專利名稱：抗真菌多肽和用于控制植物致病真菌的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及可從苜蓿屬植物中獲得的抗真菌多肽，以及用該抗真菌多肽控制致病真菌的方法?？蓪⑺隹拐婢嚯闹苯佑迷谥参锷?，以能產(chǎn)生所述多肽的微生物形式用在植物上，或?qū)λ鲋参镞M(jìn)行遺傳學(xué)修飾，使其能產(chǎn)生所述多肽。本發(fā)明還涉及DNA序列，用該DNA轉(zhuǎn)化過(guò)的微生物和植物，以及用于控制植物致病真菌的組合物。
相關(guān)技術(shù)的說(shuō)明防止農(nóng)業(yè)上重要的作物免受蟲害和病害是本領(lǐng)域所關(guān)心的重點(diǎn)。真菌感染是潮濕氣候下的一個(gè)特殊問(wèn)題，并可能是作物貯存期間的主要問(wèn)題。植物業(yè)已形成了一定程度的、對(duì)病原性真菌的天然抗性；不過(guò)，現(xiàn)代種植方法，收獲和貯存系統(tǒng)通常提供了有利于植物病原體的環(huán)境。
除了以上問(wèn)題之外，不同真菌的數(shù)量也會(huì)導(dǎo)致問(wèn)題。下列真菌屬的真菌會(huì)導(dǎo)致真菌病害鏈格孢屬；殼二孢屬；葡萄孢屬；尾孢菌屬；刺盤孢屬；色二孢屬；白粉菌屬；鐮孢屬；頂囊殼屬；長(zhǎng)蠕孢屬；殼球孢屬；叢赤殼屬；霜霉屬；莖點(diǎn)霉屬；瘤梗孢屬；疫霉屬；單軸霉屬；柄孢殼屬；柄銹菌屬；腐霉屬；核腔菌屬；Pyricularia；絲核菌屬；小核菌屬；核盤菌屬；殼針孢屬；梭殼孢屬；鉤絲殼屬；黑星菌屬；和輪枝孢屬。因此，殺真菌化合物并非總是有效的，因?yàn)槠浠钚钥赡芫窒抻谏贁?shù)幾個(gè)種。
抑制植物病原體活性的一種方法是鑒定并提取對(duì)這些病原體具有很高活性的化合物，事實(shí)上，業(yè)已提取到若干種對(duì)多種植物病原性真菌具有抗真菌活性的多肽和蛋白(Bowles，1990；Brears等，1994)。所述抗真菌多肽和蛋白包括殼多糖酶，富半胱氨酸殼多糖結(jié)合蛋白，β-1，3-葡聚糖酶，透肽菌素(包括zeamatins)，硫素，核糖體-滅活蛋白，和非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白，所述蛋白被認(rèn)為在植物的抗真菌感染的防御機(jī)制中起著重要作用。例如，在歐洲專利申請(qǐng)0 392 225中證實(shí)了將天然蛋白制品用于控制植物病原體的用途。
最近，業(yè)已發(fā)現(xiàn)另一類植物蛋白能在抵御植物病原體感染方面起著防衛(wèi)素的作用(PCT國(guó)際公開WO93/05153)。Rs-AFP1和Rs-AFP2是從蘿卜種子中分離的兩種小的富半胱氨酸蛋白，已發(fā)現(xiàn)將所述純的蛋白加入體外抗真菌試驗(yàn)培養(yǎng)基中時(shí)能抑制病原性真菌的生長(zhǎng)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)含有編碼Rs-AFP2蛋白的基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株比未轉(zhuǎn)化的植株具有更強(qiáng)的抗真菌感染的能力。
業(yè)已從很多其它植物中提取到類似于蘿卜種子Rs-AFP2的蛋白(PCT國(guó)際公開WO93/05153；Broekaert等1995)。這一類型的所有蛋白在其氨基酸序列方面具有相似性，但其在抗各種真菌的抗真菌活性方面不同，特別是在有不同的一價(jià)-和二價(jià)鹽存在的情況下更是如此。在有1mMCaCl2和50mM KCl的條件下某些抗真菌蛋白的抗真菌活性會(huì)顯著降低(Terras等，1992)。將抗真菌蛋白用于遺傳工程植物抗病性的用途會(huì)因?yàn)榭拐婢钚詫?duì)鹽的濃度的敏感性而受到極大的影響，因?yàn)?，諸如K+，Na+，Ca2+和Mg2+的金屬離子是正常的生理功能所必需的，因此，這些離子大量存在于植物細(xì)胞中。
業(yè)已在宿主-病原體相互作用之后提取了豌豆cDNA(Chiang等，1991)，該cDNA pI230是在受到病原體腐皮鐮孢病原體感染以后所產(chǎn)生的一類cDNA的一部分，這種DNA能在相容性Sacc.f.Sp.pisi和不相容性f.sp.phaseoli相互作用中產(chǎn)生。不過(guò)，該基因的蛋白產(chǎn)物沒有報(bào)導(dǎo)，其功能也是未知的。
最近，重組DNA技術(shù)業(yè)已導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因植物的出現(xiàn)，這種植物能表達(dá)對(duì)某些病害具有抗微生物活性的蛋白。例如，在有關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)了轉(zhuǎn)化多種不同雙子葉植物并獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法(參見Gasser和Fraley(1989)；Fisk和Dandekar(1993)；Christou(1994)，以及本文所引用的參考文獻(xiàn))。
類似地，用于生產(chǎn)單子葉植物的轉(zhuǎn)基因植物的方法也有大量報(bào)導(dǎo)。業(yè)已在下列植物中取得了轉(zhuǎn)化和植株再生的成功石刁白(Asparagusofficinalis；Bytebier等(1987))；大麥(Hordeum vulgare；Wan和Lemaux(1994))；玉米(Zea mays；Rhides等(1988))；Gordon-Kamm等(1990)；Fromm等(1990)；Koziel等(1993)；燕麥(Avena sativa，Somers等(1992))；鴨茅(Dactyles glomerata；Horn等(1988))；稻(Oryza sativa，包括印度和日本變種；Toriyama等(1988))；Zhang等(1988)；Luo和Wu(1988)；Zhang和Wu(1988)；Christou等(1991)；黑麥(Secale cereale；De la Pena等(1987))；高粱(Sorghum bicolor；Cassas等(1993))；甘蔗(Saccharum spp.；Bower和Birch(1992))；葦狀羊茅(Festuca arundinacea；Wang等(1992))；草坪草(Agrostis palustris，Zhong等(1993))；小麥(Triticum aestivum；Vasil等(1992))；Troy Weeks等(1993)；Becker等(1994))。
在很多出版物中都披露了植物和細(xì)菌葡聚糖酶、殼多糖酶的用途，而在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生的溶菌酶對(duì)諸如真菌的各種微生物具有較強(qiáng)的抗性。所述出版物包括EP0 292 435，EP0 290 123，WO88/00976，US4,940,840，WO90/07001，EP0 392 225，EP0 307 225，EP0 307 104，EP0 440 304，EP0 418 695，EP0 448 511，和WO91/06312。在WO91/18984中披露了通過(guò)滲透蛋白-樣蛋白的表達(dá)所獲得的保護(hù)作用。
因此，一直存在著鑒定抗生化合物的必要性，特別是能有效抗植物病原體真菌的化合物，這些化合物無(wú)論是作為組合物直接用在受感染的植物上或在轉(zhuǎn)基因植物中以足于產(chǎn)生抗所述病原體的量表達(dá)時(shí)，都能有效抗植物病原體真菌。
2.0發(fā)明概述2.1新型抗真菌多肽本發(fā)明涉及新的抗真菌多肽的發(fā)現(xiàn)，該多肽具有抗植物病原性真菌和其它真菌的寬的抗真菌活性譜。編碼該多肽的DNA與存在于植物中的其它抗真菌多肽相比沒有明顯的序列同源性，業(yè)已證實(shí)該基因在轉(zhuǎn)基因植物中所表達(dá)的編碼多肽的量足以產(chǎn)生抗真菌感染的保護(hù)作用。這種新型肽代表了可從苜蓿植物中獲得的一種新的類型的蛋白抗真菌劑。
一方面，本發(fā)明提供了一種含有序列2所示氨基酸序列(AlfAFP1)和序列14所示氨基酸序列(AlfAFP2)的分離的抗真菌多肽，及其生物學(xué)功能等同物。AlfAFP1和AlfAFP2或其生物學(xué)功能性等同物可以從植物中提取，或通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適方法生產(chǎn)或合成，包括直接化學(xué)合成，在諸如微生物、植物、和動(dòng)物系統(tǒng)，組織培養(yǎng)物、細(xì)胞培養(yǎng)物、或體外翻譯系統(tǒng)的異源生物系統(tǒng)中合成。
本發(fā)明還提供了編碼所披露的抗真菌多肽的分離的DNA序列，和遺傳構(gòu)建體，以及用于將所述DNA序列插入宿主細(xì)胞以便生產(chǎn)由該DNA所編碼的多肽的方法。這種新型核酸片段包括兩個(gè)alfAFP基因，這些基因具有在圖1、圖2和圖3中示出的，以及如序列6、序列10和序列13所示的核苷酸序列。AlfAFP1的編碼區(qū)如圖1所示，而AlfAFP1和AlfAFP2的編碼區(qū)如圖3所示。
本發(fā)明還提供了用編碼本發(fā)明抗真菌多肽的DNA核苷酸序列轉(zhuǎn)化過(guò)的微生物和植物。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面提供了一種含有序列2所示的氨基酸序列的分離的多肽。
一種編碼上述多肽的分離的DNA分子。該分離的DNA分子可以是含有序列6或序列10所示的核苷酸序列的cDNA分子。另外，該cDNA分子可以包括序列6或序列10所示核苷酸序列的一個(gè)連續(xù)的片段和能在標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格條件下與其雜交的片段。
一種控制真菌對(duì)植物的損害的方法，包括向所述植物的部位提供一種分離的多肽，該多肽含有序列2所示的氨基酸序列或主要由該氨基酸序列組成。在該方法中，可以通過(guò)植物-定居微生物為所述植物部位提供所述多肽，所述微生物能夠產(chǎn)生所述抗真菌多肽，通過(guò)噴施含有所述分離的多肽的組合物向所述植物部位提供所述多肽，或通過(guò)在該植物的細(xì)胞中表達(dá)編碼所述多肽的DNA來(lái)提供這種多肽。
另外，該植物的基因組可以包括一個(gè)或幾個(gè)編碼一種抗真菌肽、多肽或蛋白的額外DNA分子，其中，所述額外的DNA分子能表達(dá)并產(chǎn)生一種抗真菌有效量的所述肽、多肽或蛋白。該額外DNA分子還可以包括下列部分編碼B.t.內(nèi)毒素的DNA，其中，該DNA能表達(dá)并產(chǎn)生一種抗昆蟲有效量的B.t.內(nèi)毒素。所述植物可以是選自下列一組中的一員蘋果、苜蓿、大麥、花莖甘藍(lán)、甘藍(lán)、油菜(canola)、胡蘿卜、柑桔、玉米、棉花、大蒜、燕麥、洋蔥、觀賞植物、豌豆、花生、胡椒、馬鈴薯、稻、黑麥、高粱、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、番茄、草坪草、樹木、藤本植物、蔬菜、和小麥。本發(fā)明還包括由所述植物生產(chǎn)的馬鈴薯繁殖用塊根片。
據(jù)推測(cè)，編碼AlfAFP1和AlfAFP2，包括天然存在的突變蛋白及其變體的基因存在于各種植物物種的基因組中。可以通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)方法從植物物種的染色體DNA中獲得這些基因。例如，可以使用本領(lǐng)域已知方法在諸如細(xì)菌噬菌體載體λEMBL3和λgt10、粘?；蛸|(zhì)粒的載體中構(gòu)建染色體DNA文庫(kù)(Sambrook等，1989)。通過(guò)用染色體DNA或染色體DNA文庫(kù)進(jìn)行PCRTM或通過(guò)基因組DNA文庫(kù)的探針雜交可以提取編碼具有與AlfAFP1的抗真菌活性相同或相似的多肽的基因。為了避免引物-雙鏈的形成，引物應(yīng)當(dāng)不具有自身-互補(bǔ)序列，在其3’末端也不具有互補(bǔ)序列。這些引物可以含有限制位點(diǎn)。將所述引物退火到所述DNA上，并進(jìn)行足夠輪次的PCRTM，以產(chǎn)生通過(guò)凝膠電泳和染色就很容易觀察的產(chǎn)物。所述引物通常至少具有16個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，典型地至少20個(gè)核苷酸長(zhǎng)，優(yōu)選至少24個(gè)核苷酸長(zhǎng)，更優(yōu)選至少28個(gè)核苷酸長(zhǎng)。所述引物能夠特異性地引導(dǎo)具有與AlfAFP1相同或相似的抗真菌活性的抗真菌多肽或蛋白的基因?？梢约兓鰯U(kuò)增的片段并將其插入合適的載體中，并通過(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn)行繁殖。
2.2 將AlfAFP1和AlfAFP2 DNA片段用作雜交探針和引物本發(fā)明所涉及的核酸序列除了能用于指導(dǎo)本發(fā)明抗真菌蛋白或肽的表達(dá)以外，還具有多種其它用途。例如，在核酸雜交實(shí)施方案中，還可將其用作探針或引物。因此，推測(cè)包括這樣一個(gè)序列部分的核酸片段具有特殊用途所述序列由至少14個(gè)核苷酸長(zhǎng)的連續(xù)序列組成，該連續(xù)序列與序列10或序列6的一個(gè)14個(gè)核苷酸長(zhǎng)的連續(xù)DNA片段具有相同的序列或與該序列互補(bǔ)。在某些場(chǎng)合下，還可以使用更長(zhǎng)的連續(xù)的相同序列或互補(bǔ)序列，例如，大約20、30、40、50、100、200、300、400、500bp的序列等(包括所有的中間長(zhǎng)度，并可以達(dá)到和包括507bp的全長(zhǎng)序列)。
所述核酸探針能與抗真菌蛋白編碼序列特異雜交的能力，使其能被用于檢測(cè)特定樣品中互補(bǔ)序列的存在。不過(guò)，還可以設(shè)想其它用途，包括將所述序列信息用于制備突變類型的引物或用于制備其它遺傳構(gòu)建體的引物。
將這樣的核酸分子作為雜交探針用于諸如Southern和Northern印跡分析的實(shí)驗(yàn)中是特別理想的該核酸分子的序列部分由10-14、15-20、30、50或者甚至100-200個(gè)核苷酸的連續(xù)核苷酸片段組成，該序列與序列10或序列6的DNA序列相同或互補(bǔ)。一般，較小的片段可被用于雜交實(shí)施方案中，其中，所述連續(xù)的互補(bǔ)片段的長(zhǎng)度可以變化，如大約為10-14和大約100或200個(gè)核苷酸，不過(guò)，根據(jù)人們希望檢測(cè)的互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度，可以使用更大的連續(xù)互補(bǔ)片段。
當(dāng)然，所述片段也可以通過(guò)其它技術(shù)獲得，例如，通過(guò)機(jī)械剪切或通過(guò)限制酶消化。小的核酸片段通過(guò)化學(xué)方法直接合成進(jìn)行制備是比較方便的，例如，像通常所采用的方法那樣用一臺(tái)自動(dòng)寡核苷酸合成儀進(jìn)行合成。另外，還可以通過(guò)使用核酸增殖技術(shù)，如美國(guó)專利US4,683,195和US4,683,202(分別被收作本文的參考文獻(xiàn))中所披露的PCRTM技術(shù)獲得所述片段，通過(guò)將選擇的序列導(dǎo)入重組載體中進(jìn)行重組生產(chǎn)，和通過(guò)分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所普遍公知的其它重組DNA技術(shù)生產(chǎn)。
因此，對(duì)本發(fā)明的核苷酸序列能選擇性地與DNA片段的互補(bǔ)序列形成雙鏈分子的能力可加以利用。根據(jù)所設(shè)想的用途，人們可能需要采用不同的雜交條件，以便獲得探針對(duì)靶序列的不同程度的選擇性。對(duì)需要高選擇性的用途而言，人們通常需要采用較嚴(yán)格的條件來(lái)形成雜合體，例如，人們會(huì)選擇較低的鹽度和/或高的溫度條件，如大約0.02-0.15MNaCl和大約50-70℃的溫度。這樣的選擇條件容許探針和模板或靶鏈之間有很少的錯(cuò)配(如果有的話)，而且，特別適用于提取苜蓿植物抗真菌蛋白編碼DNA片段。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，通過(guò)雜交檢測(cè)DNA片段的技術(shù)是眾所周知的，而美國(guó)專利US4,965,188和US5,176,995(分別被收作本文的參考文獻(xiàn))中所披露的技術(shù)可以作為雜交分析方法的范例。披露于下列文獻(xiàn)中的技術(shù)是特別相關(guān)的Maloy等，1993；Segal，1976；Prokop，1991；和Kuby，1991。
當(dāng)然，對(duì)某些用途來(lái)說(shuō)，例如，當(dāng)人們需要用一種能與潛在的模板雜交的突變型引物鏈制備突變體時(shí)或希望從相關(guān)的種或功能性等同物等中提取苜蓿植物抗真菌蛋白編碼序列時(shí)，通常需要不太嚴(yán)格的雜交條件，以便能形成異源雙鏈。在上述場(chǎng)合下，人們可能需要采用諸如大約0.15-0.9M鹽和大約20-55℃的溫度的條件。因此，可以根據(jù)相對(duì)對(duì)照雜交的正雜交信號(hào)方便地鑒定交叉-雜交種類。一般認(rèn)為，在任何情況下通過(guò)添加較大量的甲酰胺都可以使得雜交條件更嚴(yán)格，提高甲酰胺的濃度能像提高溫度一樣使所述雜合雙鏈去穩(wěn)定。因此，雜交條件可以方便的加以操作，因此，通常是一種根據(jù)所希望的結(jié)果選擇方法。
在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的核酸序列與諸如標(biāo)記物的合適的工具組合使用，用于檢測(cè)雜交是有利的。本領(lǐng)域有多種合適的標(biāo)記工具，包括熒光、放射性、酶或其它配體，如親和素/生物素，所述配體能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，人們可能希望使用熒光標(biāo)記物或諸如脲酶、堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶的酶標(biāo)記物，而不采用放射性或其它對(duì)環(huán)境有害的試劑。就酶標(biāo)記物而言，已知比色指示底物可被用于產(chǎn)生能用人的肉眼或通過(guò)分光光度法檢測(cè)到的標(biāo)記，以鑒定與含有互補(bǔ)核酸的樣品的特異雜交。
一般，希望本文所披露的雜交探針既可作為用于溶液雜交中的試劑，又可用作采用固相實(shí)施方案的試劑。在與固相有關(guān)的實(shí)施方案中，將試驗(yàn)DNA(或RNA)吸附或以其它方式固定在一種特定的基質(zhì)或表面上。然后，在希望的條件下將這種固定的、單鏈核酸與特定探針進(jìn)行特異雜交。特定的雜交條件取決于以特定指標(biāo)要求為基礎(chǔ)的特定場(chǎng)合(例如，取決于G+C含量，靶核酸的類型，核酸的來(lái)源，雜交探針的大小等)。洗滌雜交表面，以除去非特異結(jié)合的探針分子，然后通過(guò)所述標(biāo)記物檢測(cè)特異雜交，甚至進(jìn)行定量。
本發(fā)明還提供了可用于從基因組和其它核酸文庫(kù)中篩選編碼具有與AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性的肽、多肽、和蛋白的DNA序列的寡核苷酸雜交探針，這些探針可以根據(jù)本文所提供的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。在具體的實(shí)施方案中，所述探針的長(zhǎng)度可以在大約16-28個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)變化，一般其長(zhǎng)度大約為16個(gè)核苷酸，更常見的是大約為20個(gè)核苷酸，優(yōu)選為大約24個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為大約28個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，所述探針可以與編碼具有與AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性的肽、多肽、或蛋白的基因組DNA或其它DNA序列特異雜交。所述寡核苷酸探針可以通過(guò)自動(dòng)合成的方法合成，并可以用諸如放射性核素的報(bào)道分子，例如，32P或生物素對(duì)其5’末端進(jìn)行方便地標(biāo)記。
諸如上文所提到的寡核苷酸探針可用于檢測(cè)基因組或cDNA文庫(kù)。舉例來(lái)說(shuō)，基因組文庫(kù)可以這樣構(gòu)建用諸如Sau3A的限制酶裂解或消化基因組DNA，將由此得到的DNA片段連接到諸如λ噬菌體的合適載體中，并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)，宿主細(xì)胞通常為大腸桿菌(E.coli)。cDNA文庫(kù)是mRNA的互補(bǔ)DNA拷貝，這種文庫(kù)通常是優(yōu)選的，因?yàn)樗@得的克隆沒有存在于基因組DNA上的內(nèi)含子或其它非編碼序列。在任何場(chǎng)合下，基因組和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是熟知的，這些技術(shù)披露于眾多文獻(xiàn)中，例如，Thompson和Thompson，1991.
