專利名稱：：保護(hù)植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過將微生物劑施用于免疫調(diào)節(jié)植物得到的協(xié)同抗病性來保護(hù)植物免受病原體侵襲的方法。植物經(jīng)常受到多種病原生物包括病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲的攻擊。農(nóng)作物植物尤其脆弱因?yàn)樗鼈兺ǔＷ鳛檫z傳一致的單一培養(yǎng)物栽培；當(dāng)疾病攻擊時(shí)，損失會(huì)很嚴(yán)重。然而，大多數(shù)植物有抵御病原生物的天然防御機(jī)制。植物育種者和病理學(xué)家已經(jīng)鑒定了對(duì)植物病原體有抗性的天然變種并培育成了多種農(nóng)作物植物。這些天然抗病性基因通常產(chǎn)生高水平的抵御病原體的抗性或免疫性。系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)是植物用于保護(hù)自身免受病原體傷害的復(fù)合體系的一個(gè)組成成分(Hunt和Ryals，Crit.Rev.inplantSci.15，583-606(1996)，在此引用作為參考；Ryals等，植物細(xì)胞8，1809-1819(1996)，在此引用作為參考)。也參見美國專利5,614,395，在此引用作為參考。SAR是植物-病原體發(fā)應(yīng)尤其重要的方面因?yàn)樗遣≡w誘導(dǎo)性的對(duì)廣泛侵染因子包括病毒，細(xì)菌和真菌的系統(tǒng)抗性。當(dāng)SRA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被封閉時(shí)，植物對(duì)在正常情況下致病的病原體更加敏感，它們對(duì)在正常情況不致病的侵染因子也變得敏感(Gaffney等，科學(xué)261，754-756(1993)，在此引用作為參考；Delaney等，科學(xué)266，1247-1250(1994)，在此引用作為參考；Delaney等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，92，6602-6602(1995)，在此引用作為參考；Delaney，植物生理學(xué)113，5-12(1997)，在此引用作為參考；Bi等，植物雜志8，235-245(1995)，在此引用作為參考；Mauch-Mani和Slusarenko，植物細(xì)胞8，203-212(1996)，在此引用作為參考)。這些觀察表明SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)于維持植物健康是至關(guān)重要的。概念上，SAR反應(yīng)可分成兩個(gè)階段。在起始階段，病原體侵染被識(shí)別并釋放信號(hào)，信號(hào)通過韌皮部向遠(yuǎn)端組織傳運(yùn)。靶細(xì)胞識(shí)別系統(tǒng)信號(hào)，并通過SAR基因和抗病性的表達(dá)反應(yīng)。SAR維持階段是指幾周直至植物整個(gè)生命過程的一段時(shí)間，在這個(gè)階段植物處于準(zhǔn)穩(wěn)定狀態(tài)，抗病性得以維持(Ryals等，1996)。水楊酸(SA)積累看來是SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)必需的。由于用特定抑制劑處理、苯丙氨酸氨裂合酶的后生抑制或水楊酸羥化酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，不能積累SA的植物也不能誘導(dǎo)SAR基因表達(dá)或抗病性(Gaffney等，1993；Delaney等，1994；Mauch-Mani和Slusarenko1996；Maher等，美國國家科學(xué)院院報(bào)91，7802-7806(1994)，在此引用作為參考；Pallas等，植物雜志10，281-293(1996)，在此引用作為參考)。盡管有人建議SA可能作為系統(tǒng)信號(hào)，但目前尚有爭(zhēng)議，目前確定的一點(diǎn)是如果SA不能積累，SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷[Pallas等，1996；Shulaev等，植物細(xì)胞7，1691-1701(1995)，在此引用作為參考；Vernooij等，植物細(xì)胞6，959-965(1994)，在此引用作為參考]。最近，擬南芥開始作為研究SAR的模式體系(Uknes等，植物細(xì)胞4，645-656(1992)；在此引用作為參考；Uknes等，Mol.plant-Microbe.Interact.6，692-698(1993)，在此引用作為參考；Cameron等，植物雜志5715-725(1994)，在此引用作為參考；Mauch-Mani和Slusarenko；Mol.plant-Microbe.Interact.7，378-383(1994)，在此引用作為參考；Dempsey和Klessig，BulletindeL’Institut.Pasteur93，167-186(1995)，在此引用作為參考)。已經(jīng)證明，在擬南芥中SAR可被病原體和化學(xué)品活化如SA、2，6-二氯異煙酸(INA)和苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯(BTH)(Uknes等，1992；Vernooij等Mol.Plant-MicrobeInteract.，8，228-234(1995)，在此引用作為參考；Lawton等，植物雜志10，71-82(1996)，在此引用作為參考)。INA或BTH處理或病原體侵染后，至少有三種病理相關(guān)(PR)蛋白基因，即PR-1、PR-2和PR-5與抗性的出現(xiàn)同時(shí)協(xié)同受到誘導(dǎo)(Uknes等，1992，1993)。在特征了解最清楚的物種煙草中，用病原體或免疫復(fù)合物處理誘導(dǎo)至少九套基因的表達(dá)(Ward等，植物細(xì)胞3，1085-1094(1991)，在此引用作為參考)。已通過用多種SAR基因轉(zhuǎn)化植物制備了轉(zhuǎn)基因抗病植物(美國專利5,614,395)。已經(jīng)分離到了具有修飾的SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多種擬南芥突變體(Delaney，1997)。這些突變體中的首批突變體為所謂的lsd(損傷刺激病)突變體和acd2(加速的細(xì)胞死亡)(Dietrich等，細(xì)胞77，565-577(1994)，在此引用作為參考，Greenberg等，細(xì)胞77，551-563(1994)，在此引用作為參考)。這些突變體有在其葉子上某些程度的自發(fā)性壞死損傷的形成、升高的SA水平、SARmRNA的積累以及明顯提高的抗病性。至少已分離鑒定了七株不同的lsd突變體(Dietrich等，1994；Weymann等，植物細(xì)胞7，2013-2022(1995)，在此引用作為參考)。另一類令人感興趣的突變體是cim(組成型免疫)突變體(Lawton等，“系統(tǒng)獲得性抗性的分子生物學(xué)”，于《植物中防御反應(yīng)機(jī)制》中，B.Fritig和M.Legrand編(Dordrecht，TheNetherlandsKluwerAcademicPublishers)，第422-432頁(1993)，在此引用作為參考)。也見國際PCT申請(qǐng)WO94/16077，在此引用作為參考。與lsd和acd2突變體相同，cim突變體具有升高的SA和SAR基因表達(dá)和抗性，而與lsd或acd2不同，它們的葉子上不出現(xiàn)可觀察到的損傷。Cpr1(PR基因的組成型表達(dá)者)可能是一種類型的cim突變體；然而，因?yàn)檫€未排除葉子上有極微小的損傷，Cpr1可能是一種類型的lsd突變體(Bowling等，植物細(xì)胞6，1845-1857(1994)，在此引用作為參考)。也分離到了SAR信號(hào)通路被阻斷的突變體。ndr1(非種特異性抗病性)是允許包含各種無毒基因的丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)和寄生霜霉(Peronosporaparasitica)的正常無毒菌株生長(zhǎng)的突變體(Century等，美國國家科學(xué)院院報(bào)92，6597-6601(1995)，在此引用作為參考)。很明顯，這個(gè)突變體在SAR信號(hào)通路早期被阻斷。npr1(PR基因的非表達(dá)者)是經(jīng)INA處理后不能誘導(dǎo)SAR信號(hào)途徑表達(dá)的突變體(Cao等，植物細(xì)胞6，1583-1592(1994)，在此引用作為參考)。eds(增強(qiáng)的疾病易感性)已根據(jù)其在接種低細(xì)菌濃度后能夠支持細(xì)菌侵染的能力得到分離(Glazebrook等，遺傳學(xué)143，973-982(1996)，在此引用作為參考；Parker等，植物細(xì)胞8，2033-2046(1996)，在此引用作為參考)。某些eds突變體表型上與npr1很相似，并且最近表明eds5和eds53與npr1是等位的(Glazebrook等，1996)。nim1(非誘導(dǎo)型免疫)是在INA處理后支持寄生霜霉(即霜霉病的致病因子)生長(zhǎng)的突變體(Delaney等，1995；WO94/16077)。盡管病原體侵染后nim1能夠積累SA，但是它不能誘導(dǎo)SAR基因表達(dá)或抗病性，表明突變阻斷了SA下游途徑。nim1對(duì)INA或BTH反應(yīng)的能力也受到損傷，表明阻斷存在于這些化學(xué)品作用的下游(Delaney等，1995；Lawton等，1996)。最近，分離和鑒定了兩個(gè)擬南芥等位基因，它們是分別負(fù)責(zé)nim1和npr表型的突變體(Ryals等，植物細(xì)胞9，425-439(1997)，在此引用作為參考；Cao等，細(xì)胞88，57-63(1997)，在此引用作為參考)。野生型NIM1基因產(chǎn)物參與了擬南芥中引起SAR和基因?qū)?gene-for-gene)抗病性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Ryals等，1997)。Ryals等，1997也報(bào)道了nim1的另外5個(gè)等位基因的分離，它們表現(xiàn)出從化學(xué)誘導(dǎo)的PR-1基因表達(dá)和真菌抗性較弱損傷到非常強(qiáng)的阻斷的一系列表型。將野生型NPR1基因轉(zhuǎn)化入npr1突變體不僅互補(bǔ)突變、恢復(fù)與PR基因表達(dá)有關(guān)的SAR誘導(dǎo)的反應(yīng)性和抗病性，而且使轉(zhuǎn)基因植物在沒有SAR誘導(dǎo)的情況下對(duì)丁香假單胞菌侵染有更強(qiáng)的抗性(Cao等，1997)。NF-κB/κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了從果蠅到哺乳動(dòng)物多種生物的抗病性反應(yīng)。在哺乳動(dòng)物中，NF-κB/κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可被多種不同刺激誘導(dǎo)，包括細(xì)胞接觸脂多糖、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素1(IL-1)或病毒侵染(Baeuerle和Baltimore，細(xì)胞87，13-20(1996)；Baldwin，免疫學(xué)年評(píng)14，649-681(1996))?；罨耐緩綄?dǎo)致參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的多種因子的合成，如白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素8和粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(deMartin等，基因152，253-255(1995))。在轉(zhuǎn)基因小鼠研究中，NF-κB/IκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的敲除導(dǎo)致缺陷型免疫反應(yīng)包括增強(qiáng)的對(duì)細(xì)菌和病毒病原體的易感性(Beg和Baltimore，科學(xué)274，782-784(1996)；VanAntwerp等，科學(xué)274，787-789(1996)；Wang等，科學(xué)274，784-787(1996)；Baeuerle和Baltimore(1996))。在擬南芥中，SAR與炎癥反應(yīng)在功能上相似，因?yàn)镾AR活化后正?？剐赃^程增強(qiáng)，導(dǎo)致增強(qiáng)的抗病性(Bi等，1995；Cao等，1994；Delaney等，1995；Delaney等，1994；Gaffney等，1993；Mauch-Mani和Slusarenko1996；Delaney；1997)。而且，此途徑的失活導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌、病毒和真菌病原體敏感性的增加。有趣地是，據(jù)報(bào)道，SA阻斷哺乳動(dòng)物細(xì)胞中NF-κB的活化(Kopp和Ghosh，科學(xué)265，956-959(1994))，而SA活化擬南芥中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)菌侵染果蠅活化了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致大量抗真菌蛋白如cercropinB、防衛(wèi)素、diptericin和drosomycin的合成(Ip等，細(xì)胞75，753-763(1993)；Lemaitre等，細(xì)胞86，973-983(1996))。在蠅中，這種誘導(dǎo)取決于NF-κB的兩個(gè)同系物dorsal和dif的基因產(chǎn)物并被IκB的同系物cactus抑制。抗真菌和抗細(xì)菌蛋白的合成降低大大降低了對(duì)侵染的抗性。盡管對(duì)熟練和精細(xì)的農(nóng)作物保護(hù)措施做了大量研究和應(yīng)用，包括植物的遺傳轉(zhuǎn)化，但是由于疾病導(dǎo)致的損失每年仍為幾十億美元。所以，仍不斷要求發(fā)展基于不斷增長(zhǎng)的對(duì)植物抗病性遺傳基礎(chǔ)的理解的新的農(nóng)作物保護(hù)措施。基于上述，本發(fā)明優(yōu)選的一方面涉及通過將殺蟲微生物劑施用于免疫調(diào)節(jié)植物得到的協(xié)同抗病性保護(hù)植物免受病原體侵襲的新方法。免疫調(diào)節(jié)植物是指SAR被活化，通常表現(xiàn)出比野生型更強(qiáng)的SAR基因表達(dá)因而被稱為“SAR-開”植物。應(yīng)用于本發(fā)明方法中的免疫調(diào)節(jié)植物至少可通過三種不同的方法得到將SAR化學(xué)藥品誘導(dǎo)劑如BTH，INA或SA施用于植物；通過基于SAR基因組成型表達(dá)和/或抗病性表型篩選植物的選擇育種方案；通過用一種或多種SAR基因如NIM1基因的功能形式轉(zhuǎn)化植物得到的基因工程植物。施用于免疫調(diào)節(jié)植物的殺微生物劑可以是常規(guī)的殺微生物劑如殺真菌劑氨丙靈(matalaxyl)，或者如果施用于通過選擇性育種或基因工程得到的免疫調(diào)節(jié)植物，殺微生物劑可以是SAR的化學(xué)誘導(dǎo)劑如BTH、INA或SA。免疫調(diào)節(jié)給植物提供一定水平的抗病性。相似地，將殺微生物劑施用于植物提供了一定水平的抗病性。將免疫調(diào)節(jié)與殺微生物劑施用聯(lián)合使用的預(yù)期結(jié)果是控制水平反映了由單種提供抗病性方法的加合控制水平。然而，通過同時(shí)將殺微生物劑施用于免疫調(diào)節(jié)植物，抗病性出乎預(yù)料地協(xié)同加強(qiáng)，即抗病性水平比預(yù)料的抗病性加合水平高。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及免疫調(diào)節(jié)植物的栽培以及將適量的常規(guī)殺微生物劑施用于此植物。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及用基因工程方法使植物包含和表達(dá)NIM1基因的功能形式或其同系物或其變體。本發(fā)明的方法得到比通過僅用免疫調(diào)節(jié)或殺微生物劑更高的病原體控制。免疫調(diào)節(jié)提供給植物一定水平的抗病性。相似地，將殺微生物劑施用于植物提供了一定水平的抗病性。將免疫調(diào)節(jié)與殺微生物劑施用聯(lián)合使用的預(yù)期效果是控制水平反映了由單種提供抗病性方法的加合控制水平。然而，通過同時(shí)將殺微生物劑施用于免疫調(diào)節(jié)植物，抗病性出乎預(yù)料地協(xié)同加強(qiáng)，即抗病性水平比預(yù)料的抗病性加合水平高。除了抗病性增大外，本發(fā)明的另一優(yōu)勢(shì)是本發(fā)明方法達(dá)到抗病性水平所需的殺微生物劑比用普通野生型植物需要的量少。由此產(chǎn)生的結(jié)果是殺微生物劑經(jīng)濟(jì)耗費(fèi)低，由某些殺微生物劑毒性導(dǎo)致不利環(huán)境問題的機(jī)率減小。而且，本發(fā)明的保護(hù)植物的方法通過聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)和殺微生物劑的效果使抗病原體作用時(shí)間延長(zhǎng)并且作物產(chǎn)量提高。本方法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是因?yàn)檫@兩種病原體控制的聯(lián)合作用模式彼此完全不同，形成抗性的威脅有效地得以避免。因此本發(fā)明涉及通過協(xié)同抗病性保護(hù)植物免受病原體侵襲的方法；包括以下步驟(a)提供具有一級(jí)抗病性的免疫調(diào)節(jié)植物；并且(b)向所述免疫調(diào)節(jié)植物施用至少一種殺微生物劑以賦予二級(jí)抗病性；(c)由此所述殺微生物劑向所述免疫調(diào)節(jié)植物的施用賦予比一級(jí)和二級(jí)抗病性總和更大的協(xié)同增強(qiáng)的三級(jí)抗病性。優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)植物是組成型免疫(cim)突變植物。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述cim突變植物根據(jù)下列步驟從植物群體中選出來(a)評(píng)估SAR基因在表型正常的未受侵染的植物中的表達(dá)，其中未受侵染的植物缺少損傷模型表型；并且(b)篩選在沒有病毒、細(xì)菌或真菌侵染時(shí)，組成型表達(dá)SAR基因的未受侵染的植物。優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)植物是損傷模擬突變植物。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述損傷模擬突變植物根據(jù)下列步驟從植物群體中選出(a)評(píng)估SAR基因在具有損傷模型表型的未受侵染的植物中的表達(dá)；并且(b)篩選在沒有病毒，細(xì)菌或真菌侵染時(shí)，組成型表達(dá)SAR基因的未受侵染的植物。優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)植物是通過SAR基因在植物中的重組表達(dá)得到的。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述SAR基因是NIM1基因的功能形式。更優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1基因編碼的NIM1蛋白參與了植物中引起系統(tǒng)獲得性抗性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1蛋白包含SEQIDNO2中所示的氨基酸序列。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1基因在下列條件下與SEQIDNO1中所示的編碼序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉鹽；1mMEDTA；250mM氯化鈉中于55℃雜交18-24小時(shí)，于55℃在6×SSC中洗15分鐘，3次；在3×SSC中洗15分鐘，1次。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1基因包括SEQIDNO1中所示的編碼序列和在中等嚴(yán)格條件下與其雜交的所有DNA分子。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述SAR基因編碼作為SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的顯性失活調(diào)控子的NIM1蛋白的改變形式。更優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式在相當(dāng)于SEQIDNO2的55和59位的氨基酸位是丙氨酸而不是絲氨酸。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式包含SEQIDNO8中所示的氨基酸序列。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQIDNO7中所示的核苷酸序列和在中等嚴(yán)格條件下與其雜交的所有DNA分子。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述DNA分子在下列條件與SEQIDNO7中所示的核苷酸序列雜交在1％BSA，520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉鹽；1mMEDTA，250mM氯化鈉中于55℃雜交18-24小時(shí)，于55℃在6×SSC中洗15分鐘，3次，15在3×SSC中洗15分鐘，1次。更優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法；其中所述NIM1蛋白的改變形式具有大約相當(dāng)于SEQIDNO2的1-125氨基酸位的N-末端截短的氨基酸。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式包含SEQIDNO10中所示的氨基酸序列。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述DNA分子包括SEQIDNO9中所示的核苷酸序列和在中等嚴(yán)格條件下與其雜交的所有DNA分子。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述DNA分子在下列條件下與SEQIDNO9中所示的核苷酸序列雜交；在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mM氯化鈉中于55℃雜交18-24小時(shí)，于55℃在6×SSC中洗15分鐘，3次；在3×SSC中洗15分鐘，1次。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式具有大約相當(dāng)于SEQIDNO2的522-593氨基酸位的C-末端截短的氨基酸。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式包含SEQIDNO12中所示的氨基酸序列。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述DNA分子包括SEQIDNO11中所示的核苷酸序列和在中等嚴(yán)格條件下與其雜交的所有DNA分子。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述DNA分子在下列條件下與SEQIDNO11中所示的核苷酸序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉鹽；1mMEDTA；250mM氯化鈉中于55℃雜交18-24小時(shí)，于55℃在6×SSC中洗15分鐘，3次，在3×SSC中洗15分鐘，1次。更優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式具有大約相當(dāng)于SEQIDNO2的1-125氨基酸位的N-末端截短的氨基酸和大約相當(dāng)于SEQIDNO2的522-593位氨基酸的C-末端截短的氨基酸。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式包含SEQIDNO14中所示的氨基酸序列。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述DNA分子包括SEQIDNO13中所示的核苷酸序列和在在中等嚴(yán)格條件下與其雜交的所有DNA分子。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的所述方法，其中所述DNA分子在下列條件下與SEQIDNO13中所示的核苷酸序列雜交；在1％BSA；520mMNaPO4；pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉鹽；1mMEDTA；250mM氯化鈉中于55℃雜交18-24小時(shí)，于55℃在6×SSC中洗15分鐘，3次，在3×SSC中洗15分鐘，1次。更優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式基本上由大約相當(dāng)于SEQIDNO2的103-362氨基酸位的錨蛋白基序組成。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式包含SEQIDNO16中所示的氨基酸序列。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述DNA分子包括SEQIDNO15中所示的核苷酸序列和在中等嚴(yán)格條件下與其雜交的所有DNA分子。特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述DNA分子在下列條件下與SEQIDNO15中所示的核苷酸序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉鹽；1mMEDTA；250mM氯化鈉中于55℃雜交18-24小時(shí)，于55℃在6×SSC中洗15分鐘，3次；在3×SSC中洗15分鐘，1次。此處公開的靶作物的例子包括但不局限于下列植物品種谷物(玉米，小麥，大麥，黑麥，燕麥，水稻，高粱及相關(guān)作物)；甜菜(甜菜和飼料甜菜)；梨果，核果和軟果(蘋果，梨，李，桃，杏，櫻桃，草莓，木莓和黑莓)；豆科植物(菜豆，小扁豆，豌豆，大豆)；油料植物(油菜，芥子，罌栗屬植物，橄欖，向日葵，椰子，蓖麻，可可豆，落花生)；瓜類植物(南瓜，黃瓜，甜瓜)；纖維植物(棉花，亞麻，大麻，黃麻)；柑橘屬植物(橘子，檸檬，葡萄柚，柑橘)；蔬菜(菠菜，萵苣，蘆筍，卷心菜，胡蘿卜，洋蔥，蕃茄，土豆，辣椒)；月桂屬植物(鱷梨，樟屬植物，樟樹)；或諸如煙草，堅(jiān)果，咖啡，甘蔗，茶，蛇麻草香蕉和天然橡膠的植物以及觀賞植物(開花植物，灌木，闊葉樹和常綠樹如針葉樹)。此目錄不代表任何限制。