)生的強(qiáng)心臟毒性作用的實(shí)質(zhì)性證據(jù)(P.Mushlin等，RationalDrug Therapy，221，1988；S.Kuyper等，F(xiàn)ASEP Journal，2A1133，1988；R.Boucek等，J.Biol.Chem.，26215851，1987；和R.Olson等，Proc.Natl.Acad.Sci.，853585，1988) 。
與上述的不同，較低濃度(1-2μg/mL)的13-二氫代謝物(即，阿霉素醇和柔紅霉素醇)在相同的這些試驗(yàn)系統(tǒng)中產(chǎn)生心臟毒性(R.D.Olson等，Proceed.Am.Assoc.Cancer Res.，26227，1985；R.D.Olson等，Proceed.Am.Assoc.Cancer Res.，28441，1987)。
考慮到上述情況，如下所示，由細(xì)胞內(nèi)羧基還原酶將阿霉素還原成阿霉素醇，其中，13-酮基被還原成醇
該理論提供了對(duì)蒽環(huán)類抗生素心臟毒性時(shí)間延遲性的解釋。最近，已有人對(duì)Olson和Mushlin的研究進(jìn)行了復(fù)查并證實(shí)了許多論點(diǎn)(D.Propper和E.Maser，阿霉素在家兔肝和心臟中的羰基還原(Carbonyl reduction of daunorubicin inrabbit liver and heart)，Pharmacology and Toxicology，80240-245，1997)。
例如，研究證實(shí)了心臟內(nèi)C13-醇代謝物的蓄積與心肌收縮和松弛能力下降之間的直接關(guān)系。此外，在長(zhǎng)期使用阿霉素的過(guò)程中，其13-醇代謝物(即，阿霉素醇)在大鼠和家兔心臟組織中選擇性地蓄積。而且，研究證實(shí)，柔紅霉素醇的體外心臟毒性作用比其母藥大得多。
此外，研究證實(shí)，阿霉素醇在抑制家兔乳頭肌的心臟收縮方面30倍強(qiáng)于阿霉素。還有，研究證實(shí)，心臟功能失調(diào)的機(jī)理與ATP酶抑制有關(guān)，因?yàn)榘⒚顾卮?但不是阿霉素)是肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+-Mg2+-ATP酶、線粒體的Mg2+-ATP酶和肌纖維膜的Na+-K+-ATP酶活性的抑制劑。此外，在動(dòng)物研究中用柔紅霉素處理后第2日在心臟組織中發(fā)現(xiàn)了柔紅霉素醇(但不是柔紅霉素)。
最近，蒽環(huán)類抗生素醇代謝物誘發(fā)的心臟毒性的基本機(jī)理已由Minotti等(阿霉素的二級(jí)醇代謝物使人心肌層的細(xì)胞溶質(zhì)部分中的順烏頭酸酶/鐵調(diào)節(jié)蛋白-1不可逆地鈍化(The secondary alcohol metabolite of doxorubicin irreversiblyinactivates aconitase/iron regulatory protein-1 in cytosolic fractions from humanmyocardium)，F(xiàn)ASEB Journal，12已付印，1998)闡明。Minotti等證實(shí)，阿霉素醇(但不是阿霉素)干擾鐵代謝并將鐵調(diào)節(jié)蛋白-I(IRP-I)不可逆地鈍化。其結(jié)果是，鐵無(wú)法被需鐵酶利用。這些酶的鈍化導(dǎo)致心臟毒性。
與這些發(fā)現(xiàn)一致的是以下事實(shí)螯合劑右雷佐生(dexrazoxane)可用于減少阿霉素心臟毒性(G.Weiss等，右雷佐生(ICRF-187)通過(guò)鐵調(diào)節(jié)蛋白的活化而調(diào)節(jié)運(yùn)鐵蛋白受體的表達(dá)(Modulation of transferrin receptor expression bydexrazoxane(ICRF-187)via activation of iron regulatory protein)，BiochemicalPharmacology，531419-1424，1997)。右雷佐生似乎刺激可抵消阿霉素醇作用的IRP-I的活性。
Olson和Mushlin作了這樣的構(gòu)思無(wú)法形成醇代謝物的13-羰基蒽環(huán)類抗生素類似物將不會(huì)有心臟毒性。最有吸引力的可能性是，將13-羰基還原成亞甲基。沒(méi)有已知的將該基團(tuán)代謝成醇的酶。根據(jù)該構(gòu)思而得到的結(jié)果是蒽環(huán)類抗生素阿柔比星。
與阿霉素相比，阿柔比星有許多改變，包括沒(méi)有14-OH。與其缺乏14-OH基團(tuán)一致的是，該藥對(duì)肉瘤或癌無(wú)效。但它對(duì)急性白血病有效。阿柔比星也沒(méi)有13-酮基，但有13-亞甲基。
該藥在法國(guó)和日本有售。阿柔比星明顯地沒(méi)有不可逆的蓄積性心臟毒性。使用高達(dá)3,000mg/m2的患者沒(méi)有心臟功能失調(diào)或心肌病變的跡象(D.C.Case等，對(duì)急性原始粒細(xì)胞性白血病的阿柔比星II期研究(Phase II study ofaclarubicin in acute myeloblastic leukemia)，American Journal of ClinicalOncology，10523-526，1987)。該領(lǐng)域的專家不了解阿柔比星沒(méi)有心臟毒性，不正確地設(shè)想這是由于其分布和藥物動(dòng)力學(xué)所致。但Olson和Mushlin相信，它證實(shí)了沒(méi)有13-酮基部分對(duì)心臟毒性的重要性。


圖1是心臟毒性產(chǎn)生途徑的示意圖。
發(fā)明概要本發(fā)明的一個(gè)目的是提供13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物并不抑制心臟毒性的證據(jù)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供改進(jìn)的制備這樣的13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供某些13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的前體及制備這些前體的方法。
根據(jù)這些和其它一些目的和優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供式1所示的13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物