一旦構(gòu)建成文庫(kù)，即可根據(jù)所采用的載體將該文庫(kù)鋪平板形成菌落或噬菌體，并將重組DNA轉(zhuǎn)移到尼龍或硝酸纖維素膜上。對(duì)所述DNA進(jìn)行變性，中和，并將其固定到所述膜上，然后用所述標(biāo)記探針(報(bào)道分子)與該膜進(jìn)行雜交。在此之后，洗滌所述膜，并檢測(cè)所述報(bào)道分子。然后分離并繁殖具有雜交DNA的菌落或噬菌體。可以用多種方法鑒定含有編碼AlfAFP1和AlfAFP2或具有與AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性的相關(guān)肽、多肽、或蛋白的DNA的候選克隆或PCRTM擴(kuò)增片段。因此，可以用以下方法檢驗(yàn)其所編碼的肽、多肽、或蛋白的抗真菌活性將所述DNA克隆在諸如酵母或大腸桿菌的合適宿主中、并在該宿主中表達(dá)，然后提取所述肽、多肽、或蛋白，通過(guò)諸如例3中所披露的方法分析其抗真菌活性。通過(guò)這種方法，可以提取到編碼AlfAFP1和AlfAFP2、或在生物學(xué)功能上與其相當(dāng)?shù)碾?、多肽、或蛋白的植物核酸，這種核酸可用于控制不希望的真菌并保護(hù)植物免受真菌病原體的侵害。
可以用適當(dāng)設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并寡核苷酸直接篩選基因組文庫(kù)，并可將所分離的編碼序列整合到轉(zhuǎn)化/表達(dá)載體中?？梢杂没贏lfAFP1(序列10)和AlfAFP2(序列14)的核苷酸序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列檢測(cè)從諸如高等植物的生物中分離的基因組DNA和cDNA。所述探針可以與PCRTM技術(shù)組合使用，利用逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增可雜交的cDNA(E.S.Kawasaki，1990)。可將cDNA方便地克隆到合適的轉(zhuǎn)化/表達(dá)載體中，并導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中，例如單子葉和雙子葉植物細(xì)胞。由所述DNA編碼的多肽可以在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)，并用已建立的方法提取，這些方法包括聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡分析。
另外，簡(jiǎn)并寡核苷酸可以用作篩選源于植物的cDNA文庫(kù)的探針，例如，所述文庫(kù)構(gòu)建在諸如λZapII(Stratagene，La jolla，CA)的λ噬菌體載體上。以上述方法分離的cDNA可以轉(zhuǎn)入合適的轉(zhuǎn)化/表達(dá)載體中，以便導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
2.3重組載體和抗真菌蛋白表達(dá)在其它實(shí)施方案中，預(yù)計(jì)通過(guò)將所述編碼DNA片段置于重組、或異源啟動(dòng)子的控制之下可以獲得某些優(yōu)點(diǎn)。在本文中，重組或異源啟動(dòng)子是指在其天然環(huán)境中通常不與編碼苜蓿植物抗真菌蛋白或肽的DNA片段結(jié)合的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以包括正常情況下與其它基因結(jié)合的啟動(dòng)子，和/或從任何細(xì)菌、病毒、真核細(xì)胞、或植物細(xì)胞中分離的啟動(dòng)子。當(dāng)然，重要的是使用能在用于表達(dá)的細(xì)胞類型、生物、或者甚至是動(dòng)物中有效指導(dǎo)所述DNA片段表達(dá)的啟動(dòng)子。將啟動(dòng)子和細(xì)胞類型組合用于蛋白表達(dá)的用途是分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所普遍公知的，例如，參見Sambrook等，1989。所使用的啟動(dòng)子可以是組成型的，或誘導(dǎo)型的，并可以在合適條件下使用，以指導(dǎo)所導(dǎo)入的DNA片段的高水平表達(dá)，如有利于重組蛋白或肽的大規(guī)模生產(chǎn)的條件。適用于高水平表達(dá)的合適啟動(dòng)子系統(tǒng)包括，但不限于畢赤酵母表達(dá)載體系統(tǒng)(Pharmacia LKDBiotechnology)。
就制備重組蛋白和肽的表達(dá)實(shí)施方案而言，最理想的是，將最常用的較欠的DNA片段與編碼所述完整的肽序列的DNA片段一起使用。不過(guò)，應(yīng)當(dāng)理解，將較短的DNA片段用于指導(dǎo)苜蓿植物抗真菌肽或表位核心部分的表達(dá)，如可用于制備抗-苜蓿植物抗真菌蛋白抗體的用途也屬于本發(fā)明的范疇。特別有用的是編碼具有大約8-50個(gè)氨基酸的肽抗原的DNA片段，或者所述肽抗原的長(zhǎng)度更優(yōu)選為大約8-30個(gè)氨基酸，進(jìn)一步優(yōu)選大約8-20個(gè)氨基酸。所述肽表位可以是包括源于序列2或序列14的連續(xù)氨基酸序列的氨基酸序列。
2.4苜蓿植物抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因植物在其它方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)能表達(dá)編碼本發(fā)明的新型苜蓿植物抗真菌蛋白的核酸片段的轉(zhuǎn)基因植物的方法。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。一般，該方法包括用含有可操作地連接于alfAFP1或alfAFP2編碼區(qū)的啟動(dòng)子的DNA片段轉(zhuǎn)化的合適的宿主細(xì)胞。所述編碼區(qū)通常可操作地連接于一個(gè)轉(zhuǎn)錄-終止區(qū)，以使得所述啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)所述編碼區(qū)在所述細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，并因此賦予該細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生重組蛋白的能力。另外，在需要控制、調(diào)節(jié)、或降低特定重組苜蓿植物抗真菌蛋白在特定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的表達(dá)量的場(chǎng)合下，本發(fā)明還提供了苜蓿植物抗真菌蛋白反義mRNA的表達(dá)。將反義mRNA用作控制或降低一種細(xì)胞中感興趣的特定蛋白量的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。
本發(fā)明的另一方面包括能表達(dá)編碼本文所披露的一種或幾種新型多肽組合物的基因或基因片段的轉(zhuǎn)基因植物。在本文中，“轉(zhuǎn)基因植物”一詞是指具有整合的DNA序列的植物，所述DNA序列包括，但不限于可能在正常狀態(tài)下不存在的基因、正常狀態(tài)下不能轉(zhuǎn)錄成RNA或翻譯成蛋白(“表達(dá)”)的DNA序列、或人們希望導(dǎo)入未轉(zhuǎn)化的植物中的任何其它基因或DNA序列，如正常情況下可能存在于未轉(zhuǎn)化的植物中的，但人們希望對(duì)該基因進(jìn)行遺傳工程操作或改變其表達(dá)的基因。
在某些場(chǎng)合下，希望本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的基因組能通過(guò)穩(wěn)定導(dǎo)入一個(gè)或幾個(gè)alfAFP1或alfAFP2轉(zhuǎn)基因進(jìn)行擴(kuò)增，所述轉(zhuǎn)基因或者是天然的、合成修飾的、或突變的。在某些場(chǎng)合下，需要將一個(gè)以上的轉(zhuǎn)基因整合到轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞的基因組中。當(dāng)把一個(gè)以上的苜蓿植物抗真菌蛋白編碼DNA片段整合到該植物的基因組時(shí)就是這種情況。在某些場(chǎng)合下，可能需要將一種、兩種、三種、四種、或更多種苜蓿植物抗真菌蛋白(天然的或重組工程生產(chǎn)的)整合到轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物中，并進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。
可能還需要將其它DNA片段整合到一種轉(zhuǎn)基因植物的基因組中，其中，該DNA編碼與所披露的苜?？拐婢鞍撞煌吹钠渌拐婢鞍?，或各種能改善該植物的植物產(chǎn)品的質(zhì)量或農(nóng)藝性狀的其它蛋白。因此，由所述DNA編碼的其它類型的蛋白可以包括抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌或殺昆蟲蛋白，如蘇云金芽孢桿菌(B.t.)蛋白。
在植物中同時(shí)共表達(dá)多種抗真菌和/或其它抗病原體蛋白的優(yōu)點(diǎn)是，它利用了一種以上的控制植物病原體的模式。這樣，當(dāng)表達(dá)兩種或更多種抗真菌蛋白時(shí)，可以降低產(chǎn)生抗性真菌種的可能性，拓寬抗性范圍，并有可能導(dǎo)致協(xié)同抗真菌效果，從而增強(qiáng)抗性水平。與B.t.殺昆蟲毒素蛋白的共表達(dá)，預(yù)計(jì)能在提供對(duì)多種昆蟲幼蟲的抗性方面產(chǎn)生額外的優(yōu)點(diǎn)。殺昆蟲B.t.毒素蛋白業(yè)已在包括谷類植物在內(nèi)的若干種植物中得到表達(dá)。
能產(chǎn)生某些優(yōu)點(diǎn)的其它蛋白同樣能與編碼本發(fā)明多肽的DNA共表達(dá)；包括(1)編碼酶的DNA，如葡萄糖氧化酶(它能將葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡糖酸，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫能對(duì)植物病原體產(chǎn)生廣譜性抗性)；丙酮酸氧化酶；oxylate氧化酶；膽固醇氧化酶；氨基酸氧化酶；和其它將分子氧用作一級(jí)或二級(jí)底物產(chǎn)生包括過(guò)氧化氫在內(nèi)的過(guò)氧化物的其它氧化酶；(2)病理相關(guān)蛋白，如SAR8.2a和SARB.2b蛋白；酸性和堿性形式的煙草PR-1a，PR-1b，PR-1c，PR-1’，PR-2，PR-3，PR-4，PR-5，PR-N，PR-O，PR-O’，PR-P，PR-Q，PR-S，和PR-R蛋白；殼多糖酶，如煙草堿性殼多糖酶和黃瓜殼多糖酶/溶菌酶；諸如黃瓜堿性過(guò)氧化物酶的過(guò)氧化物酶；諸如煙草堿性葡聚糖酶的葡聚糖酶；滲透蛋白-樣蛋白；(3)病毒衣殼蛋白和植物病毒的復(fù)制酶；(4)植物R-基因(抗性基因)，如擬南芥屬RPS2(Bent等，1994)，擬南芥屬RPM1(Grant等，1995)，煙草N-基因和N’-基因(Whitham等，1994)，煙草Cf-9(Jones等，1994)，亞麻L(zhǎng)6(Ellis)等，1995)，和稻Xa21(Song等，1995)。以上基因可以用組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、或能用真菌病原體和其它生物和化學(xué)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的啟動(dòng)子表達(dá)；(5)病原體Avr基因，如黃枝孢(Cladosporium fulvum)Avr9(VanDen Ackerveken等，1992)，該基因可以用病原體或化合物誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)；和(6)參與水楊酸生物合成的基因，如苯甲酸2-羥化酶(Leon等，1995)。
為了免受病原體真菌的侵害，可以導(dǎo)入的優(yōu)選基因包括，例如，來(lái)源于植物的苜蓿植物抗真菌蛋白編碼DNA序列，特別是本文所披露的獲自苜蓿屬的一種或幾種基因，或?yàn)榱私档突蛱岣哕俎Ｖ参锟拐婢鞍自谒鲛D(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的抗真菌活性而通過(guò)遺傳工程方法產(chǎn)生的任何序列。不過(guò)，據(jù)信在其它植物種中也會(huì)存在具有相似的抗真菌活性的高度同源的抗真菌蛋白，所述物種包括，但不限于以下物種擬南芥屬、大麥、花莖甘藍(lán)、甘藍(lán)、油菜、胡蘿卜、玉米、大蒜、洋蔥、豌豆、胡椒、馬鈴薯、稻、大豆、甜菜、煙草、番茄和小麥；諸如曲霉屬，青霉屬，鏈霉屬，鏈格孢屬(蕓苔鏈格孢Alternariabrassicola；馬鈴薯早疫病鏈格孢Alternaria solani)；殼二孢屬(豌豆殼二孢Ascochyta pisi)；葡萄孢屬(灰葡萄孢Botrytis cinerea)；尾孢菌屬(菊池尾孢Cercospora kikuchii；玉米尾孢Cercosporazaea-maydis)；刺盤孢屬(豆刺盤孢Colletotrichumlindemuthianum)；色二孢屬(玉米色二孢Diplodia maydis)；白粉菌屬(禾白粉菌禾本科變種Erysiphe graminis f.sp.graminis；禾白粉菌大麥變種Erysiphe graminis f.sp.hordei)；鐮孢屬(雪腐鐮孢Fusarium nivale；尖鐮孢Fusarium oxysporum；禾本科鐮孢Fusariumgraminearum；大刀鐮孢Fusarium vulmorum；腐皮鐮孢Fusariumsolani；串珠鐮孢Fusarium moniliforme；粉紅鐮孢Fusariumroseum)；頂囊殼屬(禾頂囊殼小麥變種Gaeumanomyces graminisf.sp.tritici)；長(zhǎng)蠕孢屬(大斑病長(zhǎng)蠕孢Helminthosporiumturcicum；灰色長(zhǎng)蠕孢Helminthosporium carbonum；玉米長(zhǎng)蠕孢Helminthosporium maydis)；殼球孢屬(菜豆殼球孢M(jìn)acrophominaphaseolina；Maganaporthe grisea)；叢赤殼屬(Nectriaheamatococca)；霜霉屬(東北霜霉Peronospora manshurica；煙草霜霉Peronospora tabacina)；莖點(diǎn)霉屬(甜菜莖點(diǎn)霉Phoma betae)；瘤梗孢屬(多主瘤梗孢Phymatotrichum omnivorum)；疫霉屬(樟疫霉Phytophthora cinnamomi；惡疫霉Phytophthora cactorum；菜豆疫霉Phytophthora phaseolina；寄生疫霉Phytophthora parasitica；柑桔褐腐疫霉Phytophthora citrothora；大雄疫霉大豆變種Phytophthora megasperma f.sp.sojae；致病疫霉Phytophthorainfestans)；單軸霉屬(葡萄生單軸霉Plasmopara vitivola)；單囊殼屬(白叉絲單囊殼Podosphaera leucotricha)；柄銹菌屬(高粱柄銹菌Puccinia sorghi；條形柄銹菌Puccinia striiformis；小麥柄銹病Puccinia graminisf.sp.tritici；天門冬屬柄銹病Pucciniaasparagi；隱匿柄銹菌Puccinia recondita；落花生柄銹病Pucciniaarachidis)；腐霉屬(瓜果腐霉Pythium aphanidermatum)；核腔菌屬(偃麥草核腔菌Pyrenophora tritici-repentens)；Pyricularia(Pyricularia oryzae)；腐霉屬(終極腐霉Pythium ultimum)；絲核菌屬(立枯絲核菌Rhizoctinia solani；禾本科絲核菌Rhizoctiniacerealis)；Scerotium(Scerotium rolfsii)；核盤菌屬(核盤菌Sclerotinia sclerotiorum)；殼針孢屬(番茄殼針孢Septorialycopersici；大豆殼針孢Septoria glycines；穎枯殼針孢Septorianodorum；小麥殼針孢Septoria tritici)；梭殼孢屬(莖生梭殼孢Thielaviopsis basicola)；鉤絲殼屬(葡萄鉤絲殼Uncinulanecator)；黑星菌屬(蘋果黑星菌Venturia enaequalis)；和輪枝孢屬(大麗花輪枝孢Verticillium dahliae；黃萎輪枝孢Verticilliumalbo-atrum)的微生物；和其它非植物生物。
優(yōu)選的核酸序列是獲自苜蓿植物種子的序列，或?yàn)榱私档突蛱岣哕俎Ｖ参锟拐婢鞍自谒鲛D(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的抗真菌活性而通過(guò)遺傳工程方法產(chǎn)生的序列。
轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且，將在本文中加以討論。當(dāng)然，用于轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞的載體、質(zhì)粒、粘粒、YACs(酵母人工染色體)和DNA片段一般包括操縱子、基因、和本發(fā)明的基因-衍生的序列，這些序列是天然的或合成的，特別是編碼所披露的苜蓿植物抗真菌蛋白的序列。所述DNA構(gòu)建體還可以包括諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多接頭、或者甚至是基因序列的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)可根據(jù)所需要的特定感興趣的基因具有正-或負(fù)-調(diào)節(jié)活性。所述DNA片段或基因可以編碼天然的或改性的苜蓿植物抗真菌蛋白，該蛋白可以在所得到的重組細(xì)胞中表達(dá)，和/或賦予所再生的植株改進(jìn)的表現(xiàn)型。
所述轉(zhuǎn)基因植物可能需要加強(qiáng)單子葉或雙子葉植物的抗真菌抗性，這一目的是通過(guò)將一種或幾種AlfAFP1或AlfAFP2苜蓿植物抗真菌蛋白的轉(zhuǎn)基因DNA片段整合到所述植物中而實(shí)現(xiàn)的，所述抗真菌蛋白對(duì)真菌有毒性。特別優(yōu)選的植物包括小麥、蔬菜、觀賞植物、果樹、蘋果、苜蓿、大麥、花莖甘藍(lán)、甘藍(lán)、油菜、胡蘿卜、柑桔、玉米、棉花、大蒜、燕麥、洋蔥、觀賞植物、豌豆、花生、胡椒、馬鈴薯、稻、黑麥、高粱、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、番茄、草坪草、樹木、和藤本植物。
在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明還涉及由所述轉(zhuǎn)化植物生產(chǎn)的種子、由該種子產(chǎn)生的子代、和由原始轉(zhuǎn)基因植物的子代產(chǎn)生的種子，所述轉(zhuǎn)基因植物是通過(guò)上述方法生產(chǎn)的。所述子代和種子具有穩(wěn)定地整合到其基因組中的苜蓿植物抗真菌蛋白編碼轉(zhuǎn)基因，這些子代以孟德爾方式遺傳通過(guò)導(dǎo)入穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因而產(chǎn)生的性狀。在其基因組中整合了編碼一種或幾種AlfAFP1或AlfAFP2苜蓿植物抗真菌蛋白或多肽的轉(zhuǎn)基因DNA片段的所有的轉(zhuǎn)基因植物均屬于本發(fā)明的范疇。
2.4在單子葉植物中表達(dá)提取AlfAFP1或AlfAFP2用的苜蓿是雙子葉植物。正如由Campbell等(1990)所披露的，盡管單子葉和雙子葉植物在密碼子使用方式方面存在明顯的差異，但眾所周知的是，單子葉植物以類似于雙子葉植物的方式表達(dá)基因。基于上述發(fā)現(xiàn)，似乎雙子葉基因的密碼子使用對(duì)于在單子葉植物中表達(dá)雙子葉基因來(lái)說(shuō)不存在大的障礙。在任何情況下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都熟悉對(duì)密碼子使用進(jìn)行修改以適應(yīng)相應(yīng)的宿主植物的原理(參見Murray等，1989)，而DNA構(gòu)建體的表達(dá)現(xiàn)在已成為本領(lǐng)域中的常規(guī)方法。
2.5位點(diǎn)專一性誘變位點(diǎn)專一性誘變可用于通過(guò)對(duì)基本DNA進(jìn)行專一性誘變制備個(gè)別的肽，或生物學(xué)功能等同的蛋白或肽。該技術(shù)還具有這樣的方便性制備并試驗(yàn)序列變體，例如，通過(guò)將一個(gè)或幾個(gè)核苷酸序列的變化引入該DNA，而引入一種或幾種外源因素。位點(diǎn)專一性誘變可以通過(guò)使用編碼所希望的突變的DNA序列的特異寡核苷酸序列以及足夠數(shù)量的相鄰核苷酸產(chǎn)生變體，通過(guò)以上方法提供具有足夠大小和在所通過(guò)的缺失接頭兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙鏈的序列互補(bǔ)性。通常，優(yōu)選長(zhǎng)度大約為17-25個(gè)核苷酸的引物，在所述序列的結(jié)合點(diǎn)兩側(cè)有大約5-10個(gè)殘基是改變了的。
一般，位點(diǎn)專一性誘變?cè)诒绢I(lǐng)域中是眾所周知的，眾多的出版物可以證實(shí)這一點(diǎn)。可以理解，該技術(shù)通常使用以單鏈形式和雙鏈形式存在的噬菌體載體。用于定點(diǎn)誘變的典型載體包括諸如M13噬菌體的載體。這種裁體很容易通過(guò)商業(yè)渠道獲得，其使用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，一般也是熟知的。雙鏈質(zhì)粒通常也被用于定點(diǎn)誘變中，使用這種質(zhì)?？梢允÷詫⒏信d趣的基因從質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到噬菌體的步驟。
一般，本文所述的定點(diǎn)誘變是通過(guò)首先獲得單鏈載體或?qū)㈦p鏈載體的兩股鏈解鏈而實(shí)現(xiàn)的，在所述載體的序列中包括編碼所需要的肽的DNA序列。通常，通過(guò)合成方法制備具有所需要的突變序列的寡核苷酸引物。然后將該引物與所述單鏈載體退火，并用諸如大腸桿菌聚合酶IKlenow片段的DNA聚合酶處理，以完成所述具有突變的鏈的合成。由此形成一種異源雙鏈，其中的一股鏈編碼原始非突變序列，而第二股帶有所需要的突變。然后將該載體用于轉(zhuǎn)化諸如大腸桿菌細(xì)胞的合適細(xì)胞，篩選含有具有所述突變序列結(jié)構(gòu)的重組載體的克隆。
通過(guò)定點(diǎn)誘變制備特定肽編碼DNA片段的序列變體，提供了一種生產(chǎn)潛在的有用種類的方法，但這不意味著不能用其它方法獲得肽的序列變體和編碼這種肽的DNA序列。例如，可以用諸如羥胺的誘變劑處理編碼所需要的肽序列的重組載體，以獲得序列變體。
2.6 AlfAFP1和AlfAFP2抗體組合物和制備抗體的方法在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明人提出了抗體的用途，所述抗體是與本文所披露的苜蓿植物抗真菌蛋白結(jié)合的單克隆或多克隆抗體。制備和鑒定抗體的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的(例如，參見抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988；該文獻(xiàn)被收作本文的參考資料)。制備單克隆抗體(mAbs)的方法通常沿著與制備多克隆抗體相同的路線開始。簡(jiǎn)單地講，多克隆抗體是這樣制備的用本發(fā)明的免疫原組合物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，并從免疫的動(dòng)物中收集抗血清?？蓪⒍喾N動(dòng)物用于生產(chǎn)抗血清。通常，用于制備抗一抗血清的動(dòng)物是兔、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠或山羊。由于兔具有大量的血，因此，優(yōu)選將兔用于生產(chǎn)多克隆抗體。
正如本領(lǐng)域所眾所周知的，特定組合物的免疫原性可以變化。因此，通常需要加強(qiáng)刺激宿主的免疫系統(tǒng)，這一目的可以通過(guò)將一種肽或多肽免疫原結(jié)合到一種載體上而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選載體的例子是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。還可將諸如卵清蛋白，小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白的其它白蛋白用作載體。將一種多肽與一種載體蛋白綴合的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，所述方法包括使用戊二醛、間馬來(lái)酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯，碳二亞胺和雙-重氮化聯(lián)苯胺。
正如本領(lǐng)域所熟知的，通過(guò)使用非特異性免疫反應(yīng)促進(jìn)劑，可以加強(qiáng)特定免疫原組合物的免疫原性，這種促進(jìn)劑稱被為佐劑。佐劑的例子和優(yōu)選佐劑包括完全弗氏佐劑(一種免疫反應(yīng)的非特異性促進(jìn)劑，含有滅活的結(jié)核分支桿菌)，不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。
用于生產(chǎn)多克隆抗體的免疫原組合物的量根據(jù)免疫原的性質(zhì)和用于免疫的動(dòng)物而變化?？梢杂枚喾N方法施用所述免疫原(皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi))?？梢栽诿庖咧蟮母鱾€(gè)時(shí)間點(diǎn)采集免疫動(dòng)物的血樣以監(jiān)測(cè)多克隆抗體的產(chǎn)生。還可以進(jìn)行第二次加強(qiáng)注射。加強(qiáng)和滴定過(guò)程可以重復(fù)進(jìn)行，直到達(dá)到合適的滴度。當(dāng)達(dá)到所需要的免疫原性水平以后，即可將免疫的動(dòng)物放血，提取和保存血清，和/或?qū)⑺鰟?dòng)物用于制備mAbs。