本發(fā)明的方法可用于賦予對(duì)廣泛的植物病原體的抗性，其中病原體包括但不限于病毒或類病毒如煙草或黃瓜花葉病毒、環(huán)斑病毒或壞死病毒、天竺葵曲葉病毒、紅三葉草斑駁病毒、蕃茄叢矮病毒等病毒；子囊菌綱真菌如黑星菌屬、柄球菌屬、白粉菌屬、鏈核盤菌屬、球腔菌屬和鉤絲殼霉；擔(dān)子菌綱如駝孢銹菌屬、絲核菌屬和柄銹菌屬；半知菌亞門如葡萄孢屬、長(zhǎng)蠕孢屬、喙孢屬、鐮刀菌屬(即亞粘團(tuán)串聯(lián)鐮孢、殼針孢屬、尾孢屬、鏈格孢屬、Pyricularia和假尾孢屬(即P.herpotrichoides)；卵菌綱真菌如疫霉屬(即寄生疫霉)、霜霉屬(即煙草霜霉)、盤梗霉屬、腐霉屬和單軸霉屬；及其它真菌如大孢指疫霉、Sclerophthorarayissiae、禾生指梗霉、Peronosclerosporasorghi、Peronosclerosporaphilippinensis、Peronosclerosporasacchari和Peronosclerosporamaydis、Physopellazeae、Cercosporazeae-maydis、禾生刺盤孢、玉米蜀黍赤霉、Exserohilumturcicum、玉米蜀黍球梗孢和Bipolarismaydis；細(xì)菌如丁香假單胞菌、煙草假單胞菌和斯氏泛菌；昆蟲如蚜蟲，如桃蚜；和鱗翅目如Heliothus屬種類；以及線蟲如南方根結(jié)線蟲。獲得免疫調(diào)節(jié)植物下面的三種獲得免疫調(diào)節(jié)植物的普通途徑是相關(guān)的，因?yàn)樗鼈兌歼m合Ryals等(1996)中所述的SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑模型。一旦SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化就獲得抗病性，不論采取下述的三種途徑的哪一種，一系列相同的SAR基因開啟從而產(chǎn)生抗病性。這三種途徑的區(qū)別只在于SAR途徑的哪一個(gè)位點(diǎn)開啟；三種途徑的最終結(jié)果是一致的。所以，通過一種途徑獲得的對(duì)免疫調(diào)節(jié)植物分析和觀察結(jié)果可以外推并適用于用不同途徑獲得的免疫調(diào)節(jié)植物。A系統(tǒng)獲得性抗性誘導(dǎo)劑的應(yīng)用獲得免疫調(diào)節(jié)植物的第一條途徑涉及對(duì)植物使用能誘導(dǎo)SAR的化學(xué)品。特別強(qiáng)的SAR化學(xué)誘導(dǎo)劑是苯并噻二唑如苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯(BTH)?？捎米髡{(diào)節(jié)劑的苯并噻二唑衍生物描述于美國專利5,523,311和5,614,395，兩者在此引用作為參考?？稍谔镩g多種植物中提供針對(duì)廣譜病害保護(hù)作用的BTH誘導(dǎo)的SAR在Freidrich等，植物雜志10(1)，61-70(1996)；Lawton等，植物雜志10(1)，71-82(1996)和Gorlach等，植物細(xì)胞8，629-643(1996)中有詳細(xì)的描述，這兩篇文章在此引用作為參考。其它的可用于得到本發(fā)明方法所用免疫調(diào)節(jié)植物的SAR化學(xué)誘導(dǎo)劑包括異煙酸化合物如2，6-二氯異煙酸(INA)及其低級(jí)烷基酯和水楊酸化合物(SA)。合適的INA和SA化合物的例子描述于美國專利5,614,395。B培育組成型免疫(CIM)突變植物獲得免疫調(diào)節(jié)植物的第二個(gè)途徑是根據(jù)SAR基因的組成型表達(dá)和/或抗病性表型篩選方案。大量數(shù)據(jù)表明SAR基因表達(dá)和系統(tǒng)獲得性抗性本身之間有緊密相關(guān)性(Ward等(1991)；Uknes等(1992)；Uknes等(1993)；Lawton等(1993)；和Alexander等(1993)，美國國家科學(xué)院院報(bào)90，7327-7331，在此引用作為參考)。在擬南芥中，確定的SAR基因?yàn)镻R-1、PR-2和PR-5，PR-1表達(dá)水平最高背景最低。為了鑒定和篩選組成型表達(dá)SAR基因的植物，進(jìn)行Northern分析以檢測(cè)SAR基因的表達(dá)。用Uknes等(1992)描述的方法用已知的SARDNA序列進(jìn)行雜交試驗(yàn)。雜交和克隆核酸序列的方法為本領(lǐng)域熟知。(見，例如，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，第1-3卷，Sambrook等(編輯)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)及其引用的參考)。已經(jīng)分離到至少兩組組成型表達(dá)SAR基因的SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體。一組被稱為“l(fā)sd”突變體(lsd＝損傷刺激病)，也稱為“cimI組”突變體。見WO94/16077。lsd(cimI組)突變體在葉子上自發(fā)形成損傷，積累高濃度SA，高水平的PR-1、PR-2和PR-5的mRNA，對(duì)真菌和細(xì)菌病原體有抗性(Dietrich等，1994；Weymann等，1995)。第二組被稱為“cim”(cim＝組成型免疫)突變體，也稱為“cimII組”突變體。見WO94/16077。cim突變體具有除自發(fā)損傷以外的lsd突變體的所有特征，即cim突變體的可見表型是正常的。一旦篩選到組成型表達(dá)SAR基因的植物，它們可用于育種方案以將SAR基因的組成型表達(dá)和對(duì)病原體的抗性摻入植物株系中。根據(jù)植物育種領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，依據(jù)SAR基因的表達(dá)和抗病性以及其它對(duì)于生產(chǎn)和品質(zhì)重要的特征篩選用于進(jìn)一步交配的后代。例如，因?yàn)閘sd突變體表現(xiàn)出損傷形成和壞死，具有正常表型的cim突變體對(duì)于用于這樣的育種方案和本發(fā)明的方法是優(yōu)先的，盡管如果需要，也可選用lsd突變體。C用SAR基因轉(zhuǎn)化植物第三條獲得免疫調(diào)節(jié)植物的途徑是通過用SAR基因，優(yōu)選地NIM1基因的功能形式轉(zhuǎn)化植物。1.野生型NIM1基因的重組表達(dá)野生型NIM1(SEQIDNO1)的重組過量表達(dá)產(chǎn)生了具有抗病性表型的轉(zhuǎn)基因植物。見，共同未決的美國專利申請(qǐng)序號(hào)08/880,179，在此引用作為參考?；钚訬IM1蛋白水平升高產(chǎn)生的抗病性效果與用化學(xué)藥品如BTH、INA和SA化學(xué)誘導(dǎo)相同。優(yōu)選地，NIM1基因的表達(dá)水平至少是野生型植物中NIM1基因表達(dá)水平的兩倍以上，更優(yōu)選地至少是野生型表達(dá)水平十倍以上。下面稱為“重組DNA技術(shù)”的部分描述可用于在轉(zhuǎn)基因植物中以比野生型植物高的水平重組表達(dá)野生型NIM1基因的方法。替代地，可用Cao等(1997)描述的方法用野生型NPR1基因轉(zhuǎn)化植物以產(chǎn)生抗病性植物。2.NIM1基因的改變形式的重組表達(dá)通過NIM1基因的改變形式重組表達(dá)獲得用于本發(fā)明方法的免疫調(diào)節(jié)植物，由此NIM1基因的改變利用了兩種認(rèn)識(shí)，即植物中SAR途徑表現(xiàn)與哺乳動(dòng)物和蠅中的NF-κB/IκB調(diào)節(jié)機(jī)制的功能平行以及NIM1基因產(chǎn)物是哺乳動(dòng)物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子IκBα亞類的結(jié)構(gòu)同系物。見共同未決的PCT申請(qǐng)“用NIM1基因賦予植物抗病性的方法”；在此引用作為參考。將NIM1基因序列(SEQIDNO1)用于BLAST搜索，根據(jù)NIM1基因中一個(gè)相當(dāng)保守區(qū)域與錨蛋白區(qū)域的同源性，在多種蛋白如血影蛋白、錨蛋白、NF-κB和IκB中鑒定了匹配(Michaely和Bennett，TrendscellBiol.2，127-129(1992))。在NIM1蛋白(SEQIDNO2)和70個(gè)已知含錨蛋白的蛋白之間進(jìn)行兩兩目測(cè)檢查，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控子IκBα類成員的驚人相似性(Baeuerle和Baltimore1996；Baldwin，1996)。如圖1所示，NIM1蛋白(SEQIDNO2)與小鼠、大鼠和豬(分別為SEQIDNO3、4和5)的IκBα蛋白有明顯的同源性。在整個(gè)蛋白中，NIM1包含幾個(gè)重要的IκBα結(jié)構(gòu)域，包括錨蛋白區(qū)(在圖1中通過不連續(xù)的下劃線標(biāo)出)，兩個(gè)氨基端絲氨酸(NIM1的55和59位氨基酸)，一對(duì)賴氨酸(NIM1中的99和100位氨基酸)和酸性(末端。總體上，NIM1和IκBα有30％的殘基是相同的，50％的殘基為保守性替換。因此，IκBα和NIM1在整個(gè)蛋白中有同源性，有80％的總相似性。IκBα蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮功能的一種方法是通過與胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合，阻止它進(jìn)入細(xì)胞核，從而改變靶基因的轉(zhuǎn)錄(Baeuerle和Baltimore，1996；Baldwin，1996)。NF-κB的靶基因調(diào)節(jié)(活化或阻抑)幾個(gè)細(xì)胞過程，包括抗病毒、抗微生物和細(xì)胞死亡反應(yīng)(Baeuerle和Baltimore，1996)。當(dāng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化時(shí)，IκBα的兩個(gè)絲氨酸殘基磷酸化(小鼠IκBα的第32和36氨基酸)。這啟動(dòng)雙賴氨酸處(小鼠IκBα的21和22位氨基酸)的遍在蛋白化作用。遍在蛋白化作用后，NF-κB/IκB復(fù)合物通過蛋白體輸送，在蛋白體上IκBα被降解，并且NF-κB被釋放至細(xì)胞核中。對(duì)IκBα功能起重要作用的磷酸化的絲氨酸殘基在從35位至84位氨基酸的連續(xù)的保守序列中(圖1)保守。與IκBα形成對(duì)比，雙賴氨酸位于離此蛋白N末端的約15個(gè)氨基酸處；在NIM1中，雙賴氨酸位于離C末端40個(gè)氨基酸處。而且，在NIM1和IκBα絲氨酸/蘇氨酸豐富的羧基端區(qū)域有高度同源性，這個(gè)區(qū)域?qū)τ诨A(chǔ)代謝率是重要的(Sun等，分子細(xì)胞生物學(xué)16，1058-1065(1996))。根據(jù)本發(fā)明，基于結(jié)構(gòu)同源性分析和已知對(duì)IκBα功能重要的元素的存在，預(yù)期NIM1象IκBα一樣作用，即對(duì)植物基因調(diào)控有相似的效應(yīng)。當(dāng)用化學(xué)誘導(dǎo)劑處理含有野生型NIM1基因的植物時(shí)，預(yù)計(jì)植物有更多的NIM1基因產(chǎn)物(IκB同系物)或更少的NIM1基因產(chǎn)物(IκB同系物)的磷酸化。根據(jù)此模型，結(jié)果是植物NF-κB同系物保留在細(xì)胞核之外并且產(chǎn)生SAR基因表達(dá)和抗性反應(yīng)。在nim1突變體植物中，出現(xiàn)了非功能性的NIM1基因產(chǎn)物。所以，根據(jù)此模型，NF-κB同系物自由進(jìn)入細(xì)胞核，抑制抗性和SAR基因表達(dá)。與此觀點(diǎn)一致，以水楊酸處理的動(dòng)物細(xì)胞中IκB穩(wěn)定性/豐度提高，細(xì)胞核內(nèi)有活性的NF-κB減少(Kopp和Ghosh，1994)。已知IκB的突變作用為超抑制子或顯性失活(Britta-MareenTraenckner等，歐洲分子生物學(xué)組織142876-2883(1995)；Brown等，科學(xué)2671485-1488(1996)；Brockman等，分子和細(xì)胞生物學(xué)152809-2818(1995)；Wang等，科學(xué)274；784-787(1996))。這些IκB的突變形式與NF-κB結(jié)合但不磷酸化也不遍在蛋白化，所以不被降解。NF-κB仍然與IκB結(jié)合不進(jìn)入細(xì)胞核中。就上述而言，可產(chǎn)生作用為SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的顯性失活調(diào)控子的NIM1的改變形式。轉(zhuǎn)化了NIM1的顯性失活形式的植物與nim1突變體植物有相反的表型，因?yàn)檗D(zhuǎn)化了NIM1的改變形式的植物表現(xiàn)出組成型SAR基因表達(dá)因此具有CIM表型，即轉(zhuǎn)基因植物是免疫調(diào)節(jié)的。因?yàn)镹IM1在SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中所處的位置，可以預(yù)測(cè)除了在此具體公開的以外對(duì)于此基因的許多改變將會(huì)導(dǎo)致SAR基因的組成型表達(dá)，所以產(chǎn)生CIM表型。下面標(biāo)題為“重組DNA技術(shù)”部分所述的方法可用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)比野生型水平高的NIM1基因的改變形式。下面描述了可作為SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑顯性失活調(diào)控子的幾種NIM1基因的改變形式。a將55和59位絲氨酸殘基變?yōu)楸彼釟埢Ｈ薎κBα中絲氨酸磷酸化對(duì)于刺激活化IκBα降解由此活化NF-κB是必需的。人IκBα中絲氨酸殘基(S32和S36)突變?yōu)楸彼釟埢种屏舜碳ふT導(dǎo)的磷酸化，因此封閉了IκBα蛋白體介導(dǎo)的降解(Traenckner等，1995；Brown等，1996；Brockman等，1995；Wang等，1996)。改變形式的IκBα通過將NF-κB保留于細(xì)胞質(zhì)中由此封閉下游事件作為顯性失活形式行使功能。根據(jù)圖1所示的NIM1和IκB之間氨基酸序列比較，NIM1(SEQIDNO2)中第55位(S55)和59位(59)絲氨酸與人IκBα中的S32和S36同源。為了構(gòu)建是性失活形式的NIM1，55和59位的絲氨酸被突變成丙氨酸殘基。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，NIM1基因被改變使得其編碼產(chǎn)物在擬南芥NIM1氨基酸序列(SEQIDNO2)中相應(yīng)的55位和39位氨基酸是丙氨酸而不是絲氨酸。bN-末端刪除人IκBα第1-36位氨基酸(Brockman等，1995；Sun等，1996)或第1-72位氨基酸(Sun等，1996)的刪除，包括了遍在蛋白化賴氨酸殘基K21和K22以及磷酸化位點(diǎn)S32和S36，導(dǎo)致了在轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞培養(yǎng)物中出現(xiàn)了顯性失活I(lǐng)κBα表型。NIM1基因產(chǎn)物N-末端第125個(gè)氨基酸的刪除將去掉作為遍在蛋白化位點(diǎn)的8個(gè)賴氨酸殘基以及假定的上面討論的S55和S59磷酸化位點(diǎn)。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1基因被改變使得其編碼產(chǎn)物與天然擬南芥NIM1氨基酸序列(SEQIDNO2)相比，缺失了前約125個(gè)氨基酸。cC-末端刪除人IκBα第261-317位氨基酸的刪除通過封閉C-末端絲氨酸和蘇氨酸殘基的組成型磷酸化增強(qiáng)了內(nèi)在的穩(wěn)定性。改變形式的IκBα預(yù)計(jì)以顯性失活形式發(fā)揮功能。絲氨酸和蘇氨酸豐富區(qū)位于NIM1C-末端的第522-593位氨基酸。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，NIM1基因被改變使得其編碼產(chǎn)物與天然的擬南芥NIM1氨基酸序列(SEQIDNO2)相比，缺失了約包括522-593位氨基酸的C-末端部分。dN-末端/C-末端嵌合體和錨蛋白區(qū)域NIM1基因的改變形式產(chǎn)物可作為C-末端和N-末端片段刪除或嵌合體予以制備。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含NIM1基因錨蛋白區(qū)域的構(gòu)建體。3其它SAR基因的重組表達(dá)通過重組表達(dá)多種SAR基因，諸如Ward等(1991)中所述的，制備用于本發(fā)明方法的免疫調(diào)節(jié)植物。見例如，美國專利5,614,395，它描述了通過量表達(dá)一種或多種PR蛋白基因制備抗病性植物。盡管它特別談及了NIM1基因形式的重組表達(dá)，下面標(biāo)題為“重組DNA技術(shù)”的部分所述的方法可用于在轉(zhuǎn)基因植物中以比野生型高的水平表達(dá)其它SAR基因，如PR蛋白基因。重組DNA技術(shù)用常規(guī)重組DNA技術(shù)可將通過增強(qiáng)SAR基因表達(dá)賦予植物抗病性的野生型或NIM1基因的改變形式整合到植物細(xì)胞中。通常，用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法，將編碼所選上述形式的NIM1DNA分子插入到表達(dá)系統(tǒng)中，其中DNA分子是異源的(即正常情況下不存在)。此栽體包含插入的蛋白編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件。本領(lǐng)域所知的多種載體可以應(yīng)用，例如質(zhì)粒，噬菌體病毒和其它經(jīng)修飾的病毒。合適的載體包括但不限于，病毒載體，諸如λ載體系統(tǒng)λgtl1，λgtl0和Charon4；質(zhì)粒載體諸如pBI121，pBR322，PACYC177，pACYC184，pAR系列，pKK223-3，pUC8，pUC9，pUC18，pUC19，pLG339，pRK290，pKC37，pKC101，pCDNAII；和其它相似的系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)的成分可以被修飾以提高表達(dá)。例如，可利用截短的序列，核苷酸替代或其它修飾。在此描述的表達(dá)系統(tǒng)實(shí)際上可在合適的條件下轉(zhuǎn)化任何作物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可被重新進(jìn)入整體植物以使所選形式的NIM1基因在轉(zhuǎn)基因植物中活化SAR。A植物表達(dá)盒的構(gòu)建用于轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的基因序列首先要裝配于位于可在植物中表達(dá)的適當(dāng)啟動(dòng)子之后的表達(dá)盒中。表達(dá)盒中可包含任何轉(zhuǎn)基因表達(dá)必需或可選的序列。這樣的序列包括但不限于轉(zhuǎn)錄終止子，增強(qiáng)表達(dá)的外部序列如內(nèi)含子，有活力的序列以及將基因產(chǎn)物定位至特定細(xì)胞器和細(xì)胞小室的序列。下文描述了這些表達(dá)盒容易被轉(zhuǎn)移到植物轉(zhuǎn)化栽體。下文描述了典型表達(dá)盒的各種成分。1啟動(dòng)子用于表達(dá)盒的啟動(dòng)子的選擇將決定轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中突間和時(shí)間表達(dá)方式。所選啟動(dòng)子將在特定細(xì)胞類型(如葉表皮細(xì)胞，葉肉細(xì)胞，根皮質(zhì)細(xì)胞)中或在特定組織或器官(根，葉或花，例如)表達(dá)轉(zhuǎn)基因，并且選擇將反映基因產(chǎn)物希望的積累位置。替換地，所選啟動(dòng)子可在多種誘導(dǎo)條件下驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。啟動(dòng)子強(qiáng)度即啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力不同。依據(jù)所用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可用許多合適啟動(dòng)子中的任何一個(gè)。下面是可用于表達(dá)盒的無數(shù)的啟動(dòng)子的例子。a組成型表達(dá)，CaMV35S啟動(dòng)子質(zhì)粒pCGN1761的構(gòu)建描述于公開的專利申請(qǐng)EP0392225(實(shí)施例23)，在此引用作為參考。pCGN1761包含“雙”CaMV35S啟動(dòng)子和tm1轉(zhuǎn)錄終止子，在啟動(dòng)子和終止子之間有單一的EcoRI位點(diǎn)并具有pUC型骨架。構(gòu)建pCGN1761的衍生物，它有經(jīng)修飾的多接頭，除了已存在的EcoRI位點(diǎn)外，還包括NotI和XhoI位點(diǎn)。此衍生物被命名為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用于將cDNA序列或基因序列(包括微生物ORF序列)克隆至其多接頭內(nèi)，以使它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中在35S啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。這樣構(gòu)建體中的整個(gè)的35S啟動(dòng)子—基因序列—tm1終止子表達(dá)盒可被接近啟動(dòng)子5′端的HindIII，Sphl，SalI和XbaI位點(diǎn)以及接近終止子的3′端的XbaI，BamHI和BglII位點(diǎn)切割以用于轉(zhuǎn)移至諸如下面所述的轉(zhuǎn)化載體中。而且，以HindIII，SphI，SalI，XbaI或PstI進(jìn)行5′切割，以多接頭的任一個(gè)限制性位點(diǎn)(EcoRI，NotI或XhoI)進(jìn)行3′切割可替換為另一個(gè)啟動(dòng)子。如果希望的話，通過引入增強(qiáng)翻譯的序列進(jìn)行克隆位點(diǎn)周圍的修飾。如果要進(jìn)行過量表達(dá)，這一點(diǎn)特別有用。例如，按照美國專利5,639,949實(shí)施例37所述通過優(yōu)化翻譯起始位點(diǎn)對(duì)pCGN1761ENX進(jìn)行修飾，此專利在此引用作為參考。b在化學(xué)/病原體可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子下表達(dá)pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子可被任何引起適當(dāng)高表達(dá)的其它可供選擇的啟動(dòng)子取代。例如，美國專利5,614,395中描述的化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子可取代此35S啟動(dòng)子?？晒┻x擇的啟動(dòng)子優(yōu)選地被限制性酶從其來源上切下，一種替代方法是用具有合適的末端限制性位點(diǎn)的引物PCR擴(kuò)增得到。如果采用PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的啟動(dòng)子插入靶載體后，應(yīng)該對(duì)啟動(dòng)子重新測(cè)序以檢測(cè)擴(kuò)增錯(cuò)誤?；瘜W(xué)/病原體誘導(dǎo)的煙草PR-la啟動(dòng)子被從質(zhì)粒pCIB1004(構(gòu)建過程，見EP0332104的實(shí)施例21，在此引用作為參考)切下轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒pCGN1761ENX(Uknes等，1992)。用NcoI切割pCIB1004，產(chǎn)生的線性片段的3′突出端以T4DNA聚合酶處理使它成為平端。然后用HindIII切割這個(gè)片段，凝膠純化得到的含PR-la啟動(dòng)子的片段，并將它克隆到去掉35S啟動(dòng)子的pCGN1761ENX中。這是通過用XhoI切割，T4聚合酶補(bǔ)平，然后用HindIII切割，分離含有大的插入pCIB1004啟動(dòng)子的載體的片段完成的。這產(chǎn)生了一個(gè)pCGN1761ENX衍生物，它具有PR-la啟動(dòng)子，tm1終止子和具有單一EcoRI和NotI位點(diǎn)的插入多接頭。所選的編碼序列可被插到這個(gè)載體中，融合產(chǎn)物(即啟動(dòng)子—基因—終止子)可被轉(zhuǎn)移至任何所選的轉(zhuǎn)化載體，包括下文所描述的載體。多種化學(xué)調(diào)節(jié)劑可用于以在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物中誘導(dǎo)所選編碼序列的表達(dá)，包括美國專利5,523,311和5,614,395中公開的苯并噻二唑，異煙酸和水楊酸化合物。c組成型表達(dá)，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子已知幾種肌動(dòng)蛋白異構(gòu)體在大多數(shù)類型細(xì)胞中表達(dá)，因此肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子是一個(gè)好的組成型啟動(dòng)子。特別是，水稻Actl基因的啟動(dòng)子已得到克隆、鑒定(McElroy等，植物細(xì)胞2163-171(1990))。1.3kb的啟動(dòng)子片段包括在水稻原生質(zhì)體內(nèi)表達(dá)所需的所有調(diào)節(jié)元件。而且，多種以ActI啟動(dòng)子為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)載體專門用于單子葉植物(McElroy等，MolGenGenet.231150-160(1991))。它們將ActI-內(nèi)含子，AdhI5′側(cè)翼序列和AdhI-內(nèi)含子(來自玉米乙醇脫氫酶基因)和來自CaMV35S啟動(dòng)子的序列整合在一起。35S與ActI內(nèi)含子或ActI5′側(cè)序列與ActI內(nèi)含子融合的載體表達(dá)最高。起始密碼子ATG周圍序列(GUS報(bào)告基因的序列)的優(yōu)化也增強(qiáng)表達(dá)。由McElory等(Mol.Gen.Genet.231150-160(1991))描述的啟動(dòng)子表達(dá)盒很容易被修飾而用于基因表達(dá)而且特別適用于單子葉植物宿主。例如，從McElroy構(gòu)建體上切下包含啟動(dòng)子的片段用于替換pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子，它可用以插入特定的基因序列。這樣構(gòu)建成的融合基因可被轉(zhuǎn)移至合適的轉(zhuǎn)化載體。在另一單獨(dú)報(bào)道中，水稻ActI啟動(dòng)子與其內(nèi)含子可以在培養(yǎng)的大麥細(xì)胞指導(dǎo)高表達(dá)(Chibbar等，PlantCellRep.12506-509(1993))。d組成型表達(dá)，遍在蛋白啟動(dòng)子遍在蛋白是另一已知的其基因產(chǎn)物在多種類型細(xì)胞積累，其啟動(dòng)子已從幾種植物中克隆并用于轉(zhuǎn)基因植物(如，向日葵-Bine等，植物科學(xué)7987-94(1991)和玉米—Christensen等，植物分子生物學(xué)12619-632(1989))。玉米遍在蛋白啟動(dòng)子已在轉(zhuǎn)基因單子葉植物系統(tǒng)中得以發(fā)展，其用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的序列和載體構(gòu)建公開于專利公開EP0342926(到Lubrizol)；在此引用作為參考。