神經(jīng)保護(hù)肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于治療神經(jīng)退行性紊亂的方法。該方法包括向所述的受試對象給藥治療有效量的分離的肽，該肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過所述的CD44V10氨基酸序列的20個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性。
【專利說明】神經(jīng)保護(hù)肽
[0001]本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】和【背景技術(shù)】
[0002]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及神經(jīng)保護(hù)肽試劑及其用途。
[0003]神經(jīng)退行性紊亂(例如阿爾茨海默氏疾病(AD)、帕金森氏疾病(PD)、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)和Huntington疾病(HD))是成人發(fā)作的、慢性的、進(jìn)行性且不可逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重喪失能力的疾病，其中存在神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)行性喪失，包含神經(jīng)元的死亡。 [0004]阿爾茨海默氏疾病(AD)是最普遍的神經(jīng)退行性紊亂，其可表征為認(rèn)知功能的進(jìn)行性喪失。AD的組織病理學(xué)定義為蛋白質(zhì)的異常，即，蛋白斑和神經(jīng)元纖維的纏結(jié)，這是分別由淀粉樣肽-β (Αβ)和過度磷酸化Tau蛋白的沉積所導(dǎo)致的。這些病理學(xué)伴隨有神經(jīng)元和白質(zhì)的喪失、嗜剛果紅血管病、炎癥和氧化性損傷[I]。炎癥在AD中的作用可通過老年斑周圍的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變以及神經(jīng)膠質(zhì)過多癥來證明[2]。Αβ肽是由β-淀粉樣肽前體蛋白質(zhì)(APP)通過初始β_分泌酶切割、然后通過Y-分泌酶(在其催化核心與早老素I形成蛋白質(zhì)絡(luò)合物)的膜內(nèi)消化而生產(chǎn)的。所得的肽被分泌并沉積在AD定義的淀粉樣蛋白斑中[I]。
[0005]帕金森氏疾病(PD)是在大腦的黑質(zhì)密部中多巴胺能神經(jīng)元的選擇性退化所導(dǎo)致的慢性進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病。癥狀包含運(yùn)動神經(jīng)相關(guān)的情況，包含運(yùn)動的震顫、肌張力增高、遲緩、以及姿勢不穩(wěn)定。自主功能障礙以及感覺和睡眠困難為非運(yùn)動神經(jīng)的癥狀。認(rèn)知和神經(jīng)行為的問題(包含癡呆)在疾病的晚期是普通的。ro通常在大約60歲顯現(xiàn)，但是存在年輕人發(fā)作的情況。ro的主要病理學(xué)特征為黑質(zhì)(更具體而言為密部的腹側(cè)部)中的細(xì)胞死亡，從而到患者死亡時(shí)影響了至多70%的細(xì)胞[3]。
[0006]CD44編碼了 I類跨膜蛋白質(zhì)家族，其由廣泛的選擇性剪切和翻譯后修飾得到。變化位于蛋白質(zhì)的最接近細(xì)胞外膜的部分，并且由變體外顯子V2 (在小鼠中為VI)至VlO編碼[4]。⑶44為透明質(zhì)酸(HA)的主要細(xì)胞表面受體，但是其還顯示出與諸如膠原蛋白、纖維連接蛋白、纖維蛋白原、層粘連蛋白和骨橋蛋白之類的蛋白質(zhì)結(jié)合[5]。對于使淋巴細(xì)胞循環(huán)至炎癥位點(diǎn)處的募集而言，⑶44是必須的[6，7]。⑶44S是最普遍的形式，并且大多數(shù)類型的細(xì)胞所表達(dá)，其中所述的⑶44S不包含任何變體外顯子[8]。⑶44變體蛋白質(zhì)大多與癌癥和自體免疫疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[10]和多發(fā)性硬化[11])相關(guān)報(bào)道[9]，其中包含10個(gè)變體外顯子中的一個(gè)或多個(gè)。CD44剪接變體所提示的一種獨(dú)特的功能為參與信號傳導(dǎo)。例如，顯示CD44V6對于通過酪氨酸激酶(例如c-Met[12]和VEGFR_2[13])的信號發(fā)射而言是必須的。
[0007]在大腦中，⑶44主要在白質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[14-18]。與此不同的是，包含外顯子V4、V5和VlO的⑶44變體局限于神經(jīng)元[17]。此外，在短暫性前腦缺血后的海馬體中，在活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了⑶44的表達(dá)[19]。當(dāng)Akiyama et al報(bào)道了⑶44陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的特定子集(其數(shù)量在AD的大腦中急劇升高)時(shí)，CD44首次與AD相關(guān)提及[14]。由于發(fā)現(xiàn)⑶44對于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突是必須的，報(bào)道了⑶44在CNS再生中的潛在作用[20]。由于與大腦中動脈阻塞后的野生型小鼠的梗塞面積相比，CD44缺陷型小鼠的梗塞面積減小，⑶44在缺血性腦損傷中起到作用[21]。Lammich et al[22]報(bào)道，CD44通過早老素依賴的分泌物完成雙重膜內(nèi)分裂，其中所述的分泌物釋放出細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和用于推定的核信號發(fā)射的CD44細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[22]。
[0008]W02009007934教導(dǎo)與非AD個(gè)體相比，在AD患者的海馬體中，剪接變體CD44V3、CD44V6和CD44V10的表達(dá)顯著升高。
[0009]發(fā)明概述
[0010]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了用于治療有需要的受試對象的神經(jīng)退行性紊亂的方法，包括:向受試對象給藥治療有效量的分離的肽，該肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過CD44V10氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性，由此治療神經(jīng)退行性紊亂。[0011]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了用于治療有需要的受試對象的神經(jīng)退行性紊亂的方法，包括:向受試對象給藥治療有效量的分離的肽，該肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過CD44V6氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性，由此治療神經(jīng)退行性紊亂。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了分離的肽，該肽包含⑶44V10氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過CD44V10氨基酸序列的20個(gè)氨基酸，前提條件是所述的肽并非由SEQ ID N0:49或50所列的氨基酸序列構(gòu)成，所述的肽包含神經(jīng)保護(hù)活性。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了分離的肽，該肽包含⑶44V6氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過CD44V6氨基酸序列的20個(gè)氨基酸，所述的肽包含神經(jīng)保護(hù)活性，前提條件是所述的肽并非由SEQ ID NO: 1、51或52所列的氨基酸序列構(gòu)成。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了藥物組合物，包含作為活性試劑的分離的肽和藥學(xué)上有效的載體，所述的分離的肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過⑶44V10氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了用于治療神經(jīng)退行性紊亂的分離的肽，該分離的肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過CD44V10氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽包含式I所示的氨基酸序列:
