專利名稱：牛腦神經(jīng)肽ff的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法，腦神經(jīng)肽FF是動物和人腦中天然存在的內(nèi)源性嗎啡和抗嗎啡類物質(zhì)，屬于戒毒物質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域。如何有效地戒毒，已成為人們普遍關(guān)注的社會問題，藥物戒毒是最有效的戒毒手段，目前國內(nèi)廣泛采用的方法有(1)成癮藥品遞減療法，如采用美沙酮等藥品，(2)暫時解除意識療法，如采用安定等睡眠藥物，(3)綜合療法，如用美沙酮、丁丙諾非，納洛酮，納曲酮分階段治療等藥物，這些方法雖有一定效果，但又都不很理想，最近美、日等國一些科學(xué)家已從一些動物和人腦中發(fā)現(xiàn)了一種天然內(nèi)源性嗎啡和抗嗎啡類物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，這類物質(zhì)在脫毒、戒癮、康復(fù)、防復(fù)吸階段發(fā)揮作用，如果進一步開發(fā)利用這類物質(zhì)，將會從根本上達到戒毒的目的。
1975年美國科學(xué)家Hunghes等人在動物腦中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性類嗎啡神經(jīng)肽以來，已有許多天然內(nèi)源性類嗎啡和抗嗎啡神經(jīng)肽被發(fā)現(xiàn)。1979年，日本科學(xué)家Rakagi等人從牛腦中發(fā)現(xiàn)了一種天然內(nèi)源性類嗎啡肽，并證明這種牛腦肽具有嗎啡類物質(zhì)所具有的止痛作用。1985年，美國科學(xué)家Yang等人從牛腦中首次發(fā)現(xiàn)了兩種抗嗎啡類神經(jīng)肽。它們具有抑制和減少嗎啡誘導(dǎo)的各種生物學(xué)效應(yīng)的作用。1991年，美國科學(xué)家Rothmam等人報告牛腦神經(jīng)肽FF(一種八肽。其氨基酸排列順序為Phe-Leu-Phe-Gle-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2)具有下調(diào)嗎啡Mu受體結(jié)合位的作用。1996年，美國科學(xué)家Goodman等人也報告說當(dāng)同時給小鼠服用牛腦神經(jīng)肽FF和嗎啡時，牛腦神經(jīng)肽FF也同樣具有下調(diào)嗎啡Mu受體結(jié)合位的功能。這些杰出的研究工作都表明存在于人及動物腦中的與嗎啡作用相關(guān)的神經(jīng)肽的重要作用。
對于牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法，除了1985年Yang等人報告的對牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法之外，對國內(nèi)外各種文獻的檢索都未發(fā)現(xiàn)新的制備方法的報導(dǎo)。Yang等人報告的制備方法包括，圖2所示的33個步驟，可分為兩個階段(1)初步處理和提取階段(2)純化制備階段Yang等人報告的上述制備牛腦神經(jīng)肽FF的方法和工藝存在的問題是1.Yang等人的制備方法和工藝非常復(fù)雜。從牛腦中制備出牛腦神經(jīng)肽FF，需要至少33個以上的處理制備過程。
2.所用溶液有酸(三氟已酸)，有機溶劑(氰酸甲烷)和帶毒性物質(zhì)(巰基乙醇)，這不僅為進一步除去這些溶液造成困難，而且影響牛腦神經(jīng)肽FF的質(zhì)量。
3.Yang等人的方法中用90℃水浴將牛腦煮10分鐘處理不利于保持牛腦神經(jīng)肽FF的生物活性。
4.Yang等人的方法中設(shè)備條件要求高，價格昂貴，如Hplc需要數(shù)十萬元的高效液相色譜儀，尤其是FMRF-NH2抗血清CNBr活化的Sephrarose 4B親合柱造價極其昂貴。這樣制備的牛腦神經(jīng)肽FF的價格也相應(yīng)地非常昂貴。
5.Yang等人報告的方法中，制備過程復(fù)雜，制備得率低，難以深入開發(fā)，應(yīng)用。