Taylor等(PlantcellRep.12；491-495(1993))描述一個(gè)包含玉米遍在蛋白啟動(dòng)子及其第一個(gè)內(nèi)含子的載體(pAHC25)，當(dāng)它通過微粒轟擊導(dǎo)入時(shí)，在多種單子葉植物細(xì)胞懸液中有很高的活性。遍在蛋白啟動(dòng)子適于轉(zhuǎn)基因植物中基因表達(dá)，特別是單子葉植物。合適的載體有pAHC25的衍生物或在本申請(qǐng)中描述的任何轉(zhuǎn)化載體，它們通過引入合適的遍在蛋白啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子序列而得到修飾。e根特異表達(dá)另外一種基因表達(dá)的方式是根表達(dá)。deFramond(FEBS290；103-106(1991))及公開的專利申請(qǐng)EP0452269中描述了一個(gè)合適的根啟動(dòng)子，在此引用作為參考。將此啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入合適的載體如pCGN1761ENX以插入所選基因，隨后將全部的啟動(dòng)子—基因—終止子盒轉(zhuǎn)入目的轉(zhuǎn)化載體。f創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動(dòng)子創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動(dòng)子也適用于基因表達(dá)。已描述許多這樣的啟動(dòng)子(如Xu等，植物分子生物學(xué)22；573-588(1993)，Logemann等，植物細(xì)胞1151-158(1989)，Rohrmeier&amp;Lehle，植物分子生物學(xué)22783-792(1993)，F(xiàn)irek等，植物分子生物學(xué)22129-142(1993)，Warner等，植物雜志3191-201(1993))并且適用于本發(fā)明。Logemann等描述了雙子葉植物土豆Wunl基因的5′上游序列。Xu等表明雙子葉植物土豆創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子(pin2)在單子葉植物水稻中有活性。進(jìn)一步，Rohrmeier&amp;Lehle描述了創(chuàng)傷誘導(dǎo)的玉米WiplcDNA的克隆，它可用于以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離同源啟動(dòng)子。相似，F(xiàn)irek等和Warner等已描述了來自單子葉植物石刁柏的創(chuàng)傷誘導(dǎo)基因，它可在局部創(chuàng)傷和病原體侵襲位點(diǎn)表達(dá)。用本領(lǐng)域熟知的克隆技術(shù)，這些啟動(dòng)子可轉(zhuǎn)入合適的載體中，與本發(fā)明有關(guān)的基因融合用于在植物創(chuàng)傷位點(diǎn)表達(dá)這些基因。g木髓優(yōu)先的表達(dá)專利申請(qǐng)WO93/07278在此引用作為參考，描述了在髓細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)的玉米trpA基因的分離?；蛐蛄械霓D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和啟動(dòng)子之間有1726bp。用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，此啟動(dòng)子或其一部分可轉(zhuǎn)入諸如pCGN1761的載體中，它可取代35S啟動(dòng)子并且以髓優(yōu)先的方式啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。實(shí)際上，包含髓優(yōu)先的啟動(dòng)子或其一部分的片段可轉(zhuǎn)入任何載體，經(jīng)修飾后用于轉(zhuǎn)基因植物。h葉特異表達(dá)Hudspeth&amp;Grula(植物分子生物學(xué)12；579-589(1989))描述了編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，此基因的啟動(dòng)子可用于在轉(zhuǎn)基因植物以葉特異方式啟動(dòng)任何基因的表達(dá)。2轉(zhuǎn)錄終止子多種轉(zhuǎn)錄終止子可用于表達(dá)盒。它們負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因后的轉(zhuǎn)錄終止及其正確的多腺苷酸化。合適的轉(zhuǎn)錄終止子是那些已知在植物中起作用的，包括CaMV35S終止子，tm1終止子，胭脂氨酸合酶終止子和豌豆rbcSE9終止子。它們既可用于單子葉植物也可用于雙子葉植物。3增強(qiáng)或調(diào)節(jié)表達(dá)的序列轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的多種序列可增強(qiáng)基因表達(dá)，這些序列可與本發(fā)明的基因聯(lián)合應(yīng)用提高它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。多種內(nèi)含子序列可增強(qiáng)表達(dá)，特別是在單子葉植物細(xì)胞中。例如，當(dāng)導(dǎo)入玉米細(xì)胞時(shí)，玉米AdhI基因的內(nèi)含子明顯提高位于其同源啟動(dòng)子下的野生型基因的表達(dá)。內(nèi)含子1特別有效，能夠增強(qiáng)含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體中的表達(dá)(Callis等，基因發(fā)育1；1183-1200(1987))。在同一實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，玉米bronzel基因的內(nèi)含子在增強(qiáng)表達(dá)方面有相似的效應(yīng)。內(nèi)含子序列已被常規(guī)地整合到植物轉(zhuǎn)化載體中，內(nèi)含子典型地位于非翻譯前導(dǎo)區(qū)內(nèi)。來自病毒的許多非翻譯前導(dǎo)區(qū)可增強(qiáng)表達(dá)，它們?cè)陔p子葉植物細(xì)胞中特別有效。特別是煙草花葉病毒(TMV，“W-序列”)，玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)區(qū)序列有效地增強(qiáng)表達(dá)(如，Gallie等，核酸研究15；8693-8711(1987)；Skuzeski等，植物分子生物學(xué)15；65-79(1990))。4基因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的靶向在植物中存在多種靶向基因產(chǎn)物的機(jī)制，已對(duì)控制這些機(jī)制發(fā)揮功能的序列做了較為細(xì)致的鑒定。例如，基因產(chǎn)物靶向葉綠體是由薦在于多種蛋白氨基末端的信號(hào)序列控制的，當(dāng)運(yùn)輸至葉綠體以產(chǎn)生成熟蛋白時(shí)此信號(hào)序列被切除(如Comal等，生物化學(xué)雜志26315104-15109(1988))。這些信號(hào)序列可與異源基因產(chǎn)物融合以影響異源產(chǎn)物到葉綠體的運(yùn)輸(andenBroeck，等，自然313358-363(1985))?？蓮木幋aRUBISCO蛋白，CAB蛋白，EPSP合酶，GS2蛋白和其它多種已知導(dǎo)向葉綠體的蛋白的cDNA5′末端分離編碼合適信號(hào)序列的DNA。參見美國專利5,639,949實(shí)施例37標(biāo)題為“葉綠體導(dǎo)向表達(dá)”部分。其它基因產(chǎn)物定位于其它細(xì)胞器如線粒體和過氧化物酶體(如，Unger等，植物分子生物學(xué)13411-418(1989))?？煽刂凭幋a這些產(chǎn)物的cDNA以影響異源基因產(chǎn)物向這些細(xì)胞器的導(dǎo)向。這樣序列的例子為編碼核ATP酶和線粒體特異的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶異構(gòu)體的序列。Rogers等已描述了細(xì)胞蛋白體的靶向(美國國家科學(xué)院院報(bào)826512-6516(1985))。另外，已鑒定了導(dǎo)致基因產(chǎn)物靶向其它細(xì)胞小室的序列。氨基端序列負(fù)責(zé)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，質(zhì)外體和從糊粉細(xì)胞向細(xì)胞外分泌的靶向(Koehler&amp;Ho，植物細(xì)胞2769-783(1990))。另外，氨基端序列與羧基端序列共同負(fù)責(zé)液泡定位(Shinshi等，植物分子生物學(xué)14；357-368(1990))。通過將上述合適的靶向序列與目的轉(zhuǎn)基因序列融合，可能將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物導(dǎo)向任何細(xì)胞器或細(xì)胞小室。對(duì)于葉綠體導(dǎo)向，例如，RUBISCO基因，CAB基因，EPSP合酶基因或GS2基因的葉綠體信號(hào)序列按框架與轉(zhuǎn)基因氨基端ATG融合。所選的信號(hào)序列應(yīng)包括已知的切割位點(diǎn)，構(gòu)建融合體應(yīng)該考慮需要切割的切割位點(diǎn)后的氨基酸序列。在某些情況下，這種要求可通過在切割位點(diǎn)和轉(zhuǎn)基因的ATG之間增加少量幾個(gè)氨基酸，或替換轉(zhuǎn)基因序列內(nèi)的幾個(gè)氨基酸來滿足。用Bartlett等，在Edelmann等(編輯)葉綠體分子生物學(xué)方法，Elsevier第1081-1091頁(1982)和Wasmann等，Mol，Gen.Genet205446-453(1986)描述的技術(shù)，通過檢測(cè)體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體的體外翻譯以及隨后的葉綠體的攝入測(cè)定葉綠體攝入效率從而檢測(cè)用于葉綠體運(yùn)輸?shù)娜诤蠘?gòu)建體。這些構(gòu)建技術(shù)為本領(lǐng)域熟知并且同樣適用于線粒體和過氧化物酶體。上述的細(xì)胞導(dǎo)向機(jī)制不僅可與其同源啟動(dòng)子共同使用，而且也可與異源啟動(dòng)子共同使用，以影響在啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的特定的細(xì)胞靶向，啟動(dòng)子的表達(dá)方式與靶向信號(hào)來源的啟動(dòng)子的表達(dá)方式不同。B植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建用于植物轉(zhuǎn)化的許多轉(zhuǎn)化載體為植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知，與本發(fā)明有關(guān)的基因可與任何一個(gè)這樣的載體共同使用。載體的選擇取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化的靶物種。對(duì)于某些靶物種來說，可優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記。常規(guī)用于轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記包括nptII基因，產(chǎn)生對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素的抗性(Messing&amp;Vierra基因19259-268(1982)；Bevan等，自然304184-187(1983))，bar基因，產(chǎn)生對(duì)除草劑膦絲菌素的抗性(White等，核酸研究181062(1990)；Spencer等，Theor.Appl.Genet79625-631(1990))，hph基因，產(chǎn)生對(duì)抗生素潮霉素的抗性(Blochinger&amp;Diggelmann分子細(xì)胞生物學(xué)42929-2931)和dhfr基因，產(chǎn)生對(duì)氨甲喋呤的抗性(Bourouis等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志2(7)1099-1104(1983))，以及EPSPS基因，產(chǎn)生對(duì)草甘膦抗性(美國專利4,940,935和5,186,642)。1適用于土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體很多載體適用于以根瘤土壤桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。它們通常含至少一個(gè)T-DNA邊界序列包括載體諸如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984)和pXYZ。下文描述了兩個(gè)典型的適于土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體。apCIB200和pCIB2001。雙元載體pCIB200和pCIB2001用于使用土壤桿菌的重組載體的構(gòu)建，以下述方式進(jìn)行構(gòu)建。用NarI消化pTJS75(Schrnidhauser&amp;Helinski，細(xì)菌學(xué)雜志164446-455(1985))切除四環(huán)素抗性基因，然后插入來自pUC4K攜帶NPTII的AccI片段得到pTJS75Kan(Messing&amp;Vierra，基因19259-268(1982)；Bevan等，自然304184-187(1983)；McBride等，植物分子生物學(xué)14266-276(1990))。將XhoI接頭與PCIB7的EcoRV片段連接，它包括左右T-DNA邊界，植物可選擇的nos/nptII嵌合基因和pUC多接頭(Rothstein等，基因53153-161(1987))，XhoI消化片段被克隆至Sal消化的pTJS75Kan以產(chǎn)生pCIB200(見EP0332104，實(shí)施例19)。pCIB200包括下列單一多接頭限制性位點(diǎn)EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI和SalI。pCIB2001是在pCIB200多接頭中插入另外的限制性位點(diǎn)產(chǎn)生的衍生物。pCIB2001多接頭中的單一限制性切點(diǎn)是EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI，SalI，MlnI，BcII，AvrII，ApaI，HpaI和StuI。pCIB2001除了包含這些限制性位點(diǎn)外，還包括植物和細(xì)菌卡那霉素篩選，左和右T-DNA邊界可用于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，來自RK2的在大腸桿菌和其它宿主間運(yùn)動(dòng)的trfA功能以及來自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接頭適合于克隆含有自身調(diào)節(jié)信號(hào)的植物表達(dá)盒。bpCIB10及其潮霉素篩選的衍生物雙元載體pCIB10包含編碼在植物中進(jìn)行篩選的卡那霉素抗性的基因和左右T-DNA邊界序列以及從廣譜宿主質(zhì)粒pRK252中整合的使其可在大腸桿菌和土壤桿菌都可復(fù)制的序列。其構(gòu)建由Rothstein等(基因53153-161(1987))描述。構(gòu)建了整合有潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的多種pCIB10衍生物，由Gritz等(基因25179-188(1983))描述。這些衍生物使轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞只能在潮霉素上(pCIB743)或潮霉素和卡那霉素上篩選(pCIB715，pCIB717)。2適于非土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體不用根瘤土壤桿菌的轉(zhuǎn)化使在所選的轉(zhuǎn)化載體中不必要求有T-DNA序列；所以除了使用上述含T-DNA序列的載體缺少這些序列的載體也可以應(yīng)用。不依賴土壤桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過粒子轟擊，原生質(zhì)體攝入(如PEG和電穿孔)和顯微注射。載體的選擇主要取決于轉(zhuǎn)化物種的優(yōu)先選擇。下文描述了適于非土壤桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體的構(gòu)建。apCIB3064pCIB3064是來源于pUC的載體，適合于直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和除草劑basta(或膦絲菌素)篩選的聯(lián)合應(yīng)用。質(zhì)粒pCIB246包括與大腸桿菌GUS基因調(diào)控融合的CaMV35S啟動(dòng)子和CaMV35S轉(zhuǎn)錄終止子，描述于PCT公開的申請(qǐng)WO93/07278中。此載體的35S啟動(dòng)子包括兩個(gè)起始位點(diǎn)5′的ATG序列。用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)突變這些位點(diǎn)以去掉ATG并產(chǎn)生限制性位點(diǎn)SspI和PvuII。新的限制性位點(diǎn)距離單一SalI位點(diǎn)96和37bp，距離實(shí)際起始位點(diǎn)101和42bp。得到的pCIB246衍生物被命名為pCIB3025。用SalI和SacI消化切除pCIB3025中的GUS基因，將末端補(bǔ)平重新連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pCIB3060。質(zhì)粒pJIT82來自JohnInnesCentre，Norwich，含有來自產(chǎn)綠色鏈霉菌的bar基因400bp片段被切下來插入到pCIB3060的HpaI位點(diǎn)(Thompson等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志62519-2523(1987))。由此產(chǎn)生了pCIB3064，它包括在CaMV35S啟動(dòng)子和終止子控制下用于除草劑篩選的bar基因，一個(gè)氨芐抗性基因(用于大腸桿菌篩選)和具有單一位點(diǎn)SphI，PstI，HindIII和BamHI的多接頭。此載體適用于克隆包含自身調(diào)節(jié)信號(hào)的植物表達(dá)盒。bpSOG19和pSOG35pSOG35是用大腸桿菌二氫葉酸還原酶(DFR)作為篩選標(biāo)記賦予氨甲喋呤抗性的轉(zhuǎn)化載體。利用PCR從pSOG10擴(kuò)增35S啟動(dòng)子(約800bp)、玉米Adhl基因的內(nèi)含子6(約550bp)和18bp的GUS非翻譯前導(dǎo)區(qū)序列。也擴(kuò)增了編碼大腸桿菌二氫葉酸還原酶II型基因的250bp片段，這兩個(gè)片段通過來自pB1221(Clontech)的包含pUC19載體骨架和胭脂氨酸合酶終止子的SacI-PstI片段裝配起來。這些片段的裝配產(chǎn)生pSOG19，它包含與內(nèi)含子6序列融合的35S啟動(dòng)子，GUS前導(dǎo)區(qū)，DHFR基因和胭脂氨酸合酶終止子。用玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)前導(dǎo)序列取代pSOG19中的GUS前導(dǎo)區(qū)產(chǎn)生載體pSOG35。pSOG19和pSOG35具有氨芐抗性的pUC基因和用于克隆外源物質(zhì)的HindIII，SphI，PstI和EcoRI位點(diǎn)。C轉(zhuǎn)化一旦將目的編碼序列克隆入表達(dá)系統(tǒng)，就將其轉(zhuǎn)化至植物細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化和植物再生的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，Ti質(zhì)粒載體已被用于運(yùn)送外源DNA，以及直接DNA攝入，脂質(zhì)體，電穿孔，顯微注射和微粒轟擊。另外，土壤桿菌屬的細(xì)菌也可用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。下文描述了用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物和單子葉植物的典型技術(shù)。1雙子葉植物的轉(zhuǎn)化雙子葉植物轉(zhuǎn)化技術(shù)為本領(lǐng)域熟知，包括以土壤桿菌為基礎(chǔ)的技術(shù)以及不需要土壤桿菌的技術(shù)。非土壤桿菌技術(shù)涉及原生質(zhì)體或細(xì)胞直接攝入外源遺傳物質(zhì)。這可通過PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝入，粒子轟擊介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)或顯微注射實(shí)現(xiàn)。這些技術(shù)的例子的描述見Paszkowski等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志32717-2722(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199169-177(1985)；Reich等，生物技術(shù)4；1001-1004(1986)和Klein等，自然32770-73(1987)。在每一種情況下，用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使細(xì)胞再生成整株植物。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化雙子葉植物優(yōu)選的技術(shù)，因?yàn)樗霓D(zhuǎn)化效率較高而且適于用多種植物。土壤桿菌轉(zhuǎn)化一般涉及將攜帶外源目的DNA的雙元載體(如pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)移至合適的土壤桿菌菌株，依賴于宿主土壤桿菌株攜帶的vir基因的補(bǔ)充是在Ti質(zhì)粒上還是在染色體上(如用于pCIB200和pCIB2001的CIB542株(Uknes等，植物細(xì)胞5159-169(1993))。重組雙元載體轉(zhuǎn)移至土壤桿菌是通過三親交配方法實(shí)現(xiàn)的，它使用攜帶重組雙元載體的大腸桿菌，攜帶質(zhì)粒如pRK2013并且能夠?qū)⒅亟M雙元載體移至靶土壤桿菌株的輔助大腸桿菌株。替代地，重組雙元載體可通過DNA轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移至土壤桿菌(Hofgen&amp;Willmitzer，核酸研究169877(1988))。用重組土壤桿菌轉(zhuǎn)化靶植物通常涉及用本領(lǐng)域熟知的方法共培養(yǎng)土壤桿菌和植物的外植體。轉(zhuǎn)化的組織在含有雙源質(zhì)粒T-DNA邊界之間的抗生素或除草劑抗性標(biāo)記的選擇培養(yǎng)基上再生。另外一種用基因轉(zhuǎn)化植物的方法涉及將無活性或有生物活性的顆粒推進(jìn)到植物組織和細(xì)胞上。這項(xiàng)技術(shù)公布在授予Sanford等的美國專利4,945,050，5,036,006和5,100,792中。通常，這種方法涉及在有效地滲入細(xì)胞外表面及摻入到其內(nèi)部的條件下將無活性或有生物活性的顆粒推進(jìn)到細(xì)胞上。當(dāng)使用無活性顆粒時(shí)，通過包被包含希望基因的顆粒將載體導(dǎo)入細(xì)胞。替代地，用載體包圍靶細(xì)胞，通過顆粒的激活將載體帶入細(xì)胞。具有生物活性的顆粒(如干的酵母細(xì)胞，干的細(xì)菌或噬菌體，每一種包含需導(dǎo)入的DNA)可用于推進(jìn)到植物細(xì)胞組織中。2單子葉植物的轉(zhuǎn)化大多數(shù)單子葉植物的轉(zhuǎn)化已成為常規(guī)。優(yōu)選的技術(shù)包括用PEG或電穿孔技術(shù)直接將基因轉(zhuǎn)移到原生質(zhì)體中；用顆子轟擊轉(zhuǎn)移到愈傷組織中?？捎脝蝹€(gè)DNA種類或多種DNA(即共轉(zhuǎn)化)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這兩種技術(shù)都適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)是避免完全載體構(gòu)建以及制備目的基因和篩選標(biāo)記不連鎖的轉(zhuǎn)基因植物，使得隨后的子代中不需要篩選標(biāo)記，如果這一點(diǎn)被認(rèn)為可選。然而，共轉(zhuǎn)化的缺點(diǎn)是單個(gè)DNA整合到基因組中的概率小于100％(Schocher等，生物技術(shù)4；1093-1096(1986))。專利申請(qǐng)EP0292435，EP0392225和WO93/07278描述的技術(shù)有從玉米原種近交系制備愈傷組織和原生質(zhì)體，用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，從轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生玉米植物。Gordonkamm等(植物細(xì)胞2603-618(1990))和Fromm等(生物技術(shù)8833-839(1990))公布了用顆子轟擊轉(zhuǎn)化A188來源的玉米系的技術(shù)。而且，WO93/07278和Koziel等(生物技術(shù)11194-200(1993))描述了通過顆子轟擊轉(zhuǎn)化玉米原種近交系的技術(shù)。此技術(shù)利用了從授粉后14-15天的玉米穗上切下的1.5-2.5mm長(zhǎng)的未成熟胚胎和PDS-1000HeBiolistics儀器進(jìn)行轟擊。也可通過直接基因運(yùn)送技術(shù)用原生質(zhì)體或粒子轟擊轉(zhuǎn)化水稻。已描述了對(duì)Japonica型和Indica型進(jìn)行的原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Zhany等，植物細(xì)胞繁殖7379-384(1988)；Shimamoto等，自然338274-277(1989)；Datta等，生物技術(shù)8736-740(1990))。用粒子轟擊可對(duì)兩種類型進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)化(Christou等，生物技術(shù)9957-962(1991))。專利申請(qǐng)EP0332581描述了制備，轉(zhuǎn)化和再生Pooideae原生質(zhì)體的技術(shù)。這些技術(shù)可用于轉(zhuǎn)化Dactylis和小麥。而且，Vasil等(生物技術(shù)10667-674(1992))描述了用粒子轟擊進(jìn)行的C型長(zhǎng)期再生愈傷組織細(xì)胞的小麥轉(zhuǎn)化，Vasil等(生物技術(shù)111553-1558(1993)和Week等(植物生理學(xué)1021077-1084(1993))描述了用粒子轟擊進(jìn)行未成熟胚胎和未成熟胚胎來源的愈傷組織的小麥轉(zhuǎn)化。