可以用眾所周知的方法方便地制備mAbs，如在美國(guó)專利US4,196,265中所披露的方法，該專利被收作本文的參考文獻(xiàn)。通常，該方法包括用一種特定的免疫原組合物免疫合適的動(dòng)物。例如，純化的或部分純化的抗真菌蛋白、多肽或肽。以能有效刺激抗體產(chǎn)生細(xì)胞的方法使用所述免疫組合物。優(yōu)選的動(dòng)物為諸如小鼠和大鼠的嚙齒類，不過(guò)，也可以使用兔、綿羊或蛙細(xì)胞。使用大鼠具有某些優(yōu)點(diǎn)(Goding，1986，pp.60-61)，但優(yōu)選小鼠，以BALB/c小鼠為最佳，因?yàn)檫@種小鼠是最常用的，并且通常能產(chǎn)生較高百分比的穩(wěn)定融合體。
在免疫之后，選擇具有產(chǎn)生抗體的潛力的體細(xì)胞，特別是B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)，將其用于mAb制備方案。這種細(xì)胞可以從活檢脾、扁桃體或淋巴結(jié)中獲得，或從外周血樣品中獲得。優(yōu)選脾細(xì)胞和外周血細(xì)胞，選擇前者是因?yàn)樗缓贵w產(chǎn)生細(xì)胞，這些細(xì)胞處于分裂漿母細(xì)胞期，而選擇后者是因?yàn)橥庵苎菀撰@得。通常要對(duì)一組動(dòng)物進(jìn)行免疫，并將具有最高抗體效價(jià)的動(dòng)物脾去掉，通過(guò)用注射器對(duì)所述脾進(jìn)行勻漿-獲得脾淋巴細(xì)胞。通常，源于免疫的小鼠的脾含有大約5×107-2×108淋巴細(xì)胞。
然后，將源于免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞與永生化骨髓瘤細(xì)胞融合，通常，骨髓瘤細(xì)胞是與免疫的動(dòng)物的同一種類。適用于雜交瘤生產(chǎn)融合方法的骨髓瘤細(xì)胞系優(yōu)選為不產(chǎn)生抗體的，具有高的融合效率，并具有酶缺陷，這使得它不能在某些選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，這種選擇培養(yǎng)基僅能支持所需要的融合細(xì)胞(雜交瘤)生長(zhǎng)。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可以使用多種雜交瘤細(xì)胞中的任一種(Goding，1986，pp.65-66；Campbell，1984，pp.75-83)。例如，當(dāng)免疫的動(dòng)物是小鼠時(shí)，可以使用P3-X63/Ag8，X63-Ag8.653，NS1/1.Ag41，Sp210-Ag14，F(xiàn)O，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0 Bul；對(duì)大鼠而言，可以使用R210.RCY3，Y3-Ag1.2.3，IR983F和4B210；而U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2 和UC729-6均可用于人細(xì)胞融合體。
一種優(yōu)選的鼠類骨髓瘤細(xì)胞是NS-1骨髓瘤細(xì)胞系(也被稱作P3-NS-1-Ag4-1)，該細(xì)胞系可以方便地從NIGMS人類遺傳突變細(xì)胞保藏中心(Human Genetic Mutant Cell Repository)獲得，索取的細(xì)胞系保藏號(hào)為GM3573。另一種可以使用的鼠骨髓瘤細(xì)胞系是8-氮鳥嘌呤-抗性小鼠鼠類骨髓瘤SP2/0非生產(chǎn)細(xì)胞系。
用于制備產(chǎn)抗體脾細(xì)胞或淋巴節(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜合體的方法通常包括將體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以2∶1的比例混合，不過(guò)，在有能促進(jìn)細(xì)胞膜融合的試劑(化學(xué)或電學(xué)試劑)的條件下，所述比例可分別在大約20∶1至大約1∶1的范圍內(nèi)變化。業(yè)已披露的融合方法有使用仙臺(tái)病毒的方法(Kohler，Milstein，1975；1976)，和使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG的方法(Gefter等，1977)。電誘導(dǎo)融合方法的使用也很合適(Goding，1986，pp.71-74)。
融合方法通常以很低的頻率產(chǎn)生活性雜合體，其頻率大約為1×10-6-1×10-8。不過(guò)，這并不會(huì)造成問(wèn)題，因?yàn)檫@種活的融合雜合體是通過(guò)在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)由親代未融合的細(xì)胞(特別是未融合的骨髓瘤細(xì)胞，這種細(xì)胞通常能持續(xù)無(wú)限制地分裂)分化而來(lái)的。所述選擇培養(yǎng)基通常是這樣的它含有一種能抑制核苷酸在組織培養(yǎng)基中從頭合成的試劑。優(yōu)選試劑的例子是氨基蝶呤、氨甲蝶呤、和重氮絲氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤能抑制嘌呤和嘧啶的從頭合成，而重氮絲氨酸僅能抑制嘌呤的合成。當(dāng)使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤時(shí)，將次黃嘌呤和胸苷作為核苷酸源添加到所述培養(yǎng)基中(HAT培養(yǎng)基)。當(dāng)使用重氮絲氨酸時(shí)，向所述培養(yǎng)基中添加次黃嘌呤。
優(yōu)選的選擇培養(yǎng)基是HAT。只有那些具有核苷酸補(bǔ)救途徑的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活。所述骨髓瘤細(xì)胞缺少所述補(bǔ)救途徑的關(guān)鍵酶，例如，次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)，因此，這種細(xì)胞不能存活。B-細(xì)胞可以使用該途徑，但這種細(xì)胞在培養(yǎng)中具有有限的生命極限，通常會(huì)在大約2周內(nèi)死亡。因此，唯一能在所述選擇培養(yǎng)基中存活的細(xì)胞是由骨髓瘤細(xì)胞和B-細(xì)胞形成的雜交細(xì)胞。
這種培養(yǎng)方法可以提供一種雜交瘤群體，從該群體中選擇特殊雜交瘤。通常，雜交瘤的選擇是這樣進(jìn)行的通過(guò)在微量滴定板中進(jìn)行單克隆稀釋培養(yǎng)所述細(xì)胞，然后檢測(cè)每一種克隆上清液(大約2-3周以后)的所需反應(yīng)活性。所述測(cè)試應(yīng)當(dāng)靈敏、簡(jiǎn)單并且快速，如放射免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、噬斑測(cè)定、斑點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)定等。
然后，可以對(duì)所選擇的雜交瘤進(jìn)行一系列的稀釋，并克隆到每一種抗體生產(chǎn)細(xì)胞系中，然后將這些克隆進(jìn)行無(wú)限增殖，以產(chǎn)生mAbs?？蓪⑺黾?xì)胞系用于通過(guò)兩種基本方法生產(chǎn)mAb。將所述雜交瘤的樣品注射到(通常注射到其腹膜腔)組織相容性動(dòng)物體內(nèi)，這種動(dòng)物是用于提供原始融合所需要的體細(xì)胞和毒性瘤細(xì)胞的動(dòng)物。接受注射的動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生能分泌特殊單克隆抗體的腫瘤，所述單克隆抗體是用所述融合細(xì)胞雜合體產(chǎn)生的。然后，可以放出該動(dòng)物的體液，如血清或腹水，以提供高濃度的mAbs。還可以在體外培養(yǎng)所述單細(xì)胞系，在這種情況下，mAbs能自然分離到培養(yǎng)基中，從該培養(yǎng)基中可以方便地獲得高濃度的mAbs。如果需要的話，可以對(duì)通過(guò)任一種方法生產(chǎn)的mAbs作進(jìn)一步純化，使用過(guò)濾、離心和各種層析方法，如HPLC或親和層析。
2.7 ELISAs和免疫沉淀ELISAs可以與本發(fā)明組合使用。在ELISA測(cè)定中，將整合到苜蓿植物抗真菌蛋白抗原序列上的蛋白或肽固定在一種選定的表面上，優(yōu)選具有蛋白親和力的表面，如聚苯乙烯微量滴定板的孔中。洗滌以除去不完全吸附的材料，然后需要用一種非特異性蛋白結(jié)合或包被該測(cè)定板孔，這種非特異性蛋白已知為對(duì)所述試驗(yàn)抗血清而言，在抗原性上是中性的，如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。這樣可以封閉所述固定表面上的非特異吸附位點(diǎn)，從而減弱由抗血清與該表面的非特異結(jié)合所產(chǎn)生的背景。
在抗原材料與所述孔結(jié)合以后，用非反應(yīng)材料進(jìn)行包被，以減弱背景，并洗滌以除去未結(jié)合的材料，讓該固定化表面與待測(cè)定的抗血清或臨床或生物提取物接觸，接觸方式能誘導(dǎo)免疫復(fù)合體(抗原/抗體)形成。所述條件優(yōu)選包括用諸如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)/Tween稀釋所述抗血清。所添加的上述試劑還有助于減弱非特異背景。然后將分層的抗血清培養(yǎng)大約2-4小時(shí)，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為25-27℃。在培養(yǎng)以后，洗滌所述接觸過(guò)抗血清的表面，以清除非免疫復(fù)合的材料。優(yōu)選的洗滌方法包括用諸如PBS/Tween或硼酸緩沖液的溶液洗滌。
在形成了試驗(yàn)樣品和所結(jié)合的抗原的特異免疫復(fù)合體之后，接著進(jìn)行洗滌，然后測(cè)定免疫復(fù)合體的形成，甚至測(cè)定所形成的免疫復(fù)合體的量，這種測(cè)定是通過(guò)用具有第一種抗體的特異性的第二種抗體處理該免疫復(fù)合體而實(shí)現(xiàn)的。為了提供一種檢測(cè)手段，所述第二種抗體優(yōu)選具有一種結(jié)合的酶，這種酶在與合適的生色底物一起培養(yǎng)時(shí)能產(chǎn)生一種顏色。因此，例如，人們可能希望用一種堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶-綴合的抗-兔IgG與抗血清-結(jié)合的表面接觸并培養(yǎng)一段時(shí)間，而且培養(yǎng)是在有利于免疫復(fù)合體形成的條件下(例如，在室溫下、在諸如PBS/Tween的含有PBS的培養(yǎng)基中)進(jìn)行的。
用第二種酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行培養(yǎng)，洗滌以除去未結(jié)合的材料，然后通過(guò)與一種生色底物培養(yǎng)對(duì)所述標(biāo)記物進(jìn)行定量，如當(dāng)所述酶標(biāo)記物是過(guò)氧化物酶時(shí)，所述生色底物是尿素和溴甲粉紫或2，2’-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)和過(guò)氧化氫。然后通過(guò)測(cè)定顏色生成程度進(jìn)行定量，例如使用可見光譜分光光度儀。
本發(fā)明的抗苜蓿植物抗真菌蛋白抗體特別適用于通過(guò)免疫沉淀提取其它苜蓿植物抗真菌蛋白抗原。免疫沉淀包括從復(fù)雜的混合物中分離靶抗原成分，并將其用于分辨或提取微量蛋白。為了提取膜蛋白，必須將細(xì)胞溶解到洗滌劑微團(tuán)中。優(yōu)選非離子型鹽，因?yàn)橹T如膽汁鹽的其它試劑在酸性pH或在有二價(jià)陽(yáng)離子的條件下會(huì)沉淀。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體被用于兩種抗原的密切結(jié)合。對(duì)于提高抗原，例如酶-底物對(duì)的局部濃度來(lái)說(shuō)，這是特別有用的。
2.8 Western印跡本發(fā)明的組合物在免疫印跡或Western印跡分析方面十分有用。可將所述抗-肽抗體用作高親和力一級(jí)試劑，用于鑒定固定在諸如硝酸纖維素、尼龍或其組合物的固體支持基質(zhì)上的蛋白。在免疫沉淀之后，接著進(jìn)行凝膠電泳，可將其用作用于檢測(cè)抗原的一步試劑，用于檢測(cè)該抗原的第二種試劑會(huì)導(dǎo)致負(fù)背景。當(dāng)所研究的抗原是免疫球蛋白時(shí)，這樣做是特別有用的(排除了免疫球蛋白結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁成分的使用)，所研究的抗原能與所述檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)，或者它能以與交叉反應(yīng)信號(hào)相同的相對(duì)分子量遷移。
特別有用的用于和Western印跡分析組合使用的、以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)標(biāo)記包括酶學(xué)-、放射標(biāo)記-、或熒光標(biāo)記的抗所述抗真菌成分的第二抗體。
2.9抗真菌苜蓿植物抗真菌蛋白篩選和檢測(cè)試劑盒本發(fā)明涉及用于篩選懷疑其含有苜蓿植物抗真菌蛋白或肽或苜蓿植物抗真菌蛋白相關(guān)多肽的樣品、或產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞的方法和試劑盒。一個(gè)試劑盒可以含有一種或幾種本發(fā)明的抗體，并可以含有用于檢測(cè)一種樣品與本發(fā)明的抗體之間的相互作用的試劑。所提供的試劑可以是用放射性-、熒光-或酶標(biāo)記過(guò)的。所述試劑盒可以含有能與本發(fā)明的核酸或抗體結(jié)合或相互作用的已知的放射性標(biāo)記的試劑。
所述試劑盒的試劑可以作為液體溶液，結(jié)合于固體支持物上或作為干粉形式提供。優(yōu)選地，當(dāng)所述試劑是以液體溶液形式提供的時(shí)，該液體溶液是一種水溶液。優(yōu)選地，當(dāng)所提供的試劑與一種固體支持物結(jié)合時(shí)，該固體支持物可以是層析介質(zhì)、具有若干孔的實(shí)驗(yàn)平板、或顯微鏡載玻片。當(dāng)所提供的試劑是干粉時(shí)，可以通過(guò)添加可以得到的合適的溶劑對(duì)該粉末進(jìn)行重建。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)方法和相關(guān)的試劑盒。建議將本發(fā)明的苜蓿植物抗真菌蛋白或肽用于檢測(cè)能與它反應(yīng)的抗體，或者，將用本發(fā)明方法制備的抗體用于檢測(cè)苜蓿植物抗真菌蛋白或含有苜蓿植物抗真菌蛋白相關(guān)表位的肽。
一般，所述方法包括以下步驟首先獲得被懷疑含有蛋白、肽或抗體的樣品，在能有效形成免疫復(fù)合體的條件下讓所述樣品與本發(fā)明的抗體或肽接觸，然后檢測(cè)所述免疫復(fù)合體的存在。一般，免疫復(fù)合體形成的檢測(cè)方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并可以通過(guò)使用多種方法來(lái)完成。例如，本發(fā)明涉及ELISA、RIA、免疫印跡(例如，斑點(diǎn)印跡)和直接免疫熒光技術(shù)等的應(yīng)用。一般，免疫復(fù)合體的形成可以通過(guò)使用諸如放射性標(biāo)記物或酶標(biāo)記物(如堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶等)的標(biāo)記物進(jìn)行。當(dāng)然，正如本領(lǐng)域所熟知的，人們會(huì)發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用諸如第二抗體或生物素/親和素配體結(jié)合結(jié)構(gòu)的第二結(jié)合配體還可以帶來(lái)額外的優(yōu)點(diǎn)。
為了進(jìn)行分析，建議實(shí)際上可以使用任何被懷疑含有待檢測(cè)的苜蓿植物抗真菌蛋白或肽或苜蓿植物抗真菌蛋白相關(guān)肽或抗體的樣品。預(yù)計(jì)這些實(shí)施方案可用于滴定抗原或抗體樣品，以及篩選雜交瘤等。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及可用于檢測(cè)樣品中苜蓿植物抗真菌蛋白或相關(guān)肽和/或抗體的存在的試劑盒。樣品可以包括被懷疑含有苜蓿植物抗真菌蛋白或肽的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞提取物、酶級(jí)分、蛋白提取物、或其它無(wú)細(xì)胞組合物。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)本發(fā)明的試劑盒可以包括一種合適的苜蓿植物抗真菌蛋白、肽或抗所述蛋白或肽的抗體，和一種免疫檢測(cè)試劑，以及用于容納所述抗體或抗原和試劑的裝置。所述免疫檢測(cè)試劑通常包括一種與所述抗體或抗原結(jié)合的，或與第二結(jié)合配體結(jié)合的標(biāo)記物。代表性的配體可以包括已結(jié)合有標(biāo)記物的針對(duì)所述第一抗體或抗原或生物素或親和素(或鏈霉親和素)的第二抗體。當(dāng)然，如上文所述，有多種標(biāo)記物的例子都是本領(lǐng)域人員眾所周知的，這些標(biāo)記物均可用于本發(fā)明中。
所述容器通常包括一個(gè)可以放置所述抗體、抗原或檢測(cè)試劑的小瓶，并且優(yōu)選適當(dāng)?shù)氐确诌^(guò)的小瓶。本發(fā)明的試劑盒通常還包括供商業(yè)銷售使用的用于密封容納所述抗體、抗原、和試劑容器的裝置。所述容器可以包括注模或吹塑的塑料容器，將所需要的小瓶固定在該容器中。
2.10組合物表位核心序列本發(fā)明還涉及無(wú)全細(xì)胞及其它肽的蛋白或肽組合物，該組合物含有一種純化的蛋白或肽，在該蛋白或肽上整合了一種能與一種或幾種抗苜蓿植物抗真菌蛋白抗體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的表位。具體地講，本發(fā)明涉及源于苜蓿植物抗真菌蛋白或肽的表位核心序列。
在本文中，“整合了一種能與一種或或幾種抗苜蓿植物抗真菌蛋白抗體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的表位”一句是指一種肽或蛋白抗原，該抗原包括類似于位于苜蓿植物抗真菌蛋白或多肽中的一個(gè)表位的一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)。其相似程度通常能達(dá)到這種水平抗所述苜蓿植物抗真菌蛋白或多肽的單克隆或多克隆抗體能與之結(jié)合、反應(yīng)、或以其它方式識(shí)別所述交叉反應(yīng)的肽或蛋白抗原?？蓪⑺隹贵w用于多種免疫測(cè)定方法中，例如，Western印跡分析、ELISA、和RIA等，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
苜蓿植物抗真菌蛋白免疫顯性表位和/或其適用于疫苗的功能性等同物的鑒定是比較簡(jiǎn)單的事情。例如，可以使用由Hopp在US4，554，101中所披露的方法，該專利被收作本文的參考文獻(xiàn)，該專利披露了根據(jù)親水性由氨基酸序列鑒定并制備表位的方法。在若干其它文獻(xiàn)中所披露的方法，以及基于這些方法的軟件程序也可用于鑒定表位核心序列(例如，參見Jameson和Wolf，1988；Wolf等，1988；US4,554,101)?？赏ㄟ^(guò)采用肽合成或重組技術(shù)將所述“表位核心序列”的氨基酸序列方便地整合到肽中。
用于本發(fā)明的優(yōu)選肽通常為大約8-20個(gè)氨基酸長(zhǎng)，更優(yōu)選為大約8-15個(gè)氨基酸長(zhǎng)。有人認(rèn)為，在某些場(chǎng)合下使用較短的抗原性苜蓿植物抗真菌蛋白衍生的肽具有優(yōu)勢(shì)，例如，在制備免疫學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)時(shí)就是這樣。典型的優(yōu)點(diǎn)包括容易制備和純化，較低的成本和較高的生產(chǎn)可再現(xiàn)性，以及有利的生物分布。
有人建議通過(guò)制備含有修飾過(guò)的和/或延長(zhǎng)了的表位/免疫原核心序列的合成肽可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的特殊優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)這種方法可以產(chǎn)生針對(duì)苜蓿植物抗真菌蛋白，特別是針對(duì)AlfAFP相關(guān)序列的“通用”表位肽。這種表位核心序列在本發(fā)明的特定場(chǎng)合下被確定為所述特定多肽抗原的親水部分。有人認(rèn)為該部分最有可能促進(jìn)T細(xì)胞或B細(xì)胞的刺激作用，因此，能誘導(dǎo)特定抗體的產(chǎn)生。
本文所述的表位核心序列是一種較短的氨基酸片段，該片段“互補(bǔ)”于本文所披露的苜蓿植物抗真菌蛋白抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)，因此能與該位點(diǎn)結(jié)合。另外，表位核心序列還可以是這樣一種物質(zhì)它所誘導(dǎo)的抗體能與針對(duì)本發(fā)明肽組合物的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。可以理解，在本說(shuō)明書的含義范圍內(nèi)，“互補(bǔ)”一詞是指彼此之間具有吸引力的氨基酸或肽。因此，本發(fā)明的某些表位核心序列實(shí)際上可根據(jù)其與相關(guān)的蛋白針對(duì)的抗血清競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所希望的蛋白抗原的能力或排斥這種結(jié)合的能力進(jìn)行定義。
一般，所述多肽抗原的大小不被認(rèn)為是特別重要的，只要這種抗原大到足于攜帶特定的核心序列或序列即可。一般，本發(fā)明所披露的預(yù)期的最小有用核心序列的長(zhǎng)度為大約8個(gè)氨基酸，更優(yōu)選10-20個(gè)氨基酸的序列。因此，這一大小一般相當(dāng)于用本發(fā)明方法制備的最小的肽抗原的大小。不過(guò)，如果需要的話，所述抗原的大小可以更大一些，只要它含有一個(gè)基礎(chǔ)表位核心序列即可。
表位核心序列的鑒定對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的，例如，在US4,554,101中所披露的，該專利被收作本文的參考文獻(xiàn)，該專利披露了根據(jù)其親水性由氨基酸序列鑒定并制備表位的方法。另外，有多種計(jì)算機(jī)程序可用于預(yù)測(cè)蛋白的抗原部分(例如，參見Jameson和Wolf，1988；Wolf等，1988；)。根據(jù)本說(shuō)明書，還可將計(jì)算機(jī)化的肽序列分析程序(例如，DNAStar軟件，DNAStar公司，Madison，WI)用于設(shè)計(jì)合成肽。
表位序列或在其序列中包括一個(gè)抗原表位的肽可以通過(guò)諸如固相方法的常規(guī)合成技術(shù)方便地實(shí)現(xiàn)(例如，通過(guò)使用市售肽合成儀進(jìn)行，如Applied Biosystems Model430A肽合成儀)。然后，可將以這種方法合成的肽抗原以預(yù)定的量進(jìn)行等分，并以常規(guī)方法保存，如保存于水溶液中或更優(yōu)選為以粉狀或冷凍干燥狀態(tài)保存待用。
一般，由于肽具有相對(duì)的穩(wěn)定性，如果必要的話可以水溶液形式將其保存相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，例如長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。實(shí)際上可以在沒有明顯降解作用或喪失其抗原活性的一切水溶液中保存。不過(guò)，當(dāng)在水溶液中進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的保存時(shí)，一般需要包括含有緩沖液的試劑，如Tris或磷酸緩沖液，以保持大約7.0-7.5的pH。另外，可能需要包括能抑制微生物生長(zhǎng)的試劑，如疊氮化鈉或硫柳汞。為了在水溶液中長(zhǎng)期保存，需要將該溶液保存在大約4℃下，更優(yōu)選冷凍保存。當(dāng)然，當(dāng)所述肽是以凍干或粉狀形式保存時(shí)，實(shí)際上可以無(wú)限期的保存下去，例如，以計(jì)量過(guò)的等分試樣保存，在使用之前可以用預(yù)定量的水(優(yōu)選蒸餾水)或緩沖液對(duì)該試樣進(jìn)行重新水合。
2.11生物學(xué)功能等同物2.11.1在其基礎(chǔ)多肽序列中含有保守氨基酸改變的肽、多肽和蛋白在生物學(xué)功能上等同于AlfAFP1和AlfAFP2的肽、多肽、和蛋白包括在其如序列2或序列14所示的基礎(chǔ)序列中含有保守氨基酸變化的氨基酸序列。在所述氨基酸序列中，在所述基礎(chǔ)序列上的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被其它氨基酸所取代，取代氨基酸的電荷和極性類似于原有氨基酸的電荷和極性，即這是一種保守氨基酸取代，會(huì)導(dǎo)致一種沉默變化。
用于取代所述基礎(chǔ)多肽序列中的氨基酸的取代基可以選自天然存在的氨基酸所屬類型中的其它成員?？蓪被岱殖梢韵滤姆N類型(1)酸性氨基酸；(2)堿性氨基酸；(3)中性極性氨基酸；和(4)中性非極性氨基酸。以上各種類型的代表性氨基酸包括，但不限于(1)酸性(帶負(fù)電荷)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性(帶正電荷)氨基酸，如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；(3)中性極性氨基酸，如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；(4)中性非極性(疏水性)氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
在所述基礎(chǔ)多肽序列中所發(fā)生的保守氨基酸變化，可以通過(guò)用屬于同一類型的一種氨基酸取代該類型的另一種氨基酸而實(shí)現(xiàn)。AlfAFP1和AlfAFP2的生物學(xué)功能等同物可以具有10個(gè)或更少的保守氨基酸變化，更優(yōu)選為具有7個(gè)或更少的保守氨基酸變化，最優(yōu)選為具有5個(gè)或更少的保守氨基酸變化。因此，其編碼核苷酸序列(基因、質(zhì)粒DNA、cDNA、或合成DNA)具有相應(yīng)的堿基取代，使其能編碼AlfAFP1和AlfAFP2的生物學(xué)功能等同物。
本發(fā)明所涉及的生物學(xué)功能等同肽、多肽和蛋白應(yīng)當(dāng)與基礎(chǔ)AlfAFP1和AlfAFP2的氨基酸序列或該序列中的相關(guān)部分具有大約80％或更高的序列相似性，優(yōu)選大約為85％或更高的序列相似性，最優(yōu)選大約為90％或更高的序列相似性。