式中，R1是H或OH；R2是H、OH或OMe；R3是H或OH；R4是H或OH；R5是碳水化合物或取代的碳水化合物。本發(fā)明還提供式1化合物的藥用鹽。藥用鹽包括得自藥用無(wú)機(jī)和有機(jī)酸和堿的鹽。合適的酸的例子包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來(lái)酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對(duì)甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、三氟乙酸和苯磺酸。得自合適的堿的鹽包括堿金屬鹽(如鈉鹽)和銨鹽。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供對(duì)需要抗癌治療的哺乳類宿主進(jìn)行治療的方法。將抗癌有效量的至少一種下面所示的式1化合物給藥于宿主。
式中，R1是H或OH；R2是H、OH或OMe；R3是H或OH；R4是H或OH；R5是碳水化合物或取代的碳水化合物。
本發(fā)明的再一個(gè)方面是提供制備13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的方法。該方法包括形成蒽環(huán)類抗生素13-甲苯磺酰腙與作為還原劑的氰基氫硼化物的酸性溶液。將該溶液溫和地回流。使反應(yīng)混合液冷卻。往該溶液中加入飽和的碳酸氫鈉水溶液，然后加入鹵代烴類溶劑。過(guò)濾混合物。將濾液酸化。對(duì)濾液進(jìn)行制備性色譜法分離，得到13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物。
此外，本發(fā)明的目的是解決已知的13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物制備方法中的上述缺陷。
因此，本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供產(chǎn)率高于已知方法的改進(jìn)的13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物制備方法。
因此，本發(fā)明的又一個(gè)方面是提供13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的制備方法。
蒽環(huán)類抗生素一般具有下面的式1所示結(jié)構(gòu)
式中，R1、R2、R3、R4和R5的定義同上。
根據(jù)已知的方法，可容易地將蒽環(huán)類衍生物轉(zhuǎn)化成13-甲苯磺酰腙。在酸性條件下用氰基氫硼化鈉將蒽環(huán)類抗生素13-甲苯磺酰腙還原成13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物。用制備性色譜法將產(chǎn)物純化而無(wú)需提取步驟。該方法的產(chǎn)率約為70-80％。
本發(fā)明的還有一個(gè)方面是提供制備13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的方法。該方法包括形成13-甲苯磺酰腙與氰基氫硼化物的酸性溶液。將該溶液溫和地回流。使反應(yīng)混合液冷卻。往該溶液中加入飽和的碳酸氫鈉水溶液，然后加入鹵代烴類溶劑。過(guò)濾混合物。將濾液酸化。對(duì)濾液進(jìn)行制備性色譜法分離，得到13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物。
本發(fā)明的再有一個(gè)方面是提供制備13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的方法。該方法包括將約1g的阿霉素13-甲苯磺酰腙鹽酸鹽和約2.4g的對(duì)甲苯磺酸溶解在約50mL的無(wú)水甲醇中形成溶液。往該溶液中加入約0.8g的氰基氫硼化鈉。將該溶液加熱至約68-72℃。在氮?dú)夥障聦⒃撊芤簻睾偷鼗亓骷s1小時(shí)。將反應(yīng)混合液濃縮至約20mL。將反應(yīng)混合液在冰箱中冷卻至約0-4℃。往反應(yīng)混合液中加入約2mL的飽和的碳酸氫鈉水溶液。再往反應(yīng)混合液中加入約200mL的氯仿。然后加入無(wú)水硫酸鈉。濾去鹽。用含氯化氫的乙醚將濾液酸化。將溶液加樣于硅膠柱中。用氯仿/甲醇洗脫至流出液為無(wú)色。含產(chǎn)物的流分用甲醇洗脫。將甲醇洗脫液蒸發(fā)。將蒸發(fā)所得殘余物溶解在含30％乙腈的甲酸銨緩沖液中。用苯基柱對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行制備性HPLC分離。用乙腈/甲酸銨梯度將產(chǎn)物與其它雜質(zhì)分離。然后將經(jīng)HPLC純化的流分凍干，得到約600mg的13-脫氧阿霉素鹽酸鹽。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1是心臟毒性產(chǎn)生途徑的示意圖；圖2是在175μM的本發(fā)明一個(gè)實(shí)例的化合物中溫育的右心房和心室標(biāo)本中的阿霉素醇或阿霉素的濃度與時(shí)間的關(guān)系的曲線圖；圖3是存在本發(fā)明一個(gè)實(shí)例的化合物或阿霉素時(shí)[3H]-胸苷被HL-60細(xì)胞攝取的曲線圖，該圖顯示了細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制；圖4是存在本發(fā)明一個(gè)實(shí)例的化合物或阿霉素時(shí)[3H]-胸苷被P388細(xì)胞攝取的曲線圖，該圖顯示了細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制；圖5是存在本發(fā)明一個(gè)實(shí)例的化合物或阿霉素時(shí)[3H]-胸苷被MCF7細(xì)胞提取的曲線圖，該圖顯示了細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制；圖6是存在本發(fā)明一個(gè)實(shí)例的化合物或阿霉素時(shí)[3H]-胸苷被MDA-MB-231細(xì)胞攝取的曲線圖，該圖顯示了細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制；圖7是本發(fā)明的化合物B和阿霉素對(duì)收縮功能的作用的圖示；圖8a-c分別是由用本發(fā)明一個(gè)實(shí)例的化合物處理20-23周后或用阿霉素處理過(guò)的家兔得到的左心室組織或?qū)φ諛颖镜慕M織病理的放大200倍的顯微照片，該圖顯示了阿霉素樣品中肌細(xì)胞液泡形成和肌原纖維喪失，而在本發(fā)明的化合物A或?qū)φ諛颖局袆t沒(méi)有此現(xiàn)象。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式及各種實(shí)施方式本發(fā)明利用了13-脫氧型的阿霉素、柔紅霉素或其它類似的蒽環(huán)類抗生素不會(huì)由于代謝作用而轉(zhuǎn)化成有心臟毒性的13-二氫型這樣一個(gè)事實(shí)，從而提供一種無(wú)心臟毒性的數(shù)量的本發(fā)明化合物的給藥方法，該方法沒(méi)有總累積劑量的限制。