然而，優(yōu)先的小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)涉及通過粒子轟擊轉(zhuǎn)化未成熟胚胎并包括基因運(yùn)送前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊前，任意數(shù)目的胚胎(0.75-1mm長(zhǎng))被接種在含3％蔗糖(Murashiga&amp;Skoog，植物生理學(xué)15473-497(1962))和3mg/12.4-D的MS培養(yǎng)基上以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎，此過程避光進(jìn)行。在所選的轟擊的那一天，將胚胎從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中取出放在滲透劑中(即誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有希望濃度的蔗糖或麥芽糖，通常為15％。胚胎質(zhì)壁分離2-3小時(shí)后進(jìn)行轟擊。通常每塊靶平板有24個(gè)胚胎，但這不是關(guān)鍵的。用標(biāo)準(zhǔn)方法將攜帶合適基因的質(zhì)粒(如pCIB3064或pSG35)沉淀到毫米大小的金顆粒上。用標(biāo)準(zhǔn)的80目屏以約1000psi的沖擊壓通過DuPontBiolistics氦儀器轟擊每個(gè)平板上的胚胎。轟擊后，將胚胎放回至黑暗中恢復(fù)約24個(gè)小時(shí)(仍在滲透劑中)。24小時(shí)后，將胚胎從滲透劑中取出放回到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在再生前停留的一個(gè)月。約1個(gè)月后，具有發(fā)育的胚胎發(fā)生愈傷組織的胚胎外植體被轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基中(MS+1mg/lNAA，5mg/lGA)，進(jìn)一步包含合適的篩選劑(對(duì)于pCIB3064是10mg/lbasta，對(duì)于pSOG35是2mg/lmethotrexate)。約1個(gè)月后，將發(fā)育的芽轉(zhuǎn)移至大的無菌容器“GA7S”中，它包含半濃度MS，2％蔗糖和相同濃度的篩選劑。最近，描述了用土壤桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物。見WO94/00977和美國專利5,591,616，兩者在此被引用作為參考。育種通過用SAR基因如一種形式的NIM1基因轉(zhuǎn)化得到的免疫調(diào)節(jié)植物可以是多種植物中的任何一種，包括單子葉植物和雙子葉植物；然而，用于本發(fā)明方法的免疫調(diào)節(jié)植物優(yōu)選地選自有農(nóng)業(yè)重要性的下文所列的靶作物。通過育種可以將所選形式的NIM1基因的表達(dá)與其它對(duì)生產(chǎn)和質(zhì)量有重要意義的特征融入一個(gè)植物品系。育種方法和技術(shù)為本領(lǐng)域熟知。如見WelshJ.R.植物遺傳學(xué)和育種基礎(chǔ)JohnWiley&amp;Sons，NY(1981)；作物育種，WoodD.R.(編輯)AmericanSocietyofAgronomyMadison，Wigconsin(1983)；MayoO.植物育種理論，第二版，ClarendonPressOxford(1987)；Singh，D.P.；疾病和害蟲抗性育種，Springer-Verlag；NY(1986)；以及Wricke和Weber，數(shù)量遺傳學(xué)和選擇植物育種，WaltercleGruyter和Co.，柏林(1986)。上述的通過基因工程方法整合到轉(zhuǎn)基因種子和植物中的遺傳學(xué)特征可通過有性繁殖和營養(yǎng)生長(zhǎng)傳遞，這樣可在后代植物中維持和繁殖。通常所說的維持和繁殖運(yùn)用了已知的為了適合特定目的發(fā)展的方法如耕地，播種或收獲。特殊的方法如水培或溫室技術(shù)也可應(yīng)用。因?yàn)樯L(zhǎng)的作物容易受到由昆蟲或侵染導(dǎo)致的攻擊或損壞以及要與雜草植物競(jìng)爭(zhēng)，所以要采取措施控制雜草，植物疾病，昆蟲，線蟲和其它不利條件以提高產(chǎn)量。這包括機(jī)械措施如土壤耕地，雜草或受侵染植物的去除，以及使用農(nóng)業(yè)化學(xué)藥品如除草劑，殺真菌劑，殺配子劑，殺線蟲劑，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，催熟劑和殺蟲劑。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物和種子的優(yōu)勢(shì)遺傳特征可通過植物育種得以利用，其目的是使培育的植物具有改良的特征如害蟲，除草劑或脅迫抗性，提高的營養(yǎng)價(jià)值，提高的產(chǎn)量或改良的結(jié)構(gòu)使由于倒伏或毀壞導(dǎo)致的損失減少。多種育種步驟都有明確規(guī)定的人的參與如選擇雜交品系，指導(dǎo)親本系的授粉或選擇合適的后代植物。根據(jù)希望的特征，采用不同的育種措施。相關(guān)技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知包括但不局限于雜交，近交，回交育種，多線育種，品種混合，種間雜交，非整倍體技術(shù)等。雜交技術(shù)也包括植物不育，通過機(jī)械的，化學(xué)的或生物化學(xué)手段產(chǎn)生雄性或雌性不育植物。一株雄性不育植物與不同品系的花粉之間授粉保證了雄性不育、雌性能育植物從雙方親本系中得到特征。這樣，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子和植物可用于改良植物品系的育種，即例如，提高傳統(tǒng)方法如除草劑或殺蟲劑的有效性或使其因?yàn)榫吒牧嫉倪z傳特征可以通過該方法傳播。替代地，可得到具有改良的脅迫抗性的新作物，由于其優(yōu)化的遺傳“裝備”，產(chǎn)生的產(chǎn)品比不能夠抵抗相同不利發(fā)育條件的作物的產(chǎn)品好。在種子生產(chǎn)中，發(fā)芽質(zhì)量和種子的均一性是基本的產(chǎn)品特征，而由農(nóng)場(chǎng)主收獲出售的種子的發(fā)芽質(zhì)量和均一性不重要。因?yàn)楹茈y使作物中沒有其它作物和雜草種子，控制來自種子的疾病，產(chǎn)生具有好的發(fā)芽質(zhì)量的種子，種子生產(chǎn)者已經(jīng)發(fā)展了十分廣泛和明確的種子生產(chǎn)實(shí)踐，它們?cè)谏L(zhǎng)，調(diào)理和出售純種子方面富有經(jīng)驗(yàn)。因此，對(duì)于農(nóng)場(chǎng)主來說，購買符合特定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)證實(shí)的種子而不使用從自己莊稼中收獲的種子是很常見的做法。用作種子的繁殖材料通常用保護(hù)劑包被處理，它包括除草劑，殺蟲劑，殺真菌劑，殺細(xì)菌劑，殺線蟲劑，殺軟體動(dòng)物劑或其混合物。通常使用的保護(hù)劑包被包括化合物如環(huán)己烯亞胺，萎銹靈，福美雙(TMTD)氨丙靈(氨丙靈)(Apron)和甲基嘧啶磷(Actellic)。如果希望的話，這些化合物可與制劑領(lǐng)域常用的進(jìn)一步的載體，表面活性物質(zhì)或促進(jìn)應(yīng)用的佐劑制成制劑以保護(hù)不受由細(xì)菌、真菌或有害動(dòng)物引起的損壞。保護(hù)劑包被可通過用液體制劑浸泡或濕的或干的制劑聯(lián)合包被進(jìn)行應(yīng)用。其它的應(yīng)用方法也是可能的，如直接處理芽或果實(shí)。本發(fā)明進(jìn)一步的方法是提供新的農(nóng)業(yè)方法，如上文列舉的，其特點(diǎn)是使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因植物材料或轉(zhuǎn)基因種子。這些的種子可包括合適的包裝材料在袋，容器或管內(nèi)提供，這個(gè)袋或容器能夠被封口以包含種子。這個(gè)包、容器、管可用于長(zhǎng)期，短期或既可長(zhǎng)期又可短期保存種子。合適的包裝材料的例子包括紙，諸如牛皮紙，堅(jiān)硬的或彈性塑料或其它聚合材料，玻璃或金屬。優(yōu)選的包，容器或管由多層相同或不同類型的包裝材料組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供的包、容器或管可以防止或限制水和潮氣接觸種子。在一個(gè)實(shí)施例中，封住包，容器或管的口，例如熱封口，以防止水或潮氣進(jìn)入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將吸水材料放在包裝材料之間或包裝材料附近。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過處理組成袋，容器或管的材料以限制，抑制疾病，污染或其它儲(chǔ)存或運(yùn)輸種子過程中的不利影響。這樣處理的一個(gè)例子是滅菌，如通過化學(xué)手段或通過射線照射。包含于本發(fā)明的是一個(gè)商品袋，它含有包含一種形式的NIM1基因或一種NIM蛋白的轉(zhuǎn)基因植物種子；NIM1基因在該轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)水平比在野生植物中的高，與種子一起的，還有合適的載體，還有標(biāo)簽說明它的應(yīng)用，可使植物產(chǎn)生廣泛的抗病性。將殺微生物劑應(yīng)用于免疫調(diào)節(jié)植物如在此處所描述的，保護(hù)植物的發(fā)明方法涉及兩個(gè)步驟首先，活化SAR途徑以提供免疫調(diào)節(jié)植物，第二，將殺蟲微生物應(yīng)用于此免疫調(diào)節(jié)植物以達(dá)到協(xié)同增強(qiáng)的抗病性。A傳統(tǒng)的殺微生物劑根據(jù)本發(fā)明的方法，任何商業(yè)上購買到的或殺微生物劑可應(yīng)用于通過上述三種途徑任何一種得到的免疫調(diào)節(jié)植物。合適的殺微生物劑的例子包括但不限于下述殺真菌劑4-[3-(4-氯苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙烯酰]嗎啉(“烯酰嗎啉”)(參考文獻(xiàn)C.Tomlin(編輯)殺蟲劑手冊(cè)，第10版，F(xiàn)arnhan，英國，1994第351-352頁)；5-甲基-1，2，4-三唑[3，4-b][1，3]苯并噻唑(“三環(huán)唑”)(參考文獻(xiàn)C.Tomlin(編輯)殺蟲劑手冊(cè)，第10版，F(xiàn)arnham，英國，1994，第1017-1018頁)；3-烯丙氧基-1，2-苯并噻唑-1，1-二氧化物(“烯丙基異噻唑”)(參考文獻(xiàn)C.Tomlin(編輯)殺蟲劑手冊(cè)，第10版，F(xiàn)arnham，英國，1994，第831-832頁)；α-[2-(4-氯苯基)乙基]-α-(1，1-二甲基乙基)-1H-1，2，4-三唑-1-乙醇(“戊唑醇”)(參考文獻(xiàn)EP-A-4345)；1-[[3-(2-氯苯基)-2-(4-氟苯)環(huán)氧乙烷-2-基]甲基]-1H-1，2，4-三唑(“環(huán)氧唑醇”)，(參考文獻(xiàn)EP-A-196038)；α-(4-氯苯基)-α-(1-環(huán)異丙基乙基)-1H-1，2，4-三唑-1-乙醇(“環(huán)唑醇”)(參考文獻(xiàn)美國4664696)；5-(4-氧苯基)-2，2-二甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-環(huán)戊醇(“葉菌唑”)(參考文獻(xiàn)EP-A-267778)；2-(2，4-二氯苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)-丙基-1，1，2，2-四氟乙基醚，(“氟醚唑”)(參考文獻(xiàn)EP-A-234.242)；甲基-(E)-2{2-[6-(2-氰苯氧基)嘧啶-4-基氧基]苯基}-3-甲氧丙烯酸鹽(“ICIA5504”，“azoxystrobin”)(參考文獻(xiàn)EP-A-382375)；甲基-(E)-2-甲氧亞氨基-2-(α-(O-甲苯氧基)-O-甲苯基]乙酸酯(“BAS490F”，“kresoximemethyl”)(參考文獻(xiàn)EP-A-400417)；2-(2-苯氧苯基)-(E)-2-甲氧亞氨基-N-甲基乙酰胺(參考文獻(xiàn)EP-A-398692)，[2-(2，5-二甲基苯氧甲基)-苯基]-(E)-2-甲氧亞氨基-N-甲基乙酰胺(參考文獻(xiàn)EP-A-398692)；(1R，3S/1S，3R)-2，2-二氯-N-[(R)-1-(4-氯(苯基)乙基]-1-乙基-3-甲基環(huán)丙烷甲酰胺(“KTU3616”)(參考文獻(xiàn)EP-A-341475)；乙撐雙(二硫代氨基甲酸)錳聚合體-鋅復(fù)合物；(“代森錳鋅”)(參考文獻(xiàn)美國2974156)；1-[2-(2，4-二氯苯基)-4-丙基-1，3-二氧戊環(huán)-2-亞甲基]1H-1，2，4-三唑；(“丙環(huán)唑”)(參考文獻(xiàn)GB-1522657)；1-{2-[2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基]-4-甲基-1，3-二氧戊環(huán)-2-基甲基)-H-1，2，4-三唑(惡醚唑”)(參考文獻(xiàn)GB-209860)；1-[2-(2，4-二氯苯基)戊基-1H-1，2，4-三唑(“戊菌唑”)(參考文獻(xiàn)(GB-1589852)；順-4-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]-2，6-二甲基嗎啉；(“丁苯嗎啉”)(參考文獻(xiàn)DE2752135)；1-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]哌啶(“苯銹啶”)(參考文獻(xiàn)DE2752135)；4-環(huán)丙基-6-甲基-N-苯基-2-嘧啶氨(“嘧菌環(huán)胺”)(參考文獻(xiàn)EP-A-310550)；(RS)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙?；?-丙氨酸甲酯(“氨丙靈”)(參考文獻(xiàn)GB-1500581)；(R)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙?；?-丙氨酸甲酯(“R-氨丙靈”)(參考GB-1500581)；1，2，5，6-四氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮(“咯喹酮”)(參考文獻(xiàn)GB-1394373)；磷酸氫乙酯(“乙磷鋁”)(參考文獻(xiàn)C.Tomlin(編輯)殺蟲劑手冊(cè)，第10版，F(xiàn)arnhan，英國，1994，第530-532頁)；和氫氧化銅(參考C.Tomlin(編輯)殺蟲劑手冊(cè)，第10版，F(xiàn)arnhan，英國，1994，第229-230頁)。所選的殺微生物劑優(yōu)選地與制劑技術(shù)中常用的進(jìn)一步的載體，表面活性劑或其它應(yīng)用刺激佐劑以組合物的形式應(yīng)用于被保護(hù)的免疫調(diào)節(jié)植物。合適的載體和佐劑可以是固體可以是液體，它們是制劑技術(shù)中常用的物質(zhì)，如天然的或再生的礦物質(zhì)，溶劑，分散劑，潤(rùn)濕劑，膠粘劑，加厚劑，粘合劑和肥料。使用殺微生物劑組合物優(yōu)選的方法是將其施用于植物的地上部分，尤其是施用于葉上(葉面施用)。施用的頻率和速率取決于病原體的生物的和氣候的生活條件。然而，如果植物的位點(diǎn)被液體制劑浸潤(rùn)(如水稻培養(yǎng))或殺微生物劑以固體形式，如以顆粒形式被引入土壤(土壤施用)，殺微生物劑可以通過土壤或通過水(系統(tǒng)作用)通過根滲透至整株植物。為了處理種子，殺微生物劑也可施用于種子(包被)，可通過用殺微生物制劑浸泡或用已經(jīng)合并的濕的或干的制劑包被塊莖或谷粒，將殺微生物劑施用于種子(包被)。另外，在特殊情況下，可采取其它可能的施用方法，例如處理芽或果實(shí)束。殺微生物劑可以未經(jīng)修飾的形式使用或優(yōu)選地，與制劑技術(shù)中常用的佐劑聯(lián)合使用，所以要以已知的方法制成，如可乳化的濃縮物，可包被的膏狀物，可直接噴灑或稀釋的溶液，稀釋的乳液，可潤(rùn)濕的粉末，可溶粉末，粉劑，顆粒體或在如多聚體物質(zhì)中膠囊化。根據(jù)組合物的性質(zhì)，與預(yù)期目的和大環(huán)境相一致，選擇施用方法諸如噴，噴霧，撒粉，散射，包被或傾注。殺微生物劑施用的優(yōu)勢(shì)比率通常為50g-2kg活性成分/公頃，優(yōu)選的是100g-1000g活性成分/公頃，特別是150g-700g活性成分/公頃，處理種子時(shí)，施用比率為每100kg種子0.5g-1000g，優(yōu)選地0.5g-100g活性成分。以已知方式制備制劑，如通過同源混合和/或用延展劑如溶劑，固體載體和若使用，表面活性化合物(表面活性劑)研磨殺微生物劑。合適的溶劑為芳香族碳?xì)浠衔?，?yōu)選地包括8-12碳原子的部分，如二甲苯氰混合物或替代的萘，氨甲酰苯甲酸，如鄰苯二甲酸二辛酯，脂族碳水化合物，如環(huán)己烷或石蠟，醇和甘油及其乙醚和酯，如乙醇，乙二醇，乙二醇單甲基或單乙基乙二醇醚，酮，如環(huán)己酮，強(qiáng)極性溶劑，如N-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基亞砜或二甲基甲酰胺以及植物油或環(huán)氧化植物油，如環(huán)氧化椰子油或大豆油；或水。固體載體，如用于粉劑和可分散的粉末的，通常是天然的礦物填料，諸如方解石，滑石，高嶺土，膠嶺石或硅鎂土。為了改善物理特性，有可能添加高度彌散的硅酸或高度彌散的吸收劑高分子。合適的顆粒吸附性載體是多孔型的，例如，輕石，碎磚，海泡石或皂土以及合適的非吸附型載體是，如方解石或沙。另外，可使用多種預(yù)顆?；臒o機(jī)和有機(jī)物質(zhì)，例如特別是白云石或磨碎的植物殘?jiān)?。根?jù)殺微生物劑的性質(zhì)，合適的表面活性復(fù)合物是具有好的乳化，分散和潤(rùn)濕特性的非離子，陽離子和/或陰離子表面活性劑。術(shù)語“表面活性劑”可被理解為包含表面活性劑的混合物。特別有優(yōu)勢(shì)的施用促進(jìn)佐劑是天然或合成的腦磷脂和卵磷脂系列的磷脂，如磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油和溶血卵磷脂。農(nóng)用化學(xué)藥品組合物通常包括0.1-99％，優(yōu)選地0.1-95％活性殺微生物成分，99.9-1％優(yōu)選地99.9-5％固體或液體佐劑和0-25％，優(yōu)選地0.1-2.5％表面活性劑。盡管商業(yè)產(chǎn)品優(yōu)選地制成濃縮液，最終使用者通常施用稀釋制劑。B植物活化的殺微生物劑如果殺微生物劑施用于通過上述的第二或第三條途徑獲得的免疫調(diào)節(jié)植物(選擇育種或遺傳工程)，它可以是SAR的化學(xué)誘導(dǎo)劑(植物活化的殺微生物劑)如苯并噻二唑化合物，異煙酸化合物或水楊酸化合物，它們描述于美國專利5,523,311和5,614,395中。因此，同時(shí)運(yùn)用了兩種免疫調(diào)節(jié)的方法。通過將植物活化的殺微生物劑施用于通過選擇育種途徑或遺傳工程途徑獲得的免疫調(diào)節(jié)植物，產(chǎn)生了“外-免疫調(diào)節(jié)”，獲得了協(xié)同增強(qiáng)的抗病性。如下文所述，過量表達(dá)NIM1的轉(zhuǎn)基因免疫調(diào)節(jié)植物比野生型植物對(duì)BTH的反應(yīng)更快而且對(duì)低得多的劑量的BTH發(fā)生反應(yīng)，這一點(diǎn)可以從PR-1基因表達(dá)和對(duì)寄生霜霉的抗性看出來。見實(shí)施例35和圖3的Northern印跡。僅僅施用10uMBTH就可在NIM1過量表達(dá)體中達(dá)到協(xié)同增強(qiáng)的抗病性，這個(gè)濃度正常情況下根本不足以發(fā)揮任何效力。通過利用協(xié)同作用，可以避免使用誘導(dǎo)SAR的正常情況下具植物毒性或不希望濃度的化學(xué)藥品。另外，如果SAR誘導(dǎo)化學(xué)藥品運(yùn)用對(duì)象已經(jīng)是免疫調(diào)節(jié)植物，如NIM1過量表達(dá)體，人們可以利用SAR活化的時(shí)間過程的改變。而且，達(dá)到給定的保護(hù)植物水平所需要的SAR誘導(dǎo)化學(xué)藥品量的減少也有一定的經(jīng)濟(jì)效益。C常規(guī)殺微生物劑與植物活化的殺微生物劑聯(lián)合應(yīng)用為了得到更大的抗病性，可將常規(guī)的殺微生物劑和植物活化的殺微生物劑同時(shí)施用于通過選擇育種途徑或遺傳工程途徑獲得的免疫調(diào)節(jié)植物。與單獨(dú)通過免疫調(diào)節(jié)，通過免疫調(diào)節(jié)和一種類型的殺微生物劑，或通過同時(shí)施用兩種類型的殺微生物劑(常規(guī)的和植物活化的)獲得的抗病性水平相比，這樣產(chǎn)生更高水平的協(xié)同抗病性。見，實(shí)施例19中的表35?？共⌒栽u(píng)估用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行抗病性評(píng)估。見，Uknes等(1993)分子植物微生物相互作用6680-685；Gorlach等(1996)植物細(xì)胞8629-643；Alexander等，美國國家科學(xué)院院報(bào)90；7327-7331(1993)。例如，下文描述了幾個(gè)典型的抗病性測(cè)定A寄生疫霉(phytophthoraparasitica)(黑脛病)抗性測(cè)定對(duì)導(dǎo)致黑脛病的微生物寄生疫霉的測(cè)定在按Alexander等美國國家科學(xué)院院報(bào)907327-7331(1993)描述的方法生長(zhǎng)的六周齡的植物上進(jìn)行。把植物弄濕，令其干透，然后向土壤中接種10ml孢子囊懸液(300孢子囊/ml)。將接種的植物置于溫室中，保持白天溫度23-25℃，夜晚溫度20-22℃。測(cè)定萎蔫病的標(biāo)準(zhǔn)為0＝無癥狀；1＝無癥狀；1＝有某些萎蔫的癥狀，膨脹度降低；2＝明顯的萎蔫癥狀；沒有腐爛或矮化；3＝明顯的萎蔫癥狀，矮化，無明顯的莖腐爛；4＝嚴(yán)重萎蔫，可見莖腐爛和根系統(tǒng)的某些損傷；5＝同4，但植物接近死亡或死亡，嚴(yán)重的根系統(tǒng)減退。所有的測(cè)定是在隨機(jī)設(shè)計(jì)安排的植物上進(jìn)行的。B丁香假單胞菌抗性測(cè)定將濃度為每ml含106或3×106的丁香假單胞菌煙草病變種#551株的水溶液注射到幾株6-7周齡植物的兩片較低葉片上。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量6株植物。以5個(gè)點(diǎn)疾病嚴(yán)重性對(duì)煙草野火病假單胞菌侵染的植物評(píng)級(jí)，5＝100％死組織，0＝無癥狀。對(duì)每天的評(píng)估進(jìn)行T檢驗(yàn)(LSD)，在平均疾病評(píng)級(jí)值后標(biāo)明組別。在評(píng)估當(dāng)天的數(shù)值后有同樣字母的數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有明顯差異。C煙草尾孢(Cercosporanicotianae)抗性測(cè)定將煙草尾孢(ATCC#18366)的孢子懸液(100,000-150,000個(gè)孢子/ml)噴到葉子的表面直至流出，將植物在100％濕度下維持5天。然后每天用水霧噴灑植物5-10次。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)6株植物。根據(jù)表現(xiàn)病癥的葉片面積百分?jǐn)?shù)對(duì)煙草尾孢進(jìn)行評(píng)級(jí)。對(duì)每天的評(píng)估進(jìn)行T-檢驗(yàn)(LSD)，在平均疾病評(píng)級(jí)值后標(biāo)明組別。在評(píng)估當(dāng)天的數(shù)值后有同樣字母的數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)據(jù)上沒有明顯差異。D寄生霜霉抗性測(cè)定按Uknes等(1993)所描述的在植物上進(jìn)行寄生霜霉抗性測(cè)定。通過噴灑分生孢子懸液(約5×104個(gè)孢子/ml)給植物接種競(jìng)爭(zhēng)性寄生霜霉分離物。接種的植物在具有14小時(shí)日照/10小時(shí)黑暗周期的生長(zhǎng)室內(nèi)于17℃一定濕度條件下生長(zhǎng)。在接種后3-14天，優(yōu)選地7-12天檢測(cè)植物上分生孢子梗的存在。另外，隨機(jī)選擇每項(xiàng)處理的幾株植物進(jìn)行乳酚臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行顯微檢查(Keogh等，TransBr.MycolSoc.74329-333(1980))。附圖簡(jiǎn)述圖1是NIM1蛋白序列與小鼠、大鼠和豬的IκBα的序列對(duì)比。序列上方垂直線代表NIM1和IκBα序列之間的氨基酸是相同的(矩陣值＝1.5)；序列上方的雙點(diǎn)()代表相似值＞0.5；序列上方的單點(diǎn)(·)代表相似值＜0.5但大于＞0.0；數(shù)值＜0.0表示無相似性序列上方并且沒有標(biāo)記(見實(shí)施例)。根據(jù)deMartin等，基因152，253-255(1995)確定了哺乳動(dòng)物IκBα錨蛋白區(qū)的位置。序列內(nèi)的點(diǎn)代表了NIM1和IκBα蛋白之間的缺口。通過序列下面斷線指示了IκBα中的五個(gè)錨蛋白重復(fù)。根據(jù)NIM1蛋白標(biāo)出了氨基酸的數(shù)目，在適當(dāng)?shù)牡胤揭肴笨?。加?hào)(+)被放在序列上方每10個(gè)氨基酸外。圖2是NIM1蛋白區(qū)域(數(shù)字相當(dāng)于SEQIDNO2中氨基酸位置)和水稻EST蛋白產(chǎn)物(SEQIDNO17-24)的氨基酸序列比較。圖3代表了Northern分析的結(jié)果，表明用水或BTH處理后，PR-1基因在野生型和NIM1過量表達(dá)株系中表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。按實(shí)施例中描述的方法從經(jīng)處理的植物制備和分析RNA?！癢s”為野生型擬南芥Ws生態(tài)型?！?A”，“5B”“6E”和“7C”是根據(jù)實(shí)施例21制備的獨(dú)立的NIM1過量表達(dá)植物株系?！?BTH”是以水處理；“10BTH”是以10μMBTH處理；“100BTH”是以100μMBTH處理。“0”是第0天的對(duì)照樣品；“1”，“3”和“5”是第1，3和5天的樣品。序列表中序列簡(jiǎn)述SEQIDNO1是包含野生型擬南芥NIM1基因編碼區(qū)的5655bp基因序列。SEQIDNO2是由SEQIDNO1的編碼序列編碼的野生型擬南芥NIM1蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO3是圖1中的小鼠IκBα氨基酸序列。SEQIDNO4是圖1中大鼠IκBα氨基酸序列。SEQIDNO5是圖1中豬IκBα氨基酸序列。SEQIDNO6是擬南芥NIM1基因的cDNA序列。SEQIDNO7和8分別是NIM1蛋白的顯性失活形式的DNA編碼序列和編碼的氨基酸序列，此蛋白的第55和59位氨基酸是丙氨酸而不是絲氨酸。