正如所指出過(guò)的，可以對(duì)本發(fā)明的肽結(jié)構(gòu)和編碼這種肽結(jié)構(gòu)的DNA片段進(jìn)行修飾和改變，并且仍能得到一種功能性分子，該分子編碼具有所需特性的蛋白或肽。以下說(shuō)明基于通過(guò)改變蛋白中的氨基酸以產(chǎn)生一種等同的或甚至是改進(jìn)的二代分子。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，涉及將突變的苜蓿植物抗真菌蛋白用于加強(qiáng)所述蛋白的抗真菌活性，并因此加強(qiáng)重組轉(zhuǎn)基因在植物細(xì)胞中的抗真菌活性和/或表達(dá)。所述氨基酸變化可以按照在表1中給出的密碼子通過(guò)改變所述DNA序列的密碼子而實(shí)現(xiàn)。表1氨基酸密碼子丙氨酸AlaAGCAGCC GCG GCU半胱氨酸 CysCUGCUGU天冬氨酸 AspDGACGAU谷氨酸GluEGAAGAG苯丙氨酸 PheFUUCUUU甘氨酸GlyGGGAGGC GGG GGU組氨酸HisHCACCAU異亮氨酸 IleIAUAAUC AUU GCU賴氨酸LysKAAAAAG亮氨酸LeuLUUAUUG CUA CUC CUG CUU甲硫氨酸 MetMAUG天冬酰胺 AsnNAACAAU脯氨酸ProPCCACCC CCG CCU谷氨酰胺 GlnQCAACAG精氨酸ArgRAGAAGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸SerSAGCAGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸ThrTACAACC ACG ACU纈氨酸ValVGUAGUC GUG GUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUACUAU例如，可以用某些氨基酸取代一種蛋白結(jié)構(gòu)中的其它氨基酸而不會(huì)顯著降低其與諸如抗體的抗原結(jié)合部分或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)的相互結(jié)合能力。因?yàn)槭堑鞍椎南嗷プ饔媚芰托再|(zhì)決定著蛋白的生物學(xué)功能活性，可以在該蛋白序列中進(jìn)行某些氨基酸序列的取代，并理所當(dāng)然的改變其DNA編碼序列，而所獲得的蛋白具有相似的特性。因此，本發(fā)明人設(shè)想可以對(duì)所披露的組合物的肽序列或編碼所述肽的相關(guān)DNA序列進(jìn)行改變，而又不會(huì)使其明顯喪失生物學(xué)活性或用途。
在進(jìn)行這種改變時(shí)，需要考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白相互作用生物學(xué)功能方面的重要性得到了本領(lǐng)域的普遍認(rèn)同(Kyte和Doolittle，1982，被收作本文的參考文獻(xiàn))。人們認(rèn)為，所述氨基酸的親水特性會(huì)影響所得到的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)反過(guò)來(lái)又決定該蛋白與其它分子，例如，酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。
每一種氨基酸都根據(jù)其親水性和電荷特征賦予一種親水指數(shù)(Kyte和Doolittle，1982)，其中，異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
在本領(lǐng)域中眾所周知的是，某些氨基酸可以用具有相似的親水值或等級(jí)的其它氨基酸取代，而仍然能得到具有相似生物學(xué)活性的蛋白，即仍能獲得一種生物學(xué)功能等同蛋白。在進(jìn)行所述改變時(shí)，取代的氨基酸優(yōu)選親水指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸，特別優(yōu)選親水指數(shù)在±1以內(nèi)的氨基酸，尤其親水指數(shù)在±0.5以內(nèi)的氨基酸。
本領(lǐng)域中還了解的是，類似氨基酸的取代可以根據(jù)親水性有效進(jìn)行。被收作本文參考文獻(xiàn)的US4,554,101指出，由相鄰的氨基酸的親水性所決定的一種蛋白的最大局部平均親水性與該蛋白的生物學(xué)特性相關(guān)。
如在US4,554,101中所詳細(xì)披露的，氨基酸殘基具有以下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
2.11.2 AlfAFP片段和變體盡管本發(fā)明的抗真菌多肽優(yōu)選包括序列2和序列14所示的氨基酸序列，不過(guò)，本發(fā)明還包括具有與所述抗真菌多肽相同或相似的抗真菌活性的所述序列的片段和變體。因此，序列2或序列14中的8個(gè)或更多個(gè)氨基酸的連續(xù)序列可能具有所述活性，例如，包括序列1。
AlfAFP1和AlfAFP2的片段可以是截短的形式，其中從該多肽的N-末端、C-末端、中部缺失了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，或?yàn)橐陨先笔У慕M合。所述片段可以是AlfAFP1和AlfAFP2的天然存在的或合成的變體，但仍保留了AlfAFP1和AlfAFP2的抗真菌活性。
AlfAFP1和AlfAFP2的變體包括將一個(gè)或幾個(gè)氨基酸插入其天然序列中的形式。所述變體還可以是天然存在的或合成的AlfAFP1和AlfAFP2的變體，但仍保留了AlfAFP1和AlfAFP2的抗真菌活性。
本發(fā)明還包括上述形式的組合，即同時(shí)含有氨基酸缺失和添加的多肽。其中還可以有氨基酸取代。
本發(fā)明所涉及的AlfAFP1和AlfAFP2的變體和片段應(yīng)當(dāng)優(yōu)選與具有序列2和序列14所示相應(yīng)氨基酸序列的AlfAFP1和AlfAFP2的相應(yīng)部分具有大約70-75％或更高的序列相似性，更優(yōu)選具有大約80％、85％、88％或更高的序列相似性，最優(yōu)選具有大約90％或95％或更高的序列相似性。
2.11.3 AlfAFP的其它生物學(xué)功能等同形式可用于本發(fā)明中的AlfAFP1和AlfAFP2的其它生物學(xué)功能等同形式包括上文所披露的多肽或其生物學(xué)功能等同物與其它肽、多肽、或蛋白的綴合物，以形成融合產(chǎn)物，該融合產(chǎn)物具有與具有序列2或序列14所示氨基酸序列的AlfAFP1和AlfAFP相同、相似的抗真菌活性或更高的抗真菌活性。
2.12蛋白組合物提供了一種抗真菌組合物，該組合物含有抗真菌有效量的本發(fā)明所分離的一種或幾種抗真菌多肽。優(yōu)選的組合物含有序列2和序列14所示的氨基酸序列，以及一種可以接受的載體。抗真菌組合物可用于抑制病原真菌的生長(zhǎng)或殺死病原真菌。所述組合物可以用常規(guī)方法制備，如披露于下列文獻(xiàn)中的方法，Winnacker-Kuchler(1986)；van Falkenberg(1972-1973)；和K.Martens(1979)。必需的配制助劑，如載體、惰性材料、表面活性劑、溶劑、及其它添加劑同樣是本領(lǐng)域中眾所周知的，而且披露于諸如以下文獻(xiàn)中Watkins(YEAR)，和Winnacker-Kuchler(1986)。使用所述制劑，還可以制備本發(fā)明抗真菌多肽與其它抗真菌活性物質(zhì)、肥料和/或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等的混合物，所述混合物可以是成品制劑或罐裝混合物形式。
本發(fā)明所涉及的抗真菌組合物還包括宿主細(xì)胞形式，如能產(chǎn)生本發(fā)明的抗真菌多肽的細(xì)菌和真菌細(xì)胞，所述細(xì)胞能定居在植物的根部和/或葉部。能以這種方式使用的細(xì)菌細(xì)胞的例子包括土壤桿菌屬、節(jié)桿菌屬、固氮螺菌屬、棍狀桿菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬、根瘤桿菌屬、和酵母屬等的菌株。
可以與本發(fā)明抗真菌多肽組合的多種常見真菌抗生素和化學(xué)殺真菌劑是本領(lǐng)域中熟知的，并詳細(xì)披露于Worthington和Walker(1983)的著述中。例如，所述真菌抗生素包括多氧菌素、三國(guó)霉素、羧酰胺、芳族糖類、萎銹靈、嗎啉、固醇生物合成抑制劑、和有機(jī)磷化合物?？梢耘c本發(fā)明的抗真菌多肽組配的其它活性成分包括殺昆蟲劑、引誘劑、滅菌劑、殺螨劑、殺線蟲劑和殺草劑。US5,421,839中包括對(duì)許多活性劑進(jìn)行的綜述，諸如本發(fā)明殺真菌多肽的物質(zhì)可以與這些活性劑組配。
本發(fā)明的抗真菌多肽無(wú)論是單獨(dú)使用或是與其它活性劑組合，其用量范圍均大約為0.1-100mg/ml，優(yōu)選為大約5-50mg/ml，其pH范圍大約為3-9。例如，所述組合物可以用大約1mM-1M的磷酸緩沖液緩沖，該磷酸緩沖液的濃度優(yōu)選為大約10-100mM，更優(yōu)選為大約15-50mM。
因此，AlfAFP1，AlfAFP2及其生物學(xué)功能等同物預(yù)計(jì)可用于在多種植物中控制真菌，所述真菌的例子包括下列屬和種鏈格孢屬(蕓苔鏈格孢Alternaria brassicola；茄鏈格孢Alternaria solani)；殼二孢屬(豌豆殼二孢Ascochyta pisi)；葡萄孢屬(灰葡萄孢Botrytis cinerea)；尾孢菌屬(菊池尾孢Cercospora kikuchii；玉米尾孢Cercosporazaea-maydis)；刺盤孢屬(豆刺盤孢Colletotrichum lindemuthianum)；色二孢屬(玉米色二孢Diplodia maydis)；白粉菌屬(禾白粉菌禾本科變種Erysiphe graminisf.sp.graminis；禾白粉菌大麥變種 Erysiphe graminisf.sp.hordei)；鐮孢屬(雪腐鐮孢Fusarium nivale；尖鐮孢Fusarium oxysporum；禾本科鐮孢Fusarium graminearum；大刀鐮孢Fusarium vulmorum；腐皮鐮孢Fusarium solani；串珠鐮孢Fusarium moniliforme；粉紅鐮孢Fusarium roseum)；頂囊殼屬(禾頂囊殼小麥變種Gaeumanomyces graminisf.sp.tritici)；長(zhǎng)蠕孢屬(大斑病長(zhǎng)蠕孢Helminthosporium turcicum；灰色長(zhǎng)蠕孢Helminthosporium carbonum；玉米長(zhǎng)蠕孢Helminthosporiummaydis)；殼球孢屬(菜豆殼球孢M(jìn)acrophomina phaseolina；Maganaporthegrisea)；叢赤殼屬(Nectria heamatococca)；霜霉屬(東北霜霉Peronospora manshurica；煙草霜霉Peronosporatabacina)；莖點(diǎn)霉屬(甜菜莖點(diǎn)霉Phoma betae)；瘤梗孢屬(多主瘤梗孢Phymatotrichum omnivorum)；疫霉屬(樟疫霉Phytophthora cinnamomi；惡疫霉Phytophthoracactorum；菜豆疫霉Phytophthora phaseolina；寄生疫霉Phytophthora parasitica；柑桔褐腐疫霉Phytophthora citrothora；大雄疫霉大豆變種Phytophthora megasperma f.sp.sojae；致病疫霉Phytophthora infestans)；單軸霉屬(葡萄生單軸霉Plasmopara vitivola)；單囊殼屬(白叉絲單囊殼Podosphaera leucotricha)；柄銹菌屬(高粱柄銹菌Puccinia sorghi；條形柄銹菌Pucciniastriiformis；小麥柄銹病Puccinia graminisf.sp.tritici；天門冬屬柄銹病Puccinia asparagi；隱匿柄銹菌Puccinia recondita；落花生柄銹病Puccinia arachidis)；腐霉屬(瓜果腐霉Pythium aphanidermatum)；核腔菌屬(偃麥草核腔菌Pyrenophora tritici-repentens)；Pyricularia(Pyricularia oryzae)；腐霉屬(終極腐霉Pythium ultimum)；絲核菌屬(立枯絲核菌Rhizoctinia solani；禾本科絲核菌Rhizoctinia cerealis)；Scerotium(Scerotium rolfsii)；核盤菌屬(核盤菌Sclerotinia sclerotiorum)；
殼針孢屬(番茄殼針孢Septoria lycopersici；大豆殼針孢Septoria glycines；穎枯殼針孢Septoria nodorum；小麥殼針孢Septoria tritici)；梭殼孢屬(莖生梭殼孢Thielaviopsis basicola)；鉤絲殼屬(葡萄鉤絲殼Uncinula necator)；黑星菌屬(蘋果黑星菌Venturia enaequalis)；輪枝孢屬(大麗花輪枝孢Verticillium dahliae；黃萎輪枝孢Verticillium albo-atrum)；通過(guò)下面所提供的詳細(xì)說(shuō)明和附圖可以了解本發(fā)明的其它使用范圍。不過(guò)，應(yīng)當(dāng)理解的是，所述詳細(xì)說(shuō)明和特定實(shí)施例盡管表示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但給出這些實(shí)施例僅是為了說(shuō)明目的，因?yàn)閷?duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，通過(guò)閱讀該詳細(xì)說(shuō)明在本發(fā)明構(gòu)思范圍內(nèi)所作的各種改變和改進(jìn)是顯而易見的。
3.0


通過(guò)下面結(jié)合附圖所作的詳細(xì)說(shuō)明，可以更好的理解本發(fā)明的上述及其它目的、特征、和優(yōu)點(diǎn)，提出這些附圖僅僅是為了說(shuō)明目的，而不是為了限定本發(fā)明。
本發(fā)明給出的與質(zhì)粒圖譜中相同的DNA片段有AMP氨芐青霉素抗性、ori-pUC源于pUC質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)；LACLac Z基因的部分序列；p-e35S啟動(dòng)子e35S；HSP70內(nèi)含子源于玉米的熱激蛋白70的內(nèi)含子；NOS3’農(nóng)桿菌屬Ti質(zhì)粒的胭脂氨酸合成酶(nos)基因的3’非翻譯部分；ori-M13M13噬菌體復(fù)制起點(diǎn)；Spc/Str細(xì)菌壯觀霉素/鏈霉素抗性基因；p-MMV玄參屬花葉病毒35S啟動(dòng)子；EPSPS/CTP2源于擬南芥屬5-烯醇丙酮基-3-phosphoshikimate合成酶基因(EPSPS)；CP4syn合成的細(xì)菌glyphosate抗性CP4 5-烯醇丙酮基-3-phosphoshikimate合成酶(EPSPS)基因；E9 3’豌豆ssRUBISCOE9基因的3’非翻譯區(qū)；PetHSP70-前導(dǎo)序列矮牽牛熱激蛋白70基因的5’非翻譯前導(dǎo)序列；ori-322pUC322復(fù)制起點(diǎn)。
圖1表示AlfAFP1的cDNA核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列。三角表示成熟AlfAFP1多肽的起點(diǎn)。下面劃線的氨基酸序列表示信號(hào)肽。在下面劃有雙線的序列表示潛在的polyA信號(hào)序列。星號(hào)表示終止密碼子。
圖2是AlfAFP1、AlfAFP2和pI230的疊加比較。除了AlfAFP1之外，所有氨基酸序列均源于cDNA序列，并包括信號(hào)肽和成熟蛋白。線條表示保守氨基酸殘基。AlfAFP1的成熟蛋白用黑體表示。
圖3是回收的AlfAFP1和AlfAFP2的5’cDNAs的比較。相同的堿基用省略線表示。
圖4是pMON23317的物理圖譜。
圖5是pMON22653的物理圖譜。
圖6是pMON22575的物理圖譜。
圖7是pMON22656的物理圖譜。
圖8是pMON17227的物理圖譜。
圖9是pMON22659的物理圖譜。
圖10是相當(dāng)于表2數(shù)據(jù)的棒圖，表示用表達(dá)AlfAFP1 cDNA的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物進(jìn)行的黃萎病試驗(yàn)結(jié)果。
4.0 對(duì)典型實(shí)施方案的說(shuō)明4.1本發(fā)明的研究所鑒定的cDNAs和其它核酸，在作為轉(zhuǎn)基因整合到易感植物中后能產(chǎn)生對(duì)真菌病原體的抗性。通過(guò)以功能上可操縱的方式將所述DNA導(dǎo)入農(nóng)藝、園藝、觀賞、及其它經(jīng)濟(jì)上或商業(yè)上有利用價(jià)值的植物中，可使這些植物產(chǎn)生對(duì)真菌病原體的抗性，使所導(dǎo)入的DNA以能有效產(chǎn)生對(duì)真菌病原體的抗性的水平在所述植物中表達(dá)。
4.2定義下列詞句具有以下含義。
表達(dá)細(xì)胞內(nèi)過(guò)程的總稱，包括由諸如結(jié)構(gòu)基因的編碼DNA分子所進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以產(chǎn)生多肽。
啟動(dòng)子一個(gè)DNA序列上或一類DNA序列上的識(shí)別位點(diǎn)，由它提供結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)控制因子，而且，RNA聚合酶能與該位點(diǎn)特異結(jié)合，并啟動(dòng)所述基因的RNA合成(轉(zhuǎn)錄)。
再生由植物細(xì)胞(例如，植物原生質(zhì)體或外植體)長(zhǎng)成植株的過(guò)程。
結(jié)構(gòu)基因能表達(dá)生成一種多肽的基因。
轉(zhuǎn)化將外源DNA序列(例如，載體、重組DNA分子)導(dǎo)入細(xì)胞或原生質(zhì)體的過(guò)程，其中，所述外源DNA序列被整合到染色體上或能夠自主復(fù)制。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞其DNA通過(guò)將外源DNA分子導(dǎo)入該細(xì)胞中而發(fā)生了改變的細(xì)胞。
轉(zhuǎn)基因細(xì)胞由轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植物產(chǎn)生或再生的一切細(xì)胞。典型的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包括由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，特別是諸如葉、根、莖的細(xì)胞，例如體細(xì)胞產(chǎn)生的植物愈傷組織，或獲自轉(zhuǎn)基因植物的生殖(胚)細(xì)胞。
轉(zhuǎn)基因植物由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或原生質(zhì)體所產(chǎn)生的植物或其后代，其中，該植物的DNA含有導(dǎo)入的外源DNA分子，該外源DNA分子原來(lái)并不存在于同一種天然的、非轉(zhuǎn)基因植物中?！稗D(zhuǎn)基因植物”和“轉(zhuǎn)化植物”兩個(gè)名詞在本領(lǐng)域中有時(shí)被作為同一名詞用來(lái)定義其DNA中含有外源DNA分子的植物。不過(guò)，我們認(rèn)為將由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或原生質(zhì)體獲得的再生植株或愈傷組織稱作轉(zhuǎn)基因植物從科學(xué)角度講更正確一些，因此，在本文的以下部分采用這一稱呼。
載體一種能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的和/或能與另一個(gè)DNA片段可操作地連接，以引起所連接的片段復(fù)制的DNA分子。質(zhì)粒是一種典型的載體。
生物學(xué)功能等同物在本文中，與本發(fā)明抗真菌蛋白相關(guān)的等同物是肽、多肽和蛋白，該等同物含有一個(gè)與本發(fā)明的新型肽，如AlfAFP1和AlfAFP2的序列具有相似性的序列或部分，該等同物具有與本文所披露的多肽相同或相似的功能特性，包括抗真菌活性。生物學(xué)等同物還包括能與抗AlfAFP1和AlfAFP2的抗體反應(yīng)，即特異結(jié)合的肽、多肽和蛋白，這種等同物具有相同或相似的抗真菌活性，包括單克隆和多克隆抗體。
抗真菌多肽是指具有抗真菌特性的多肽，例如，抑制真菌細(xì)胞生長(zhǎng)，或殺死真菌細(xì)胞，或終止或延遲真菌生活周期的時(shí)機(jī)，如孢子萌發(fā)、孢子形成或交配。
消除或控制真菌損傷從農(nóng)業(yè)意義上講，是指降低因感染真菌病原體而對(duì)作物造成的損傷。更常見的是，該短語(yǔ)是指減弱因不希望的真菌在任何特定位點(diǎn)出現(xiàn)而引起的不利影響。
結(jié)構(gòu)編碼序列是指編碼一種肽、多肽和蛋白的DNA序列，所述肽或蛋白是由細(xì)胞通過(guò)以下過(guò)程產(chǎn)生的將該結(jié)構(gòu)編碼序列轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)，然后將該mRMA翻譯成所需要的肽、多肽或蛋白產(chǎn)物。
4.3探針和引物由本發(fā)明所提供的DNA序列信息能夠制備較短的DNA(或RNA)序列，該序列具有與本文所披露的特定多核苷酸基因序列進(jìn)行特異性雜交的能力。可以根據(jù)特定的首蓿植物抗真菌蛋白基因序列，例如序列10或序列13所示的序列制備具有適當(dāng)長(zhǎng)度的核酸探針。所述DNA和核酸探針與苜蓿植物抗真菌蛋白基因序列進(jìn)行特異雜交的能力使其特別適用于多種實(shí)施方案中。最重要的是，該探針可用于檢測(cè)互補(bǔ)序列在特定樣品中存在的多種試驗(yàn)中。
在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用寡核苷酸探針。所述引物的序列是使用本發(fā)明的多核苷酸設(shè)計(jì)的，將該引物用于通過(guò)PCRTM技術(shù)檢測(cè)、擴(kuò)增或突變?cè)从谲俎俚能俎Ｖ参锟拐婢鞍谆虻囊粋€(gè)特定片段。還可以使用所述引物通過(guò)PCRTM擴(kuò)增源于其它種的與苜蓿植物抗真菌蛋白基因相關(guān)的片段。
為了產(chǎn)生本發(fā)明的某些優(yōu)點(diǎn)，用于雜交研究或測(cè)定的優(yōu)選核酸序列包括互補(bǔ)于苜蓿植物抗真菌蛋白編碼序列，如序列10或序列13所示序列的一個(gè)至少14-30個(gè)核苷酸的片段的序列。至少14個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度大小有助于確保該片段具有形成一種穩(wěn)定而又具有選擇性的雙鏈分子的足夠長(zhǎng)度。一般，不過(guò)，為了提高雜交的穩(wěn)定性和選擇性，優(yōu)選在超過(guò)14個(gè)堿基的片段長(zhǎng)度上具有互補(bǔ)序列的分子，并因此改善所得到的特異雜交分子的質(zhì)量和程度。一般，優(yōu)選設(shè)計(jì)出具有14-20個(gè)核苷酸的基因互補(bǔ)片段的核酸分子，如果需要的話可以更長(zhǎng)。例如，通過(guò)采用核酸再生技術(shù)用化學(xué)方法直接合成可以方便地制備所述片段，如由US4,683,195和US4,683,202所披露的PCRTM技術(shù)，以上專利被收作本文的參考文獻(xiàn)，或通過(guò)從含有合適的插入片段和合適的限制位點(diǎn)的重組質(zhì)粒中切除特定的DNA片段進(jìn)行制備。
4.4重組載體本發(fā)明涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體。因此，在一種實(shí)施方案中，表達(dá)載體是一種分離的和純化的DNA分子，該分子包括一個(gè)與編碼本發(fā)明的多肽的編碼片段可操作地連接的啟動(dòng)子，所述編碼片段還與一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)連接，以便由所述啟動(dòng)子啟動(dòng)該編碼片段的轉(zhuǎn)錄。
在本文中，“可操作地連接”一詞是指是以這種方式與一個(gè)編碼片段連接的啟動(dòng)子該編碼片段的轉(zhuǎn)錄受該啟動(dòng)子的控制和調(diào)節(jié)。將一個(gè)啟動(dòng)子與一個(gè)編碼片段可操作地連接的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的苜蓿植物抗真菌蛋白的DNA的重組表達(dá)是用轉(zhuǎn)化過(guò)的格蘭氏細(xì)菌，如大腸桿菌或假單胞菌宿主細(xì)胞完成的。能在大腸桿菌和其它格蘭氏陰性宿主細(xì)胞中進(jìn)行目標(biāo)多肽的高效表達(dá)的啟動(dòng)子在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
在將本發(fā)明的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化植物時(shí)，選擇具有能在植物中啟動(dòng)表達(dá)的能力的啟動(dòng)子。能在植物中起作用的啟動(dòng)子同樣是眾所周知的。可用于在植物中表達(dá)所述多肽的啟動(dòng)子是所披露的誘導(dǎo)型、病毒、合成的、組成型的(Poszkowski等，1989；Odell等，1985)，并可以是時(shí)間調(diào)控的、空間調(diào)控的、和時(shí)-空調(diào)控的(Chau等，1989)。
4.4.1啟動(dòng)子還要選擇啟動(dòng)子指導(dǎo)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的對(duì)編碼片段的轉(zhuǎn)錄活性的能力。在植物組織中結(jié)構(gòu)基因可以由多種啟動(dòng)子啟動(dòng)。啟動(dòng)子可以是近-組成型的，如CaMV35S啟動(dòng)子，或能影響雙子葉植物或單子葉植物的組織特異性或發(fā)育特異性啟動(dòng)子。