本發(fā)明包括式A的改進(jìn)型阿霉素
以下稱該化合物為化合物A。
改進(jìn)的化合物A通過(guò)將阿霉素的13-酮基還原成亞甲基而得到。體外實(shí)驗(yàn)顯示，改進(jìn)的化合物A在與阿霉素被轉(zhuǎn)化成阿霉素醇相同的條件下不會(huì)被心臟組織代謝成該代謝物。
下述體外實(shí)驗(yàn)研究了本發(fā)明的改進(jìn)型阿霉素的生物轉(zhuǎn)化。研究的目的是確定本發(fā)明的化合物A是否會(huì)在離體的家兔心肌標(biāo)本中被代謝成C-13羥基代謝物。在由新西蘭白種家兔得到的游離的右心室和右心房壁條中用熒光HPLC技術(shù)對(duì)阿霉素、阿霉素醇和化合物A進(jìn)行了分析。心房和心室條被溫育于含充氧的克雷布斯-碳酸氫鹽緩沖液的肌肉浴(30℃)中。將阿霉素(175μM)或化合物A(175μM)加入到浴中并每隔30分鐘取出心房和心室條，此操作進(jìn)行了210分鐘。將各條帶用生理鹽水簡(jiǎn)單地沖洗后用吸水紙吸干，對(duì)半切割并稱重。將組織于-70℃貯存在管瓶中，以便測(cè)定組織中的阿霉素、阿霉素醇和化合物A濃度。阿霉素、阿霉素醇和化合物A的組織濃度通過(guò)由3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線加以確定，用平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤表示。觀察到化合物A和阿霉素的心房和心室濃度的具時(shí)間依賴性的增加。溫育210分鐘后，化合物A和阿霉素的心房組織濃度(ng/mg濕重)無(wú)顯著差異(化合物A743±89；阿霉素617±35)。溫育210分鐘后，化合物A在心室中的濃度顯著高于阿霉素的心室濃度(化合物A626±31；阿霉素407±30；P＜0.05)。然而，僅阿霉素被代謝成C-13羥基代謝物(即阿霉素醇)。未檢測(cè)到化合物A的代謝。這些實(shí)驗(yàn)表明，化合物A在離體的心臟標(biāo)本中不會(huì)形成C-13羥基代謝物。
該研究的目的是確定化合物A是否會(huì)在離體的家兔心肌標(biāo)本中被代謝成C-13羥基代謝物。
用本發(fā)明的化合物A和阿霉素進(jìn)行了試驗(yàn)。
用家兔全心室、右和左心房組織、右心室游離的壁、克雷布斯-碳酸氫鹽緩沖液(pH7.4)、生理(0.9％)鹽水、硫酸銨、異丙醇、氯仿、柔紅霉素、阿霉素、阿霉素醇和甲醇進(jìn)行了分析。
試驗(yàn)方案包括將新西蘭白家兔游離的右心室壁和心房的薄條(各80-100mg)溫育于含充氧的克雷布斯-碳酸氫鹽緩沖液(pH7.4)的離體肌肉浴(30℃)中。如先前所報(bào)道的(P.S.Mushlin等，Br.J.Pharmacol.，110975-982，1993)，離體肌肉浴的組成如下127mM氯化鈉、2.5mM氯化鈣、2.3mM氯化鉀、25mM碳酸氫鈉、1.3mM磷酸二氫鉀、0.6mM硫酸鎂和5.6mM葡萄糖。
至于阿霉素醇的合成，用Takanashi和Bachur法(S.Takanashi和N.R.Bachur，Drug Metab.Disp.，417-87，1976)的略作改進(jìn)了的方法(P.S.Mushlin等，Br.J.Pharmacol.，110975-982，1993)合成阿霉素醇。
根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在3個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)中測(cè)定了阿霉素、阿霉素醇和化合物A的組織濃度(ng/mg濕重)并表示為平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤。通過(guò)雙因子分析法(方差分析)用Prizm(GraphPad)程序分析經(jīng)不同時(shí)間間隔的處理的效果。
觀察和檢查結(jié)果包括觀察到化合物A和阿霉素在家兔心房(表1)和游離的右心室壁(表2)組織中的濃度均有時(shí)間依賴性的增加(圖1)?；衔顰在心房和心室中的濃度均等于或高于阿霉素在心房和心室中的濃度。然而，僅阿霉素被代謝成C-13羥基代謝物(即，阿霉素醇)，在家兔心房(表1)和心室(表2)組織中均觀察到阿霉素醇的時(shí)間依賴性的蓄積(圖2)。未檢測(cè)到化合物A的代謝(圖2)。
表1試驗(yàn)化合物和阿霉素醇在家兔心房組織中的濃度(ng/mg濕重)
ND表示未檢測(cè)出化合物A的C-13羥基代謝物。由3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)得到的組織濃度表示為平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤。ND和平均值由3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)得到。
表2試驗(yàn)化合物和阿霉素醇在家兔右心室游離壁組織中的濃度(ng/mg濕重)
1P＞0.05，化合物A與阿霉素比較。ND表示未檢測(cè)出化合物A的C-13羥基代謝物。由3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)得到的組織濃度表示為平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤。ND和平均值由3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)得到。
對(duì)實(shí)驗(yàn)的討論和由實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論包括實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物A在離體的家兔心臟標(biāo)本中不會(huì)形成C-13羥基代謝物。然而，相關(guān)結(jié)構(gòu)的化合物阿霉素被代謝成阿霉素醇(即，C-13羥基代謝物)。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素在心房組織中代謝成阿霉素醇的反應(yīng)似乎大于其在心室組織中的反應(yīng)。
圖2圖示在溫育于175μM的本發(fā)明化合物A或阿霉素中的右心房(A)和心室(V)標(biāo)本中的阿霉素醇隨著時(shí)間變化的濃度。由圖2可知，本發(fā)明化合物的濃度遠(yuǎn)低于已知的阿霉素。
其它體外研究顯示，本發(fā)明化合物A在抑制人癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面與阿霉素同樣有效。
顯示本發(fā)明化合物在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面的效果的實(shí)驗(yàn)將本發(fā)明化合物A和阿霉素對(duì)體外細(xì)胞增殖的效果進(jìn)行了比較。