SEQIDNO9和10分別是N末端刪除的NIM1蛋白的顯性失活形式的DNA編碼序列和編碼的氨基酸序列。SEQIDNO11和12分別是C末端刪除的NIM1蛋白的顯性失活形式的DNA編碼序列和編碼的氨基酸序列。SEQIDNO13和14分別是N末端和C末端都刪除的顯性失活形式的NIM1基因的DNA編碼序列和編碼的氨基酸序列。SEQIDNO15和16分別是NIM1錨蛋白區(qū)域的DNA編碼序列和編碼的氨基酸序列。SEQIDNO17是圖2中水稻-1氨基酸序列33-155。SEQIDNO18是圖2中水稻-1氨基酸序列215-328。SEQIDNO19是圖2中水稻-2氨基酸序列33-155。SEQIDNO20是圖2中水稻-2氨基酸序列208-288。SEQIDNO21是圖2中水稻-3氨基酸序列33-155。SEQIDNO22是圖2中水稻-3氨基酸序列208-288。SEQIDNO23是圖2中水稻-4氨基酸序列33-155。SEQIDNO24是圖2中水稻-4氨基酸序列215-271。SEQIDNO25-32是寡核苷酸引物。定義下列定義將有助于理解本發(fā)明植物細(xì)胞植物的結(jié)構(gòu)和生理結(jié)構(gòu)，是由原生質(zhì)體和細(xì)胞壁組成。術(shù)語“植物細(xì)胞”指植物的一部分細(xì)胞或來自植物的細(xì)胞。某些細(xì)胞的例子包括是活細(xì)胞一部分的分化細(xì)胞；培養(yǎng)的分化細(xì)胞；培養(yǎng)的未分化細(xì)胞；未分化組織諸如愈傷組織或腫瘤的細(xì)胞；種子，胚胎，繁殖體和花粉的分化細(xì)胞。植物組織組織成結(jié)構(gòu)和功能單位的一群植物細(xì)胞。包括植物或培養(yǎng)的任何組織。這個(gè)術(shù)語包括但不限于整體植物，植物器官，植物種子，組織培養(yǎng)或組織成結(jié)構(gòu)和/或功能單位的任何植物細(xì)胞群。此術(shù)語與上述的任何特殊類型的植物組織或由此定義包含的任何特殊類型的植物組織聯(lián)合使用或單獨(dú)使用并不是要排除任何其它類型的植物組織。原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞。后代植物以有性方式或無性方式產(chǎn)生的未來世代植物，包括但不限于子代植物。轉(zhuǎn)基因植物在基因組內(nèi)穩(wěn)定整合了重組DNA的植物。重組DNA將不同來源的或用重組DNA技術(shù)制備的DNA片段連接形成的任何DNA分子。重組DNA技術(shù)體外制備重組DNA和將重組DNA轉(zhuǎn)入它可以表達(dá)或繁殖的細(xì)胞的技術(shù)(見，生物醫(yī)學(xué)和分子生物簡(jiǎn)明詞典，Juo編輯，CRC出版社BocaRaton(1996))，例如，以多種形式將DNA轉(zhuǎn)移至原生質(zhì)體或細(xì)胞，DNA包括(1)環(huán)形，線形或超螺旋形的裸露DNA，(2)包含于核小體或染色體或細(xì)胞核或其植物的DNA，(3)與其它分子復(fù)合或相關(guān)的DNA，(4)包含于脂質(zhì)體，原生質(zhì)球，細(xì)胞或原生質(zhì)體中的DNA或(5)轉(zhuǎn)自宿主以外的生物的DNA(如根瘤土壤桿菌)。這些和其它多種將重組DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域所熟知；可以用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物。重組DNA技術(shù)也包括可用于提高單子葉植物中過氧化物酶活性的Treco等，WO94/12650和Treco等，WO95/31560中描述的同源重組方法。特別是，調(diào)節(jié)區(qū)(如啟動(dòng)子)可以被轉(zhuǎn)入植物基因組中以提高外源過氧化物酶的表達(dá)。重組DNA技術(shù)也包括將缺乏選擇表達(dá)信號(hào)的過氧化物酶編碼序列插入單子葉植物并分析由于單子葉植物中的外源控制序列，轉(zhuǎn)基因單子葉植物中過氧化物酶的表達(dá)提高。這將導(dǎo)致植物內(nèi)過氧化物酶編碼序列拷貝數(shù)的升高。根據(jù)傳統(tǒng)植物育種方法而不是此處描述的技術(shù)方法，最初將重組DNA插入R0植物的基因組不被定義為完成。在最初的插入后，用基本的傳統(tǒng)的育種方法可以繁殖轉(zhuǎn)基因后代。嵌合基因包含至少兩個(gè)異源部分的DNA分子，即來自預(yù)先存在的DNA序列的部分不與其預(yù)先存在狀態(tài)相關(guān)，優(yōu)選地通過重組DNA技術(shù)制備這些序列。表達(dá)盒包含在啟動(dòng)子和終止子之間可以插入編碼序列的DNA分子。編碼序列DNA分子，轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)導(dǎo)致多肽或蛋白形成。基因包括負(fù)責(zé)控制表達(dá)即轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控DNA序列和編碼序列的不連續(xù)的染色體區(qū)域，當(dāng)轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)，此編碼序列產(chǎn)生了獨(dú)特的多肽或蛋白。acd加速細(xì)胞死亡的突變體植物AFLP擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性avrRpt2毒性基因Rpt2，從丁香假單胞菌分離BAC細(xì)菌人工染色體BTH苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯CIM組成型免疫表型(SAR組成型地活化)cim組成型免疫突變植株cM厘摩cprlPR基因突變體植株的組成型表達(dá)體Col-O擬南芥生態(tài)型ColumbiaECs酶組合Emwa與擬南芥Ws-O生態(tài)型相容的寄生霜霉分離物EMS甲基磺酸乙酯INA2，6-二氯異煙酸Ler擬南芥生態(tài)型Landsbergerectalsd損傷刺激疾病突變植株nahG將水楊酸轉(zhuǎn)變成兒茶酚的水楊酸羥化酶惡臭假單胞菌NahG用nahG基因轉(zhuǎn)化的擬南芥株系ndr非種特異性的抗病性突變植株nim非誘導(dǎo)免疫突變植株NIM1野生型基因，參與SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)NIM1野生型NIM1基因編碼的蛋白nim1NIM1的突變等位基因，使植物對(duì)疾病易感；也指具有NIM1的nim1突變等位基因的擬南芥突變植株Noco與擬南芥Col-O生態(tài)型相容的寄生霜霉分離物ORF開放讀碼框架PCs引物組合PR病理相關(guān)的SA水楊酸SAR系統(tǒng)獲得性抗性SAR-onSAR活化的免疫調(diào)節(jié)植物，通常比野生型SAR基因表達(dá)高并具有抗病性表型SSLP簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性UDS普遍疾病易感表型Wela與擬南芥Weiningen生態(tài)型相容的寄生霜霉分離體Ws-O擬南芥生態(tài)型IssilewskijaWT野生型YAC酵母人工染色體實(shí)施例通過下文詳細(xì)的方法、配方和實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例只是為了說明而不是限制本發(fā)明的范圍。此處所采用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知；Sambrook等分子克隆，編輯，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989)，T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist.基因融合實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港；紐約(1984)以及AusubelF.M.等，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)GreenePublishingAssoc和Wiley-Interscience(1987)中也描述了這些技術(shù)。I.將系統(tǒng)獲得性抗性化學(xué)誘導(dǎo)劑與常規(guī)殺微生物劑聯(lián)合施用于植物產(chǎn)生的協(xié)同抗病性效果在這組實(shí)施例中，通過運(yùn)用SAR化學(xué)誘導(dǎo)劑如苯并噻二唑誘導(dǎo)植物的SAR。另外，常規(guī)的殺微生物劑也施用于這些植物。然后使植物接受來自各種病原體的致病壓力。兩種抵抗病原體的方法聯(lián)合應(yīng)用(誘導(dǎo)化學(xué)品+殺微生物劑)產(chǎn)生比加合作用大的效應(yīng)即協(xié)同抗病性。這通過增效倍數(shù)(SF)來決定，即觀察到的效果(O)與期望效果(E)的比率。給定的活性成分聯(lián)合作用的期望效果(E)可通過所謂的Colby公式來描述，按下述方法計(jì)算(Colby，S.R.“計(jì)算除草劑聯(lián)合作用的協(xié)同和拮抗反應(yīng)”雜草，第15卷，第20-22頁(1967))ppm＝每升噴灑混合物中活性成分(＝a.i.)毫克數(shù)X＝由活性成分I以pppm活性成分施用時(shí)產(chǎn)生的作用百分?jǐn)?shù)，Y＝由活性成分II以qppm活性成分施用時(shí)產(chǎn)生的作用百分?jǐn)?shù)，E＝由活性成分I+II以p+qppm活性成分施用時(shí)產(chǎn)生的預(yù)期效果(加性作用)。Colby公式為E=X+Y-X&times;Y100]]>實(shí)施例1在大麥上對(duì)禾白粉菌的作用剩余保護(hù)作用用水性噴灑混合物(最高為0.02％活性成分)噴灑約8cm高的大麥植物達(dá)到葉尖滴水的程度，3-4天后用真菌的分生孢子噴植物。被侵染的植物生長(zhǎng)于22℃溫室中。通常侵染10天后評(píng)價(jià)真菌的侵染。系統(tǒng)作用用水性噴灑混合物(最高為0.002％活性，取決于土壤的體積)澆灌8cm高的大麥植物。小心噴灑混合物使之不能接觸植物的地上部分。3-4天后用真菌的分生孢子噴植物。被侵染的植物生長(zhǎng)于22℃溫室中。通常在侵染后10天評(píng)估真菌的侵染。表1大麥上抵抗白禾粉菌的作用成分I苯并噻二唑-7-羧酸成分II葉菌唑>表2大麥上抵抗白禾粉菌的作用成分I苯并噻二唑-7-羧酸成分II氟醚唑表3在大麥上對(duì)白禾粉菌的作用成分I苯并{1，2，3}噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II葉菌唑?qū)嵤├?黃瓜上抵抗胡蘆科毛盤孢(Colletotrichumlagenarium)的作用培養(yǎng)10-14天后，用從可潤(rùn)濕的檢測(cè)化合物粉劑制備的噴灑混合物噴灑黃瓜植株。3-4天后，用真菌的孢子懸液(1.0×105孢子/ml)侵染植物，在高濕度下于23℃培養(yǎng)30小時(shí)。然后在常規(guī)濕度下于22-23℃繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)真菌侵染，侵染7-10天后評(píng)估保護(hù)作用。培養(yǎng)10-14天后，通過土壤施用的方法，用從可潤(rùn)濕的檢測(cè)化合物粉劑制備的噴灑混合物噴灑黃瓜植物。3-4天后，用真菌的孢子懸液(1.5×105孢子/ml)侵染植物，在高濕度下于23℃培養(yǎng)30小時(shí)。然后在常規(guī)濕度下于22℃繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)真菌的侵染，侵染7-10天后評(píng)估保護(hù)作用。表4黃瓜/葉面施用抵抗胡蘆科毛盤孢的作用成分I苯并噻二唑-7-羧酸成分IIazoxystrobin表5黃瓜/土壤施用抵抗胡蘆科毛盤孢的作用成分I苯并噻二唑-7-羧酸成分IIazoxystrobin*增效倍數(shù)不能計(jì)算表6黃瓜/葉面施用抵抗葫蘆科毛盤孢的作用成分I苯并噻二唑-7-羧酸成分IIkresoximemethyl表7黃瓜/葉面施用抵抗葫蘆科毛盤孢的作用成分I苯并{1，2，3}噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分IIazoxystrobin表8黃瓜/土壤施用抵抗葫蘆科毛盤孢的作用成分I苯并{1，2，3}噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分IIazoxystrobin實(shí)施例3煙草植物上抵抗煙草尾孢的作用用檢測(cè)化合物(濃度最大值為0.02％活性成分)的制劑溶液噴灑煙草植物(6周齡)。處理后4天，用煙草尾孢(150,000孢子/ml)孢子囊懸液接種植物，在高濕度下放置4-5天后在常規(guī)的光照/黑暗節(jié)律進(jìn)一步培養(yǎng)。根據(jù)侵染了真菌的葉表面評(píng)估實(shí)驗(yàn)中的癥狀。表9在煙草植物上對(duì)煙草尾孢的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II戊唑醇表10煙草植物上抵抗煙草尾孢的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II環(huán)唑醇表11煙草植物上抵抗煙草尾孢的作用成分I苯并噻二唑-7-羧酸成分II丁苯嗎啉表12煙草植物上煙草尾孢的作用成分I苯并噻二唑-7-羧酸成分II惡醚唑?qū)嵤├?在水稻植物上對(duì)Pyriculariaoryzae的作用將兩周齡的水稻植物連同其根周圍的土壤一起放在裝有噴灑混合物(最大值0.006％活性成分)的容器中。96小時(shí)后，用此真菌的分生孢子懸液侵染水稻植物。在95-100％相對(duì)濕度下于24℃培養(yǎng)被侵染植物5天后評(píng)估真菌的侵染。表13水稻植株上抵抗Pyriculariaoryzae的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-羧酸-S-甲酯成分IIKTU3616在一塊12m2的土地上，用從可潤(rùn)濕的活性成分粉制成的噴灑混合物噴灑水稻植物，自然侵染。侵染后44天測(cè)量被真菌侵染的葉的面積進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果如下表14大田水稻植株上抵抗Pyriculariaoryzae的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II咯喹酮將兩周齡的水稻植物連同其根周圍的土壤一起放在裝有噴灑混合物的容器中。36天后評(píng)估真菌侵?jǐn)_。未經(jīng)處理的植物的侵染作用百分?jǐn)?shù)為0。表15水稻植株上抵抗Pyriculariaoryzae的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II三環(huán)唑?qū)嵤├?在辣椒上對(duì)Colletotrichum屬種類(碳疽病)和Cercospora屬種類(葉斑病)的作用對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量的作用在約10m2的土地上(試驗(yàn)位置Cikampek，Java，Indonesia)，以每公頃500-700升的量對(duì)植物噴灑噴灑混合物總共7次，間隔約7天。首次噴灑3天后，用真菌人工侵染植物。表16抵抗毛盤孢屬的作用通過分析第五次噴灑后對(duì)辣椒果實(shí)的侵染進(jìn)行評(píng)估成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II代森錳鋅表17抵抗尾孢屬的作用通過分析第六次噴灑后對(duì)葉子的侵染進(jìn)行評(píng)估成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II代森錳鋅表18對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量的作用第六次噴灑后收獲辣椒。成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II代森錳鋅實(shí)施例6小麥中抵抗隱匿柄銹菌的作用用從制成的活性成分制備的噴灑混合物或活性成分的組合噴灑7日齡的小麥植物至滴水葉尖。4天后，用此真菌分生孢子懸液侵染被處理的植物，隨后被處理的植物于相對(duì)濕度90-100％下在20℃培養(yǎng)兩天。侵染后10天，評(píng)估真菌侵染。表19小麥中抵抗隱匿柄銹菌的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II丙環(huán)唑表20小麥中抵抗隱匿柄銹菌的作用成分I苯并噻二唑-7-羧酸成分II苯銹啶實(shí)施例7在小麥中對(duì)禾白粉菌的作用在田間試驗(yàn)中(10m2)，用從可潤(rùn)濕的活性成分粉末制備的噴灑混合物噴灑處于生長(zhǎng)期的冬小麥。自然侵染，侵染后10天評(píng)估真菌侵染。得到了下列結(jié)果表21小麥中抵抗禾白粉菌的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II丙環(huán)唑表22小麥中抵抗禾白粉菌的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分IIcyprodinil實(shí)施例8在香蕉中對(duì)Mycosphaerellafijiensis的作用用從可潤(rùn)濕的活性成分粉劑制成的噴灑混合物以17-19天的間隔噴灑300m2土地上的40棵香蕉植物，總共6次。自然侵染。測(cè)量真菌侵染的葉子進(jìn)行評(píng)估。得到了下列結(jié)果表23香蕉中抵抗Mycosphaerellafijiensis的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II丙環(huán)唑<實(shí)施例9在蕃茄中對(duì)馬鈴薯早疫病鏈格孢的作用用從可潤(rùn)濕的活性成分粉末制備的噴灑混合物以7天間隔噴灑7m2土地上的蕃茄植物，總共9次。自然侵染。測(cè)量真菌侵染的葉子進(jìn)行評(píng)估。得到了下列結(jié)果表24大田中的蕃茄中抵抗馬鈴薯早疫病鏈格孢的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分IIcyprodinil實(shí)施例10在蕃茄中對(duì)致病疫霉的作用用從可潤(rùn)濕的活性成分粉末制備的噴灑混合物或活性成分組合噴灑蕃茄植物“RoterGnom”至葉尖滴水。4天后以真菌孢子囊懸液噴灑處理的植物，隨后在相對(duì)空氣濕度90-100％于18-20℃在小室中培養(yǎng)兩天。侵染5天后評(píng)估真菌侵染。得到了下列結(jié)果表25蕃茄上抵抗致病疫霉的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II氨丙靈表26蕃茄中抵抗致病疫霉的作用成分I苯并噻二唑-7-羧酸成分II氨丙靈實(shí)施例11黃瓜中抵抗古巴假霜霉的作用用從可潤(rùn)濕的活性成分粉末制備的噴灑混合物或活性成分組合噴灑16-19天齡的黃瓜植物(“Wisconsin”)至葉尖滴水。4天后用古巴假霜霉(365株，Ciba；最大值5000個(gè)/毫升)孢子囊侵染處理的植物，隨后在相對(duì)空氣濕度70-90％下于18-20℃培養(yǎng)1-2天。侵染后10天評(píng)估真菌侵染并與未處理植物的侵染進(jìn)行比較。得到下列結(jié)果表27黃瓜中抵抗古巴假霜霉的作用成分I苯并噻二唑-7-羧酸成分II氨丙靈實(shí)施例12煙草植株上抵抗煙草霜霉菌的作用用檢測(cè)組合物制成的溶液噴灑煙草植物(6周齡)。處理4天后用真菌的孢子囊懸液接種植物，于高濕度下培養(yǎng)4-5天然后繼續(xù)以正常光照/黑暗節(jié)律順序繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)被真菌侵染的葉面評(píng)估試驗(yàn)中的癥狀。未處理植物的侵染作用百分?jǐn)?shù)為0。表28煙草植株上抵抗煙草霜霉菌的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II烯酰嗎啉實(shí)施例13擬南芥中抵抗寄生霜霉的作用將殺真菌劑氨丙靈，乙磷鋁和氫氧化銅以及SAR激活劑苯并(1，2，3)-噻二唑-7羥酸S-甲酯(BTH)與可潤(rùn)濕的粉末載體分別制成25％，80％，70％和25％的活性成分，它們以精細(xì)塵粉的形式施用于三周齡的植物上。單獨(dú)施用可潤(rùn)濕的粉末作為對(duì)照。三天后，按Delaney等(1995)描述的方法以寄生霜霉分生孢子懸液接種植物。用可相容的寄生霜霉分離物Emwa(1-2×105孢子/m)接種Ws植物；以可相容的寄生霜霉分離物Noco2(0.5-1×105孢子/ml)接種Col植物。接種后，覆蓋植物以維持高的濕度，并將之放置在17℃的具有14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗循環(huán)的生長(zhǎng)室內(nèi)(Uknes等，1993)。接種8周后收獲組織。通過在解剖顯微鏡下對(duì)分生孢子的發(fā)育進(jìn)行評(píng)級(jí)，跟蹤真菌侵染進(jìn)程12天(Delaney等(1994)；Dietrich等(1994))。對(duì)單獨(dú)葉片進(jìn)行乳酚臺(tái)盼藍(lán)染色以觀察葉組織內(nèi)真菌的生長(zhǎng)。用NS1和NS2作引物，寄生霜霉EmWaDNA作為模板根據(jù)White等(1990，PCR方法，方法和應(yīng)用指南，第315-322頁)的方法進(jìn)行PCR得到的rRNA真菌探針對(duì)真菌生長(zhǎng)進(jìn)行定量。以酚/氯仿抽提后氯化鋰沉淀的方法從冰凍組織中純化RNA(Lagrimini等，1987美國國家科學(xué)院院報(bào)，847542-7546)。根據(jù)Ausbel等1987)描述，通過甲醛瓊脂糖凝膠電泳分離樣品(7.5μg)并將分離的樣品轉(zhuǎn)移至尼龍膜上(Hybond-N+，Amersham)。根據(jù)Church和Gilbert(1984，美國國家科學(xué)院院報(bào)，811991-1995)的方法進(jìn)行雜交和洗滌。根據(jù)廠商說明用PhosphorImager(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)測(cè)定轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)量。通過以組成型表達(dá)b-微管擬南芥cDNA探測(cè)條狀濾紙進(jìn)行樣品上樣標(biāo)準(zhǔn)化。未處理的植物侵染的真菌生長(zhǎng)抑制為零。得到了下列結(jié)果表29擬南芥(Col-O)中抵抗寄生霜霉NoCo2的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II氨丙靈<tablesid="table29"num="029"><tablewidth="670">測(cè)試號(hào)成分真菌生長(zhǎng)抑制％增效倍數(shù)O/EBTH氨丙靈O(觀測(cè)值)E(預(yù)測(cè)值)對(duì)照----010.01mM--02--0.1mg/l030.01mM0.1mg/l40.70∞</table></tables>表30擬南芥(Ws)中抵抗寄生霜霉Emwa的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II氨丙靈表31擬南芥(Ws)中抵抗寄生霜霉Emwa的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II乙磷鋁表32擬南芥(Ws)中抵抗寄生霜霉Emwa的作用成分I苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯成分II氫氧化銅從表29中可以看出，野生型擬南芥Col-O植物中表現(xiàn)出了協(xié)同抗病性作用。通過將0.01mMBTH或0.0001g/L氨丙靈單獨(dú)施用于植物未觀察到真菌生長(zhǎng)抑制，因?yàn)檫@些濃度在正常情況下不足以有效力。然而，以正常情況不足濃度的兩種化合物同時(shí)施用，觀察到40.7％的真菌生長(zhǎng)抑制，很明顯是協(xié)同效應(yīng)。表30-32表示了野生型擬南芥Ws植物中的協(xié)同抗病性效應(yīng)。將0.01mMBTH施用于Ws植物，只能觀察到20-30％的真菌生長(zhǎng)抑制。然而，同時(shí)將BTH和氨丙靈，乙磷鋁或氫氧化銅同時(shí)施用于植物，可觀察到協(xié)同抗病性。聯(lián)合抗真菌效應(yīng)降低了控制病原體所需的殺真菌劑和13TH有效濃度，從而減少了阻止真菌生長(zhǎng)所需的化學(xué)劑量，所以可以緩和由于化學(xué)耐受導(dǎo)致了的葉破壞。II通過將常規(guī)殺微生物劑和/或系統(tǒng)獲得性抗性化學(xué)誘導(dǎo)劑施用于組成型免疫(CIM)突變植物獲得的協(xié)同抗病性效應(yīng)在這組實(shí)施例中，發(fā)展了高流通量的Northern印跡篩選鑒定在正常生長(zhǎng)中具有高濃度PR-1mRNA的突變植物，認(rèn)為這些突變植物也表現(xiàn)系統(tǒng)獲得性抗性。用這種篩選獲得了大量突變體；它們不僅表現(xiàn)出PR-1的積累而且也表現(xiàn)出PR-2和PR-5mRNA的積累(Lawton等(1993)；Dietrich等(1994)及Weymann等(1995)。這些突變體中SA水平升高，抵抗病原體侵染，證實(shí)這種方法可用于分離SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體。用這種篩選分離到了兩組SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體。一組被命名為lsd突變體(lsd＝損傷刺激疾病)。此組突變體在WO94/16077中公開為“cim組I”，此公開在此引用作為參考。lsd組(akacimI組)在葉子上自發(fā)形成損傷，積累高濃度的SA，高水平的PR-1，PR-2和PR-5mRNA，對(duì)真菌和細(xì)菌病原體有抗性(Dietrich等，1994；Weymann等，1995)。第二組，被稱為cim(cim＝組成型免疫)在下文有所描述具有除自發(fā)損傷以外所有的lsd突變體的特征。第二組(cim)相當(dāng)于WO94/16077公開的“cim組II”突變體。下文描述的cim3突變植物系屬于cim組(cim組II)是顯性突變，其野生型表型為表達(dá)穩(wěn)定的高水平的SA，SAR基因mRNA并具有廣泛的抗病性。實(shí)施例14具有組成型SAR基因表達(dá)的cim突變體的分離和鑒定將1100個(gè)單獨(dú)的M2誘變(EMS)擬南芥植物生長(zhǎng)于Aracon盤中(lehleseeds，RoundRock，TX)生長(zhǎng)，每組約100個(gè)。按上述Uknes等，1993描述的方法培養(yǎng)植物，特別注意避免過度澆水和病原體侵染。簡(jiǎn)而言之，用水飽和MetroMix360并以10升為一組高壓滅菌3次70分鐘。每次高壓滅菌之間充分?jǐn)嚢栎d種混合物。將種子置于20％(lorox中5分鐘進(jìn)行消毒，在播種前用消毒水洗7次。將播種的種子春化3-4天后以9小時(shí)白晝15小時(shí)夜晚的周期于22℃在房中培養(yǎng)。當(dāng)植物長(zhǎng)至三至四周齡時(shí)，收獲1至2片50-100mg重的葉子，用快的微量RNA制備方法分離總RNA(Verwoerd等(1989)核酸研究17，2362)。通過Norther印跡分析分析PR-1基因表達(dá)(Lagrimini等(1987)，美國國家科學(xué)院院報(bào)84，7542-7546；Ward等，1991)。每一組植物包括未經(jīng)處理的和以INA處理(0.25mg/m)兩天的擬南芥作為對(duì)照。