正如所討論的，可將編碼AlfAFP1和AlfAFP2的DNA在植物細(xì)胞中的表達(dá)置于天然存在的同源啟動(dòng)子，或多種異源啟動(dòng)子的控制之下。在有關(guān)文獻(xiàn)中披露了可在植物細(xì)胞中起作用的多種啟動(dòng)子。例如，其中包括胭脂氨酸合成酶(nos)、甘露氨酸合成酶(mas)和章魚氨酸合成酶(ocs)啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子由根癌農(nóng)桿菌的致瘤質(zhì)粒攜帶；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動(dòng)子；強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子；玄參屬花葉病毒(FMV)35S啟動(dòng)子；源于核糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基的(ssRUBISCO)的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；源于煙草的EIF-4A啟動(dòng)子(Mandel等，1995)；源于擬南芥屬的殼多糖啟動(dòng)子(Samac等，1991)；源于花莖甘藍(lán)的LTP(運(yùn)脂蛋白)啟動(dòng)子(Pyee等，1995)；源于玉米的遍在蛋白啟動(dòng)子(Christensen等，1992)；以及源于稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy等，1990)。以上所有啟動(dòng)子均被用于構(gòu)建在植物中表達(dá)的各種類型的DNA構(gòu)建體。例如，參見PCT國(guó)際公開WO84/02913。
可用于本發(fā)明方法中的DNA構(gòu)建體上的啟動(dòng)子可以根據(jù)其在受到真菌感染時(shí)賦予一種編碼序列的特異表達(dá)的能力進(jìn)行選擇。由真菌病原體感染植物，可以誘導(dǎo)多種蛋白，這些蛋白被稱為防衛(wèi)相關(guān)的或致病相關(guān)的(PR)蛋白(Bowles，1990；Bol等，1990；Linthorst，1991)。所述防衛(wèi)相關(guān)的或PR基因可以編碼參與苯丙酸代謝的酶(例如，苯丙氨酸脫氨酶，查耳酮合成酶)，能修飾植物細(xì)胞壁的蛋白(例如，富羥脯氨酸糖蛋白，富甘氨酸蛋白，過(guò)氧化物酶)，能降解真菌細(xì)胞壁的酶(如，殼多糖酶，葡聚糖酶)，奇甜蛋白-樣蛋白，或起功能尚不清楚的蛋白。業(yè)已從多種植物中提取并鑒定了防衛(wèi)相關(guān)或PR基因?？蓪⑺龌虻膯?dòng)子用于在受到真菌病原體感染的轉(zhuǎn)基因植物中啟動(dòng)AlfAFP1和AlfAFP2及其生物學(xué)功能等同物的表達(dá)。例如，所述啟動(dòng)子源于從馬鈴薯植物中分離的防衛(wèi)相關(guān)或PR基因(Fritzemeier等，1987；Cuypers等，1988；Logemann等，1989；Matton等，1989；Schroder等，1992)。另外，可以使用諸如獲自煙草的PRP1啟動(dòng)子的病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Martini等，1993)。
還可以根據(jù)其在AlfAFP1和AlfAFP2蛋白最為有效的組織中進(jìn)行特異表達(dá)的能力選擇啟動(dòng)子，所述組織如植物的開花部分(Weigel，1995)。
在任何場(chǎng)合下，被選擇用于啟動(dòng)AlfAFP1和AlfAFP2在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的特定啟動(dòng)子都應(yīng)當(dāng)能夠促進(jìn)抗真菌有效量的AlfAFP1和AlfAFP2在植物組織中的表達(dá)。能夠啟動(dòng)所述表達(dá)的組成型啟動(dòng)子的例子有e35S，F(xiàn)MV35S，稻肌動(dòng)蛋白，玉米遍在蛋白和eIF-4A啟動(dòng)子。
如果必要的話，可以對(duì)用于本發(fā)明DNA構(gòu)建體中的啟動(dòng)子進(jìn)行修飾，以影響其控制特性。例如，可將CaMV35S連接在ssRUBISCO基因的特定部分上，在沒有光照的條件下，抑制該基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生一種能在葉片中起作用但不能在根部起作用的啟動(dòng)子。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，“CaMV35S”包括CaMV35S啟動(dòng)子的變體，例如，通過(guò)與操縱子片段連接、隨機(jī)或受控制的誘變等所產(chǎn)生的啟動(dòng)子。另外，可以對(duì)用于本發(fā)明的啟動(dòng)子加以改變，使其含有多個(gè)增強(qiáng)子序列，以提高基因的表達(dá)水平。所述增強(qiáng)子序列的例子由Kay等披露(1987)。
當(dāng)所述啟動(dòng)子是近-組成型啟動(dòng)子時(shí)，如CaMV35S，能在多種轉(zhuǎn)化的植物組織(例如，愈傷組織、葉片、種子、和根)中加強(qiáng)多肽的表達(dá)。另外，可以使用含有組織特異性啟動(dòng)子的植物整合載體指導(dǎo)轉(zhuǎn)化的效果。
一種典型的組織特異性啟動(dòng)子是對(duì)種子組織具有特異性的凝集素啟動(dòng)予。大豆種子中的凝集素蛋白是由單基因(Lel)編碼的，該基因僅能在種子成熟過(guò)程中表達(dá)，其含量占種子總mRNA的大約2-5％。所述凝集素基因和種子特異啟動(dòng)子已被全面鑒定，并被用于在轉(zhuǎn)基因煙草植物中指導(dǎo)種子特異性表達(dá)(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。
4.4.2表達(dá)載體制備表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。用于轉(zhuǎn)化植物的表達(dá)載體(轉(zhuǎn)化載體)以及制備這種載體的方法披露于以下美國(guó)專利中US4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011，以上專利所披露的內(nèi)容被收作本文的參考?？梢詫?duì)所述載體進(jìn)行修飾，使其含有本發(fā)明的編碼序列。
業(yè)已建立了多種通過(guò)宿主的粘性末端或平末端將DNA可操作地連接到載體上的多種方法。例如，可以將互補(bǔ)的均聚物尾加到待插入載體DNA中的DNA片段上。然后通過(guò)所述互補(bǔ)的均聚尾之間的氫鍵將所述載體和DNA片段連接在一起，以形成重組DNA分子。
編碼一種具有賦予細(xì)胞抗真菌活性多肽的能力的編碼區(qū)優(yōu)選為AlfAFP1或AlfAFP2基因。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽具有序列2或序列14所示的氨基酸殘基序列，或所述序列的功能性等同物。按照該實(shí)施方案，所述編碼區(qū)優(yōu)選包括序列10所示的DNA序列或序列13所示的DNA序列。
由用組織特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞所產(chǎn)生的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，可以與由不同組織特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞所產(chǎn)生的第二種轉(zhuǎn)基因植物雜交，以產(chǎn)生一種雜交轉(zhuǎn)基因植物，這種雜交轉(zhuǎn)基因植物能在一種以上的特定組織中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化效應(yīng)。
典型的組織特異性啟動(dòng)子有玉米蔗糖合成酶1(Yang等，1990)，玉米醇脫氫酶1(Vogel等，1989)，玉米集光復(fù)合體(Simpson等，1986)，玉米熱激蛋白(Odell等，1985)，豌豆小亞基RuBP羧化酶(Poulsen等，1986；Cashmore等，1983)，Ti質(zhì)粒甘露氨酸合成酶(Langridge等，1989)，Ti質(zhì)粒胭脂氨酸合成酶(Langridge等，1989)，矮牽牛查耳酮異構(gòu)酶(Van Tunen等，1989)，菜豆富甘氨酸蛋白1(Keller等，1989)，CaMV35S轉(zhuǎn)錄物(Odell等，1985)和馬鈴薯patatin(Wenzler等，1989)。優(yōu)選的啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動(dòng)子和S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動(dòng)子。
表達(dá)載體的選擇以及最終將一種多肽編碼區(qū)同哪一種啟動(dòng)子可操作地連接，直接取決于所希望的功能特性，例如，蛋白表達(dá)的位點(diǎn)和時(shí)間，以及待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。以上是在構(gòu)建重組DNA分子時(shí)所固有的眾所周知的限制因素。不過(guò)，用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的載體能夠指導(dǎo)可操作地與其連接的所述多肽編碼區(qū)的表達(dá)。
用于在高等植物中表達(dá)基因的常用載體是本領(lǐng)域中眾所周知的，并包括源于根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的載體(Rogers等，1987)。不過(guò)，已知有幾種其它的植物整合載體系統(tǒng)能在植物中起作用，包括pCaMVCN轉(zhuǎn)移控制載體(Fromm等，1985)。質(zhì)粒pCaMVCN(由Pharmacia出售，Piscataway，NZ)包括花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于表達(dá)所述多肽的載體包括一個(gè)選擇標(biāo)記，該標(biāo)記能在植物細(xì)胞中起作用，優(yōu)選為抗藥性選擇標(biāo)記。一種優(yōu)選的抗藥性標(biāo)記是一種基因，該基因的表達(dá)可產(chǎn)生卡那霉素抗性；即含有胭脂氨酸合成酶啟動(dòng)子，Tn5新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptII)和胭脂氨酸合成酶3’非翻譯區(qū)的嵌合基因(Rogers等，1988)。
本發(fā)明的嵌合構(gòu)建體的3’非翻譯區(qū)應(yīng)當(dāng)含有轉(zhuǎn)錄終止子，或一個(gè)具有相同功能的元件，以及一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)，該信號(hào)在植物中起著導(dǎo)致腺苷酸化核苷酸添加到mRNA的3’末端的作用。所述3’區(qū)的例子包括含有農(nóng)桿菌屬Ti質(zhì)粒基因的聚腺苷酸化信號(hào)的3’轉(zhuǎn)錄的、非翻譯的片段，如胭脂氨酸合成酶(nos)基因，以及植物基因，如大豆7s儲(chǔ)藏蛋白基因和豌豆ssRUBISCO E9基因(Fischoff等，歐洲專利申請(qǐng)0 385962)。舉例來(lái)說(shuō)，可將以上因子進(jìn)行組合，以產(chǎn)生一種重組的、雙鏈DNA分子，該分子包括從5’至3’方向可操作地連接的以下部分
a)一個(gè)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能在植物細(xì)胞中起作用，導(dǎo)致一種mRNA序列的產(chǎn)生；b)一種編碼AlfAFP1或AlfAFP2的DNA編碼序列；和c)一個(gè)3’非翻譯區(qū)，它能在植物細(xì)胞中起作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的終止和聚腺苷酸化核苷酸向所述RNA序列的3’末端添加。
AlfAFP1和AlfAFP2的DNA編碼序列可以包括序列13或序列6所示的完整的核苷酸序列或其具有相同功能的任何部分，如截短的形式。另外，為了利用所述肽產(chǎn)生抗所述抗真菌多肽的抗體，需要表達(dá)該抗真菌多肽的表位區(qū)。
通常，位于所述聚腺苷酸化位點(diǎn)下游幾百個(gè)堿基對(duì)處的DNA序列起著終止轉(zhuǎn)錄的作用。該DNA序列在本文中被稱為轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。該區(qū)是對(duì)轉(zhuǎn)錄的信使RNA(mRNA)進(jìn)行有效聚腺苷酸化所需要的，并被稱為3’非翻譯區(qū)。RNA聚合酶能通過(guò)聚腺苷酸化的起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄編碼DNA序列。
還可將翻譯增強(qiáng)子作為所述載體DNA的一部分整合進(jìn)去。因此，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體還應(yīng)當(dāng)優(yōu)選包括一個(gè)或幾個(gè)5’非翻譯前導(dǎo)序列，該序列起著增強(qiáng)由所得到的mRNA轉(zhuǎn)錄物所得到的基因產(chǎn)物的表達(dá)。所述序列可源于被選擇用于表達(dá)該基因的啟動(dòng)子或可對(duì)其進(jìn)行特異修飾，以加強(qiáng)mRNA的翻譯。片段還可以從病毒RNA、合適的真核基因、或合成基因序列獲得(Griffiths等，1993)。
希望所述“增強(qiáng)子”序列能加強(qiáng)或改變所得到的mRNA的翻譯效率。本發(fā)明并不局限于這樣的構(gòu)建體其中增強(qiáng)子源于天然的5’非翻譯啟動(dòng)子序列，而且，還可以包括源于其它不相關(guān)的啟動(dòng)子的非翻譯前導(dǎo)序列，如其它增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄激活物或基因。例如，矮牽牛熱激蛋白70(Hsp70)含有所述前導(dǎo)序列(Winter，1988)。
4.4.3用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)AlfAFP的DNA構(gòu)建體如上文所述，本發(fā)明提供了有利于本發(fā)明所討論的DNA序列在高等植物和各種微生物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體。在本文中，“載體構(gòu)建體”或“表達(dá)載體”是指以功能性形式可操作地連接的DNA片段組件，該組件能指導(dǎo)本文所討論的DNA序列，以及任何感興趣的其它序列或基因的表達(dá)。
以雙鏈DNA形式存在的植物結(jié)構(gòu)編碼序列(基因、cDNA、合成DNA或其它DNA)的表達(dá)包括通過(guò)RNA聚合酶由所述DNA的一股鏈轉(zhuǎn)錄信使RNA(mRNA)，以及隨后在細(xì)胞核里面對(duì)該mRNA的原始轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行加工。所述加工涉及3’非翻譯區(qū)，該區(qū)能將聚腺苷酸化核苷酸添加到該mRNA的3’末端。
由DNA到mRNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程是受一段被稱為“啟動(dòng)子”的DNA調(diào)控。該啟動(dòng)子片段包括一個(gè)堿基序列，該序列指示RNA聚合酶與所述DNA結(jié)合，并用該DNA的一股鏈作為模板開始mRNA的轉(zhuǎn)錄，以形成相應(yīng)的RNA鏈。
因此，可用于本發(fā)明的載體包括可操作地與感興趣的編碼序列連接的啟動(dòng)子因子，并且，還可以包括5’非翻譯前導(dǎo)序列，3’非翻譯區(qū)，以及一個(gè)或幾個(gè)選擇標(biāo)記。有多種這樣的標(biāo)記是本領(lǐng)域中眾所周知的。
4.4.4所述cDNA序列的核苷酸序列生物學(xué)功能等同物本發(fā)明不僅包括如序列13或序列6所示的cDNA序列，而且還包括在生物學(xué)功能上等同的核苷酸序列。“生物學(xué)功能上等同的核苷酸序列”一詞表示DNA和RNA，包括基因組DNA，質(zhì)粒DNA，cDNA，合成DNA和mRNA核苷酸序列，它編碼具有與AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性的肽、多肽和蛋白，即在將其以功能上可操作地方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞以便其能夠表達(dá)時(shí)，它能以足于賦予宿主細(xì)胞或植物對(duì)真菌病原體的抗性的量產(chǎn)生具有抗真菌活性的肽、多肽或蛋白。
4.4.5編碼AlfAFP保守氨基酸改變的核苷酸序列本發(fā)明的生物學(xué)功能等同核苷酸序列，包括編碼基礎(chǔ)AlfAFP1和AlfAFP2氨基酸序列中的保守氨基酸改變的核苷酸序列，能使其產(chǎn)生沉默變化。所述核苷酸序列包括相對(duì)編碼野生型AlfAFP1和AlfAFP2的核苷酸序列的相應(yīng)堿基取代。
4.4.6含有堿基取代、添加、或缺失的核苷酸序列除了編碼所述基礎(chǔ)AlfAFP1和AlfAFP2多肽序列中的保守氨基酸改變的核苷酸序列之外，本發(fā)明的生物學(xué)功能等同核苷酸序列還包括含有其它堿基取代、添加、或缺失的核苷酸序列。其中包括含有與序列13或序列6所示DNA相同的遺傳信息的核酸，該核酸編碼能賦予宿主細(xì)胞和植物與AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌抗性的肽、多肽或蛋白。所述核苷酸序列可被稱為“序列13或序列6所示cDNA的遺傳學(xué)上等同的修飾形式”，并可以用本文所披露的方法鑒定。在編碼AlfAFP1和AlfAFP2的cDNA、質(zhì)粒DNA、基因組DNA、合成DNA或其它核酸中所產(chǎn)生的突變優(yōu)選能保留該編碼序列的讀框。另外，所述突變優(yōu)選不會(huì)產(chǎn)生互補(bǔ)片段，這種片段能夠雜交以產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)，如環(huán)或發(fā)卡，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)mRNA翻譯產(chǎn)生不利影響。
盡管突變位點(diǎn)可以預(yù)先確定，但沒有必要預(yù)先確定突變本身的性質(zhì)。例如，為了在特定位點(diǎn)上選擇最佳突變特性，可以在靶密碼子上進(jìn)行隨機(jī)誘變。
另外，可以通過(guò)合成含有突變序列的寡核苷酸將突變引入特定位點(diǎn)，在所述突變序列的旁側(cè)是限制位點(diǎn)，使其能夠連接到天然AlfAFP1或AlfAFP2的cDNA序列的片段上。在進(jìn)行連接以后，所得到的重構(gòu)核苷酸序列編碼具有所需的氨基酸插入、取代或缺失的衍生形式的AlfAFP1或AlfAFP2。
在任何情況下，都可以通過(guò)諸如例3中所披露的方法篩選所表達(dá)的突變體的希望的抗真菌活性。
序列13或序列6的cDNA的有用的遺傳學(xué)等同修飾形式的具體例子包括具有與序列13或序列6的cDNA有很高同源性，即序列相同性的核苷酸序列的DNA。可以與序列13或序列6的cDNA或其相應(yīng)部分有大約70％或更高的序列相同性，更優(yōu)選大約80％或更高的序列相同性，最優(yōu)選大約90％或更高的序列相同性。
所述遺傳學(xué)上等同的修飾形式可以用常規(guī)的DNA-DNA或DNA-RNA雜交技術(shù)(Sambrook等，1989)提取或通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCRTM)方法擴(kuò)增。所述修飾形式應(yīng)當(dāng)具有在通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化技術(shù)將其導(dǎo)入正常情況下對(duì)真菌病原體敏感的植物細(xì)胞中后，賦予該植物對(duì)所述真菌病原體的抗性的能力。
4.4.7編碼AlfAFP的片段和變體的核苷酸序列在例5中所討論的AlfAFP1和AlfAFP2的片段和變體可以由cDNA、質(zhì)粒DNA、基因組DNA、合成DNA或mRNA編碼。所述核酸與具有序列13和序列6中所示核苷酸序列的編碼AlfAFP1和AlfAFP2的cDNA的相應(yīng)片段或部分，或與其對(duì)應(yīng)的mRNA之間具有大約70％或更高的序列相似性，優(yōu)選大約80％或更高的序列相似性，最優(yōu)選大約90％或更高的序列相似性。
在本發(fā)明中，具有序列13和序列6所示核苷酸序列的AlfAFP1和AlfAFP2的cDNA的核酸生物學(xué)功能等同物包括1)其長(zhǎng)度通過(guò)天然或人工突變，如部分核苷酸缺失、插入、添加等而發(fā)生了改變的DNA，因此，當(dāng)序列13的完整長(zhǎng)度被100％地采用時(shí)，所述生物學(xué)功能等同序列的長(zhǎng)度大致為序列13或序列6所示序列的60-120％，優(yōu)選80-110％；或2)含有部分(優(yōu)選為其完整長(zhǎng)度的20％或更低，優(yōu)選為10％或更低，更優(yōu)選為5％或更低)天然或人工突變的核苷酸序列，以使該序列能編碼不同的氨基酸。不過(guò)，其中，所得到的多肽保留了AlfAFP1和AlfAFP2的抗真菌活性。以這種方法產(chǎn)生的突變DNA通常編碼一種與由序列13和序列6的核苷酸序列所編碼的AlfAFP1和AlfAFP2(序列2)的氨基酸序列之間具有70％或更高，優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選90％或更高的序列相同性的多肽。
在本發(fā)明中用于產(chǎn)生人工突變的方法并不受特別的限制，而且所述突變可以用本領(lǐng)域中任何常規(guī)方法產(chǎn)生。
例如，可以用合適的限制酶對(duì)AlfAFP1或AlfAFP2的cDNA或基因進(jìn)行處理，以便插入或缺失合適的DNA片段，使正確的氨基酸讀框得以保存。在用限制性內(nèi)切酶處理之后，對(duì)消化過(guò)的DNA進(jìn)行處理，以補(bǔ)平所有的突出端，并將這些DNA重新連接。
還可以通過(guò)合成含有突變序列的寡核苷酸序列將突變引入特定的位點(diǎn)，該序列旁側(cè)的限制位點(diǎn)使其能被連接到天然AlfAFP1或AlfAFP2的cDNA或基因組序列的片段上。在連接以后，所得到的重構(gòu)序列編碼具有所希望的氨基酸插入、取代或缺失的衍生物。
另外，可將寡核苷酸位點(diǎn)專一性或片段專一性誘變方法用于產(chǎn)生改變了的cDNA或基因組DNA序列，該序列可根據(jù)所需要的取代、缺失或插入而具有特定的密碼子變化。
產(chǎn)生上述變化的代表性方法披露于以下文獻(xiàn)中Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik等(1985)；Frits Eckstein等(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；Osuna等(1994)；和Walder等(1986)?？梢詫?duì)通過(guò)上述任一種方法產(chǎn)生的本發(fā)明所披露的cDNA序列的生物學(xué)功能等同物進(jìn)行選擇，選擇是通過(guò)用例3所述的方法測(cè)定其所編碼的肽、多肽或蛋白而進(jìn)行的。
4.4.8編碼能與抗AlfAFP的抗體反應(yīng)的肽、多肽和蛋白的核苷酸序列編碼AlfAFP1和AlfAFP2的cDNA的生物學(xué)功能等同形式包括編碼能與抗AlfAFP1和AlfAFP2的抗體起反應(yīng)，即特異結(jié)合的肽、多肽和蛋白的核苷酸序列，它具有與該多肽相同或相似的抗真菌活性。所述抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
4.4.9遺傳學(xué)簡(jiǎn)并核苷酸序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，即天然存在蛋白中的大部分氨基酸具有一個(gè)以上的密碼子，可以將其它DNA(和RNA)序列用于實(shí)施本發(fā)明，所述其它DNA序列含有大體上與本發(fā)明的cDNA相同的遺傳信息，并編碼大體上與由序列13與序列6的核苷酸序列編碼的氨基酸序列相同的氨基酸序列。這一原理同樣適用于本文所討論的任何其它核苷酸序列。
4.4.10為了增強(qiáng)在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)而設(shè)計(jì)的合成DNA序列本發(fā)明cDNA的生物學(xué)功能等同形式還包括為了增強(qiáng)在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)而設(shè)計(jì)的合成DNAs。宿主細(xì)胞通常具有優(yōu)選形式的密碼子使用(Murray等，1989)。因此，為了增強(qiáng)在特定宿主中表達(dá)而設(shè)計(jì)的合成DNA s應(yīng)當(dāng)體現(xiàn)該宿主細(xì)胞中的密碼子使用形式。
在本發(fā)明中，可以用序列分析軟件包的“BestFit”或“Gap”程序測(cè)定序列相似性或相同性(遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組公司，威斯康遜大學(xué)生物技術(shù)中心，Madison，WI53711)。
4.4.11編碼融合形式AlfAFP1的核苷酸序列可用于本發(fā)明的序列13或序列6的cDNA的其它生物學(xué)功能等同形式包括這樣的序列該序列被修飾成能編碼與其它肽、多肽或蛋白的綴合物，如在“本發(fā)明概述”和例5部分所討論的，因此它能編碼一種融合產(chǎn)物。
4.4.12通過(guò)雜交檢測(cè)AlfAFP cDNA的生物學(xué)功能等同形式盡管在序列13或序列6中示出了編碼AlfAFP1和AlfAFP2的核苷酸序列的一種實(shí)施方案，但應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明還包括能與序列13和序列6的序列及其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列，而且該序列所編碼的肽、多肽和蛋白具有與AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性。所述核苷酸序列優(yōu)選能在中等至高度嚴(yán)格的條件下與序列13和序列6或其互補(bǔ)序列雜交(參見Samrook等，1989)。典型的條件包括首先在6XSSC，5XDenhardt’s溶液，100mg/ml魚精DNA，0.1％SDS中，在55℃進(jìn)行足夠時(shí)間(例如，幾小時(shí)至過(guò)夜)長(zhǎng)度的雜交，接著洗滌兩次，每次15分鐘，洗滌是在室溫下在2XSSC，0.1％SDS中進(jìn)行的，接著再在0.5-1XSSC，0.1％SDS中，在55℃下進(jìn)行兩次，每次15分鐘，然后進(jìn)行放射性自顯影。通常，當(dāng)所述雜交混合物在0.1XSSC中洗滌至少一次時(shí)所述核酸分子能夠雜交，所述洗滌是在55℃，優(yōu)選60℃，更優(yōu)選65℃的溫度下進(jìn)行的。