根據(jù)顯示本發(fā)明化合物效果的實(shí)驗(yàn)，將化合物A對(duì)得自人和鼠白血病(HL60和P388)和人乳房癌(MCF7和MDA-MB231)的培養(yǎng)細(xì)胞系的抗增殖效果與阿霉素進(jìn)行了比較。通過(guò)測(cè)定[3H]胸苷的細(xì)胞參入來(lái)研究對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制。在同一培養(yǎng)條件下將化合物A的抗增殖效果與阿霉素進(jìn)行了比較。由曲線擬合分析法得到產(chǎn)生最大抑制的50％(IC50)的濃度。平均IC50值(用nM表示)和95％置信度如下所示。由3或4個(gè)各重復(fù)3次的獨(dú)立分析測(cè)得平均值。
在所研究的4個(gè)細(xì)胞系的每一個(gè)中，化合物A和阿霉素均完全消除了[3H]胸苷的細(xì)胞參入。這些研究證實(shí)，化合物A和阿霉素是強(qiáng)有力的體外癌細(xì)胞增殖抑制劑，雖然如IC50值的比(強(qiáng)度比)所示，阿霉素在所有4個(gè)細(xì)胞系中抑制[3H]胸苷參入的能力略強(qiáng)于化合物A(P＜0.05)。
此研究的目的包括用已建立的胸苷參入規(guī)程(E.Severison和E.L.Larsson，對(duì)多克隆B和T細(xì)胞活化劑的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Lymphocyte responses to polyclonal Band T cell activators)，D.M.Weir編， Cellular Immunology，第2卷第4版，Blackwell Scientific Publications出版，第631頁(yè)，1986年)確定化合物A抑制許多得自人和鼠白血病(HL60和P388)和人乳房癌(MCF7和MDA-MB231)的培養(yǎng)的惡性細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)(增殖)的強(qiáng)度，以計(jì)算出試驗(yàn)化合物在4個(gè)細(xì)胞系中的每一個(gè)中產(chǎn)生最大反應(yīng)的50％所需的有效濃度(IC50)和將該值與由阿霉素得到的數(shù)值進(jìn)行比較。
在下述范圍內(nèi)用細(xì)胞特異性介質(zhì)稀釋試驗(yàn)化合物
在各孔中加入50μl稀釋物，每個(gè)稀釋物3份，讓細(xì)胞在試驗(yàn)化合物的存在下生長(zhǎng)24小時(shí)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析包括非配對(duì)t測(cè)驗(yàn)，若合適的話。顯著性程度選擇為P＜0.05。
觀察和檢查結(jié)果如下。在所試驗(yàn)的4個(gè)癌細(xì)胞系中，化合物A和阿霉素產(chǎn)生[3H]胸苷攝取的濃度依賴性抑制。產(chǎn)生最大反應(yīng)的50％的濃度(IC50)值由曲線擬合分析法得到。IC50值(單位為nM)如下所示，表示3-4個(gè)每個(gè)重復(fù)3次的試驗(yàn)的平均值(括號(hào)內(nèi)是95％的置信限)。<
>結(jié)果表明，化合物A在所有4個(gè)體外細(xì)胞系中抑制細(xì)胞增殖的效能小于阿霉素。但兩個(gè)化合物同等有效。
對(duì)體外試驗(yàn)結(jié)果的討論和結(jié)論表明，在所研究的4個(gè)細(xì)胞系中的每一個(gè)中，化合物A和阿霉素均完全消除了[3H]胸苷的細(xì)胞參入。如IC50值之比(強(qiáng)度比)所示，阿霉素抑制[3H]胸苷參入所有4個(gè)細(xì)胞系的能力強(qiáng)于化合物A(P＜0.05)。見(jiàn)圖3-6。這些研究證實(shí)，化合物A和阿霉素均是強(qiáng)有力的癌細(xì)胞體外增殖抑制劑。圖8a-c是圖示與已知的阿霉素化合物和對(duì)照樣本相比，本發(fā)明化合物對(duì)心臟組織的影響的顯微照片。
體內(nèi)研究顯示，化合物A在小鼠白血病模型中可有效地延長(zhǎng)生存期而全身毒性小于阿霉素(具體結(jié)果如下所示)。
下面敘述化合物A對(duì)小鼠P388白血病的效果。
在第0日在CDF1雄性小鼠腹膜內(nèi)接種106個(gè)P388鼠白血病細(xì)胞。在第1至第9日，往腹膜內(nèi)注射阿霉素或化合物A。每日測(cè)量體重并記錄生存情況。在一個(gè)這樣的研究中，給小鼠注射阿霉素或化合物A的劑量為0.8mg/kg/日。在第22日，在賦形劑組中，小鼠的生存率為0/8，阿霉素組為7/8，化合物A組為5/8。阿霉素和化合物A相對(duì)于賦形劑有顯著性差異，而它們彼此之間則沒(méi)有。
在另一個(gè)同樣的鼠白血病模型研究中，阿霉素的注射劑量為0.8mg/kg/日，而化合物A的注射劑量為1.6、2.4或3.2mg/kg/日。
表 3
上面的數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；*相對(duì)于賦形劑，P＞0.05；#相對(duì)于阿霉素，P＜0.05。
在第19日，化合物A的劑量為1.6mg/kg/日，其抑制由白血病發(fā)展及伴隨的腹水導(dǎo)致的體重增加的療效幾乎與阿霉素相同。當(dāng)化合物A的劑量為2.4和3.2mg/kg/日時(shí)，其抑制體重增加的療效大于阿霉素。在第25日，所有劑量的化合物A在維持生存方面與阿霉素同樣有效。到第32日為止，與賦形劑和阿霉素比較，僅化合物A(3.2mg/kg/日)有效地延長(zhǎng)了生存期。在該研究中所用的阿霉素劑量是該模型的最大有效劑量。阿霉素劑量增大實(shí)際上會(huì)降低生存率。因此，雖然化合物A的強(qiáng)度小于阿霉素，但在較大劑量水平上，它比阿霉素更能有效地延長(zhǎng)生存期。
業(yè)已用Mushlin等在Br.J.Pharmacol.，110975-982，1993中描述的家兔心臟模型顯示，化合物B(柔紅霉素的13-脫氧類似物)也沒(méi)有柔紅霉素在體外心臟收縮功能方面的心臟毒性。結(jié)果示于圖7。
如下所示，也用體內(nèi)大鼠模型顯示，化合物B沒(méi)有阿霉素的心臟毒性。下面的討論證實(shí)，在下面的大鼠靜脈內(nèi)注射中所用的本發(fā)明化合物B沒(méi)有心臟毒性作用。
在雄性Sprague Dawley大鼠的靜脈中每隔一天注射柔紅霉素鹽酸鹽或化合物B鹽酸鹽水溶液(5mg/kg/日)，注射3次(總劑量15mg/kg/日)。另用賦形劑作對(duì)照。第一次注射后第7日，在各大鼠的腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)使其麻醉。把導(dǎo)管插入大鼠的氣管內(nèi)使其呼吸100％氧氣。用加熱燈和溫度控制器使其體溫維持在37℃。在右頸動(dòng)脈中插入導(dǎo)管并伸入主動(dòng)脈中，用Statham壓力傳感器和Gould記錄儀記錄平均動(dòng)脈壓(MAP)和心率(HR)。然后將導(dǎo)管伸入左心室中記錄左室收縮壓(LVSP)、最大左室dP/dt(dP/dt)和左室舒張末期壓(LVEDP)。