本發(fā)明的目的就是針對上述問題，旨在導(dǎo)找一種新的簡便廉價和得率高的制備方法以制備牛腦神經(jīng)肽FF。
以下結(jié)合圖1對本發(fā)明的制備方法作以下具體說明。
選用新鮮無疾病牛腦1公斤，在0-25℃下放入一大玻璃燒杯中。加入500-2000毫升蒸餾水輕輕搖動。小心除去蒸餾水。再加入500-20000毫升蒸餾水沖洗一次。然后把牛腦放入勻漿器中并加入500-2000毫升蒸餾水，在勻漿器中轉(zhuǎn)速1000-2000轉(zhuǎn)/分，溫度0-25℃，勻漿5分鐘，取出勻漿后的牛腦放入0℃-10℃的冰箱中冷凍過夜，第二天，取出牛腦漿放入4-25℃水浴中慢慢溶化，在溶化后的牛腦漿中加入500-2000毫升蒸餾水，振蕩均勻后在1000-3000轉(zhuǎn)/分和0-25℃條件下離心10分鐘。收集上清液，在沉淀物中再加入500-2000亳升生理鹽水。振蕩均勻后再離心10分鐘(離心條件同上)。取上清液并將兩次提取的上清液混合。然后將提取的上清液用0.20μ-0.50μ的濾膜過濾。過濾溫度0-25℃，濾出液放入0℃～-10℃的冰箱中保存或直接在分子篩(Sephadex G10-G200)上柱層析。柱層析溫度0-25℃。洗脫液為蒸餾水。部分收集器以每分鐘1毫升的的流速分部收集。收集液保存在0～-10℃冰箱中。取少量收集液經(jīng)PAGE電泳檢測，收集與標(biāo)準(zhǔn)牛腦神經(jīng)肽FF電泳圖譜相似的部分，再做分子篩柱層析(Sephedex G10-G200)。柱層析溫度0-25℃，洗脫液為蒸餾水。取少量樣品做PAGE電泳。與標(biāo)準(zhǔn)牛腦神經(jīng)肽FF有同樣電泳圖譜的即可確定為牛腦神經(jīng)肽FF。收集的牛腦神經(jīng)肽FF溶液在無菌操作條件下和0-25℃范圍內(nèi)用除菌濾膜或除菌漏斗抽濾除菌。然后按5∶2比例加入1％的右旋糖苷為復(fù)興劑。在無菌操作和0-25℃條件下，將牛神經(jīng)肽FF溶液分裝于無菌安瓿瓶中(每支1毫升)。之后冷凍干燥，并在無菌操作和0-25℃條件下對安瓿瓶火焰封口，從而制成試驗用粉狀牛腦神經(jīng)肽FF。


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖，有14個步驟；圖2為對比技術(shù)的工藝流程圖，有33個步驟；從本發(fā)明的具體說明可以看出本發(fā)明突出的優(yōu)點是1、制備牛腦神經(jīng)肽FF的方法簡便。Yang等人報告的制備主法需要33步繁雜的工藝過程，而本發(fā)明僅要14步即可完成對牛腦神經(jīng)肽FF的制備。
2、Yang等人報告的制備方法中對牛腦要在90℃水浴中煮10分鐘。本發(fā)明無需高溫處理牛腦，而在0-25℃的較低溫度下制備牛腦神經(jīng)肽FF，有利于保持牛腦神經(jīng)肽FF的生物活性。
3、Yang等人報告的制備方法中使用了有機溶劑(氰酸甲烷)，酸堿溶液(三氟乙酸)和有毒物質(zhì)(巰基乙醇)。本發(fā)明全過程中不接觸任何有機溶劑，酸堿溶液和有毒物質(zhì)，能制備出高質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)安全的牛腦神經(jīng)肽FF。
4、Yang等人報告的制備方法中使用了許多昂貴的儀器和試劑，本發(fā)明使用的是廉價設(shè)備和簡便的制備條件。因此制備的牛腦神經(jīng)肽FF價格低廉，可以大量的制備和應(yīng)用。
5、由于本發(fā)明制備方法簡單，制備過程損失少，因此牛腦神經(jīng)肽FF產(chǎn)率高。每公斤牛腦可制備5克的高產(chǎn)量牛腦神經(jīng)肽FF。而Yang等人的得率很低。