本發(fā)明還涉及能在相當(dāng)于上述條件的鹽和溫度條件下與序列13和序列6的cDNA雜交的核苷酸序列，該核苷酸序列所編碼的肽、多肽和蛋白具有與本發(fā)明所披露的AlfAFP1和AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性。
如果上述核苷酸序列所編碼的肽、多肽或蛋白的抗真菌活性與AlfAFP1和AlfAFP2抗真菌活性相差大約±25％或更低，則認(rèn)為該序列具有大體上與編碼AlfAFP1和AlfAFP2的序列13和序列6的cDNA相同的生物學(xué)功能。
4.4.13能與抗AlfAFP的抗體起反應(yīng)的肽、多肽和蛋白AlfAFP1和AlfAFP2的生物學(xué)功能等同形式還包括能與抗AlfAFP1和AlfAFP2的抗體起反應(yīng)，即特異結(jié)合的肽、多肽和蛋白，它具有與該多肽相同或相似的抗真菌活性。所述抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
4.5新型抗真菌蛋白的鑒定本發(fā)明還提供了構(gòu)成AlfAFP1或AlfAFP2抗真菌蛋白的全部或一部分的新型多肽。AlfAFP1是分子量大約為5,186道爾頓的多肽。SDS凝膠電泳顯示其大致分子量為6kDa。按照例2所述方法測(cè)定氨基酸序列，并按照例3所述方法測(cè)定其生物學(xué)效力。其氨基酸序列包括序列2所示的45個(gè)氨基酸。
4.7轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明的其它方面包括用一種或幾種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或完整的植株的方法和組合物，所述表達(dá)載體含有苜蓿植物抗真菌蛋白編碼基因片段。由所述轉(zhuǎn)化方法所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或由所述轉(zhuǎn)化方法所產(chǎn)生的植物或由轉(zhuǎn)基因植物所產(chǎn)生的子代和種子是本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案。
用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌和酵母細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域所熟知。通常，轉(zhuǎn)化方法類似于用于轉(zhuǎn)化諸如大腸桿菌或釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的其它細(xì)菌或真菌的眾所周知的方法。用DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，將基因轉(zhuǎn)入花粉，注射到生殖器官，注射到成熟的胚和粒子轟擊。所述每一種方法具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。因此，將基因?qū)胍环N特定植物種的一種特定方法對(duì)另一種植物種來(lái)說(shuō)不一定是最有效的，不過(guò)，將哪一種方法用于特定的植物種是眾所周知的。
存在很多用于將轉(zhuǎn)化DNA片段導(dǎo)入細(xì)胞中的方法，但并不是所有方法都適用于將DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中。據(jù)信，合適的方法實(shí)際上包括可將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的所有方法，如農(nóng)桿菌感染，通過(guò)PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化直接導(dǎo)入DNA(Omirullh等，1993)，通過(guò)脫水/抑制-介導(dǎo)的DNA攝取，通過(guò)電穿孔，通過(guò)用碳化硅纖維激發(fā)，通過(guò)加速涂有DNA的粒子等。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選加速方法，其中包括，例如微粒轟擊等。用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。業(yè)已披露了四種用于將基因?qū)爰?xì)胞的方法(1)化學(xué)方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法，如微量注射(Capecchi，1980)，電穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；US5,2384,253)和基因槍(Johnston，Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988a；1988b)；和(4)受體-介導(dǎo)機(jī)制(Curiel等，1994；1992；Wagner等，1992)。
4.7.1電穿孔對(duì)多種動(dòng)物和植物細(xì)胞施加簡(jiǎn)單的高電壓電脈沖可導(dǎo)致在其細(xì)胞質(zhì)膜上形成納米級(jí)的孔。通過(guò)這些孔將DNA直接攝入細(xì)胞質(zhì)中，或因?yàn)榧?xì)胞膜成分的再分配而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，與此相伴的是所述孔的關(guān)閉。電穿孔方法可能極其有效，既可用于克隆基因的瞬時(shí)表達(dá)，又可用于建立帶有整合的感興趣的基因拷貝的細(xì)胞系。與磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)體融合不同，電穿孔方法通常能產(chǎn)生帶有一個(gè)或至多幾個(gè)整合的外源DNA拷貝的細(xì)胞系。
通過(guò)電穿孔方法導(dǎo)入DNA的技術(shù)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在該方法中，要使用某些細(xì)胞壁降解酶，如果膠降解酶，使得靶受體細(xì)胞比未處理過(guò)的細(xì)胞更容易通過(guò)電穿孔方法轉(zhuǎn)化?；蛘?，通過(guò)機(jī)械創(chuàng)傷使得受體細(xì)胞更容易被轉(zhuǎn)化。為了通過(guò)電擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，人們可以采用諸如細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物或胚發(fā)生愈傷組織的易碎組織，或者直接轉(zhuǎn)化未成熟的胚或其它有機(jī)組織。人們可以通過(guò)用果膠降解酶(果膠裂解酶)處理或以受控制的方式進(jìn)行機(jī)械創(chuàng)傷對(duì)所選擇的細(xì)胞的細(xì)胞壁進(jìn)行部分降解。這種細(xì)胞隨后可以通過(guò)電擊法接受DNA轉(zhuǎn)移，電穿孔可以在這一時(shí)期進(jìn)行，然后通過(guò)合適的選擇或篩選方法鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述篩選方法取決于新整合的DNA的性質(zhì)。
4.7.2微粒轟擊用于將轉(zhuǎn)化DNA片段導(dǎo)入細(xì)胞的另一種優(yōu)選方法是微粒轟擊。在該方法中，可以用核酸涂覆粒子，并通過(guò)推力將其送入細(xì)胞。典型的粒子包括由鎢、金、白金等組成的顆粒。
微粒轟擊除了是一種再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的單子葉植物的有效方法之外，其另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是既不需要提取原生質(zhì)體(Cristou等，1988)，又不需要易受農(nóng)桿菌屬感染。用于通過(guò)加速將DNA導(dǎo)入玉米細(xì)胞中的一種代表性實(shí)施方案是Biolistics Particle Delivery System，該裝置可用于將涂有DNA的顆粒或細(xì)胞通過(guò)一個(gè)諸如不銹鋼或Nytex網(wǎng)的網(wǎng)射在覆蓋有懸浮培養(yǎng)的玉米細(xì)胞的濾膜表面上。所述網(wǎng)將所述顆粒分散，以便這些顆粒不會(huì)以大的團(tuán)聚體輸入受體細(xì)胞中。據(jù)信，插在所述微粒裝置和待轟擊的細(xì)胞之間的網(wǎng)可以降低微粒團(tuán)聚體的大小，并可以以較高的頻率轉(zhuǎn)化，因?yàn)榻档土擞捎谶^(guò)大的微粒對(duì)受體細(xì)胞造成的傷害。
對(duì)轟擊而言，優(yōu)選將懸浮液中的細(xì)胞濃縮在濾膜或固體培養(yǎng)基上。另外，可以將未成熟的胚或其它靶細(xì)胞放在固體培養(yǎng)基上。將待轟擊的細(xì)胞放在大顆粒阻擋板下方的合適距離處。如果需要還可將一個(gè)或幾個(gè)網(wǎng)放在所述加速裝置和待轟擊的細(xì)胞之間。通過(guò)使用本發(fā)明的技術(shù)可以獲得多達(dá)一千個(gè)或更多個(gè)能瞬時(shí)表達(dá)一種標(biāo)記基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶。能在轟擊之后48小時(shí)表達(dá)所述外源基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化灶中的細(xì)胞數(shù)，通常為1-10個(gè)，平均為1-3個(gè)。
在轟擊轉(zhuǎn)化時(shí)，人們可以優(yōu)化轟擊前培養(yǎng)條件和轟擊參數(shù)，以產(chǎn)生最大數(shù)量的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。在該方法中，用于轟擊的物理和生物學(xué)參數(shù)都很重要。物理因素有參與DNA/微粒沉淀的控制的因素，或影響所述大顆粒或微顆粒的飛行和速度的因素。生物學(xué)因素包括在轟擊之前和轟擊之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操作的所有步驟，為了減輕與轟擊相關(guān)的創(chuàng)傷而對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行的滲透壓調(diào)節(jié)，以及轉(zhuǎn)化DNA的性質(zhì)，如線性化DNA或完整的超螺旋質(zhì)粒。據(jù)信，對(duì)于未成熟胚的成功轉(zhuǎn)化來(lái)說(shuō)，轟擊前操作是特別重要的。
因此，在小規(guī)模研究中人們希望調(diào)節(jié)各種轟擊參數(shù)，以全面優(yōu)化其調(diào)節(jié)。人們可能特別希望調(diào)節(jié)諸如間隙距離、飛行距離、組織距離、和氦氣壓力之類的物理參數(shù)。還可以通過(guò)改變影響受體細(xì)胞的生理狀態(tài)的條件降低創(chuàng)傷減弱因子(TRFs)，并能因此影響轉(zhuǎn)化和整合的效率。例如，為了進(jìn)行最佳的轉(zhuǎn)化，可以對(duì)滲透壓狀態(tài)、組織水合和繼代培養(yǎng)階段或受體細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)整。通過(guò)閱讀本說(shuō)明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以了解其它常規(guī)調(diào)節(jié)的執(zhí)行情況。
4.7.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移是一種被普遍用于將基因?qū)胫参锛?xì)胞的系統(tǒng)，因?yàn)?，可將DNA導(dǎo)入全植株組織中，省略了由原生質(zhì)體再生全植株的必要性。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物整合載體，將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。例如，參見公開的方法(Fraley等，1985；Rogers等，1987)。另外，Ti-DNA的整合是一種比較精確的方法，會(huì)產(chǎn)生很少的重組。待轉(zhuǎn)移的DNA片段由邊界序列確定，而間插DNA通常是以所披露的方式插入植物基因組中(Spielmann等，1986；Jorgensen等，1987)。
現(xiàn)代農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體能夠在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬中復(fù)制，可以用所公開的方法進(jìn)行方便地操作(Klee等，1985)。而且，在用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移載體方面的最新技術(shù)發(fā)展改善了基因或限制位點(diǎn)在所述載體中的排列，以便構(gòu)建能夠表達(dá)各種多肽編碼基因的載體。所披露的載體(Rogers等，1987)具有常見的多接頭片段，其旁側(cè)為一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)聚腺苷酸化位點(diǎn)，用于指導(dǎo)插入的多肽編碼基因的表達(dá)，并適用于本發(fā)明目的。另外，含有有臂和無(wú)臂Ti基因的農(nóng)桿菌屬可用于轉(zhuǎn)化。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化有效的植物種中，由于該方法的簡(jiǎn)易和確定的基因轉(zhuǎn)移性質(zhì)而選擇該方法。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片和諸如子葉和下胚軸的其它組織的轉(zhuǎn)化似乎局限于受農(nóng)桿菌天然感染的植物。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在雙子葉植物中最為有效。雖然單子葉植物不是農(nóng)桿菌屬的天然宿主，但業(yè)已報(bào)導(dǎo)了用農(nóng)桿菌屬載體實(shí)現(xiàn)了天門冬屬的轉(zhuǎn)化(Dytebier等，1987)。
用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物通常含有位于一條染色體上的單基因。所述轉(zhuǎn)基因植物相對(duì)所增加的基因而言可以被稱為雜合的。不過(guò)，“雜合的”一詞的使用通常意味著在染色體對(duì)的第二條染色體上的相同的位點(diǎn)上存在一個(gè)互補(bǔ)基因，但在本發(fā)明的含有一個(gè)添加基因的植物中沒有這樣的互補(bǔ)基因，有理由相信這種植物的更準(zhǔn)確的名稱是獨(dú)立的分離體，因?yàn)樗鎏砑拥耐庠椿蛟谟薪z分裂和減數(shù)分裂期間是獨(dú)立分離的。
更優(yōu)選的是對(duì)所述添加的結(jié)構(gòu)基因而言是純合的轉(zhuǎn)基因植物；即一種含有兩個(gè)添加基因的轉(zhuǎn)基因植物，在染色體對(duì)的每一條染色體的相同位點(diǎn)上各有一個(gè)基因。純合轉(zhuǎn)基因植物可以通過(guò)以下方法獲得使含有單一的添加基因的獨(dú)立分離的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行有性交配(自交)，讓某些所產(chǎn)生的種子萌發(fā)，對(duì)所得到的植株進(jìn)行分析，分析其相對(duì)對(duì)照(天然的、非轉(zhuǎn)基因的)或獨(dú)立分離轉(zhuǎn)基因植物的增強(qiáng)了的轉(zhuǎn)基因活性。
可以理解，可以讓兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行交配，以產(chǎn)生含有兩個(gè)獨(dú)立分離的、添加的外源基因的后代。通過(guò)合適子代的自交可以產(chǎn)生對(duì)于兩個(gè)添加的外源基因來(lái)說(shuō)都是純合的植株，所述外源基因編碼感興趣的多肽。還可以與一個(gè)親本植株進(jìn)行回交，和與一種非轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行異型雜交。
4.7.4其它轉(zhuǎn)化方法植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化可以用基于磷酸鈣沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔、和以上處理的組合的方法實(shí)現(xiàn)(例如，參見Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1986；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)。
所述系統(tǒng)在不同植物種上的應(yīng)用取決于特定植物種由原生質(zhì)體再生的能力。披露了用于禾谷類植物由原生質(zhì)體再生的典型方法(Fugimura等，1985；Toriyema等，1986；Yamada等，1985；Abdullah等，1986)。
為了轉(zhuǎn)化不能由原生質(zhì)體成功地再生的植物種，可以使用其它方法將DNA導(dǎo)入完整的細(xì)胞或組織。例如，可以用公開的方法實(shí)現(xiàn)谷類由未成熟的胚或外植體進(jìn)行的再生(Vasil，1988)。另外，可以使用“粒子槍”或高速微粒方法(Vasil，1992)。
使用后一種方法，讓攜帶在小的金屬顆粒表面上的DNA通過(guò)細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，正如所披露的那樣(Klein等，1987；Klein等，1988；McCabe等，1988)。所述金屬顆粒能穿透幾層細(xì)胞，因此，能轉(zhuǎn)化組織外植體中的細(xì)胞。
4.8生產(chǎn)抗真菌轉(zhuǎn)基因植物的方法通過(guò)用含有重組AlfAFP1和/或AlfAFP2的基因片段轉(zhuǎn)化諸如植物細(xì)胞的合適宿主細(xì)胞，其所編碼的苜蓿植物抗真菌蛋白的表達(dá)可導(dǎo)致抗真菌植株的形成。
具體來(lái)說(shuō)，可以用一種含有苜蓿植物抗真菌蛋白的編碼片段和合適的選擇標(biāo)記的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化諸如小麥或玉米細(xì)胞的胚性植物細(xì)胞的懸浮液，轉(zhuǎn)化是使用諸如粒子轟擊的方法進(jìn)行的(Maddock等，1991；Vasil，1992)，以便將涂覆在微粒上的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。然后由能表達(dá)所述抗真菌蛋白的轉(zhuǎn)化胚愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因植株。
還可以用其它細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的形成，這些方法為本領(lǐng)域所熟知，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移(Fraley等，1983)。可以通過(guò)直接DNA轉(zhuǎn)移將DNA導(dǎo)入花粉(Zhou等，1983；Hess等，1987；Lou等，1988)，通過(guò)將DNA注射到植物的生殖器官(Pena等，1987)，或通過(guò)將DNA注射到未成熟胚的細(xì)胞中而將DNA導(dǎo)入植物中，然后使脫水的胚重新水合(Neuheus等，1987；Bendrook等，1986)。
由單個(gè)的植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或各種轉(zhuǎn)化的外植體進(jìn)行的植株的再生、發(fā)育、和培養(yǎng)為本領(lǐng)域所熟知(Weisseach和Weisseach，1988)。所述再生和生長(zhǎng)過(guò)程通常包括以下步驟選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，培養(yǎng)這些獨(dú)特的細(xì)胞，使其通過(guò)常見的胚胎發(fā)育階段，通過(guò)長(zhǎng)根的小植株階段。以類似方法再生轉(zhuǎn)基因胚和種子。然后將所得到的轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)根的幼苗種植到諸如土壤的合適植物生長(zhǎng)介質(zhì)中。
由葉片外植體進(jìn)行的含有通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入的編碼感興趣的多肽的外源基因的植物的發(fā)育或再生可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法完成，如由Horsch等(1985)所披露的。在該方法中，在有選擇試劑的條件下，在能誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)化的植物種再生幼苗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，如所披露的(Fraley等，1983)。
所述方法通常能在2-4個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生幼苗，然后將這些幼苗轉(zhuǎn)移到合適的根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有選擇試劑和一種抗生素，以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。在有選擇試劑的條件下能長(zhǎng)根的幼苗形成小植株，然后將這些小植株移植到土壤或其它介質(zhì)中，以便產(chǎn)生根。所述方法根據(jù)所使用的特定植物種而變化，這種變化在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
優(yōu)選地，讓再生的植株自花授粉，以產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物，如上文所述?；蛘撸層伤鲈偕仓戢@得的花粉與農(nóng)業(yè)上重要的結(jié)實(shí)植物雜交，所述植物優(yōu)選為近交系。相反，可將所述重要的近交系的花粉用于為再生的植株授粉。用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法栽培本發(fā)明的含有一種需要的多肽的轉(zhuǎn)基因植物。
因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有較大量的編碼區(qū)(例如，AlfAFP基因)，該基因編碼感興趣的AlfAFP多肽。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是一種獨(dú)立的分離體，它能將所述基因及其活性傳給其子代；例如，所述基因處于純合或雜合狀態(tài)的轉(zhuǎn)基因植物，并能將所述基因傳給其所有有性雜交的后代。還可以用營(yíng)養(yǎng)繁殖或嫁接的方法獲得無(wú)性系。另外，可將轉(zhuǎn)基因植物的種子種植到大田中或溫室中，并讓所得到的性成熟的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行自花授粉，以產(chǎn)生純育植株。由這些植株所產(chǎn)生的后代形成純育系，評(píng)價(jià)所述純育系例如加強(qiáng)了的抗真菌病原體的抗真菌能力，所述評(píng)價(jià)優(yōu)選在大田中、在環(huán)境條件下進(jìn)行。本發(fā)明人認(rèn)為，本發(fā)明特別適用于產(chǎn)生具有商業(yè)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物，包括各種草坪草、小麥、玉米、稻、大麥、燕麥、馬鈴薯、大豆、棉花、諸如草莓的漿果、各種觀賞植物和蔬菜、以及多種長(zhǎng)堅(jiān)果和長(zhǎng)水果的樹木和植物。
4.9表達(dá)AlfAFP1的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物的產(chǎn)生和黃萎病控制發(fā)病試驗(yàn)結(jié)果可以通過(guò)以下步驟產(chǎn)生能表達(dá)抗真菌有效量的AlfAFP1和AlfAFP2及其生物學(xué)功能等同物的轉(zhuǎn)基因植物(a)用一種重組DNA分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA分子在5’-3’方向上包括可操作地連接的(i)一個(gè)能指導(dǎo)基因在植物中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子片段；(ii)一個(gè)DNA編碼序列，該序列所編碼的RNA能編碼AlfAFP1和AlfAFP2或具有與AlfAFP1或AlfAFP2相同或相似的抗真菌活性的其生物學(xué)功能等同物；和(iii)一個(gè)3’非翻譯區(qū)，它編碼一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)，該信號(hào)在植物細(xì)胞中起著使轉(zhuǎn)錄終止和將聚腺苷酸化核苷酸添加到所述RNA序列的3’末端的作用；(b)篩選被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(c)再生被轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞，以產(chǎn)生分化的植株；和(d)選擇轉(zhuǎn)化的植株，該植株的細(xì)胞能袁達(dá)所述DNA編碼序列，并產(chǎn)生抗真菌有效量的AlfAFP1或AlfAFP2或其生物學(xué)功能等同物。
本發(fā)明的方法可以用多種方法實(shí)現(xiàn)。通過(guò)上述任一種方法制備的抗真菌多肽可以與載體或包括其它抗真菌劑在內(nèi)的其它添加劑混合的形式直接施加到植物上，正如本領(lǐng)域中眾所周知的。所述多肽可以由細(xì)菌或酵母細(xì)胞表達(dá)，可將這些細(xì)胞施加到植物上，其中的某些細(xì)胞可以與植物共生。還可以用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，使其含有編碼抗真菌多肽的DNA。所述基因可以組織特異性形式以組成型方式表達(dá)，或在植物受到真菌病原體感染以后表達(dá)。