在用柔紅霉素處理過(guò)的大鼠中，與賦形劑對(duì)照組相比，MAP、LVSP和dP/dt明顯地大大下降了(表4)。在用柔紅霉素處理過(guò)的大鼠中，體重也顯著下降了。而在賦形劑對(duì)照組與用化合物B處理過(guò)的大鼠之間，它們的MAP、LVSP和dP/dt和體重大同小異(表5)。這些數(shù)據(jù)顯示，在柔紅霉素會(huì)使心臟收縮力和心臟功能產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性下降的劑量水平上，化合物B沒(méi)有心臟毒性。結(jié)果表明，化合物B可以治療劑量給藥而不會(huì)產(chǎn)生心臟毒性，而相同治療劑量的柔紅霉素則會(huì)削弱心臟功能。
表4反復(fù)給藥后柔紅霉素和賦形劑對(duì)大鼠左心室功能的影響
表4中的數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；每隔一日在大鼠靜脈內(nèi)注射化合物(5mg/kg/日)，共3次；在第一次注射后第7日進(jìn)行測(cè)定。體重1＝第0日的體重，體重2＝第7日的體重。*表示相對(duì)于賦形劑，p＜0.05。
表5反復(fù)給藥后化合物B和賦形劑對(duì)大鼠左心室功能的影響
每隔一日在大鼠靜脈內(nèi)注射化合物(5mg/kg/日)，共3次；在第一次注射后第7日進(jìn)行測(cè)定。體重1＝第0日的體重，體重2＝第7日的體重。
也用家兔慢性阿霉素心臟毒性模型對(duì)化合物A進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在該模型中，阿霉素削弱了心臟功能，其組織病理學(xué)變化與長(zhǎng)期用阿霉素治療的人的類似。在用阿霉素處理過(guò)的6只家兔中，有5只出現(xiàn)心臟組織病理學(xué)變化和/或功能損傷。在同樣條件下，化合物A未出現(xiàn)與臨床相關(guān)的心臟毒性。
本發(fā)明化合物無(wú)心臟毒性得到下述研究結(jié)果的支持，在該研究中，用慢性家兔模型評(píng)估了阿霉素和化合物A的心臟毒性。
根據(jù)該研究，將24只雄性新西蘭白兔隨機(jī)分成4組。往6只家兔耳緣靜脈內(nèi)注射阿霉素(1mg/kg)，每周2次，共8周。往另外6只家兔耳緣靜脈內(nèi)注射化合物A(1mg/kg)，每周2次，共8周。每日監(jiān)測(cè)阿霉素注射組和化合物A注射組的家兔的食物消費(fèi)并給性別和年齡相當(dāng)?shù)淖鳛閷?duì)照的家兔喂食相同量的食物，同時(shí)在對(duì)照組家兔耳緣靜脈內(nèi)注射賦形劑(0.9％氯化鈉)，每周2次，共8周。在研究過(guò)程中每周用多普勒超聲技術(shù)監(jiān)測(cè)主動(dòng)脈根的加速。從研究的第10周開(kāi)始，每隔一周用M型超聲心動(dòng)圖測(cè)定縮短分?jǐn)?shù)(fractionalshortening)并持續(xù)至研究結(jié)束。在研究開(kāi)始后第20周開(kāi)始或者當(dāng)縮短分?jǐn)?shù)小于25％或至少3周維持在25-29 ％時(shí)，讓家兔安樂(lè)死。由各被處死的家兔制備左心室乳頭肌、左心室游離壁和心尖樣本以便進(jìn)行組織病理學(xué)分析，并由對(duì)處理過(guò)程不了解的組織病理學(xué)家進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)液泡形成、肌原纖維退化、單核性炎癥和壞死的程度，將損害分成輕微、中等或嚴(yán)重。在阿霉素處理組、化合物A處理組、阿霉素對(duì)照組和化合物A對(duì)照組(每組6只家兔)中，分別有4只、0只、1只和0只家兔出現(xiàn)縮短分?jǐn)?shù)異常。在阿霉素處理組、化合物A處理組、阿霉素對(duì)照組和化合物A對(duì)照組(每組6只家兔)中，分別有3只、0只、0只和0只家兔出現(xiàn)異常的主動(dòng)脈根加速(其數(shù)值在9m/s/s以下)。在阿霉素處理組中，6只家兔均出現(xiàn)輕微至嚴(yán)重的組織病理學(xué)異常；而用化合物A處理的6只家兔中有2只出現(xiàn)輕微的組織病理學(xué)異常。在二個(gè)對(duì)照組的家兔心臟組織中，均未發(fā)現(xiàn)組織病理學(xué)損害。當(dāng)3個(gè)心臟毒性試驗(yàn)中的至少2個(gè)為異常時(shí)，確定心臟總體狀態(tài)為異常。使用這些標(biāo)準(zhǔn)，阿霉素處理組的6只家兔中，5只家兔的心臟總體狀態(tài)為異常；在其它3個(gè)組中，沒(méi)有1只家兔異常(P＜0.05，F(xiàn)isher氏Exact檢驗(yàn))。與阿霉素相比，化合物A在所試驗(yàn)的劑量水平上基本上沒(méi)有心臟毒性。此外，化合物A對(duì)血液變化和體重增加沒(méi)有明顯的影響，而阿霉素明顯地使血液學(xué)產(chǎn)生了變化并抑制了體重增加。在該給藥方案中，化合物A對(duì)家兔的心臟毒性和全身性毒性小于阿霉素。
評(píng)估心臟毒性實(shí)驗(yàn)的目的包括用慢性家兔模型比較化合物A與阿霉素的心臟毒性。
67％(4/6)的用阿霉素處理過(guò)的家兔出現(xiàn)左心室縮短分?jǐn)?shù)異常。在6只用阿霉素處理過(guò)的家兔中有3只(50％)出現(xiàn)異常的主動(dòng)脈根加速。而用化合物A處理過(guò)的家兔無(wú)一有任何心臟毒性的功能性跡象。最敏感的心臟毒性指標(biāo)是組織病理學(xué)變化。所有用阿霉素處理過(guò)的家兔均出現(xiàn)以肌細(xì)胞液泡形成和肌原纖維喪失為主要特征的組織病理學(xué)損害。6只家兔中有4只出現(xiàn)輕微心臟毒性，1只有中等損害，1只有嚴(yán)重?fù)p害。用化合物A處理過(guò)的6只家兔中有2只有輕微組織病理學(xué)損害(見(jiàn)圖8)。將所有3個(gè)心臟毒性試驗(yàn)的結(jié)果匯總，在阿霉素處理組的6只家兔中有5只出現(xiàn)心臟狀態(tài)異常，而化合物A處理組則1只也沒(méi)有(P＜0.02，F(xiàn)isher氏Exact檢驗(yàn))。當(dāng)3個(gè)心臟毒性試驗(yàn)中的至少2個(gè)為異常時(shí)，確定心臟總體狀態(tài)為異常。在研究過(guò)程的第8周，從耳緣動(dòng)脈采取血樣以得到血細(xì)胞讀數(shù)。與用賦形劑或化合物A處理的動(dòng)物相比，用阿霉素處理使白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、血紅蛋白、平均微粒血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞分布寬度出現(xiàn)顯著性下降(P＞0.05)。與賦形劑相比，化合物A不改變這些變數(shù)，只是紅細(xì)胞分布寬度略有增加。此外，與化合物A處理相比，阿霉素處理抑制了體重增加。用化合物A處理的家兔在研究開(kāi)始時(shí)和結(jié)束時(shí)的體重分別為3.17±0.06kg和4.10±0.10kg，而用阿霉素處理的家兔在研究開(kāi)始時(shí)和結(jié)束時(shí)的體重分別為3.19±0.10kg和3.54±0.06kg(P＞0.05，單向方差分析，Duncan氏新的多重范圍檢驗(yàn))。