實施例根據(jù)本發(fā)明結(jié)合附圖的具體說明中的制備方法對牛腦神經(jīng)肽FF進行了多次實際制備。重復(fù)制備試驗均獲得同樣的結(jié)果，實施例如下取1公斤新鮮無疾病的健康牛腦放入一大燒杯中。加入1000毫升蒸餾水，輕輕振蕩后，除去蒸餾水。再加入1000毫升蒸餾水。輕輕振蕩后再除去蒸餾水。將牛腦轉(zhuǎn)入勻漿器中并加入1000毫升蒸餾水，在20℃±2℃條件下1400轉(zhuǎn)/分，勻漿5分鐘，之后將牛腦漿放入-5℃的冰箱中冷凍過夜。第二天，取出冷凍的牛腦漿放在20℃水盆中使其慢慢溶化，在溶化后的牛腦漿中加入1000毫升蒸餾水。振蕩均勻后在離心機中2000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘(溫度20℃)。收集上清液，在沉淀物中加入1000毫升生理鹽水溶液，振蕩均勻后再在離心機中2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，再收集上清液。將兩次離心獲得的上清液含在一起，然后用0.45μ孔徑的濾膜過濾(上述操作均在20℃±2℃的條件下進行)，取過濾后的濾出液400毫升立即在1000×100毫米的分子篩柱上層析(Sephedex×G100，層析溫度為20℃，洗脫液為蒸餾水)，部分收集器以每分鐘1毫升的流速分部收集。取少重收集液做PAGE電泳。收集與標(biāo)準(zhǔn)牛腦神經(jīng)肽FF相同電泳圖譜的部分混合后再做分子篩柱層析(Sephedex G50，柱層析溫度20℃，洗脫液為蒸餾水)。再取少量樣品做PAGE電泳。收集與標(biāo)準(zhǔn)牛腦神經(jīng)肽FF相同電脈圖譜的部分(即為制備牛腦神經(jīng)肽FF)，在無菌操作和溫度20℃條件下用除菌漏斗過濾除菌。然后按5∶2比例加入無菌復(fù)興劑溶液(1％的右旋糖苷)，在無菌操作和20℃條件下將制備的牛腦神經(jīng)肽FF溶液(內(nèi)有復(fù)興劑)分裝于無菌安瓿瓶中(每支1毫升)。之后冷凍干燥，并在無菌操作和20℃條件下火焰密封安瓿瓶。從而制成試驗用粉狀牛腦神經(jīng)肽FF。按上述制備方法，每公斤牛腦可制備100支試驗用粉狀牛腦神經(jīng)肽FF(每支50毫克)，這樣每公斤牛腦可制備5克粉狀牛腦神經(jīng)肽FF)。
由下述實際應(yīng)用本發(fā)明制備的粉狀牛腦神經(jīng)肽FF經(jīng)PAGE電泳和生物學(xué)試驗進一步證明了本發(fā)明的制備方法和工藝是完全成功的和有效的。
1、PAGE電泳進一步鑒別取1支制備的粉狀牛腦神經(jīng)肽FF，加入0.2毫升蒸餾水溶解，加入0.2毫升的25％的庶糖液和10微升4％的溴酚蘭溶液，制備15％和18％濃度的兩種凝膠做PAGE電泳。加樣5微升。100v電脈3小時，然后用氨基黑10B染色液染色，之后用5％的冰已酸脫色，試驗結(jié)果表明在15％和18％兩種凝膠上電泳，制備的牛腦神經(jīng)肽FF和標(biāo)準(zhǔn)牛腦神經(jīng)肽FF都為單一的電泳帶，在15％凝膠上它們的泳動距離都為1.0厘米，在18％凝膠上它們的泳動距離都為0.8厘米。
2、阻止嗎啡成癮作用取18-20克體重的昆明種小鼠40只，分組每組10只共分4組，A組為生理鹽水組，B組為單獨給于嗎啡組，C組為同時給于嗎啡和制備的牛腦神經(jīng)肽FF組，D組為單獨制備的牛腦經(jīng)肽FF組。A組每天每只中小鼠腹腔給生理鹽水0.3毫升一次，B組動物每天腹腔給于100毫克/公斤的鹽酸嗎啡。C組動物每天腹腔除給于100毫克/公斤的鹽酸嗎啡外，同時給于40毫克/10克的牛腦神經(jīng)肽FF，D組動物每天腹腔給于40毫克/10克的牛腦神經(jīng)肽FF，每天一次給藥，給于7天后，從第八天開始每天兩次給藥連續(xù)四天，然后在第12天上午給藥6小時后，給鈉酷酮(5毫克/每只小鼠)做跳臺試驗，結(jié)果表明，單獨生理鹽水動物(A組)不成癮。單獨嗎啡組動物(B)組100％的動物成癮，嗎啡和制備的牛腦神經(jīng)肽FF合用組(C組)動物僅30％成癮，70％的不成癮。單獨制備的牛腦神經(jīng)肽FF組(D組)動物不成癮，三次重復(fù)試驗結(jié)果完相相同。這說明制備的牛腦神經(jīng)肽FF具有抗嗎啡成癮作用。這一結(jié)果與1991年Rothman和1996年Gooman報告的牛腦神經(jīng)肽FF具有抑制和減少嗎啡誘導(dǎo)的各種生物學(xué)作用的結(jié)果相吻合。
3、抑制已成癮動物的發(fā)作作用。