所述新型苜蓿植物抗真菌多肽的氨基酸序列業(yè)已通過(guò)直接測(cè)序法和通過(guò)克隆cDNA的翻譯測(cè)定，其同源性有別于其它植物防衛(wèi)素型抗真菌多肽。最接近的多肽序列源于豌豆mRNA(pI230)，它們具有70％的同源性。在圖2中示出了將AlfAFP1的氨基酸與pI230的氨基酸序列進(jìn)行比較的疊加圖。
本發(fā)明還涉及本文所披露的一切DNA序列或其生物學(xué)功能等同物的用途，可將其用于生產(chǎn)能被用于鑒定能賦予植物細(xì)胞對(duì)真菌病原體抗性的相關(guān)DNA序列的重組質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化的微生物、探針、和底物，并可將其用于生產(chǎn)抗所述真菌病原體的轉(zhuǎn)基因植物。
如上文所述，本發(fā)明的抗真菌多肽還可用于與化合物以及其它抗真菌劑組合，包括與具有抗真菌活性的其它肽、多肽、和蛋白組合，以便產(chǎn)生一種廣譜活性，即能控制更多的病原體，和/或提供控制同一種真菌病原體的多種作用模式。所述其它抗真菌劑的例子包括殼多糖酶、富半胱氨酸殼多糖結(jié)合蛋白、D-1，3-葡聚糖酶、透肽菌素(包括zeamatins)，硫素，核糖體-失活蛋白，核非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白。
提供下列本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明，是為了幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。盡管如此，以下詳細(xì)說(shuō)明不應(yīng)被視為對(duì)本發(fā)明的不適當(dāng)限定，因?yàn)楸绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思或范圍的前提下能對(duì)本文所披露的實(shí)施方案進(jìn)行改進(jìn)或改變。
5.0實(shí)施例通過(guò)以下說(shuō)明性的、非限定性實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明。
5.1例1首先用Laemmli的方法(1970)通過(guò)電泳測(cè)定AlfAFP1的分子量。將所述多肽溶解在含有450mN Tris-HCl，pH8.45，12％甘油，4％SDS，0.06％考馬斯藍(lán)G，和0.0025％酚紅(Novex，San Diego，CA)的變性加樣緩沖液中，煮沸10分鐘，并在16％的Tricine凝膠(Novex，San Diego，CA)中電泳，電泳是在含有100mM Tris，100mM Tricine，和1％SDS的電泳緩沖液中進(jìn)行的，以125V的恒定電壓電泳2小時(shí)。銀染(Integrated Separation Systems，Natick，MA)，發(fā)現(xiàn)了一條分子量大約為4kDa的帶。
通過(guò)Scoble等(1993)披露的正離子電噴射質(zhì)譜對(duì)AlfAFP1進(jìn)行質(zhì)譜分析。所觀察到的所述天然多肽的分子量大約為5,186道爾頓。
5.2例2AlfAFP1的氨基酸序列為了測(cè)定AlfAFP1的氨基酸序列，在含有8mM二硫蘇糖醇的8M尿素中使純化的多肽(根據(jù)質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)，其純度大于98％)變性。通過(guò)用Stone等(1993)所披露的S-羧基-甲基化方法修飾半胱氨酸殘基。通過(guò)用截至分子量為1,000kDa的膜對(duì)蒸餾水透析除去試劑。在一臺(tái)Applied Biosystems model 470A蛋白測(cè)序儀(Applied Biosystems，Norwalk CT)進(jìn)行自動(dòng)Edman降解。用一臺(tái)Applied Biosystems model120PTH分析儀以聯(lián)機(jī)形式通過(guò)反相分析鑒定相應(yīng)的PTH-氨基酸衍生物。
所述多肽的N-末端測(cè)序證實(shí)了序列1所示的43個(gè)氨基酸，在其40和41位上具有不確定的信號(hào)。通過(guò)對(duì)所述多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析所得到的資料表明，所述多肽含有45個(gè)氨基酸，而且，未測(cè)定的氨基酸殘基是第40位上的色氨酸，第41位上的半胱氨酸，第44位上的精氨酸，和第45位上的半胱氨酸。
成熟AlfAFP1多肽的全氨基酸序列如序列2所示。該多肽的計(jì)算分子量為5,187，這一結(jié)果與所測(cè)定的分子量5,186(例1)吻合。
5.3例3AlfAFP1的生物效力AlfAFP1(序列2)的抗真菌活性用抑制50％的真菌菌絲生長(zhǎng)(IC50)所需要的以μg/ml為單位表示的濃度。真菌菌絲生長(zhǎng)抑制的百分比被定義為100x試樣培養(yǎng)物中平均菌絲長(zhǎng)度與對(duì)照培養(yǎng)物中平均菌絲長(zhǎng)度的比，在所述對(duì)照培養(yǎng)物中，用緩沖液取代所述多肽樣品。
在倒置顯微鏡下面，通過(guò)測(cè)定在有所述多肽的條件下對(duì)多種不同真菌的真菌菌絲體長(zhǎng)度的抑制作用，測(cè)定AlfAFP1的抗真菌活性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中所使用的真菌，讓真菌孢子(2×104孢子/ml)在50μl的雙強(qiáng)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中萌發(fā)5-15小時(shí)。最終的單強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基含有K2HPO4(2.5mM)，MgSO4(50μM)，CaCl2(50μM)，F(xiàn)eSO4(5μM)，CoCl2(0.1μM)，CuSO4(0.1μM)，Na2MoO4(2μM)，H3BO3(0.5μM)，KI(0.1μM)，ZnSO4(0.5μM)，MnSO4(0.1μM)，葡萄糖(10g/l)，天冬酰胺(1g/l)，甲硫氨酸(20mg/l)，肌醇(2mg/l)，生物素(0.2mg/l)，鹽酸硫胺素(1mg/l)，和鹽酸吡哆醇(0.2mg/l)。為了研究陽(yáng)離子的拮抗效應(yīng)，分別以1mM和50mM的終濃度加入CaCl2和KCl。這種添加了鹽的培養(yǎng)基被稱為“高鹽培養(yǎng)基”，而其原始培養(yǎng)基被稱為“低鹽培養(yǎng)基”。在孢子萌發(fā)以后，將50μl過(guò)濾消毒的溶解在蒸餾水中的多肽溶液加入含有所述萌發(fā)孢子的試驗(yàn)孔中，將該混合物在24℃下培養(yǎng)15-24小時(shí)。以0-80μg/ml的濃度對(duì)AlfAFP1進(jìn)行試驗(yàn)，以測(cè)定其IC50值。用獲自Pierce(Rockford，IL)的BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定多肽濃度。
袁2表示AlfAFP1抗大刀鐮孢(小麥頭疥病的致病劑)和大麗花輪枝孢(馬鈴薯早期死亡的致病劑)的抗真菌活性。
表2AlfAFP1的抗直菌活性
袁2中的數(shù)據(jù)表明，AlfAFP1具有潛在的抗鐮孢菌屬和輪枝孢屬的抗真菌活性，所述真菌能在包括大麥、玉米、棉花、燕麥、馬鈴薯、大豆、番茄和小麥在內(nèi)的很多作物上引起發(fā)病。與披露于PCT國(guó)際公開號(hào)WO93/05153中所披露的其它抗真菌肽相比，該多肽的抗真菌活性對(duì)存在于試驗(yàn)培養(yǎng)基中的鹽的拮抗作用不那么敏感。在用編碼AlfAFP1或AlfAFP2的DNA轉(zhuǎn)化的植物中，所述以μg/ml表示的導(dǎo)致真菌菌絲生長(zhǎng)50％抑制(IC50)所需的濃度可以實(shí)現(xiàn)。IC50值落在許多市售殺真菌劑的范圍內(nèi)，并反應(yīng)了將該抗真菌多肽用在植物的感染部位的用途。
5.4.1 例4克隆AlfAFP cDNAsmRNA提取用獲自Bio101公司(La Jolla，CA)的RNaide Plus試劑盒，按照生產(chǎn)商推薦的方法由苜蓿種子制備總RNA。按照Celano等所披露的方法(1993)用寡聚(dT)纖維素(GIBCO BRL/生命技術(shù)，Gaithersburg，MD)提取mRNA或聚腺苷酸化mRNA。
5.4.2 cDNA克隆用5’RACE試劑盒(GIBCO BRL/生命技術(shù)，Gaithersburg，MD)克隆所述多肽cDNA的5’片段。通過(guò)用寡聚-dT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，由聚腺苷酸化mRNA制備第一條cDNA。通過(guò)RNaseH1消化和旋轉(zhuǎn)桶分離除去所述mRNA鏈，然后用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在該酶的生產(chǎn)商推薦的條件下將poly-C尾添加到一股cDNA鏈上。通過(guò)PCRTM擴(kuò)增所述多肽基因的5’片段，使用GeneAmp DNA擴(kuò)增試劑盒(Perkin Emmer Cetus)和生產(chǎn)商所推薦的反應(yīng)條件。
用于擴(kuò)增的兩個(gè)引物是1)混合的寡核苷酸33-聚體(14個(gè)核苷酸編碼克隆位點(diǎn)，19個(gè)編碼基因特異性的核苷酸，簡(jiǎn)并性32，序列3)，由它編碼所述多肽序列沿反義方向的C-末端的35-41位的氨基酸；和2)寡聚-dT引物，它與所述cDNA(序列4)的poly-C尾退火。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析PCRTM反應(yīng)產(chǎn)物，在全反應(yīng)混合物中存在一條大約330bp的帶，但在僅含有一種引物的對(duì)照反應(yīng)混合物中沒有該帶。從所述凝膠中切除該帶，并使用Ultrafree-MC離心過(guò)濾裝置(Millipore，Bedford，MA)提取DNA。用BamHI消化該DNA片段，將其克隆到質(zhì)粒pGEM11Zf(+)(Promega，Madison，WI)中，并用PRISM Ready ReactionDideoxy Terminator Cycle Sequencing試劑盒(Applied Biosystems)在一臺(tái)373DNA Sequencer Stretch Model上對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。
提取了AlfAFPcDNA的兩種不同同系物。第一份克隆AlfAFP1如序列5所示，具有預(yù)測(cè)的氨基酸序列，但缺少其5’末端的信號(hào)序列的前7個(gè)氨基酸。第二個(gè)5’cDNA克隆AlfAFP2與AlfAFP1高度同源。它含有完整的信號(hào)肽編碼序列，如序列6所示。所述cDNA的翻譯能產(chǎn)生如序列14所示的具有39個(gè)氨基酸的截短的成熟肽。在圖3中對(duì)兩種同系物AlfAFP1和AlfAFP2的核苷酸序列進(jìn)行了比較。
所述多肽cDNA 3’片段的克隆如下。將為了5’RACE而制備的cDNA的第一條鏈用作模板，通過(guò)PCRTM擴(kuò)增所述多肽cDNA的3’部分，擴(kuò)增時(shí)使用GeneAmp DNA擴(kuò)增試劑盒(Perkin Elmer Cetus)和生產(chǎn)商所推薦的反應(yīng)條件。
用于擴(kuò)增的兩個(gè)引物是1)混合的寡核苷酸34-聚體(14個(gè)核苷酸編碼克隆位點(diǎn)，20個(gè)編碼基因特異性的核苷酸，簡(jiǎn)并性32，序列7)，由它編碼所述多肽序列的4-10位氨基酸；和2)寡聚-dT引物，它與所述cDNA(序列8)的poly(A+)尾退火。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析PCRTM反應(yīng)產(chǎn)物，在全反應(yīng)混合物中存在一條大約400bp的帶，但在僅含有一種引物的對(duì)照反應(yīng)混合物中沒有該帶。從所述凝膠中切除該帶，并使用Ultrafree-MC離心過(guò)濾裝置(Millipore，Bedford，MA)提取DNA。用BamHI消化該DNA片段，將其克隆到質(zhì)粒pGEM11Zf(+)(Promega)中，并用PRISM Ready Reaction Dideoxy Terminator CycleSequencing試劑盒(Applied Biosystems)在一臺(tái)373DNA SequencerStretch Model上對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。其序列如序列9所示。
所述多肽cDNA的5’末端(序列5)和3’末端(序列9)有112個(gè)核苷酸的重疊。通過(guò)以下3個(gè)序列因子的組合形成序列6所示的全長(zhǎng)多肽cDNA序列6的1-112號(hào)核苷酸，序列5的20-198號(hào)核苷酸，和序列9的111-308號(hào)核苷酸。
如圖1所示，所述抗真菌多肽cDNA含有一個(gè)74bp的5’前導(dǎo)序列，一個(gè)編碼72個(gè)氨基酸的多肽的219bp的開放讀框，以及一個(gè)加在poly(A+)尾上的179bp的3’非翻譯區(qū)。推測(cè)的多肽包括一個(gè)由27個(gè)氨基酸組成的推定信號(hào)肽和一個(gè)由45個(gè)氨基酸組成的成熟多肽，這一結(jié)果與通過(guò)質(zhì)譜分析和直接氨基酸測(cè)序所測(cè)定的序列一致(參見例1和例2)。實(shí)際上信號(hào)肽裂解發(fā)生在丙氨酸和精氨酸之間，即發(fā)生在圖1中的箭頭位置。
為了方便克隆，通過(guò)PCRTM用工程方法將限制位點(diǎn)整合在含有所述多肽cDNA編碼區(qū)的cDNA片段的末端。5’基因特異引物含有起始密碼子(ATG)的15bp上游和具有BamHI限制位點(diǎn)的39bp的多肽(序列11)，而3’基因特異引物具有一個(gè)位于終止密碼子(TAA)之后的BamHI限制位點(diǎn)(序列12)，將這兩個(gè)引物用于擴(kuò)增cDNA片段，該cDNA是按照上述方法通過(guò)mRNA的逆轉(zhuǎn)錄而制成的。該P(yáng)CRTM擴(kuò)增片段如序列13所示。
將該P(yáng)CRTM產(chǎn)物作為一個(gè)241bp BamHI片段亞克隆到預(yù)先構(gòu)建的含有一個(gè)具有玉米Hsp70內(nèi)含子的E35S啟動(dòng)子的大腸桿菌盒式載體pMON23317(圖4)的BamHI位點(diǎn)上，以形成pMON22653(圖5)。所述nos基因的3’非翻譯聚腺苷酸化序列也可以作為終止子。該載體還含有一個(gè)位于所述內(nèi)含子和終止序列之間的多接頭位點(diǎn)，位于所述啟動(dòng)子和終止子之前和之后的Not1位點(diǎn)，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因。用一個(gè)針對(duì)BamHI克隆位點(diǎn)上游50bp的HSP70內(nèi)含子的序列的引物對(duì)插入pMON22653的cDNA進(jìn)行測(cè)序。該cDNA插入片段的序列如序列13所示，該序列為其正確轉(zhuǎn)錄取向，其推測(cè)的氨基酸序列與通過(guò)直接氨基酸序列分析所測(cè)定的所述多肽的序列吻合(參見序列2)。
5.5 例55.5.1 用于馬鈴薯轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒將編碼AlfAFP1的263bp的BamHI/EcoRI片段由質(zhì)粒pMON22653(圖5)克隆到預(yù)先構(gòu)建的大腸桿菌盒式載體pMON22575(圖6)中，取代它上面的p46基因。所得到的質(zhì)粒被命名為pMON22656(圖7)，用NotI裂解該質(zhì)粒，以提取含有所述多肽編碼cDNA的NotI片段。然后將該NotI片段插入pMON17227(圖8)的NotI位點(diǎn)上，該質(zhì)粒是一種雙臂植物轉(zhuǎn)化載體。所得到的質(zhì)粒被命名為pMON22659(圖9)，它含有以下DNA片段細(xì)菌壯觀霉素/鏈霉素抗性基因(Spc/St)(Fling等，1985)，其后是所述T-DNA的右臂。與所述右臂鄰接的是合成的細(xì)菌glyphosate抗性CP4 5-烯醇丙酮基-3-phosphoshikimate合成酶(EPSPS)基因，該基因由FMV啟動(dòng)子啟動(dòng)(參見PCT公開WO92/04449)。所述CP4基因賦予所述轉(zhuǎn)化體glyphosate抗性，并因此賦予其用glyphosate作為選擇轉(zhuǎn)化體的手段的能力。將源于擬南芥屬CP4 5-烯醇丙酮基-3-phosphoshikimate合成酶(EPSPS)的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽與CP4基因融合，以便引導(dǎo)CP4-EPSPS蛋白至葉綠體。在所述CP4基因的3’末端是E9 3’末端，由它提供轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和聚腺苷酸化信號(hào)序列。隨后的嵌合片段包括FMV啟動(dòng)子，所述抗真菌多肽cDNA，和nos3’末端。其后是所述T-DNA的左臂，以及復(fù)制起點(diǎn)(ori-322)(Stalker等，1981)。
5.5.2 三親交配方法在轉(zhuǎn)化之前，通過(guò)三親交配方法讓含有pMON22659的大腸桿菌與農(nóng)桿菌ABI交配，再與具有輔助質(zhì)粒pRK2013(Ditta等，1980)的大腸桿菌交配。ABI是攜帶無(wú)臂pTiC58質(zhì)粒pMP90RK(Koncz，1986)的A208根癌農(nóng)桿菌菌株。在結(jié)合到所述ABI菌株中之后，由所述無(wú)臂Ti質(zhì)粒提供pMON載體自主復(fù)制所必需的trfA基因功能。當(dāng)植物組織與ABIpMON綴合物一起培養(yǎng)時(shí)，所述載體通過(guò)由所述無(wú)臂pMP90RK Ti質(zhì)粒編碼的vir功能轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。
在30℃下讓農(nóng)桿菌屬在含有25μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基(每升含有10克胰胨，5克酵母浸膏，和5克NaCl)中生長(zhǎng)30小時(shí)。在含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中讓含有pRK2013的大腸桿菌生長(zhǎng)過(guò)夜。讓獲得了pMON22659的大腸桿菌，在含有75μg/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在所有培養(yǎng)物均已長(zhǎng)成后，將4mlLB培養(yǎng)基加入分別含有100μl農(nóng)桿菌ABI、大腸桿菌pRK2013和大腸桿菌pMON22659的試管中。該混合物在離心機(jī)中離心1分鐘，并倒掉上清液部分。將沉淀部分重新懸浮于剩余液體中(大約100μl)，將一份等份試樣(大約25μl)移液到LB瓊脂(1.5％)板的中部。在30℃下生長(zhǎng)過(guò)夜，然后用來(lái)自所述瓊脂板的一等份細(xì)胞劃線接種添加了75μg/ml壯觀霉素、50μg/ml卡那霉素、和25μg/ml氯霉素的LB瓊脂板。
在30℃下培養(yǎng)24-48小時(shí)之后，在用由含有pMON22659質(zhì)粒的大腸桿菌、含有pRK2013的大腸桿菌和農(nóng)桿菌ABI進(jìn)行三親交配所得到的細(xì)胞劃線的平板上出現(xiàn)菌落，而在用由含有pMON22659的大腸桿菌、和ABI交配所產(chǎn)生的細(xì)胞(無(wú)含有pRK2013的大腸桿菌，這種大腸桿菌是質(zhì)粒轉(zhuǎn)移所必需的)劃線的對(duì)照平板上沒有出現(xiàn)菌落。在進(jìn)行三親交配之后，從前一個(gè)平板上選擇4個(gè)菌落，并將每一個(gè)菌落分別接種到添加了75μg/ml壯觀霉素、50μg/ml卡那霉素、和25μg/ml氯霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在30℃下生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)從農(nóng)桿菌屬細(xì)胞中分離的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性分析，證實(shí)了編碼所述不同抗真菌多肽的DNA的存在。將含有編碼AlfAFP1的DNA的培養(yǎng)物用于轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物。
5.5.3 轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物讓含有pMON22659的農(nóng)桿菌在含有75μg/ml壯觀霉素、25μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素，pH7.0的2ml LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。第二天，用MSO培養(yǎng)基以1∶10的比例稀釋所述細(xì)菌，1L體積的MSO培養(yǎng)基含有4.4g MS鹽(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，MO)，30g蔗糖，和2ml維生素B5(Sigma化學(xué)公司，產(chǎn)品目錄號(hào)G1019)，pH5.7，或者一直稀釋到在600nm波長(zhǎng)下的光密度讀數(shù)為0.2-0.33。
將葉片從馬鈴薯植株(Solanum tuderosum var.Russet Burbank)的莖上除去，所述馬鈴薯植株是在無(wú)菌條件下由含有節(jié)的莖的切片長(zhǎng)成的，所述條件包括19℃的溫度，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光照周期，和100μE/s/m2的光照強(qiáng)度，在每升含有4.4gMS鹽(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，MO)，30g蔗糖，0.17g NaH2PO4.H2O，0.4mg鹽酸硫胺素，25g抗壞血酸，和0.1g肌醇pH6.0，和0.2％的Gelrite瓊脂的PM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3周。將所述莖切成3-5毫米的節(jié)段。
在接種之前，將30個(gè)莖段放在共培養(yǎng)平板上，將其作為非接種的對(duì)照。共培養(yǎng)平板含有0.9％瓊脂-固化1/10MS鹽(Murashige等，1962)和3％蔗糖，該共培養(yǎng)平板是這樣制備的首先在所述瓊脂上涂2ml 6-7日齡的煙草懸浮細(xì)胞，作為飼養(yǎng)層(Fraley等，1983)，然后用一個(gè)8.5cm的無(wú)菌Whatman濾紙片覆蓋所述細(xì)胞。
通過(guò)將所述稀釋的細(xì)菌懸浮液浸在所述莖段上接種待轉(zhuǎn)化的外植體切段，并讓該混合物培養(yǎng)15分鐘。然后將細(xì)菌懸浮液從外植體切段上吸走，然后將這些外植體切段均勻分布在共培養(yǎng)平板上(大約每個(gè)平板90個(gè)莖插條)。在19℃、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗周期和100μE/s/m2的光照強(qiáng)度下，進(jìn)行為期兩天的共培養(yǎng)，然后將外植體放在1X MS鹽、5.0mg/l玉米素核糖苷、10mg/l AgNO3、3％蔗糖、500mg/l羧芐青霉素、和0.1mg/l萘乙酸的0.9％的瓊脂/固化愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，并在19℃和16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗周期的條件下培養(yǎng)兩天。然后將外植體轉(zhuǎn)移到添加了0.025mM glyphosate的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。4周以后，將外植體放在含有1X MS鹽、5.0mg/l玉米素核糖苷、10mg/lAgNO3、3％蔗糖、500mg/l羧芐青霉素、0.3mg/l GA3、和0.025mMglyphosate的0.9％瓊脂固化芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。8周以后開始出現(xiàn)芽。在為期12周的時(shí)間內(nèi)每隔4周將外植體轉(zhuǎn)移到新鮮的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。將芽從愈傷組織上切除，并放在由0.2％Glerite瓊脂固化的PM培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)大約2周或生長(zhǎng)到出現(xiàn)根而且大到足于種植到土壤中。一旦移植到Metro-Mix 350(Hummert種子公司，St.Louis)中，用2-3個(gè)月的時(shí)間在溫室中生長(zhǎng)幼苗，生長(zhǎng)條件為14小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗周期，光強(qiáng)為600-700μE/s/m2，日間溫度為65-75°F，夜間為55-65°F，相對(duì)濕度為60％。
5.5.4 分析抗真菌多肽在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中的表達(dá)從生長(zhǎng)至1-2英寸高的轉(zhuǎn)基因植株上取葉片樣品(20-100mg)。在含有1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4，和0.05％Tween-20的PBST緩沖液(15μl/mg組織)中研磨所述葉片樣品，并在4℃下放置過(guò)夜。離心，然后將100μl上清液用于ELISA測(cè)定?？笰lfAFP多肽(序列2)的多克隆抗體是由Pocono Rabbit Farm(Canadensis，PA)制備的。通過(guò)加入100μl以1∶250的比例稀釋于包被緩沖液的抗體(1mg IgG/ml)用抗AlfAFP1多肽的抗體包被NuncMaxi-sorp 96孔板(Nunc#4-39454)的孔，并在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜，所述包被緩沖液為每升蒸餾水中含有1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3，pH9.6。然后將所述包被溶液從所述孔中除去，用PBST洗滌該孔3次。將100μl葉片上清液或用添加了0.2％(w/v)BSA、成分V(Sigma，St.Louis)的PBST適當(dāng)稀釋過(guò)的多肽標(biāo)準(zhǔn)物加入所述孔中。