所有植物的維持按照Weymann等(1995)所述進(jìn)行。鑒定了80株可能積累高水平PR-1mRNA的突變體。對(duì)其后代進(jìn)行試驗(yàn)，挑選了5株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。在沒有病原體或誘導(dǎo)處理的情況下，假定的cim突變體SAR基因表達(dá)升高。對(duì)假定cim突變體后代試驗(yàn)證實(shí)組成型的PR-1表達(dá)是可以遺傳的。在cim突變體中，cim2和cim3水平是最高的，進(jìn)一步鑒定了最穩(wěn)定的PR-1表達(dá)。用隱性無毛性狀作為鑒定F1子代的標(biāo)記與Columbia進(jìn)行回交。在花粉散布前去掉Col-g11花芽，立即和施用來自突變體的花粉F1植物在土壤中生長(zhǎng)，通過香花簇的出現(xiàn)鑒定異型雜交植物。cim2和cim3與生態(tài)型Col-O或La-er雜交后，鑒定到大部分的SAR基因高表達(dá)的F1植物，表明這些性狀是顯性的。對(duì)于cim2而言，有些而不是全部F1植物組成型表達(dá)SAR基因。如果cim2突變體是顯性的而且以雜合子的形式存在親本中，才可期望得到這樣的結(jié)果。cim2進(jìn)一步的遺傳試驗(yàn)表明F2代中有連續(xù)可變分離，這與不完全顯性一致。cim3在F1代中表現(xiàn)出1∶1分離，兩個(gè)表達(dá)高水平PR-1mRNA的F1植物自交產(chǎn)生F2群體。通過對(duì)PR-1mRNA積累劃分等級(jí)，F(xiàn)2分離為93株F2植物高表達(dá)PR-1mRNA，52株F2植物沒有明顯的PR-1mRNA積累，比率為3∶7∶1(C2＝1.77；0.5＞P＞0.1)，這與cim3是顯性單基因突變的假設(shè)相一致。隨后的異型雜交證實(shí)cim3作為顯性突變遺傳。對(duì)于cim3而言，在篩選中鑒定的最初M2植物和M3群體看上去正常。然而，因?yàn)閏im植物是自交的，某些表達(dá)最好的品系受精能力較低。與Col-gll回交后得到了具有正常表現(xiàn)和受精能力以及PR-1表達(dá)強(qiáng)的植物最初鑒定時(shí)，cim3稍微有些矮；而且有薄而變形的葉子。然而，與野生型Col-gl雜交產(chǎn)生的F2植物保留了SAR基因高表達(dá)，而且不能與野生型植物區(qū)分。這表明矮的變性的表型是由與組成型SAR基因表達(dá)無關(guān)的獨(dú)立突變引起的。當(dāng)植物在無菌條件下生長(zhǎng)時(shí)，也可觀察到cim3突變表型，證實(shí)了PR-1mRNA積累不是由病原體引起。實(shí)施例15SARA基因表達(dá)除PR-1之外，cim3也高表達(dá)另外兩種SAR基因，PR-2和PR-5。后代中SAR基因表達(dá)水平不同，但總比未被處理的對(duì)照高10倍，與經(jīng)抗性誘導(dǎo)的INA(0.25mg/ml)處理野生型植物得到的水平相似。實(shí)施例16水楊酸分析病原體誘導(dǎo)擬南芥壞死后，內(nèi)源性SA濃度升高(Uknes等，1993，上述)。根據(jù)Uknes等；1993所述，分析了水楊酸及其葡萄糖偶聯(lián)物。從10株cim3和10株對(duì)照4周齡植物中收獲葉組織。收獲單株植物的葉子并分析其PR-1基因表達(dá)。測(cè)量表達(dá)PR-1植物的SA水平。cim3中自由SA的濃度比未受侵染的野生型擬南芥的高3.4倍(分別為233±35VS69±8ng/g鮮重)。cim3中SA葡萄糖偶聯(lián)物(SAG)比未受侵染的野生型擬南芥高13.1倍(分別為4519±473VS344±58ng/g鮮重)。SA和SAG升高的水平與報(bào)道的病原體侵染的組織或epr突變體的水平可以比擬。實(shí)施例17抗病性評(píng)估了cim3對(duì)擬南芥霜霉病致病因子寄生霜霉(NoCo2)的抗性。根據(jù)Uknes等1991，上述，所述將寄生霜霉接種約4周齡的cim(由PR-1RNA表達(dá)證實(shí))30株，對(duì)照植物(野生型Columbia)30株。7天后，根據(jù)keogh等(1980)TransBrMycol.Soc74，329-333及koch和Slusarenko(1990)植物細(xì)胞2437-445所述分析植物孢子形成并用盼臺(tái)藍(lán)染色觀察真菌結(jié)構(gòu)。野生型(Col-O)植物支持菌絲，分生孢子和卵孢子生長(zhǎng)，而以INA(0.25mg/ml)處理的野生型植物和cim植物不能支持真菌生長(zhǎng)。典型的cim3介導(dǎo)的抗性可在病原體侵染部位看到一小群死細(xì)胞。這種抗性與lsd突變體(Dietrich等，1994，上述，Weymann等，1995，上述)或SAR被誘導(dǎo)的野生型植物(Uknes等，1992，上述)中的抗性相似。通常，可觀察到中間抗性表型，包括cim3植物中尾隨菌絲尖的蔓延壞死。蔓延壞死與用低劑量的SA或INA處理的野生型植物中發(fā)現(xiàn)的相似(Uknes等，1992上述，Uknes等，1993，上述)。然而，cim3植物上從未見卵孢子生長(zhǎng)而所有的對(duì)照植物都表現(xiàn)出卵孢子生長(zhǎng)。盼臺(tái)藍(lán)染色未見未接種的cim3葉子上有自發(fā)的損傷。除了對(duì)真菌病原體寄生霜霉有抗性外，cim3對(duì)細(xì)菌病原體丁香假單胞菌DC3000的侵染也有抗性。用丁香假單胞菌DC3000懸液接種六周齡的野生型(±INA處理)以及cim3植物，在時(shí)間進(jìn)程中通過監(jiān)測(cè)從侵染葉片中提取的細(xì)菌的生長(zhǎng)跟蹤疾病的進(jìn)展。在第0天和第2天Col-O，Col-O+INA和cim3細(xì)菌滴度之間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不明顯。然而，第4天時(shí)，野生型植物和cim3植物的細(xì)菌生長(zhǎng)有31倍的降低(P＜0.003，Sokal和Rohlf，1981)。肉眼觀察植物以檢測(cè)病癥。野生型植物的葉子嚴(yán)重退綠，病癥大大超出了最初接種區(qū)域。相反，以INA預(yù)處理的野生型植物或cim3植物中幾乎沒有病癥。在這個(gè)實(shí)施例中，于28℃在含有利福平(50μg/ml)的KingB培養(yǎng)基上(瓊脂平板或液體)上培養(yǎng)丁香假單胞菌蕃茄株DC3000(Walen等(1991)植物細(xì)胞3，45-59)。稀釋過夜培養(yǎng)物并以2-5×105細(xì)胞/ml重新懸浮于10mMMgCl2中并注射到擬南芥葉子中。用28號(hào)針頭在葉子的中上部扎一個(gè)洞，然后用1cc注射器將約250ul稀釋的細(xì)菌溶液注射到洞中。在不同的時(shí)間點(diǎn)，用1號(hào)木栓打孔器從每一種處理的10株植物取3個(gè)隨機(jī)的葉片穿孔片，總共有10個(gè)隨機(jī)樣品。將3個(gè)穿孔片放在含有300ul10mMMgCl2的Eppendorf管內(nèi)并用研桿研磨。合適地稀釋得到的細(xì)菌懸液并將之接種在含利福平(50μg/ml)的KingB培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)4天。計(jì)數(shù)細(xì)菌克隆，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Student數(shù)據(jù)分析(Sokal和Rohlf(1981)，Biometry，第二版，紐約W.H.FreemanandCompany)。在這個(gè)實(shí)施例中，將2，6-二氯異煙酸(INA)懸浮于無菌去離子水中形成制成可潤(rùn)濕的粉劑中的25％活性成分(0.25mg/ml，325μM；Kessmann等(1994)植物病理學(xué)年評(píng)32，439-59)。所有的植物以水或I溶液噴灑至即將流出的程度。實(shí)施例18SA在SAR基因表達(dá)和抗病性中的作用為了研究cim3中SA，SAR基因表達(dá)和抗性之間的關(guān)系，對(duì)表達(dá)水楊酸羥化酶(nahG)基因的擬南芥植物進(jìn)行雜交(Delaney等，1994)。通過利用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將35S驅(qū)動(dòng)的nahG基因轉(zhuǎn)化至擬南芥制備了“NahG植物”。見，HuangH，Ma，H.(1992)PlantMol.Biol.Rep.10，372-383，在此引用作為參考；Gaffney等(1993)科學(xué)261，754-756，在此引用作為參考；以及Delaney等(1994)科學(xué)266，1247-1250，在此引用作為參考。Col-nahG擬南芥除了具顯性nahG基因外，還攜帶顯性卡那霉素抗性基因，因此Col-nahG用作花粉供體。將F1種子于水中水化30分鐘，然后以10％(lorox0.05％吐溫20進(jìn)行表面滅菌5分鐘并用無菌水徹底沖洗。將種子接種于含有25mg/ml卡那霉素的培養(yǎng)上(GM，Murashige和Skoog培養(yǎng)基，含10g/L蔗糖，0.5g/L2-(嗎啉)乙磺酸，以KOH調(diào)節(jié)pH為5.7)以篩選F1植物。見Valvekens等(1988)美國國家科學(xué)院院報(bào)85，5536-5540。18天后將具有卡那霉素抗性的F1植物轉(zhuǎn)移至土壤中。通過Northern印跡分析證實(shí)在所有實(shí)驗(yàn)中都有nahG基因的存在和PR-1的表達(dá)。因?yàn)閏im突變體和nahG表型都是顯性的，可在F1植物中分析這兩個(gè)基因之間的上位性。分析了cim3×nahG雜交的70株F1植物中的PR-1和nahG基因表達(dá)。mRNA表達(dá)的Northern印跡分析中，nahG基因的存在與SAR基因表達(dá)的抑制相關(guān)。通過分析得到的F2分離體中的PR-1mRNA證實(shí)每一株F1都有cim的存在。為了確定對(duì)于抗病性cim3突變是否對(duì)于nahG是上位的，cim3×nahG雜交的5株F1植物自交，種植了20-30粒F2種子，其中5株F1植物已被證實(shí)有nahG缺少PR-1mRNA。分析了F2群體中單株植物中的nahG和PR-1mRNA的表達(dá)，然后以寄生霜霉(NoCo2)攻擊這些植物以評(píng)估其疾病易感性。nahG基因的存在消除了由cim3賦予的抗病性，表明在SAR基因表達(dá)和抗病性表型中nahG對(duì)于cim3是上位的。實(shí)施例19將殺微生物劑和/或BTH施用于cim突變體獲得的協(xié)同抗病性在病原體接種前3天，將以可潤(rùn)濕的粉末載體制成25％活性成分(ai)的化學(xué)誘導(dǎo)劑系統(tǒng)獲得性抗性BTH(苯并[1，2，3]噻二唑-7-羧酸-S-甲酯)(Metraux等，1991)和/或制成25％活性成分的殺微生物劑metulaxyl(cGA48988)，或單獨(dú)將可潤(rùn)濕的粉末以精細(xì)粉塵的形式施用于4周齡植物的葉子。用可相容的病原體寄生霜霉NoCo2分生孢子懸液(1.8×105孢子/ml)接種植物。接種后，覆蓋植物以保持高的濕度并將之放在17℃的14小時(shí)白晝/10小時(shí)夜晚周期的Percival生長(zhǎng)室內(nèi)(Uknes等，1993)。接種后8天收獲植物。用以NS1和NS2作引物寄生霜霉EmWaDNA作為模板，根據(jù)White等(1990；PCR方法方法和應(yīng)用指南，第315-322頁)的PCR的方法獲得的rRNA真菌探針測(cè)定真菌生長(zhǎng)。通過酚/氯仿抽提后氯化鋰沉淀的方法從冷凍的組織中純化RNA(Lagrimini等，1987美國國家科學(xué)院院報(bào)847542-7546)。根據(jù)Ausbel等(1987)描述的通過甲醛瓊脂糖凝膠電泳分離樣品(7.5ng)并印跡到尼龍膜上(Hybond-N+，Amersham)。根據(jù)Church和Gilbert(1984，美國國家科學(xué)院院報(bào)81；1991-1995)的方法進(jìn)行雜交和洗滌。根據(jù)廠商說明用PhosphorImager(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)測(cè)定轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)量。通過以組成型表達(dá)b-微管擬南芥cDNA探測(cè)條狀濾紙進(jìn)行樣品上樣標(biāo)準(zhǔn)化。未被處理的植物侵染的真菌生長(zhǎng)抑制為零。單獨(dú)將氨丙靈，“植物活化劑”BTH或?qū)北`和BTH同時(shí)施用于上述的cim植物產(chǎn)生了比加性大的，即協(xié)同抗病性效應(yīng)。以增效倍數(shù)(SF)即觀察到的(O)效應(yīng)與期望的(E)效應(yīng)的比值測(cè)定效應(yīng)。得到了下列結(jié)果。表33擬南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分Icim3突變成分II氨丙靈WT＝野生型Col-OND＝未測(cè)定表34擬南芥中抵抗寄生霜霉的作用成份Icim3突變成份IIBTHWT＝野生型Col-OND＝未測(cè)定表35擬南芥中抵抗寄生霜霉的作用成份Icim3突變成份IIBTH和氨丙靈(M)WT＝野生型Col-OND＝未測(cè)定由上列表中可以看出，通過單獨(dú)施用氨丙靈，單獨(dú)使用BTH和聯(lián)合使用氨丙靈和BTH，cim3植物可表現(xiàn)出協(xié)同抗病性效應(yīng)。例如，與未被處理的野生植物相比，可見未被處理的cim3植物有12.5％真菌生長(zhǎng)抑制；這表明cim3突變體中SAR基因的組成型表達(dá)與抗病性相關(guān)。然而，如表30中所示，通過將氨丙靈以0.0001g/l(正常情況下不足以有效的濃度)施用于免疫調(diào)節(jié)的(SAR-開)cim3植物，觀察到的真菌生長(zhǎng)抑制水平提高至57.8％。從這些數(shù)據(jù)計(jì)算到的增效倍數(shù)4.6清楚地表明通過將殺微生物劑施用于免疫調(diào)節(jié)植物得到的協(xié)同效應(yīng)。表31中列出的數(shù)據(jù)表明協(xié)同是通過將系統(tǒng)獲得性抗性化學(xué)誘導(dǎo)劑諸如BTH施用于免疫調(diào)節(jié)的(SAR-開)cim3植物得到的。例如，在野生型植物中，0.03mM的BTH正常情況下不足以賦予有效的抗病性，只提供20.8％真菌生長(zhǎng)抑制。然而，在cim3植物中，正常情況下不足濃度的BTH可提供73.1％真菌生長(zhǎng)抑制，幾乎與推薦的BTH的有效濃度0.1mM的抑制水平一樣高。從表31中的數(shù)據(jù)中計(jì)算的增效倍數(shù)2.2清楚地表明通過將BTH施用于免疫調(diào)節(jié)植物得到的協(xié)同效應(yīng)是通過其它途徑得到的。當(dāng)BTH和氨丙靈同時(shí)施用于cim3植物時(shí)，抗病性效應(yīng)更為明顯。如上文實(shí)施例13(表29)所述，在野生型植物中，單獨(dú)施用0.01mMBTH或0.0001g/l氨丙靈不能獲得真菌生長(zhǎng)抑制，因?yàn)檫@些濃度正常情況下不足以產(chǎn)生效應(yīng)。然而，通過同時(shí)將這些在正常情況不足濃度的組合物施用于植物，可觀察到40.7％真菌生長(zhǎng)抑制，對(duì)于野生型植物來說是一種協(xié)同效應(yīng)。在cim3植物中，同時(shí)施用0.01mMBTH和0.001g/l氨丙靈可產(chǎn)生100％真菌生長(zhǎng)抑制，這表明有進(jìn)一步的協(xié)同活性。因此，將正常情況下無效的低濃度化學(xué)藥品聯(lián)合用于免疫調(diào)節(jié)cim植物得到的抗病性提供了對(duì)于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯的優(yōu)勢(shì)。通過利用本文表現(xiàn)出的協(xié)同性優(yōu)勢(shì)，可避免正常情況下有毒的或不希望濃度的化學(xué)藥品。另外，由于達(dá)到給定植物保護(hù)水平需要的化學(xué)藥品量降低可以實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)上的收益。III通過將常規(guī)的殺微生物劑和/或系統(tǒng)獲得性抗性化學(xué)誘導(dǎo)劑施用于包含NIM1基因形式的轉(zhuǎn)基因植物獲得的協(xié)同抗病性效應(yīng)NIM1基因是植物的系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)途徑的關(guān)鍵成分(Ryals等，1996)。通過化學(xué)和生物誘導(dǎo)劑NIM1基因與SAR的活化相關(guān)聯(lián)，與這些誘導(dǎo)劑相連是SAR和SAR基因表達(dá)必需的。通過分子生物學(xué)分析已知攜帶突變nim1基因植物的基因組確定NIM1基因的位置，此基因使宿主植物對(duì)多種病原體極其敏感從而使它們不能對(duì)病原體和SAR化學(xué)誘導(dǎo)劑進(jìn)行應(yīng)答。已對(duì)擬南芥的野生型NI曲因進(jìn)行了作圖和測(cè)序(SEQIDNO1)。野生型NIM1基因產(chǎn)物(SEQIDNO2)參與了導(dǎo)致擬南芥中SAR和基因-對(duì)-基因抗病性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Ryals等，1997)。野生型形式的NIM1的重組過量表達(dá)使免疫調(diào)節(jié)植物具有組成型免疫(CIM)表型，因此可賦予轉(zhuǎn)基因植物抗病性?；钚訬IM1蛋白水平的升高產(chǎn)生的抗病性效應(yīng)與誘導(dǎo)化學(xué)藥品諸如BTH，INA和SA等產(chǎn)生的化學(xué)誘導(dǎo)抗病性效應(yīng)相同。見，共同懸而未決的美國申請(qǐng)08/880,179，在此引用作為參考。而且，已表明NIM1基因產(chǎn)生是哺乳動(dòng)物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子IκBα亞類的結(jié)構(gòu)同系物(Ryals等，1997)。IκB的突變可作為NF-κB/IκB調(diào)節(jié)程序的超阻抑物或顯性失活物。因此，某些NIM1的改變形式可作為SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的顯性-失活調(diào)節(jié)物。這些NIM1的改變形式賦予轉(zhuǎn)化了它們的植物的表型與nim1突變體相反，即，轉(zhuǎn)化了NIM1的改變形式的免疫調(diào)節(jié)植物表現(xiàn)出組成型SAR基因表達(dá)和CIM表型。見，共同懸而未決的PCT申請(qǐng)“用NIM1基因賦予植物抗病性的方法”，在此引用作為參考。實(shí)施例20用包含野生型NIM1基因的粘粒克隆轉(zhuǎn)化植物粘粒D7(于1996年9月25日以ATCC97736貯存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心)是從包含DIM1基因區(qū)產(chǎn)生而來因此包括野生型NIM1基因(SEQIDNO1)。粘粒E1也是從包含NIM1基因區(qū)域產(chǎn)生而來因此也包括野生型NIM1基因(SEQIDNO1)。根據(jù)美國專利申請(qǐng)08/880,179描述的，通過輔助株AB101(pRK2013)以三親交配通過接合轉(zhuǎn)移將粘粒D7和E1移入根瘤土壤桿菌AGL-1。用真空抽濾將這些粘粒轉(zhuǎn)化卡那霉素敏感的nim1突變擬南芥系(Mindrinos等，1994，細(xì)胞78，1089-1099)。收獲抽濾植物的種子并使其在含有50mg/ml卡那霉素作為篩選劑的GM瓊脂板上發(fā)芽。劃平板約兩周后將經(jīng)受了篩選的幼苗轉(zhuǎn)移至土壤中。轉(zhuǎn)移至土壤中的植物在轉(zhuǎn)移后在人工氣侯室中大約生長(zhǎng)一周。用Chromister將300mMINA以精細(xì)的粉塵施用并完全覆蓋植物。約兩天后，收獲葉子以抽提RNA并進(jìn)行PR-1表達(dá)分析。用寄生霜霉(分離物EmWa)噴灑植物，于高濕度條件下在19℃白晝/17℃夜晚溫度和8小時(shí)光照/16小時(shí)黑暗周期的生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)。真菌侵染8-10天后，評(píng)估植物對(duì)真菌生長(zhǎng)劃分陽性或陰性。在每一組實(shí)驗(yàn)中以同樣的方式處理Ws和nim1植物作為對(duì)照。用LiCl/酚抽提緩沖液從收集的組織中提取總RNA(Verwoerd等，1989，核酸研究，2362)。在甲醛瓊脂糖凝膠上分離RNA樣品并將它轉(zhuǎn)移至GeneScreenPlue(DuPont)膜上。用32P標(biāo)記的PR-1cDNA探針對(duì)印跡進(jìn)行雜交。將得到的印跡對(duì)膠片進(jìn)行曝光以確定經(jīng)INA處理后誘導(dǎo)PR-1表達(dá)的轉(zhuǎn)化子。為了觀察是否D7和E1轉(zhuǎn)化子過量表達(dá)NIM1是由于插入位點(diǎn)(位置)效應(yīng)，包含D7或E1粘粒的初級(jí)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行自交并收集T2種子。將來自一株E1系和95株D7系的種子播種于土壤中并按上述的方法生長(zhǎng)。當(dāng)T2植物至少有4片真葉時(shí)，分別收集每株植物的一片葉子。從組織中提取RNA，分析PR-1和NIM1表達(dá)。用寄生霜霉(EmWa)接種植物并于侵染后10天分析真菌生長(zhǎng)。大多數(shù)轉(zhuǎn)化子真菌生長(zhǎng)比正常低，其中的4個(gè)即D7-2，D7-74，D7-89和E1-1系根本沒有可見的真菌生長(zhǎng)。植物比正常NIM1和PR-1表達(dá)水平高并具有真菌抗性表明NIM1過量表達(dá)賦予抗病性。實(shí)施例21NIM1在其天然啟動(dòng)子下過量表達(dá)用包含1.4kb啟動(dòng)子序列的BamHI-HindIIINIM1基因組片段(SEQIDNO1-堿基1249-5655)轉(zhuǎn)化Ws野生型植物產(chǎn)生組成型表達(dá)NIM1基因的植物。將此片段克隆入pSGCG01并轉(zhuǎn)化入土壤桿菌菌株GV3101(pMP90，Koncz和Schell(1986)，MolGenGenet204383-396)。按前述方法抽濾Ws植物。收獲得到的種子并將之接種于含50ug/ml卡那霉素的GM瓊脂上。將存活的植物轉(zhuǎn)移至土壤中并按前述方法檢測(cè)對(duì)寄生霜霉分離物Emwa的抗性。被選擇的植物自交并繼續(xù)篩選兩代以產(chǎn)生純合系。將其中幾個(gè)品系的種子播種在土壤中，培養(yǎng)每種品系的15-18株植物三周，再次在不用誘導(dǎo)化學(xué)藥品處理的前提下檢測(cè)Emwa抗性。在真菌處理后約24小時(shí)，48小時(shí)天收獲，合并，冷凍每個(gè)品系的組織。植物繼續(xù)在生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)至接種后10天，然后說估其對(duì)Emwa的抗性。從收集的所有樣品中制備RNA并按前述方法進(jìn)行分析(Delaney等，1995)。印跡與擬南芥基因探針PR-1進(jìn)行雜交(Uknes等，1992)。被分析的13株轉(zhuǎn)基因植物中的五株表現(xiàn)出PR1基因表達(dá)的早期誘導(dǎo)。在這些品系中，真菌處理后24或48小時(shí)PR-1mRNA比較明顯。這五個(gè)品系也沒有可見的真菌生長(zhǎng)。按照(Dietrich等，1994)所述用乳酚藍(lán)染葉片以證實(shí)葉片里沒有真菌菌絲。48小時(shí)時(shí)在其它8個(gè)品系中沒有PR-1基因的誘導(dǎo)表達(dá)，這些植物對(duì)Emwa無抗性。也檢測(cè)了一亞組抗性株系的對(duì)細(xì)菌病原體丁香假單胞菌DC3000抗性的提高以評(píng)估按照Uknes等(1993)描述的抗性范圍基本上按照Lawton等(1996)描述的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。那些細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢的品系也表現(xiàn)出對(duì)Emwa的組成型抗性。這表明NIM1基因在其天然啟動(dòng)子下過量表達(dá)的植物對(duì)病原體有組成型免疫性。為了評(píng)估這些品系中CIM表型的其它特征，評(píng)估未受侵染的植物中自由的和與葡萄糖偶聯(lián)的水楊酸，用乳酚藍(lán)染葉片以評(píng)估微損傷的出現(xiàn)。抗性植物以有性方式與SAR突變體諸如NahG和ndr1雜交以建立抗性表型和其它突變體的上位關(guān)系，評(píng)估NIM1的顯性失活突變體如何影響水楊酸依賴的反饋環(huán)。實(shí)施例2235S啟動(dòng)的NIM1的過量表達(dá)將全長(zhǎng)NIM1cDNA(SEQIDNO6)克隆至pCGN1761ENXrEcoRI位點(diǎn)(Comai等(1990)植物分子生物學(xué)15，373-381)。從產(chǎn)生的質(zhì)粒中得到了含有增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄正確方向的NIM1cDNA和tm13′終止子的XbaI片段。這個(gè)片段被克隆至雙元載體pCIB200并被轉(zhuǎn)入GV3101。按前述方法抽濾Ws植物。收獲得到的種子并將之接種在含50ug/ml卡那霉素的GM瓊脂上。將存活的幼小植物轉(zhuǎn)移至土壤中，按前述方法進(jìn)行檢測(cè)。所選的植物進(jìn)行自交并繼續(xù)選擇兩代以產(chǎn)生純合系。當(dāng)用Emwa處理而又沒有用化學(xué)藥品處理時(shí)被檢的58個(gè)品系中有9個(gè)表現(xiàn)出抗性。因此，NIM1cDNA的過量表達(dá)也會(huì)產(chǎn)生抗病性。實(shí)施例23NIM1是IκBα的同系物在NIM1的蛋白基因產(chǎn)物和IκB之間進(jìn)行多序列對(duì)比，表明NIM1基因產(chǎn)物是IκBα的同系物(圖1)。用BLAST(Al+schul等，分子生物學(xué)雜志215，403-410(1990))進(jìn)行序列同系物搜索。用ClustV(Higgin等，CABIO5，151-153(1989))作為DNASTAR(Madison，WI)公司的LasergeneBiocomputingSoftware包的一部分構(gòu)建了多序列對(duì)比。用于對(duì)比的序列是NIM1(SEQIDNO2)，小鼠IκBα(SEQIDNO3，基因庫錄入號(hào)1022734)，大鼠IκBα(SEQIDNO4，基因庫錄入號(hào)57674和X63594；Tewari等，核酸研究20，607(1992)和豬IκBα(SEQIDNO5，基因庫錄入號(hào)Z21968；deMartin等，歐州分子生物學(xué)組織雜志12，2773-2779(1993)；基因錄入號(hào)517193，deMartin等，基因152，253-255(1995))。用于Clustal分析的參數(shù)是gappenalty10和gaplengthpenalty10。用PAM250weighttable計(jì)算進(jìn)化趨異距離(Dayhoff等，“一種蛋白進(jìn)化變化模型。檢測(cè)遠(yuǎn)關(guān)系矩陣”，蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集，第5卷增補(bǔ)3，M.O.Dayhoff編輯(國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，WashiagtonD.C.)