取18-22克的昆明種小鼠40只，分組每組10只，共分4組，所有小鼠按體重每次腹腔注射鹽酸嗎啡100毫升/公斤，一天兩次。在第九天上午注射嗎啡6小時后做跳臺試驗。A組為成癮探測組，每只小鼠注射5毫克/公斤的鈉絡(luò)酮催癮，結(jié)果100％的動物都成癮，B組為生理鹽水治療組。在給納絡(luò)酮前1小時給于0.5毫升/每只的生理鹽水，然后再給于5毫克/公斤的納絡(luò)酮催癮，結(jié)果30％的成癮小鼠不發(fā)作。C組為制備的牛腦神經(jīng)肽FF組，在給納絡(luò)酮前1小時給于40毫克/10克的牛腦神經(jīng)肽FF，然后再給于5毫克/公斤的納絡(luò)酮催癮，結(jié)果70％的成癮小鼠不發(fā)作。D組為不治療組，在給納絡(luò)酮前不做任何治療，在給于5毫克/kg的納絡(luò)酮催癮后100％的小鼠都發(fā)作。試驗重復(fù)三次，結(jié)果完全相同。
權(quán)利要求
1.一種牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法，其特征在于制備方法依次包括以下步驟取新鮮健康牛腦為原料經(jīng)蒸餾水兩次清洗，在勻漿器中勻漿，在離心機中離心，收集上清液，以濾膜過濾，濾出液在分子篩上柱層析，以部分收集器分部收集，PAGE電泳檢測，過濾除菌，冷凍干燥為粉狀牛腦神經(jīng)肽FF。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法，其特征在于在0-25℃溫度用蒸餾水對新鮮健康牛腦進行輕輕振蕩清洗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法，其特征在于將清洗過的牛腦經(jīng)過勻漿器在轉(zhuǎn)速為1000-2000轉(zhuǎn)/分，溫度為0-25℃條件下勻漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法，其特征在于勻漿后的牛腦漿經(jīng)過500-2000毫升蒸餾水和500-2000毫升生理鹽水兩次分布提取，在1000-3000轉(zhuǎn)/分的離心機0-25℃溫度條件下離心獲得上清液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法，其特征在于用孔徑為0.20μ至0.50μ的濾膜對提取的上清液進行過濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法，其特征在于用分子篩(Sephedex G10-G200)進行兩次柱層析，柱層析溫度0-25℃，洗脫液為蒸餾水。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法，其特征在于收集的牛腦神經(jīng)肽FF溶液采用除菌濾膜或除菌漏斗抽濾除菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法，其特征在于除菌后的濾液按5∶2的比例加入1％的右旋糖苷為復(fù)興劑，并分裝于無菌安瓿中冷凍干燥為粉末狀，并在0-25℃條件下，無菌操作對安瓿瓶火焰封口。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法，其特征在于在全部制備過程中僅以蒸餾水、生理鹽水為溶劑。
全文摘要
本發(fā)明為牛腦神經(jīng)肽FF的制備方法,其制備工藝步驟順序為將新鮮健康牛腦經(jīng)蒸餾水兩次清洗,在勻漿器中勻漿,在離心機中離心,收集上清液,以濾膜過濾,濾出液在分子篩上柱層析,以部分收集器分部收集,PAGE電泳檢測,過濾除菌,冷凍干燥為粉末,牛腦神經(jīng)肽FF,此方法工藝簡便,得率高,工藝過程不破壞牛腦神經(jīng)肽FF的生物活性,溶劑只有蒸餾水和生理鹽水,無污染,價格低廉。
文檔編號C07K14/435GK1172115SQ97112508
公開日1998年2月4日 申請日期1997年7月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月4日
發(fā)明者安玉會 申請人:安玉會