由標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定從轉(zhuǎn)基因植物中分離的每一種多肽的濃度，該標(biāo)準(zhǔn)曲線是用各種量的相應(yīng)的純化多肽繪制的。AlfAFP1能與所述多克隆抗體制劑發(fā)生交叉反應(yīng)。在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜，然后將所述溶液從所述孔中取出，并用PBST洗滌3次。將0.5毫克/毫升按照Boorsma等(1975)所述方法制備的AlfAFP1抗體/堿性磷酸酶綴合物的以1∶1000的比例稀釋于PBST中的100μl溶液加入每一個(gè)孔中。將該板于22℃下培養(yǎng)4小時(shí)，然后用PBST洗滌該孔5次。將100μl溶解于200mM Tris緩沖液，pH9的新制備的對(duì)硝基苯磷酸(1mg/ml)(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，MO)加入每一個(gè)孔中，將該板在22℃下培養(yǎng)1小時(shí)，用Thermo-max微量板讀數(shù)器(Molecuar Devices，Menlo Park，CA)在605nm波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度。將以不同水平表達(dá)抗真菌多肽的植物用于隨后的發(fā)病試驗(yàn)。
5.5.5 轉(zhuǎn)基因植物的黃萎病控制將烈性大麗花輪枝孢菌的2-3周齡培養(yǎng)物的分生孢子和菌絲體用于接種PBA(馬鈴薯，200g/l；Bacto葡萄糖，20g/l；和Bacto瓊脂，15g/l)培養(yǎng)平板上。讓該培養(yǎng)物在22℃下生長(zhǎng)4-5天。然后通過(guò)用無(wú)菌蒸餾水洗滌該培養(yǎng)板，并通過(guò)兩層紗布過(guò)濾該液體以收獲分生孢子。用一臺(tái)血細(xì)胞記數(shù)器測(cè)定分生孢子的濃度，并用無(wú)菌蒸餾水調(diào)整至1×106分生孢子/ml。
按照上述方法，在裝有50ml PM-瓊脂培養(yǎng)基的塑料杯中在無(wú)菌條件下由莖插條生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。當(dāng)植株大約1-2英寸高時(shí)，將其從所述培養(yǎng)基中取出，并將其根浸泡在所述孢子懸浮液中(Joaquim等，1991)。然后將接種過(guò)的植株移植到裝有Metro-Mix350土壤的6英寸盆中。將所述盆放入生長(zhǎng)箱中，置于如下條件下溫度20℃，光照強(qiáng)度320μE/s/cm2，12小時(shí)白天/12黑夜光周期，每天兩次進(jìn)行地下滲灌，每次浸泡20分鐘。在接種4周以后，按照0-100％的等級(jí)對(duì)發(fā)病嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)級(jí)(Horsfall等，1945)。為了繪制病害隨時(shí)間發(fā)展的曲線，每周對(duì)植株進(jìn)行一次評(píng)價(jià)，至少進(jìn)行8周時(shí)間。
5.5.6 AlfAFP-表達(dá)馬鈴薯植株對(duì)黃萎病的抗性試驗(yàn)21個(gè)獨(dú)立的表達(dá)AlfAFP的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯系對(duì)黃萎病的抗性。AlfAFP1在葉片中的表達(dá)是其在整個(gè)植株中表達(dá)的標(biāo)記，因?yàn)橛糜谥笇?dǎo)相應(yīng)的編碼DNA表達(dá)的FMV啟動(dòng)子能在馬鈴薯植株的所有類型的組織中以組成形式指導(dǎo)基因的表達(dá)。在該發(fā)病試驗(yàn)中包括21個(gè)獨(dú)立的不表達(dá)AlfAFP的系，這些系是在表達(dá)AlfAFP表達(dá)分析過(guò)程中鑒定的，這些系被作為負(fù)對(duì)照。在該試驗(yàn)中，還包括18個(gè)獨(dú)立的載體對(duì)照系，作為負(fù)對(duì)照。這18個(gè)系是通過(guò)用獲得了質(zhì)粒pMON17227的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化而獲得的(載體對(duì)照，圖8)，它不含有任何抗真菌多肽編碼DNA。
表3中歸納了所述每一個(gè)系的定性蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)，以及在接種后第46天測(cè)定的每一個(gè)系在黃萎病試驗(yàn)中發(fā)病嚴(yán)重程度的等級(jí)。為方便起見，在圖10中相同的發(fā)病數(shù)據(jù)以棒圖形式表示。每一個(gè)馬鈴薯系在表3(從上到下)和圖10(從左到右)中的出現(xiàn)順序是相同的。表3AlfAFP1在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中的表達(dá)和黃萎病抗性植株 系# 蛋白表達(dá) 發(fā)病程度(％)(定性ELISA)(接種后46天)AlfAFP117562 + 5陽(yáng)性 17554 + 17.5植株 17556 + 2017557 + 22.517563 + 2517570 + 27.517566 + 3017567 + 3517550 + 4017551 + 4518945 + 5018968 + 5018944 + 4517652 + 3518940 + 3517564 + 3017568 + 2517654 + 2517561 + 22.517558 + 2017636 + 17.5平均29.6AlfAFP117638 - 22.5陰性 18946 - 37.5植株 17642 - 4517555 - 5018971 - 6017643 - 6517655 - 7017637 - 72.517646 - 75
18955- 8018950- 10018958- 10017552- 8018975- 7518963- 7018972- 7018952- 6518956- 6018974- 4518943- 4017648- 35平均62.7裁體 149470 30對(duì)照 149240 40149250 40149180 50149260 50149280 50149360 75149200 100149230 100149270 100149350 100149410 95149330 60149300 50149310 50149400 50149460 40149490 40平均62.2如表3和圖10所示，AlfAFP1表達(dá)植株的病害嚴(yán)重程度比所述非表達(dá)植株或載體對(duì)照平均低52％。這一數(shù)據(jù)是按以下方式計(jì)算的[(18個(gè)載體對(duì)照系的平均值)-(21個(gè)表達(dá)系的平均值)]×100％/(18個(gè)載體對(duì)照系的平均值)；或[(21個(gè)非表達(dá)系的平均值)-(21個(gè)表達(dá)系的平均值)]×100％/(21個(gè)非表達(dá)系的平均值)。21個(gè)AlfAFP1表達(dá)系中的13個(gè)的發(fā)病嚴(yán)重程度等級(jí)等于或低于30％；相反，在21個(gè)非表達(dá)系中僅有一個(gè)或在18個(gè)載體對(duì)照系僅有一個(gè)系的發(fā)病嚴(yán)重性的得分低于30％。上述結(jié)果表明，AlfAFP1能賦予表達(dá)該蛋白的植物對(duì)黃萎病抗性。本發(fā)明是以上述方式說(shuō)明的，但顯而易見的是，該方法可以多種形式改變。這些改變不應(yīng)被視為超出本發(fā)明的構(gòu)思和范圍，而且，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是，所有類似改變均被視為包括在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
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序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)名稱Monsanto公司(B)街道700 Chesterfield Parkway North(C)城市St.Louis(D)州MO(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編63198(G)電話512-418-3000(H)傳真713-789-2679(ii)發(fā)明名稱抗真菌多肽和用于控制植物致病真菌的方法(iii)序列數(shù)14(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(vi)在先中請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/766,355(B)申請(qǐng)日1996年12月13日(2)序列1資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(xi)序列描述序列1Arg Thr Cys Glu Asn Leu Ala Asp Lys Tyr Arg Gly Pro Cys Phe Ser1 5 10 15Gly Cys Asp Thr His Cys Thr Thr Lys Glu Asn Ala Val Ser Gly Arg20 25 30Cys Arg Asp Asp Phe Arg Cys Xaa Xaa Thr Lys35 40(2)序列2資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(xi)序列描述序列2Arg Thr Cys Glu Asn Leu Ala Asp Lys Tyr Arg Gly Pro Cys Phe Ser1 5 10 15Gly Cys Asp Thr His Cys Thr Thr Lys Glu Asn Ala Val Ser Gly Arg20 25 30Cys Arg Asp Asp Phe Arg Cys Trp Cys Thr Lys Arg Cys35 40 45(2)序列3資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ix)特征(A)名稱/鍵modified_base(B)位置(16，22)中的一個(gè)(D)其它資料/mod_base＝其它/note＝“N＝肌苷”(ix)特征(A)名稱/鍵modified_base(B)位置(19，25，28，31)中的一個(gè)
(D)其它資料/mod_base＝其它/note＝“D＝A或G或T”(ix)特征(A)名稱/鍵modified_base(B)位置24(D)其它資料/mod_base＝其它/note＝“K＝G或T”(xi)序列描述序列3GGGAATTCGG ATCCANCADC ANCKDAADTC DTC 33(2)序列4資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ix)特征(A)名稱/鍵modified base(B)位置(18..19，23..24，28..29)的結(jié)合(D)其它資料/mod_base＝其它/note＝“N＝肌苷”(xi)序列描述序列4GGGAATTCGG ATCCGGGNNG GGNNGGGNNG 30(2)序列5資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度200個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形
(ix)特征(A)名稱/鍵modified_base(B)位置17(D)其它資料/mod_base＝其它/note＝“N＝A或C或G或T”(xi)序列描述序列5GGGGGGGGGG GGGGGGNCAG GCTTATGCTT CCTCTTCTTG GTTCTCTTTG TTGCACAAGA60AATTGTGGTG ACAGAAGCCA GAACATGTGA GAATTTGGCA GATAAATATA GGGGACCATG120CTTTAGTGGT TGTGACACTC ACTGCACAAC CAAAGAGAAC GCAGTTAGTG GAAGGTGTAG180GGACGACTTC CGCTGCTGCT200(2)序列6資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度293個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ix)特征(A)名稱/鍵modified_base(B)位置(17，265)中的一個(gè)(D)其它資料/mod_base＝其它/note＝“N＝A或C或G或T”(xi)序列描述序列6GGGGGGGGGG GGGGGGNTGT CAAACACACA CATAACACAT AAGTGACCGT GAGTCATTAA60ATTTATATAT ATTCATCAAT CTAATCAA C TATGGAGAAG AAATCACTAG CTGGCTTATG120CTTCCTCTTC CTCGTTCTCT TTGTTGAACA AGAAATTATG GTGACCGAGG CAGCTACTTG180TGAGAATTTG GCTAACACAT ACAGGGGACC ATGCTTCGGT GGTTGTGACT TTCACTGCAA240AACCAAAGAA CACTTACTTA GCGGNAGGTG CAGGGACGAC TTCCGCTGCT GCT 293(2)序列7資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ix)特征(A)名稱/鍵modified_base(B)位置(17，31)中的一個(gè)(D)其它資料/mod_base＝其它/note＝“D＝A或G或T”(ix)特征(A)名稱/鍵modified_base(B)位置(19，20，28)中的一個(gè)(D)其它資料/mod_base＝其它/note＝“B＝C或G或T”(ix)特征(A)名稱/鍵modified_base(B)位置(22，25)中的一個(gè)(D)其它資料/mod_base＝其它/note＝“肌苷”(xi)序列描述序列7GGGAATTCGG ATCCGADABB TNGCNGABAA DTA 33(2)序列8資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(xi)序列描述序列8GGGAATTCGG ATCCTTTTTT TTTTTTTTTT TT32(2)序列9資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度327個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ix)特征(A)名稱/鍵modified_base(B)位置(244，305)中的一個(gè)(D)其它資料/mod_base＝其它/note＝“N＝A或C或G或T”(xi)序列描述序列9GAGAATTTGG CGGATAAGTA TAGGGGACCA TGCTTTAGTG GTTGTGACAC TCACTGCACA60ACCAAAGAGA ACGCAGTTAG TGGAAGGTGT AGGGATGACT TTCGTTGTTA GTGTACTAAA120AGATGTTAAA TGGATCTCCT CCAACATCAA GATGTGCATG GAATAGTCTT TATAATAAAA180CTAAATAAAT AAAATGCACG CAGTATAGCT ACAACTTCAT CTATATATAT GTACTCAATA240TCGNGCATAA CGTATTAGTT ATGCACTTCT ATCATATGGA ATAAACATCA ATAAGTAATT300TCGTNTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAA327(2)序列10資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度507個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ix)特征(A)名稱/鍵modified_base(B)位置(17，424，485)中的一個(gè)
(D)其它資料/mod_base＝其它/note＝“N＝A或C或G或T”(xi)序列描述序列10GGGGGGGGGG GGGGGGNTGT CAAACACACA CATAACACAT AAGTGACCGT GAGTCATTAA60ATTTATATAT ATTCATCAAT CTAATCAAAC TATGGAGAAG AAATCACTAG CTGGCTTATG120CTTCCTCTTC TTGGTTCTCT TTGTTGCACA AGAAATTGTG GTGACAGAAG CCAGAACATG180TGAGAATTTG GCAGATAAAT ATAGGGGACC ATGCTTTAGT GGTTGTGACA CTCACTGCAC240AACCAAAGAG AACGCAGTTA GTGGAAGGTG TAGGGACGAC TTCCGCTGCT GGTGTACTAA300AAGATGTTAA ATGGATCTCC TCCAACATCA AGATGTGCAT GGAATAGTCT TTATAATAAA360ACTAAATAAA TAAAATGCAC GCAGTATAGC TACAACTTCA TCTATATATA TGACTCAATA420TCGNGCATAA CGTATTAGTT ATGCACTTCT ATCATATGGA ATAAACATCA ATAAGTAATT480TCGTNTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAA507(2)序列11資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度62個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(xi)序列描述序列11GGGGATCCCA ATCTAATCAA ACTATGGAGA AGAAATCACT AGCTGGCTTA TGCTTCCTCT60TC 62(2)序列12資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度47個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形
(xi)序列描述序列12GGGGATCCTT AACATCTTTT AGTACACCAG CAGCGGAAGT CGTCCCT47(2)序列13資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度250個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(xi)序列描述序列13GGGGATCCCA ATCTAATCAA ACTATGGAGA AGAAATCACT AGCTGGCTTA TGCTTCCTCT60TCTTGGTTCT CTTTGTTGCA CAAGAAATTG TGGTGACAGA AGCCAGAACA TGTGAGAATT120TGGCAGATAA ATATAGGGGA CCATGCTTTA GTGGTTGTGA CACTCACTGC ACAACCAAAG180AGAACGCAGT TAGTGGAAGG TGTAGGGACG ACTTCCGCTG CTGGTGTACT AAAAGATGTT240AAGGATCCCC 250(2)序列14資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(xi)序列描述序列14Ala Thr Cys Glu Asn Leu Ala Asn Thr Tyr Arg Gly Pro Cys Phe Gly1 5 10 15Gly Cys Asp Phe His Cys Lys Thr Lys Glu His Leu Leu Ser Gly Arg20 25 30Cys Arg Asp Asp Phe Arg Cys3權(quán)利要求
1.一種編碼苜蓿植物抗真菌多肽的純化核酸片段。
2.如權(quán)利要求1的核酸片段，它所編碼的多肽包括序列2或序列14的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1的核酸片段，它包括序列13的核酸序列或與該序列互補(bǔ)的序列或能在高嚴(yán)格條件下與序列13雜交的序列。
4.如權(quán)利要求1的核酸片段，它包括序列13中105-242位之間的核酸序列，或與該序列互補(bǔ)的序列，或能在高嚴(yán)格條件下與序列13的105-242位之間的序列雜交的序列。
5.如權(quán)利要求1的核酸片段，進(jìn)一步限定為包括序列10的核酸序列，或與該序列互補(bǔ)的序列，或能在高嚴(yán)格條件下與序列10的序列雜交的序列。
6.一種分離的DNA分子，它具有選自以下的核苷酸序列a)圖1的核苷酸序列(序列10上18-507位之間)；b)序列13的核苷酸序列；c)序列13上105-242位之間的核苷酸序列；d)能由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并編碼與a)、b)或c)的核苷酸序列所編碼的肽相同的肽的核苷酸序列e)a)、b)、c)或d)中任一個(gè)的互補(bǔ)序列；和f)能在高嚴(yán)格條件下與(a)-(f)中任一個(gè)雜交的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求1的核酸片段，還可被限定為RNA片段。
8.一種含有分離的苜蓿植物抗真菌基因的DNA片段。
9.如權(quán)利要求8的DNA片段，包括一個(gè)分離的苜蓿屬基因。
10.如權(quán)利要求9的DNA片段，它所編碼的抗真菌多肽包括一個(gè)由序列2或序列14的至少15個(gè)氨基酸組成的連續(xù)的氨基酸序列。
11.如權(quán)利要求10的DNA片段，還可被限定為重組載體。
12.如權(quán)利要求11的DNA片段，其中，所述DNA可操作地連接于一個(gè)啟動(dòng)子上，該啟動(dòng)子能表達(dá)所述DNA片段。
13.如權(quán)利要求12的DNA片段，其中，所述啟動(dòng)子選自下列一組FMV 35S啟動(dòng)子，CaMV 35S啟動(dòng)子，ssRUBISCO啟動(dòng)子，EIF-4A啟動(dòng)子，LTP啟動(dòng)子，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，和遍在蛋白啟動(dòng)子。
14.一種重組宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求10所述的DNA片段。
15.如權(quán)利要求14的重組宿主細(xì)胞，還可進(jìn)一步限定為植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞選自下列一組蘋果、苜蓿、大麥、花莖甘藍(lán)、甘藍(lán)、油菜、胡蘿卜、柑桔、玉米、棉花、大蒜、燕麥、洋蔥、豌豆、花生、胡椒、馬鈴薯、稻、黑麥、高粱、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、番茄、草坪草、和小麥。
16.如權(quán)利要求14的重組宿主細(xì)胞，還可被限定為馬鈴薯植物細(xì)胞。
17.一種利用編碼一種分離的苜蓿植物抗真菌多肽的DNA片段的方法，包括以下步驟a)制備一種如權(quán)利要求11所述的重組載體，其中，所述苜蓿植物抗真菌多肽編碼DNA片段處于一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下；b)將所述重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中；c)在能有效表達(dá)所編碼的抗真菌多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；d)收集所述表達(dá)的抗真菌多肽。
18.一種分離的核酸片段，選自下列一組a)序列3、5、6-7、9-10或13中任一個(gè)的核苷酸序列；b)與序列3、5、6-7、9-10或13中任一個(gè)互補(bǔ)的序列；c)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并編碼與序列3、5、6-7、9-10或13中任一個(gè)所編碼的肽產(chǎn)物相同的肽的核苷酸序列；和d)能在高嚴(yán)格條件下與序列3、5、6-7、9-10或13中任一個(gè)雜交的核苷酸序列。
19.一種由權(quán)利要求6所述的DNA編碼的分離苜蓿植物抗真菌多肽。
20.如權(quán)利要求19的多肽，包括序列2或序列14的氨基酸序列。
21.如權(quán)利要求19的多肽，其中，所述多肽是從苜蓿中分離的。
22.一種分離的苜蓿植物抗真菌多肽，含有序列2、序列14的氨基酸序列或其功能變體。
23.如權(quán)利要求22的多肽，其中，所述變體包括所述序列的至少8個(gè)氨基酸的截短片段。
24.一種組合物，含有溶解在合適溶劑中的抗真菌有效量的權(quán)利要求19所述的多肽。
25.一種轉(zhuǎn)基因植物，在其基因組中整合了一個(gè)編碼權(quán)利要求19所述抗真菌多肽的轉(zhuǎn)基因。
26.如權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述多肽具有序列2或序列14的氨基酸序列。
27.如權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)基因植物，其中，該多肽是由序列13的DNA或能在高嚴(yán)格條件下與序列13雜交的序列編碼的。
28.權(quán)利要求25所述植物的子代。
29.源于權(quán)利要求25所述植物的種子。
30.權(quán)利要求25所述植物的無(wú)性系。
31.一種控制植物真菌的方法，包括為一種植物提供抗真菌有效量的如權(quán)利要求19所述的多肽。
32.如權(quán)利要求31的方法，其中，所述多肽是由權(quán)利要求24所述組合物提供的。
33.如權(quán)利要求31的方法，其中，所述多肽是這樣提供的用一種含有編碼具有序列2或序列14所示氨基酸序列的多肽的DNA的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，讓抗真菌有效量的所編碼的多肽表達(dá)。
全文摘要
證實(shí)了從苜蓿屬植物中分離的抗真菌多肽能控制真菌對(duì)植物的損害。將編碼所述多肽的DNA克隆到用于轉(zhuǎn)化植物－定居微生物或植物的載體上,從而提供了一種抑制真菌在植物上生長(zhǎng)的方法。可將所述多肽制成組合物,用于控制不希望的真菌。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1276013SQ97181717
公開日2000年12月6日 申請(qǐng)日期1997年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月13日
發(fā)明者J·梁, D·M·沙, Y·S·吳, C·A·羅森伯格, S·哈基米 申請(qǐng)人:孟山都公司