第345-358頁(1978))。用改進(jìn)的Dayhofftable計(jì)算殘基相似性(Schwartz和Dayhoff，“一種蛋白進(jìn)化變化模型”，蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集，M.O.Dayhoff編輯(國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，Washington，D.C.)第353-358頁(1979)；Gribskov和Burgess核酸研究14，6745-6763(1986))。同源性搜索表明NIM1與幾種蛋白，包括錨蛋白，NF-κB和IκB的錨蛋白區(qū)域有同源性?？偼葱宰詈玫氖桥cIκB及相關(guān)分子的同源性(圖1)。NIM1在第55位和第59位氨基酸有兩個(gè)絲氨酸；第59位的絲氨酸處于鄰近效應(yīng)序列中(D/ExxxxS)，此位置(N-末端)與磷酸化依賴的，遍在蛋白介導(dǎo)的可誘導(dǎo)降解作用是一致的。所有的IκBα都含這些N-末端絲氨酸，并且是IκB失活及隨后的NF-κB釋放所必需的。NIM1具有錨蛋白區(qū)域(氨基酸260-290和323-371)。據(jù)認(rèn)為錨蛋白區(qū)域涉及蛋白蛋白相互作用；是IκB和NF-κB分子的普遍特征。IκB的C末端可以是不相似的。NIM1與某些IκBC-末端的QL-豐富區(qū)(氨基酸491-499)有某些相似性。實(shí)施例24第55和59位絲氨酸殘基換成丙氨酸殘基的NIM1的改變形式的制備人IκBα中絲氨酸殘基的磷酸化是刺激活化的IκBα降解及其活化NF-κB所必需的。將人IκBα中絲氨酸殘基(S32-S36)誘變成丙氨酸抑制了刺激誘導(dǎo)的磷酸化由此封閉IκBα蛋白體-介導(dǎo)的降解(E.Britta-MareenTraenckuer等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志142876-2883(1995)；Broun等，科學(xué)2671485-1488(1996)；Brockman等，分子和細(xì)胞生物學(xué)152809-2818(1995)；Wang等，科學(xué)274784-787(1996))。此改變形式的IκBα作為一種顯性失活形式將NF-κB阻滯在細(xì)胞漿中，由此封閉下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。根據(jù)NIM1和IκB之間的序列比較，NIM1的絲氨酸55(S55)和59(S59)與人IκBα中的S32和S36同源。為了構(gòu)建顯性失活形式的NIM1，第55和59位的絲氨酸被突變成丙氨酸殘基。這可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行，諸如，用QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?#200518Strategene)。以下列引物(SEQIDNO6，位置192-226)根據(jù)廠商說明，用包含42bp5′非翻譯序列(UTR)和187bp的3′UTR的全長(zhǎng)NIM1cDNA(SEQIDNO6)可制備成誘變構(gòu)建體5′-CAACAGCTTCGAAGCCGTCTTTGACGCGCCGGATG-3′(SEQIDNO25)和5′CATCCGGCGCGTCAAAGACGGCTTCGAAGCTGTTG-3′(SEQIDNO26)，其中下劃線的堿基為突變位置。技術(shù)路線為將克隆至載體pSE936(Elledeg等，美國國家科學(xué)院院報(bào)881731-1735(1991))的NIM1cDNA變性與包含有改變堿基的引物退火。DNA聚合酶(pfu)通過非鏈置換延伸引物從而產(chǎn)生有缺刻的環(huán)形鏈。用限制性核酸內(nèi)切酶DpnI消化DNA，它只切割甲基化位點(diǎn)(非誘變的模板DNA)。剩余的環(huán)形雙鏈DNA用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌株XL-1-BLue。從得到的克隆中提取質(zhì)粒并進(jìn)行序列測(cè)序以證實(shí)有突變堿基存在同時(shí)沒有其它突變出現(xiàn)。用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI消化誘變的NIM1cDNA并將它克隆至pCGN1761，使它處于花椰菜花葉病毒雙35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下。通過XbaI部分消化將包含35S啟動(dòng)子，NIM1cDNA和tm1終止子的轉(zhuǎn)化盒并將之連接到去磷酸化的pCIB200的XbaI位點(diǎn)。SEQIDNO7和8分別表示了NIM1基因的改變形式的DNA編碼序列及其編碼的氨基酸序列。實(shí)施例25N末端刪除的NIM1的改變形式的制備將人IκBα第1-36位氨基酸(Brockman等；Sun等)或第1-72位氨基酸包括K21，K22，S32和S32刪除導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化人細(xì)胞培養(yǎng)物中的顯性失活I(lǐng)κBα表型。NIM1cDNA編碼產(chǎn)物的N-末端刪除約125個(gè)氨基酸去除了可能作為遍在蛋白化位點(diǎn)的8個(gè)賴氨酸殘基及S55和S59位可能的磷酸化位點(diǎn)(見實(shí)施例2)。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何技術(shù)，可制備改變的基因構(gòu)建體。例如，用Ho等基因7751-59(1989)的方法，可制備編碼約前125個(gè)氨基酸的DNA被刪除的NIM1形式。下列引物可產(chǎn)生一個(gè)1612bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNO6418-2011)5′-ggaattca-ATGGATTCGGTTGTGACTGTTTTG-3′(SEQIDNO27)和5′-ggaattcTACAAATCTGTATACCATTGG-3′(SEQIDNO28)，其中合成的起始密碼子被下劃線(ATG)，EcoRI接頭序列為小寫。用包含0.1-100ng模板DNA，10mMTrispH8.3/50mMKCl/2mMMgCl2/0.00％明膠/0.25mM每種dNTP/0.2mM每種引物和1單位rTthDNA聚合酶的終體積為50μl的反應(yīng)混合液在PerkinElmerCetus9600PCR機(jī)器上擴(kuò)增片段。PCR條件如下94℃3分鐘35×℃(94℃30秒52℃1分鐘72℃2分鐘)72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物直接克隆至pCR2.1載體(Invitrogen)。用限制性內(nèi)切酶EcoRI消化使PCR產(chǎn)生的插入片段從PCR載體中釋放出來并將之連接到去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位點(diǎn)，使之處于雙35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。對(duì)構(gòu)建體進(jìn)行序列測(cè)定以證實(shí)合成起始ATG的存在并證實(shí)PCR過程中沒有發(fā)生其它突變。通過XbaI部分限制性消化將包含35S啟動(dòng)子，修飾的NIM1cDNA和tm1終止子的轉(zhuǎn)化盒從pCGN1761中釋放出來連接到pCIB200的XbaI位點(diǎn)。SEQID9和10分別表示了具有N-末端氨基酸刪除的NIM1基因的改變形式的DNA編碼序列及其氨基酸序列。實(shí)施例26C末端刪除的NIM的改變形式的制備據(jù)認(rèn)為刪除人IκBα的第261-317位氨基酸會(huì)通過阻斷C末端的絲氨酸和蘇氨酸殘基的組成型磷酸化導(dǎo)致增強(qiáng)的內(nèi)在的穩(wěn)定性。NIM1C末端的第522-593位氨基酸含有一段絲氨酸和蘇氨酸豐富區(qū)。通過刪除編碼第522-593位氨基酸的核苷酸序列可對(duì)NIM1基因的C末端編碼區(qū)進(jìn)行修飾。用Ho等(1989)的方法，通過PCR刪除了NIM1cDNA(SEQIDNO61606-2011)的C-末端編碼區(qū)和3′UTR，產(chǎn)生了一個(gè)1623bp的片段，所用的引物為5′-cggaattcGATCTCTTTAATTTGTGAATTTC-3′(SEQIDNO29)和5′-ggaattcTCAACAGTTCATAATCTGGTCG-3′(SEQIDNO30)，其中，一個(gè)合成的終止密碼子被下劃線(互補(bǔ)鏈上為TGA)，EcoRI接頭序列是小寫字母。PCR反應(yīng)成分與前文所述的相同，循環(huán)參數(shù)如下94℃3分鐘35×(94℃30分鐘52℃30秒72℃2分鐘)；72℃10分鐘]。PCR產(chǎn)物被直接克隆到pCR2.1載體(Invitrogen)。用EcoRI進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶消化將PCR載體中PCR產(chǎn)生的插入片段游離出來并連接到包含雙35S啟動(dòng)子的去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位點(diǎn)。對(duì)此構(gòu)建體進(jìn)行序列測(cè)定以證實(shí)合成的符合讀框的終止密碼子的存在，同時(shí)證實(shí)PCR過程中沒有出現(xiàn)其它突變。通過用XbaI進(jìn)行部分限制性消化將包含啟動(dòng)子，飾的NIM1cDNA和tm1終止子的轉(zhuǎn)化盒從pCGN1761中釋放出來連接到去磷酸化的pCIB200的XbaI位點(diǎn)。SEQIDNO11和12分別表示了一種改變形式的C-末端氨基酸刪除的NIM1基因的DNA編碼序列和編碼的氨基酸序列。實(shí)施例27N-末端/C-末端刪除嵌合NIM1的改變形式的制備用第819位(SEQIDNO6)的一個(gè)單一的KpnI限制性位點(diǎn)可制備N-末端和C-末端缺失形式的NIM1(SEQIDNO6)。N-末端刪除形式(實(shí)施例25)是用EcoRI/KpnI限制性核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的，通過凝膠電泳回收與修飾的N末端一致的415bp的片段。同樣，C末端刪除形式是用EcoRI/KpnI限制性核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的，通過凝膠電泳回收與修飾的C-末端一致的790bp的片段。將片段于15℃連接，用EcoRI消化以消除EcoRI多聯(lián)體并將之克隆至去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位點(diǎn)。Nlc末端刪除形式的NIM1處于雙35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下。相似地，可制備由誘變的推測(cè)的磷酸化位點(diǎn)S55/S59(實(shí)施例24)與C-末端刪除(實(shí)施例26)融合形成的嵌合形式的NIM1。此構(gòu)建體通過上述方法制備。對(duì)此構(gòu)建體進(jìn)行序列測(cè)定以證實(shí)起始和終止密碼子的忠實(shí)性并證實(shí)克隆過程中沒有出現(xiàn)突變。通過用XbaI部分限制性消化各自的包含35S啟動(dòng)子，NIM1嵌合體和tm1終止子的轉(zhuǎn)化盒釋放出來連接到去磷酸化的pCIB200的XbaI位點(diǎn)。SEQIDNO13和14分別表示改變形式的N-末端和C末端氨基酸都缺失的NIM1基因的DNA編碼序列及其編碼的氨基酸序列。實(shí)施例28錨蛋白區(qū)域的NIM1的改變形式的制備NIM1在約103-362氨基酸處與錨蛋白基序有同源性。用Ho等(1989)的方法，通過PCR[條件94℃3分鐘35×(94℃30秒62℃30秒72℃2分鐘)72℃10分鐘]從NIM1cDNA(SEQIDNO6349-1128)擴(kuò)增編碼推測(cè)的錨蛋白區(qū)域的DNA序列(SEQIDNO13093-3951)，所用引物為5′-ggaattcaATGGACTCCAACAACACCGCCGC-3′(SEQIDNO31)和5′-ggaattcTCAACCTTCCAAAGTTGCTTCTGATG-3′(SEQIDNO32)。用EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶消化得到的產(chǎn)生然后連接到去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位點(diǎn)，它處于雙35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下。對(duì)構(gòu)建體進(jìn)行序列測(cè)定以證實(shí)合成的起始密碼子(ATG)，符合讀框的終止密碼子(TGA)的存在，同時(shí)證實(shí)PCR過程沒有出現(xiàn)其它突變。通過用XbaI部分限制性核酸內(nèi)切酶消化將包含35S啟動(dòng)子，錨蛋白區(qū)域和tm1終止子的轉(zhuǎn)化盒從pCGN1761中釋放出來并連接到去磷酸化的pCIB200的XbaI位點(diǎn)。SEQIDNO15和16分別表示了NIM1錨蛋白區(qū)域的DNA編碼序列及其編碼的氨基酸序列。實(shí)施例29嵌合基因的構(gòu)建為了提高NIM1的改變形式的合適的空間和時(shí)間表達(dá)的可能性，一個(gè)4407bp包含NIM1啟動(dòng)子和基因的HindIII/BamHI片段(SEQIDNO1堿基1249-5655)和/或一個(gè)5655bp的EcoRV/BamHI片段(SEQIDNO1堿基1-5655)用于制備上述實(shí)施例24-28的NIM1的改變形式。盡管構(gòu)建步驟可能不同，思路與此述上文描述的實(shí)施例相似。改變形式的強(qiáng)過量表達(dá)有可能是致死性。所以，實(shí)施例24-28中描述的NIM1基因的改變形式可以放在內(nèi)源性的NIM1啟動(dòng)子以外的啟動(dòng)子的控制下，包括但不局限于nos啟動(dòng)子或Rubisco啟動(dòng)子的小亞單位。同樣，改變形式NIM1可在病原體-反應(yīng)啟動(dòng)子PR-1的控制下表達(dá)(美國專利5,614,395)。這樣的表達(dá)只在病原體攻擊或其它SAR活化條件下允許NIM1的改變形式強(qiáng)表達(dá)。而且，當(dāng)用在正常情況下不活化SAR的濃度的SAR激活劑化合物(即BTH或INA)處理時(shí)，在PR-1啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)改變形式的NIM的轉(zhuǎn)化子中，抗病性可以明顯，由此活化反饋環(huán)(Weymann等，(1995)植物細(xì)胞72013-2022)。實(shí)施例30將NIM1的改變形式轉(zhuǎn)化入擬南芥制備的構(gòu)建體(實(shí)施例24-29)通過電穿孔進(jìn)入GV3101株而移入根瘤土壤桿菌。這些構(gòu)建體通過真空抽濾(Mindrinos等，細(xì)胞78，1089-1099(1994))或通過標(biāo)準(zhǔn)根轉(zhuǎn)化用以轉(zhuǎn)化擬南芥生態(tài)型Col-O和Ws-O。收獲這些植物的種子并使它們?cè)谝钥敲顾?或其它合適的抗生素)作為篩選劑的瓊脂平板上發(fā)芽。只有轉(zhuǎn)化的幼小植物能夠解除篩選劑的毒性而生存。經(jīng)受篩選的幼苗被轉(zhuǎn)移至土壤中檢測(cè)其CIM(組成型免疫)表型。通過與野生型植物比較，評(píng)估可觀察到的表型差異。實(shí)施例31評(píng)估轉(zhuǎn)化了野生型NIM1基因或NIM1基因的改變形式的植物的CIM表型收獲每一株初級(jí)轉(zhuǎn)化體的一片葉子，分離RNA(Verwoerd等，1989，核酸研究，2362)，通過RNA印跡分析檢測(cè)組成型PR-1表達(dá)(Uknes等，1992)。評(píng)估每一株植物的表示組成型SAR表達(dá)分析的增強(qiáng)的抗病性反應(yīng)(Uknes等，1992)。制備了兩種可相容的寄生霜霉分離物，Emwa和Noco，的濃度為5-10×104孢子/ml分生孢子懸液(即，這些真菌株分別導(dǎo)致野生型Ws-O和Col-O植物的疾病)，根據(jù)轉(zhuǎn)化子的野生型，用合適的分離物噴灑轉(zhuǎn)化子。在第7天對(duì)植物進(jìn)行疾病分級(jí)，收獲一片葉子用探針進(jìn)行RNA印跡分析，提供了一種測(cè)量真菌侵染的方法。生產(chǎn)表現(xiàn)CIM表型的轉(zhuǎn)化子的T1代并鑒定純合子植物。根據(jù)下述對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行一系列的抗病性測(cè)試。根據(jù)Dietrich等(1994)描述的，用Noco和Emwa重復(fù)進(jìn)行真菌侵染，用乳酚藍(lán)染葉子以鑒定真菌菌絲的存在。根據(jù)Uknes等(1993)描述的，用細(xì)菌病原體丁香假單胞菌DC3000侵染轉(zhuǎn)化體以評(píng)估抗性范圍。評(píng)估未受侵染葉子的自由和葡萄糖偶聯(lián)的SA，用乳酚藍(lán)染葉子以評(píng)估微小損傷的出現(xiàn)。抗性植物通過有性方式與SAR突變體如NahG(美國專利5,614,395)和hdr1雜交以建立抗性表型與其它突變體的上位關(guān)系，評(píng)估NIM1的顯性失活突變體如何影響SA依賴的反饋環(huán)。實(shí)施例32NIM1同系物的分離通過在中等嚴(yán)格條件下與擬南芥或優(yōu)選與一個(gè)來自擬南芥NIM1基因的寡核苷酸探針雜交可以得到NIM1同系物，此探針包括至少10核苷酸的其編碼序列連續(xù)部分。影響雜合體穩(wěn)定性的因素決定了雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性。其中因素之一是解鏈溫度Tm，根據(jù)DNA探針，GeorgeHKeller和MarkM.Manak；MacmillanPublisherLtd，1993第一部分；分子雜交技術(shù)；第8頁提供的公式很容易計(jì)算出Tm值。優(yōu)選的雜交溫度是比計(jì)算的解鏈溫度Tm低約25℃的溫度，如果是寡核苷酸，是比解鏈溫度Tm低約5-10℃的溫度。用NIM1cDNA(SEQIDNO6)作探針，通過篩選不同農(nóng)作物的基因文庫或cDNA文庫確定擬南芥NIM1的同系物，這些農(nóng)作物包括但不局限于實(shí)施例33中所列出的。完成此項(xiàng)工作的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括平板DNA文庫的雜交篩選(噬斑或克??；見如Sambrook等，分子克隆，編輯，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989))以及用寡核苷酸引物通過PCR擴(kuò)增(見，如Innis等，PCR方法，方法和應(yīng)用指南編輯，AcademicPress(1990))。鑒定的同系物通過遺傳工程整合到此處表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化到上述的農(nóng)作物中。用被檢農(nóng)作物植物的相關(guān)病原體評(píng)估轉(zhuǎn)化子的增強(qiáng)的抗病性。已通過DNA印跡分析檢測(cè)了黃瓜，蕃茄，煙草，玉米，小麥和燕麥基因組中的NIM1同系物。從黃瓜，蕃茄，煙草，玉米，小麥和大麥中分離基因組DNA，用BamHI，HindIII，XbaI或SalI限制性切割上述基因組，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離切割后的基因組并通過毛細(xì)印跡將它們轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。經(jīng)UV-交叉固定DNA后，用32P-放射標(biāo)記的擬南芥NIM1cDNA與膜在低嚴(yán)格條件下雜交[(1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉；1mMEDTA；250mM氯化鈉)于55℃雜交18-24小時(shí)]。雜交后，在低嚴(yán)格條件下洗滌印跡[6×SSC15分鐘(×3)，3×SSC15分鐘(×1)，于55℃；1×SSC是0.15MNaCl，15mM檸檬酸鈉(pH7.0)]，對(duì)X-光膠片曝光以觀察與NIM1一致的帶。另外，通過與NIM1基因相似鑒定的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)可用于分離同系物。例如，通過與NIM1基因的相似性鑒定了幾個(gè)水稻表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)。用ClustalV(Higgins，DesmondG.和PanlM.Sharp(1989)，微型計(jì)算機(jī)的快速敏感的多序列對(duì)比；CABIOS5151-153)作為DNA*(1228SouthParkStreet，MadisonWisconsin，53715)LasergenBiocomputingSoftwarepackagefortheillacintosh(1994)的一部分構(gòu)建成多序列對(duì)比。NIM1蛋白的某些區(qū)域與4個(gè)不同的水稻cDNA蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列同源。在GenBankBLAST搜索用NIM1序列確定了同源性。NIM1和水稻cDNA產(chǎn)物的同源區(qū)域的比較列于圖2(見SEQIDNO2和SEQIDNO17-24)。此NIM1蛋白片段與4個(gè)水稻產(chǎn)物有36-48％共同的氨基酸序列。這些水稻EST對(duì)于從其它單子葉植物中分離NIM1同系物特別有用。也可通過PCR得到同系物。在這種方法中，在已知同系物(如水稻和擬南芥)之間進(jìn)行了比較。氨基酸和DNA高度相似或完全相同的區(qū)域可用作PCR引物。氨基酸M和W豐富的區(qū)域后面最好是氨基酸殘基F，Y，C，H，Q，K和E豐富的區(qū)域，因?yàn)檫@些氨基酸由有限數(shù)量的密碼子編碼。一旦確定了合適的區(qū)域，通過不同的第三位密碼子的替代可制備那個(gè)區(qū)域的引物。靶物種限制第三位替代的多樣性。例如，因?yàn)橛衩诪镚C豐富，如果可能的話，設(shè)計(jì)引物時(shí)在第三位用G或C。在多種標(biāo)準(zhǔn)條件下對(duì)cDNA或基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。如果出現(xiàn)了一條帶，則克隆它并/或?qū)λ鼫y(cè)序以確定它是NIM1同系物。實(shí)施例33一種NIM1在農(nóng)作物植物中表達(dá)賦予Col-O或Ws-OCIM表型的構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物植物進(jìn)行評(píng)估。替代地，從前述實(shí)施例中分離的改變了的天然NIM1基因被放回各自的植物中。盡管NIM1基因可被插入到廣泛范圍的任何植物細(xì)胞，它對(duì)于農(nóng)作物細(xì)胞特別有用，諸如水稻，小麥，燕麥，黑麥，玉米，土豆，胡蘿卜，甘薯，甜菜，菜豆，豌豆，菊苣，萵苣，卷心菜，花椰菜，花莖甘藍(lán)，蕪菁，小蘿卜，菠菜，蘆筍，洋蔥，大蒜，茄子，胡椒，芹菜，胡蘿卜，西葫蘆，南瓜，zucchini，黃瓜，蘋果，梨，榅桲，甜瓜，李，櫻桃，桃，油挑，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，鳳梨，鱷梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，煙草，蕃茄，高梁和甘蔗。評(píng)估轉(zhuǎn)化子的增強(qiáng)的抗病性。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NIM1基因的表達(dá)水平甚少是野生型植物中天然NIM1表達(dá)水平的兩倍，優(yōu)選地，比野生型表達(dá)水平高10倍。實(shí)施例34通過將常規(guī)殺微生物劑施用于過量表達(dá)NIM1的轉(zhuǎn)基因植物得到的協(xié)同抗病性用于本實(shí)施例(6E和7C)的植物品系是根據(jù)實(shí)施例21描述的，用BamHI-HindIIINIM1基因片段(SEQIDNO1-堿基1249-5655)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥植物(生態(tài)型Ws)得到的。將殺真菌劑氨丙靈乙磷鋁和氫氧化銅分別以可潤(rùn)濕的粉末載體制成25％，80％和70％活性成分(ai)以精細(xì)粉塵的形式施用于三周齡的組成型表達(dá)NIM1基因的轉(zhuǎn)基因植物Ws的葉子上。單獨(dú)施用可潤(rùn)濕粉末作為對(duì)照。三天后，根據(jù)Delaney等(195)所述，用寄生霜霉分離物Emwa分生孢子懸液(1-2×105孢子/ml)接種植物。接種后，覆蓋植物以保持高濕度，并將之放置在17℃14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗周期的Pervical生長(zhǎng)室內(nèi)(Uknes等，1993)。接種后8天收獲組織。通過在解剖顯微鏡下觀察對(duì)分生孢子的發(fā)育劃分等級(jí)(Delaney等(1994)；Dietrich，等，1994)，跟蹤真菌侵染進(jìn)程12天。對(duì)單個(gè)葉片進(jìn)行乳酚臺(tái)盼藍(lán)染色以觀察葉片內(nèi)真菌生長(zhǎng)。用以NS1和NS2為引物，以寄生霜霉EmWaDNA為模板，根據(jù)White等(1990；PCR方法，方法和應(yīng)用指南，第315-322頁)的方法通過PCR獲得的rRNA真菌探針對(duì)真菌生長(zhǎng)進(jìn)行定量。通過酚/氯仿抽提后氯化鋰沉淀的方法(Lagrimini等，1987，美國國家科學(xué)院院報(bào)847542-7546)，從冷凍組織中純化RNA。根據(jù)Ausbel等(1987)所述通過甲醛瓊脂糖凝膠電泳分離樣品(7.5ug)并將它跡到尼龍膜上(HybondN+，Amersham)。根據(jù)Church和Gilbert(1984，美國國家科學(xué)院院報(bào)811991-1995)進(jìn)行雜交和洗滌。根據(jù)廠商說明用PhosphorImage(MolecularDynamicsSunnyvale，CA)確定轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)量。通過以組成型表達(dá)b-微管擬南芥cDNA探測(cè)條狀濾紙進(jìn)行樣品上樣標(biāo)準(zhǔn)化。未被處理的植物侵染的真菌生長(zhǎng)抑制為零。將氨丙靈，乙磷鋁或氫氧化銅施用于過量表達(dá)NIM1的植物品系產(chǎn)生一個(gè)比加性大的即協(xié)同抗病性效應(yīng)。效應(yīng)根據(jù)增效倍數(shù)(SF)測(cè)定，SF是觀察的(O)效應(yīng)與期望的(E)效應(yīng)的比率。