異常主動(dòng)脈根加速被定義為數(shù)值在9.0以下。加速度單位為m/s/s。N＝正常心臟功能；A＝異常心臟功能。
往大鼠的靜脈內(nèi)注射1mg/kg的阿霉素(DOX)或化合物A(DOXA)，每周2次，共8周(總累積劑量為16mg/kg)。對(duì)年齡相當(dāng)、喂食同樣飼料的阿霉素對(duì)照組(C)或化合物A對(duì)照組(CX)的大鼠僅注射賦形劑。
阿霉素組與化合物A、CX或C組存在顯著性差異(P＜0.05；2X2列聯(lián)Chi方分析(2X2 continguency Chi square analysis)，雙尾)。
往大鼠的靜脈內(nèi)注射1mg/kg的阿霉素(DOX)或化合物A(DOXA)，每周2次，共8周(總累積劑量為16mg/kg)。對(duì)年齡相當(dāng)、喂食同樣飼料的阿霉素對(duì)照組(C)或化合物A對(duì)照組(CX)的大鼠僅注射賦形劑。
N＝心臟功能或組織病理學(xué)正常；A＝心臟功能或組織病理學(xué)異常。當(dāng)3個(gè)心臟毒性試驗(yàn)中的至少2個(gè)為異常時(shí)，定義心臟總體狀態(tài)為異常。異常的縮短分?jǐn)?shù)的定義是，趨勢(shì)或維持值在25％左右或更低。異常主動(dòng)脈加速的定義為其數(shù)值在9.0mists以下。組織病理學(xué)異常的定義是，出現(xiàn)液泡、肌原纖維損害和單核性炎癥(參見(jiàn)上面關(guān)于方法的討論)。組織病理學(xué)變化如前所述評(píng)價(jià)為正常、輕微、中等或嚴(yán)重。與化合物A、C和CX組相比，阿霉素處理組中總體心臟狀態(tài)異常的大鼠明顯地更多(P＜0.02，F(xiàn)isher氏Exact檢驗(yàn)，雙尾)。
表6化合物A對(duì)兔心臟毒性的評(píng)價(jià)
1劑量1mg/kg，每周2次，共8周2異常組織病理學(xué)液泡、肌原纖維損害3相對(duì)于阿霉素，p＜0.02由心臟毒性研究得出的結(jié)論是，在本發(fā)明中，化合物A不改變心臟功能，在6只家兔中，僅2只有輕微的組織病理學(xué)影響。另一方面，在阿霉素處理組的6只家兔中，有5只的心臟功能發(fā)生了變化，在該心臟毒性的慢性家兔模型中，所有的家兔均出現(xiàn)了組織病理學(xué)異常。與阿霉素相比，化合物A在所試驗(yàn)的劑量水平上基本上沒(méi)有心臟毒性。此外，化合物A對(duì)血液學(xué)和體重增加沒(méi)有明顯的影響，在本發(fā)明的給藥方案中，化合物A對(duì)家兔的心臟毒性和全身性毒性小于阿霉素。
用小鼠進(jìn)行的亞急性毒性試驗(yàn)也顯示，化合物A的骨髓毒性小于阿霉素。具體結(jié)果如下。
表7化合物A對(duì)小鼠紅血細(xì)胞和骨髓淋巴細(xì)胞的影響(n＝4-5)
在第1、5和9日靜脈注射藥物。在第15日進(jìn)行測(cè)定。數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。+表示不同于賦形劑，p＜0.05；#表示不同于化合物A，p＜0.05。二個(gè)劑量均是最大亞致死劑量。
上述研究的結(jié)果清楚地表明，化合物A是阿霉素的無(wú)心臟毒性形式。由于化合物A保留了14-OH部分，因此，化合物A很可能除白血病之外對(duì)治療肉瘤和癌有用。由于化合物A不形成有毒的13-醇型代謝物，因此，預(yù)期其沒(méi)有劑量限制性心臟毒性。由此，與阿霉素不同，只要需要，可用化合物A給藥以緩解病情和/或防止疾病復(fù)發(fā)和病灶轉(zhuǎn)移。在這點(diǎn)上，化合物A和其它13-脫氧蒽環(huán)類抗生素在癌的蒽環(huán)類抗生素化學(xué)治療上是一個(gè)重要的突破。
結(jié)果表明，與化合物A類似的蒽環(huán)類抗生素衍生物應(yīng)比其非13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物對(duì)應(yīng)物在臨床上更有效，因?yàn)榍罢哂捎谄淙矶拘暂^小且沒(méi)有劑量限制性的蓄積性心臟毒性而可以以較高的有效劑量和較長(zhǎng)的時(shí)間給藥。本發(fā)明的用于治療患可用阿霉素和柔紅霉素治療的癌的患者的13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物可以13-酮基型對(duì)應(yīng)化合物的有效或等效累積劑量的至少1.5倍給藥。
本發(fā)明還提供形成13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的改進(jìn)方法。表8提供可根據(jù)本發(fā)明合成的13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的例子。如前面所討論的，已知表8所示的這些化合物具有抗腫瘤性能。
與已知的方法不同，本發(fā)明的方法對(duì)溫度不那么敏感。例如，本發(fā)明的操作可在約0-75℃進(jìn)行。較好的是，本發(fā)明的操作在約65-75℃進(jìn)行。更好的是，本發(fā)明的操作在約68-72℃進(jìn)行。溫度超過(guò)約72℃通常會(huì)使反應(yīng)物和產(chǎn)物分解。
本發(fā)明的方法包括許多一般條件。例如，本發(fā)明的操作最好在酸性條件下進(jìn)行。換言之，pH應(yīng)約為6.5或更低。已知的制備上述化合物的方法在反應(yīng)混合物內(nèi)使用堿性條件，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，這會(huì)使反應(yīng)物和產(chǎn)物分解。反應(yīng)或其任何部分(如僅回流)可在沒(méi)有氧、水和/或氮?dú)夥障掠诟哌_(dá)約75℃進(jìn)行。
此外，反應(yīng)不應(yīng)含氧和水。反應(yīng)最好在氮?dú)夥栈蚨栊詺怏w氣氛下用無(wú)水溶劑進(jìn)行。
本發(fā)明方法的產(chǎn)率遠(yuǎn)高于已知的化合物制備方法。例如，發(fā)現(xiàn)已知方法的產(chǎn)率約為30％。另一方面，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法的產(chǎn)率約為70-80％。
根據(jù)上面所述，本發(fā)明提供制備上述式I化合物的方法。
下面提供反應(yīng)過(guò)程中分子轉(zhuǎn)化的例子。
式中，R1、R2、R3、R4和R5的定義同上。
下面的流程圖舉例說(shuō)明了本發(fā)明的13-脫氧阿霉素(它是13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物)制備方法的一個(gè)實(shí)施方式的例子。
下面是蒽環(huán)類抗生素衍生物的例子及它們的合成。
表 8
在上面的化合物中，R5可以是不同蒽環(huán)類抗生素類似物的變型。此外，可將D環(huán)氟化。
本發(fā)明的方法一般包括用還原劑形成13-脫氧蒽環(huán)類抗生素的溶液。將該溶液溫和地回流。然后，可將反應(yīng)混合物冷卻。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，將反應(yīng)混合物冷卻至約0-4℃。然后往反應(yīng)混合物中加入堿。該堿可以是冷的。例如，堿可約為0-4℃。堿的一個(gè)例子是飽和的碳酸氫鈉水溶液。可往反應(yīng)混合物中加入鹵代烴溶劑?？蓪Ⅺu代烴溶劑與堿一起同時(shí)加入到反應(yīng)混合物中。鹵代烴溶劑可以是冷的。例如，鹵代烴溶劑可約為0-4℃?？捎玫柠u代烴溶劑的例子是氯仿。然后將反應(yīng)混合物過(guò)濾。過(guò)濾也可在較低的溫度下進(jìn)行。例如，過(guò)濾可在約4-15℃進(jìn)行。
上述堿和鹵代烴溶劑的加入最好能促使水解沉淀?？蓪o(wú)機(jī)鹽沉淀物從反應(yīng)混合物中濾去。過(guò)濾后，可將濾液酸化。將濾液用硅膠柱進(jìn)行色譜法分離。可用極性較小的溶劑將疏水性雜質(zhì)洗脫除去。然后可將13-脫氧蒽環(huán)類抗生素產(chǎn)物洗脫下來(lái)并將洗脫物進(jìn)一步純化。
本發(fā)明的方法最好包括在無(wú)水甲醇中用對(duì)甲苯磺酸和氰基氫硼化鈉形成蒽環(huán)類抗生素13-甲苯磺酰腙的溶液。在氮?dú)夥障聦⑷芤簻睾偷鼗亓鳎缓罄鋮s。加入飽和的碳酸氫鈉水溶液和氯仿。濾去鹽沉淀物，用含氯化氫的乙醚將濾液酸化，然后用硅膠柱分離。用氯仿與甲醇的混合液將分解產(chǎn)生的疏水性雜質(zhì)洗脫出來(lái)。用甲醇將產(chǎn)物即13-脫氧蒽環(huán)類抗生素洗脫出來(lái)。通過(guò)制備性HPLC將甲醇洗脫物進(jìn)一步純化。
根據(jù)上述方法的任一個(gè)，在分離13-脫氧蒽環(huán)類抗生素之前或之后，可用一種或多種還原劑和/或可將13-酮基部分還原成亞乙基部分的其他試劑處理13-脫氧蒽環(huán)類抗生素。
下面提供本發(fā)明方法的例子。
實(shí)施例制備13-脫氧阿霉素鹽酸鹽將1g阿霉素13-甲苯磺酰腙鹽酸鹽和2.4g對(duì)甲苯磺酸溶解在50mL無(wú)水甲醇中。往該溶液中加入0.8g氰基氫硼化鈉。將所得溶液加熱至68-72℃并在氮?dú)夥障聹睾突亓鞑⒈３?小時(shí)。
然后將反應(yīng)混合物濃縮至約20mL，在冰箱中冷卻至0-4℃。加入2mL飽和的碳酸氫鈉水溶液，然后加入200mL氯仿。加入無(wú)水硫酸鈉，振蕩后濾去鹽。將濾液用含氯化氫的乙醚酸化。
接著將溶液加樣于硅膠柱(2.5×5cm)上。用氯仿/甲醇(10/1)洗脫，直至流出液成無(wú)色。將含產(chǎn)物的結(jié)合流分(bound fraction)用甲醇洗脫。將甲醇洗脫物蒸發(fā)，并將殘余物溶解在30％乙腈/甲酸銨緩沖液(pH＝4.0，0.5％)中，用制備性HPLC分離。用苯基柱和乙腈/甲酸銨梯度(用30分鐘將乙腈從27％增加至30％)將產(chǎn)物與其它雜質(zhì)分離。將HPLC純化的流分凍干，得到13-脫氧阿霉素甲酸鹽固體，然后將其溶解在含氯化氫的甲醇中。蒸去溶劑，將產(chǎn)物沉淀于甲醇/乙醚中，得到600mg13-脫氧阿霉素鹽酸鹽。產(chǎn)率為80％。TLC∶Rf＝0.38 氯仿∶甲醇∶水30101U.V.λmax＝233、252、293、485nmMS530(M+H)
1HNMR(甲醇-d4)(見(jiàn)下面)δ 1.30(d，3H，6′-H3)1.85(m，2H，13-H2)2.05(m，2H，10-H2)2.06(d，1H，12-H)3.05(d，1H，12-H)3.55(m，1H，5′-H)3.90(m，2H，14-H2)4.05(m，3H，O-CH3)4.25(m，1H，4′-H)4.95(m，1H，3′-H)5.40(m，1H，1′-H)7.50(dd，1H，3-H)7.80(m，2H，1-和2-H)。
本發(fā)明還包括對(duì)需要抗癌治療的哺乳動(dòng)物宿主進(jìn)行治療的方法。這些方法包括將抗癌有效量的至少一種式1化合物給藥于宿主。
本發(fā)明化合物的抗癌有效量可根據(jù)哺乳動(dòng)物的種類、體重、年齡、個(gè)體狀況和給藥方式而定。本發(fā)明化合物可通過(guò)常用的方法給藥，既可作為治療劑單獨(dú)給藥，也可與治療劑組合給藥。它們可單獨(dú)地但一般與根據(jù)所選給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐而選擇的藥用載體一起給藥。
給藥劑量當(dāng)然將根據(jù)已知因素(如具體藥劑的藥效特征及其模式和給藥途徑)，接受者的年齡、健康狀況和體重，癥狀的性質(zhì)和程度、同時(shí)進(jìn)行的治療的種類，治療頻率和所希望的效果而變化?；钚猿煞值娜談┝靠杉s為0.001-1000mg/kg體重，最好為0.1至約30mg/kg。
劑型(適合給藥的組合物)含約1-100mg活性成分/單元。在這些藥用組合物中，活性成分通常占組合物總重量的約0.5-95％。
活性成分可以固體劑型(如膠囊、片劑和粉劑)或以液體劑型(如酏劑、糖漿和混懸液)口服給藥。也可以滅菌液體劑型通過(guò)腸胃外給藥?；钚猿煞诌€可通過(guò)鼻內(nèi)(滴鼻劑)或通過(guò)吸入給藥。也可采用其它劑型，如用藥膏或軟膏透皮給藥。
明膠膠囊含活性成分和粉末載體(如乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等)?？捎妙愃频南♂寗┲圃靿褐破Ｆ瑒┖湍z囊均可制成緩釋產(chǎn)品以使藥劑在數(shù)小時(shí)內(nèi)連續(xù)釋放?？稍趬褐破弦蕴腔蚰ぐ?，掩飾不快的味道和防止片劑被空氣破壞，或者可制成腸溶片以在腸胃道中選擇性崩解。
口服液體劑型可含著色劑和調(diào)味劑以使患者更易接受。
一般而言，水、合適的油、鹽水、葡萄糖水溶液及相關(guān)的糖溶液和二醇(如丙二醇或聚乙二醇)適合用作腸胃外給藥用溶液的載體。腸胃外給藥用溶液最好含活性成分的水溶性鹽、合適的穩(wěn)定劑，如果需要，最好還含緩沖物質(zhì)?？寡趸瘎?如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸)是合適的穩(wěn)定劑，它們可單獨(dú)使用，也可組合使用。也可使用檸檬酸及其鹽和乙二胺四乙酸鈉。