得到如下結(jié)果表36擬南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分INIM1過量表達(dá)(6E株系)成分II氨丙靈WT＝野生型Ws表37擬南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分INIM1過量表達(dá)(6E株系)成分II乙磷鋁WT＝野生型Ws表38擬南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分INIM1過量表達(dá)(7C系)成分II乙磷鋁WT＝野生型Ws表39擬南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分INIM1過量表達(dá)(6E株系)成分II氫氧化銅WT＝野生型Ws表40擬南芥中抵抗寄生霜霉的作用成分INIM1過量表達(dá)(7C株系)成分II氫氧化銅WT＝野生型Ws從上述表中可以看出，通過施用氨丙靈，乙磷鋁和氫氧化銅，過量表達(dá)NIM1的植物表現(xiàn)出協(xié)同抗病性效應(yīng)。例如，未處理的NIMI植物中(6E系)相對(duì)于未處理的野生型植物有10％真菌生長(zhǎng)抑制；這表明此NIM1過量表達(dá)者中組成型的SAR基因表達(dá)與抗病性相關(guān)。然而，可以從表37中看出，通過將乙磷鋁以5.0g/l(正常情況下不足以有效的濃度)施用于免疫調(diào)節(jié)的(SAR-開)NIM1過量表達(dá)植物，觀察到的真菌生長(zhǎng)抑制增加到93％。從這些資料計(jì)算得出的5.5的增效倍數(shù)清楚地表明了將殺微生物劑施用于免疫調(diào)節(jié)植物(SAR-開)得到的協(xié)同效應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施例中，未被處理的NIM1植物(7C系)相對(duì)于未處理的野生型植物有14％的真菌生長(zhǎng)抑制，表明此NIM1過量表達(dá)者中組成型的SAR基因表達(dá)與抗病性相關(guān)。然而，可以從表40看出來，通過將氫氧化銅以2.0g/l(正常情況下不足以有效的濃度)施用于免疫調(diào)節(jié)的(SAR-開)NIM1過量表達(dá)植物，觀察到的真菌生長(zhǎng)抑制增加到77％。從這些資料計(jì)算得出的5.5的增效倍數(shù)清楚地說明了將殺微生物劑施用于免疫調(diào)節(jié)植物(SAR-開)得到的協(xié)同效應(yīng)。因此，將過量表達(dá)NIM1的免疫調(diào)節(jié)植物與低的，在正常情況下不足以有效濃度的殺微生物劑聯(lián)合應(yīng)用得到抗病性的優(yōu)勢(shì)對(duì)于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說很明顯。利用此處表明的協(xié)同性優(yōu)勢(shì)，可避免正常情況下有毒或另外的不希望的殺微生物劑濃度。另外，由于達(dá)到給定保護(hù)植物水平所需要的殺微生物劑的量減少，可以實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益。實(shí)施例35將SAR化學(xué)誘導(dǎo)劑施用于過量表達(dá)NIM1的轉(zhuǎn)基因植物得到的協(xié)同抗病性也分析了包含有在自身啟動(dòng)子控制下的NIM1基因組DNA片段(實(shí)施例21)的植物相對(duì)于野生型Ws品系對(duì)不同濃度的BTH的反應(yīng)。按照前述方法播種培養(yǎng)每一品系的種子。種植后約3周，從每一品系上收獲葉樣品(第0天作對(duì)照)，剩余的植物以H2O，10uMBTH或100uMBTH處理。處理1，3和5天收獲另外的樣品。收獲了第3天的樣品后，每個(gè)品系的一亞組植物被移走并根據(jù)上述方法用寄生霜霉分離物Emwa進(jìn)行處理。從收獲的組織中制備RNA，以擬南芥PR-1基因探針進(jìn)行Northern分析。侵染后8天對(duì)植物真菌抗性進(jìn)行劃分等級(jí)。對(duì)Ws和4株NIM過量表達(dá)品系(3A，5B，6E和7E)的Northern分析結(jié)果示于圖3。經(jīng)低水平的10uMBTH處理后(正常情況下BTH的有效濃度為100-300uM)，野生型Ws品系中幾乎檢測(cè)不到PR-1基因表達(dá)。經(jīng)這種處理的Ws植物仍然對(duì)真菌病原體寄生霜霉(Emwa)敏感。然而，在所有NIM-1過量表達(dá)品系中，在低水平BTH處理后有一個(gè)強(qiáng)的多的PR-1基因表達(dá)反應(yīng)。另外，用10uMBTH處理的所有NIM1過量表達(dá)品系表現(xiàn)出對(duì)寄生霜霉全部或部分抗性。用乳酚藍(lán)染葉子以鑒定真菌菌絲的存在(Dietrich等，1994))證實(shí)NIM1過量表達(dá)品系中沒有真菌生長(zhǎng)。相對(duì)于野生型而言，經(jīng)100uMBTH處理后，NIM1過量表達(dá)品系的葉組織中的PR-1基因表達(dá)強(qiáng)的多而且也快得多。因此，從PR-1基因表達(dá)和對(duì)寄生霜霉的抗性可以看出，免疫調(diào)節(jié)植物能對(duì)低的多的BTH作出快的多的反應(yīng)。這個(gè)數(shù)據(jù)表明通過將系獲得性抗性化學(xué)誘導(dǎo)劑諸如BTH施用于免疫調(diào)節(jié)(SAR-開)植物諸如NIM1過量表達(dá)植物可以獲得協(xié)同抗病性。因此，將過量表達(dá)NIM1的免疫調(diào)節(jié)植物與低的在正常情況下不足以有效濃度的殺微生物劑聯(lián)合應(yīng)用得到抗病性的優(yōu)勢(shì)對(duì)于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說很明顯。利用此處表明的協(xié)同性優(yōu)勢(shì)，可避免正常情況下有毒或另外的不希望的殺微生物劑濃度。另外，由于達(dá)到給定保護(hù)植物水平所需的殺微生物劑的量減少，可以實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益。序列表(1)基本信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱NOVARTISAG(B)街道Schwarzwaldallee215(C)城市Basel(D)國家瑞士(F)郵政編號(hào)4002(G)電話+41616961111(H)傳真+41616967976(H)電傳962991(ii)發(fā)明名稱保護(hù)植物的方法(iii)序列數(shù)32(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，版本#1.30(2)關(guān)于SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5655個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵外顯子(B)位置2787..3347(D)其它信息/產(chǎn)物＝“NIM1的第一個(gè)外顯子”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵外顯子(B)位置3427..4162(D)其它信息/產(chǎn)物＝“NIM1的第二個(gè)外顯子”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵外顯子(B)位置4271..4474(D)其它信息/產(chǎn)物＝“NIM1的第三個(gè)外顯子”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵外顯子(B)位置4586..4866(D)其它信息/產(chǎn)物＝“NIM1的第四個(gè)外顯子”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置連接(2787..3347，3427..4162，4271..4474，4586..4866)。(xi)序列描述SEQIDNO1TGTGATGCAAGTCATGGGATATTGCTTTGTGTTAAGTATACAAAACCATCACGTGGATAC60ATAGTCTTCAAACCAACCACTAAACAGTATCAGGTCATACCAAAGCCAGAAGTGAAGGGT120TGGGATATGTCATTGGGTTTAGCGGTAATCGGATTGAACCCTTTCCGGTATAAAATACAA180AGGCTTTCGCAGTCTCGGCGTATGTGTATGTCTCGGGGTATCTACCATTTGAATCACAGA240ACTTTTATGTGCGAAGTTTTCGATTCTGATTCGTTTACCTGGAAGAGATTAGAAAATTTG300CGTCTACCAAAAACAGACAGATTAATTTTTTCCAACCCGATACAAGTTTCGGGGTTCTTG360CATTGGATATCACGGAACAACAATGTGATCCGGTTTTGTCTCAAAACCGAAACTTGGTCC420TTCTTCCATACTCCGAACTCTGATGTTTTCTCAGGATTAGTCAGATACGAAGGGAAGCTA480GGTGCTATTCGTCAGTGGACAAACAAAGATCAAGAAGATGTTCACGAGTTATGGGTTTTA540AAGAGCAGTTTTGAAAAGTCGTGGGTTAAAGTGAAAGATATTAAAAGCATTGGAGTAGAT600TTGATTACGTGGACTCCAAGCAACGACGTTGTATTGTTTCGTAGTAGTGATCGTGGTTGC660CTCTACAACATAAACGCAGAGAAGTTGAATTTAGTTTATGCAAAAAAAGAGGGATCTGAT720TGTTCTTTCGTTTGTTTTCCGTTTTGTTCTGATTACGAGAGGGTTGATCTGAACGGAAGA780AGCAACGGGCCGACACTTTAAAAAAAAAATAAAAAAAATGGGCCGACAAATGCAAACGTA840GTTGACAAGGATCTCAAGTCTCAAGTCTCAATTGGCTCGCTCATTGTGGGGCATAAATAT900ATCTAGTGATGTTTAATTGTTTTTTATAAGGTAAAAAGGAATATTGAATTTTGTTTCTTA960GGTTTATGTAATAATACCAAACATTGTTTTATGAATATTTAATCTGATTTTTTGGCTAGT1020TATTTTATTATATCAAGGGTTCCTGTTTATAGTTGAAAACAGTTACTGTATAGAAAATAG1080TGTCCCAATTTTCTCTCTTAAATAATATATTAGTTAATAAAAGATATTTTAATATATTAG1140ATATACATAATATCTAAAGCAACACATATTTAGACACAACACGTAATATCTTACTATTGT1200TTACATATATTTATAGCTTACCAATATAACCCGTATCTATGTTTTATAAGCTTTTATACA1260ATATATGTACGGTATGCTGTCCACGTATATATATTCTCCAAAAAAAACGCATGGTACACA1320AAATTTATTAAATATTTGGCAATTGGGTGTTTATCTAAAGTTTATCACAATATTTATCAA1380CTATAATAGATGGTAGAAGATAAAAAAATTATATCAGATTGATTCAATTAAATTTTATAA1440TATATCATTTTAAAAAATTAATTAAAAGAAAACTATTTCATAAAATTGTTCAAAAGATAA1500TTAGTAAAATTAATTAAATATGTGATGCTATTGAGTTATAGAGAGTTATTGTAAATTTAC1560TTAAAATCATACAAATCTTATCCTAATTTAACTTATCATTTAAGAAATACAAAAGTAAAA1620AACGCGGAAAGCAATAATTTATTTACCTTATTATAACTCCTATATAAAGTACTCTGTTTA1680TTCAACATAATCTTACGTTGTTGTATTCATAGGCATCTTTAACCTATCTTTTCATTTTCT1740GATCTCGATCGTTTTCGATCCAACAAAATGAGTCTACCGGTGAGGAACCAAGAGGTGATT1800ATGCAGATTCCTTCTTCTTCTCAGTTTCCAGCAACATCGAGTCCGGAAAACACCAATCAA1860GTGAAGGATGAGCCAAATTTGTTTAGACGTGTTATGAATTTGCTTTTACGTCGTAGTTAT1920TGAAAAAGCTGATTTATCGCATGATTCAGAACGAGAAGTTGAAGGCAAATAACTAAAGAA1980GTCTTTTATATGTATACAATAATTGTTTTTAAATCAAATCCTAATTAAAAAAATATATTC2040ATTATGACTTTCATGTTTTTAATGTAATTTATTCCTATATCTATAATGATTTTGTTGTGA2100AGAGCGTTTTCATTTGCTATAGAACAAGGAGAATAGTTCCAGGAAATATTCGACTTGATT2160TAATTATAGTGTAAACATGCTGAACACTGAAAATTACTTTTTCAATAAACGAAAAATATA2220ATATACATTACAAAACTTATGTGAATAAAGCATGAAACTTAATATACGTTCCCTTTATCA2280TTTTACTTCAAAGAAAATAAACAGAA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有一級(jí)抗病性的免疫調(diào)節(jié)植物；并且(b)向所述免疫調(diào)節(jié)植物施用至少一種殺微生物劑以賦予二級(jí)抗病性；(c)由此所述殺微生物劑向所述免疫調(diào)節(jié)植物的施用賦予比一級(jí)和二級(jí)抗病性水平總和更大的協(xié)同增強(qiáng)的三級(jí)抗病性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)植物是(a)組成型免疫(cim)突變植物；(b)損傷模擬突變植物；(c)通過在植物中重組表達(dá)SAR基因得到的；(d)通過向植物施用能誘導(dǎo)SAR的化學(xué)品得到的。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述cim突變植物根據(jù)下列步驟從植物群體中選出(a)評(píng)估SAR基因在表型正常的未受侵染植物中的表達(dá)，其中所述未受侵染的植物缺少損傷模擬表型，并且(b)篩選在沒有病毒、細(xì)菌或真菌侵染時(shí)，組成型表達(dá)SAR基因的未受侵染的植物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述損傷模擬突變植物根據(jù)下列步驟從植物群體中選出(a)評(píng)估SAR基因在具有損傷模擬表型的未受侵染的植物中的表達(dá)；并且(b)篩選在沒有病毒、細(xì)菌或真菌侵染時(shí)，組成型表達(dá)SAR基因的未受侵染的植物。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述SAR基因是編碼NIM1蛋白功能形式的NIM1基因，NIM1蛋白參與植物中引起系統(tǒng)獲得性抗性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述NIM1蛋白包含SEQIDNO2中所示的氨基酸序列。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述NIM1基因包含SEQIDNO1中所示的編碼序列。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述SAR基因編碼作為SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑顯性失活調(diào)控子的NIM1蛋白的改變形式。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式在相當(dāng)于SEQIDNO2的55和59位的氨基酸位是亮氨酸而不是絲氨酸。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式包含SEQIDNO8中所示的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQIDNO7中所示的核苷酸序列。12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式具有大約相當(dāng)于SEQIDNO2的1-125氨基酸位的N末端截短的氨基酸。13.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式包含SEQIDNO10中所示的氨基酸序列。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQIDNO9中所示的核苷酸序列。15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述NIM1蛋白的具有大約相當(dāng)于SEQIDNO2的522-593氨基酸位的C末端截短的氨基酸。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式包含SEQIDNO2中所示的氨基酸序列。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQIDNO11中所示的核苷酸序列。18.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式具有大約相當(dāng)于SEQIDNO2的1-125氨基酸位的N-末端截短的氨基酸和大約相當(dāng)于SEQIDNO2的522-593氨基酸位的C末端截短的氨基酸。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式包含SEQIDNO14中所示的氨基酸序列。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQIDNO13中所示的核苷酸序列。21.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式基本上由大約相當(dāng)于SEQIDNO2的103-362氨基酸位的錨蛋白基序組成。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述NIM1蛋白的改變形式包含SEQIDNO16中所示的氨基酸序列。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述DNA分子包含SEQIDNO15中所示的核苷酸序列。24.根據(jù)權(quán)利要求7、11、14、17、20和23中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述DNA分子在下列條件下與SEQIDNO1、7、9、11、13或15中所列的核苷酸序列雜交在1％BSA；520mMNaPO4；pH7.2；7％十二烷基硫酸鈉鹽；1mMEDTA；250mM氯化鈉中，于55℃雜交18-24小時(shí)，并于55℃在6×SSC中洗15分鐘(3次)，3×SSC中洗15分鐘(1次)。25.根據(jù)權(quán)利要求1-24中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述殺微生物劑是選自下列群體的殺真菌劑4-3[(4-氯苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙烯酰]嗎啉(“烯酰嗎啉”)；5-甲基-1，2，4-三唑[3，4-b][1，3]苯并噻唑(“三環(huán)唑”)；3-烯丙氧基-1，2-苯并噻唑-1，1-二氧化物(“烯丙基異噻唑”)；α-[2-(4-氯苯基)乙基]-α-(1，1-二甲基乙基)-1H-1，2，4-三唑-1-乙醇(“戊唑醇”)；1-[3-(2-氯苯基)-2-(4-氟苯)環(huán)氧乙烷-2-基]甲基]-1H-1，2，4-三唑(“環(huán)氧唑醇”)；α-(4-氯苯基)-α-(1-環(huán)異丙基乙基)-1H-1，2，4-三唑-1-乙醇(“環(huán)唑醇”)；5-(4-氯苯基)-2，2-二甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-環(huán)戊醇(“葉菌唑”)；2-(2，4-二氯苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)-丙基-1，1，2，2-四氟乙醚(“氟醚唑”)；甲基-(E)-2-{2-[6-(2-氰苯氧基)嘧啶-4-基氧基]苯基}-3-甲氧丙烯酸鹽(“ICIA5504”“azoxystrobin”)；甲基-(E)-2-甲氧亞氨基-2-[α-(O-甲苯氧基)-O-甲苯基]乙酸酯(“BAS490F”，“cresoximemethyl”)；2-(2-苯氧苯基)-(E)-2-甲氧亞氨基-N-甲基乙酰胺；[2-(2，5-二甲基苯氧甲基)-苯基)]-(E)-2-甲氧亞氨基-N-甲基乙酰胺；(1R，3S/1S，3R)-2，2-二氯-N-[(R)-1-(4-氯(苯基)乙基]-1-乙基-3-甲基環(huán)丙烷甲酰胺，(“KTU3616”)；乙撐雙(二硫代氨基甲酸)錳聚合體-鋅復(fù)合物(代森錳鋅)；1-[2-(2，4-二氯苯基)-4-丙基-1，3-二氧戊環(huán)-2-基甲基]-1H-1，2，4-三唑(“丙環(huán)唑”)；1-{2-[2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基]-4-甲基-1，3-二氧戊環(huán)-2-基甲基)-1H-1，2，4-三唑(“惡醚唑”)1-[2-(2，4-二氯苯基)戊基-1H-1，2，4-三唑(“戊菌唑”)順-4-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]-2，6-二甲基嗎啉(“丁苯嗎啉”)1-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]哌啶(“苯銹啶”)；4-環(huán)丙基-6-甲基-N-苯基-2-嘧啶氨(“嘧菌環(huán)胺”)；(RS)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙酰基)-丙氨酸甲酯(“氨丙靈”)；(R)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙?；?-丙氨酸甲酯(“R-氨丙靈”)；1，2，5，6-四氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮(“咯喹酮”)；和磷酸氫乙酯(“乙磷鋁”)。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述殺真菌劑是氨丙靈。27.根據(jù)權(quán)利要求2-26中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述能誘導(dǎo)SAR的化學(xué)品是苯并噻二唑化合物、異煙酸化合物或水楊酸化合物。28.根據(jù)權(quán)利要求1-26中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述殺微生物劑是苯并噻二唑化合物、異煙酸化合物或水楊酸化合物。29.根據(jù)權(quán)利要求1-28中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中將兩種殺微生物劑同時(shí)施用于所述免疫調(diào)節(jié)植物。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述殺微生物劑是選自下列群體的殺真菌劑4-3[(4-氯苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙烯酰]嗎啉(“烯酰嗎啉”)；5-甲基-1，2，4-三唑[3，4-b][1，3]苯并噻唑(“三環(huán)唑”)；3-烯丙氧基-1，2-苯并噻唑-1，1-二氧化物(“烯丙基異噻唑”)；α-[2-(4-氯苯基)乙基]-α-(1，1-二甲基乙基)-1H-1，2，4-三唑-1-乙醇(“戊唑醇”)；1-[3-(2-氯苯基)-2-(4-氟苯)環(huán)氧乙烷-2-基]甲基]-1H-1，2，4-三唑(“環(huán)氧唑醇”)；α-(4-氯苯基)-α-(1-環(huán)異丙基乙基)-1H-1，2，4-三唑-1-乙醇(“環(huán)唑醇”)；5-(4-氯苯基)-2，2-二甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-環(huán)戊醇(“葉菌唑”)；2-(2，4-二氯苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)-丙基-1，1，2，2-四氟乙醚(“氟醚唑”)；甲基-(E)-2-{2-[6-(2-氰苯氧基)嘧啶-4-基氧基]苯基}-3-甲氧丙烯酸鹽(“ICIA5504”“azoxystrobin”)；甲基-(E)-2-甲氧亞氨基-2-[α-(O-甲苯氧基)-O-甲苯基]乙酸酯(“BAS490F”，“cresoximemethyl”)；2-(2-苯氧苯基)-(E)-2-甲氧亞氨基-N-甲基乙酰胺；[2-(2，5-二甲基苯氧甲基)-苯基)]-(E)-2-甲氧亞氨基-N-甲基乙酰胺；(1R，3S/1S，3R)-2，2-二氯-N-[(R)-1-(4-氯(苯基)乙基]-1-乙基-3-甲基環(huán)丙烷甲酰胺，(“KTU3616”)；乙撐雙(二硫代氨基甲酸)錳聚合體-鋅復(fù)合物(代森錳鋅)；1-[2-(2，4-二氯苯基)-4-丙基-1，3-二氧戊環(huán)-2-基甲基]-1H-1，2，4-三唑(“丙環(huán)唑”)；1-{2-[2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基]-4-甲基-1，3-二氧戊環(huán)-2-基甲基)-1H-1，2，4-三唑(“惡醚唑”)1-[2-(2，4-二氯苯基)戊基-1H-1，2，4-三唑(“戊菌唑”)順-4-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]-2，6-二甲基嗎啉(“丁苯嗎啉”)1-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙基]哌啶(“苯銹啶”)；4-環(huán)丙基-6-甲基-N-苯基-2-嘧啶氨(“嘧菌環(huán)胺”)；(RS)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙?；?-丙氨酸甲酯(“氨丙靈”)；(R)-N-(2，6-二甲基苯基-N-(甲氧乙酰基)-丙氨酸甲酯(“R-氨丙靈”)；1，2，5，6-四氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮(“咯喹酮”)；和磷酸氫乙酯(“乙磷鋁”)。并且另一種殺微生物劑是苯并噻二唑化合物、異煙酸化合物或水楊酸化合物。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中殺真菌劑是氨丙靈，另一種殺微生物劑是苯并噻二唑化合物。全文摘要本發(fā)明涉及通過將傳統(tǒng)殺微生物劑施用于免疫調(diào)節(jié)植物得到的協(xié)同抗病性來保護(hù)植物免受病原體侵襲的方法。免疫調(diào)節(jié)植物是指那些其中SAR被激活因而稱為“SAR－開”的植物。免疫調(diào)節(jié)植物至少可以用三種方法提供:通過將SAR的化學(xué)誘導(dǎo)劑如BTH,INA或SA施用于植物;通過基于SAR基因組成型表達(dá)和/或抗病性表型的篩選育種方法;或通過用一種或多種SAR基因如NIM1基因的功能形式轉(zhuǎn)化植物。通過將殺微生物劑同時(shí)施用于免疫調(diào)節(jié)植物,抗病性出乎意料地協(xié)同增強(qiáng);即抗病性水平比預(yù)期的抗病性加合水平更高。文檔編號(hào)C07K14/415GK1245537SQ97181610公開日2000年2月23日申請(qǐng)日期1997年12月23日優(yōu)先權(quán)日1996年12月27日發(fā)明者J·A·賴亞爾斯,S·J·尤肯斯,A·莫里那弗南德咨,L·B·弗里德里克申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司