此外，靜脈內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射用劑型可含凍干粉末，在注射時(shí)可將該粉末用注射用滅菌的水或滅菌的鹽水重新配制。這些溶液可含防腐劑，如苯扎氯銨、羥苯甲酯或羥苯丙酯、三氯叔丁醇。
合適的藥用載體在本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考書(shū)Remington′s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Company出版)中有敘述。
權(quán)利要求
1.對(duì)需要抗癌治療的哺乳動(dòng)物宿主進(jìn)行治療的方法，該方法包括以下步驟將抗癌有效量的至少一種式1表示的化合物給藥于宿主而沒(méi)有總累積劑量的限制
式中，R1是H或OH；R2是H、OH或OMe；R3是H或OH；R4是H或OH；R5是碳水化合物或取代的碳水化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述總累積劑量是相應(yīng)的13-酮基型化合物的等效累積劑量的至少1.5倍。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述化合物是13-脫氧阿霉素。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述化合物具有以下結(jié)構(gòu)式
5.制備13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的方法，該方法包括以下步驟形成蒽環(huán)類抗生素13-甲苯磺酰腙的溶液；加入還原劑，將13-酮基部分還原成亞甲基部分；將上述溶液回流；使反應(yīng)混合物冷卻；加入飽和的碳酸氫鈉水溶液；往反應(yīng)混合物中加入鹵代烴類溶劑；將反應(yīng)混合物過(guò)濾；將濾液酸化；對(duì)濾液進(jìn)行色譜法分離，分離出13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物。
6.制備13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的方法，該方法包括以下步驟在無(wú)水甲醇中用對(duì)甲苯磺酸和氰基氫硼化鈉形成蒽環(huán)類抗生素13-甲苯磺酰腙的溶液；在氮?dú)夥障聦⑷芤簻睾偷鼗亓?；將溶液冷卻；往溶液中加入飽和的碳酸氫鈉水溶液和氯仿，形成沉淀物；濾去沉淀物；用含氯化氫的乙醚將濾液酸化；用硅膠柱分離出含于濾液中的鹽；用氯仿與甲醇的混合液將鹽分解產(chǎn)生的疏水性雜質(zhì)洗脫出來(lái)；用甲醇將13-脫氧蒽環(huán)類抗生素產(chǎn)物洗脫出來(lái)；用制備性HPLC將甲醇洗脫物進(jìn)一步純化。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述溶液的pH為6.5或以下。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述回流在約68-72℃進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述回流在約65-75℃進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述回流在高達(dá)約75℃的溫度下進(jìn)行。
11.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述回流在沒(méi)有氧的條件下進(jìn)行。
12.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述回流在沒(méi)有水的條件下進(jìn)行。
13.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述回流在氮?dú)夥障逻M(jìn)行。
14.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述回流在惰性氣體氣氛下進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求6所述的方法，該方法的產(chǎn)率約為70-80％。
16.制備13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的方法，該方法包括以下步驟形成蒽環(huán)類抗生素13-甲苯磺酰腙的溶液；加入還原劑；將上述溶液回流；使反應(yīng)混合物冷卻；加入飽和的碳酸氫鈉水溶液；往反應(yīng)混合物中加入鹵代烴類溶劑；將反應(yīng)混合物過(guò)濾；將濾液酸化；對(duì)濾液進(jìn)行色譜法分離，分離出13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物。
17.制備13-脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物的方法，該方法包括以下步驟將約1g的阿霉素13-甲苯磺酰腙鹽酸鹽和約2.4g的對(duì)甲苯磺酸溶解在約50mL的無(wú)水甲醇中形成溶液；往該溶液中加入約0.8g的氰基氫硼化鈉；將該溶液加熱至約68-72℃；在氮?dú)夥障聦⒃撊芤簻睾偷鼗亓骷s1小時(shí)；將反應(yīng)混合液濃縮至約20mL；將反應(yīng)混合液在冰箱中冷卻至約0-4℃；往反應(yīng)混合液中加入約2mL的飽和的碳酸氫鈉水溶液；往反應(yīng)混合液中加入約200mL的氯仿；加入無(wú)水硫酸鈉；振蕩后將由加入無(wú)水硫酸鈉而產(chǎn)生的鹽濾去；用含氯化氫的乙醚將濾液酸化；將溶液加樣于硅膠柱中；再用氯仿/甲醇洗脫至洗脫液為無(wú)色；用甲醇洗脫出含產(chǎn)物的流分；將甲醇洗脫液蒸發(fā)；將由蒸發(fā)而得到的殘余物溶解在含30％乙腈的甲酸銨緩沖液中；用苯基柱對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行制備性HPLC分離；用乙腈/甲酸銨梯度將產(chǎn)物與其它雜質(zhì)分離；將經(jīng)HPLC純化的流分凍干，得到約600mg的13-脫氧阿霉素鹽酸鹽。
全文摘要
作為無(wú)心臟毒性的蒽環(huán)類抗生素衍生物的13－脫氧蒽環(huán)類抗生素衍生物及其制備方法。
文檔編號(hào)C07H15/252GK1270522SQ98809247
公開(kāi)日2000年10月18日 申請(qǐng)日期1998年8月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月13日
發(fā)明者張席妮, R·D·奧爾森, G·M·沃爾什 申請(qǐng)人:杰姆藥物股份有限公司