[0017]X1-G-Y-T-S
[0018]其中Xl為谷氨酸或谷氨酰胺的任意一者。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的氨基酸序列包含擬肽。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的擬肽包含逆反模擬物。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽如SEQ ID N0:26、45或46所列。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽由⑶44V10氨基酸序列構(gòu)成。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，⑶44V10氨基酸序列為人⑶44V10氨基酸序列。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，⑶44V6氨基酸序列為人⑶44V6氨基酸序列。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽包含核心序列X1-X2-S-H,其中X1和X2為酸性氨基酸。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，Xl包含谷氨酸。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，X2包含天冬氨酸。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽由⑶44V6氨基酸序列構(gòu)成。[0029]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽包含在SEQ ID NO:8_15、18_45或46中所列的氨基酸序列。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽包含在SEQ ID N0:49或50中所列的氨基酸序列。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽包含在SEQ ID N0:2-7、16或17中所列的
氨基酸序列。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了用于治療神經(jīng)退行性紊亂的分離的肽，該分離的肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過CD44V6氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，神經(jīng)退行性紊亂選自:帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、ALS、多系統(tǒng)萎縮、阿爾茨海默氏疾病、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、進(jìn)行性核上性麻痹、額顳葉癡呆伴與染色體17相關(guān)的帕金森病、以及Pick疾病。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，神經(jīng)退行性疾病為帕金森氏疾病。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，神經(jīng)退行性疾病為阿爾茨海默氏疾病。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽包含選自SEQ ID NO: 12, 15，17，19，24，26，31，32，34，36-38，43-46中 的氨基酸序列。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽包含在SEQ ID NO:26或45中所列的氨基酸序列。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，包含作為活性試劑的分離的肽和藥學(xué)上有效的載體，所述的分離的肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過CD44V6氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性。
[0039]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽附著在細(xì)胞滲透試劑上。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，至少一個(gè)氨基酸為天然存在的氨基酸。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，至少一個(gè)氨基酸為合成的氨基酸。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，合成的氨基酸包含D異構(gòu)體。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，分離的肽共價(jià)附著在細(xì)胞滲透試劑上。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞滲透試劑為肽試劑。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽不超過20個(gè)氨基酸。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述的肽的長度為5-10個(gè)氨基酸。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了選擇用于治療神經(jīng)退行性疾病的試劑的方法，該方法包括:
[0048](a)在神經(jīng)毒劑存在下，使⑶44V10/6肽與神經(jīng)元細(xì)胞接觸；以及
[0049](b)監(jiān)測神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞死亡，其中與在⑶44V10/6肽缺乏下神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞死亡的量或時(shí)間相比，在CD44V10/6肽存在下神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞死亡的量或時(shí)間降低指示用于治療神經(jīng)退行性疾病的試劑。
[0050]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，神經(jīng)毒劑選自淀粉樣肽、谷氨酸鹽、6-0HDA、MPTP和MPP+ο
[0051 ] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，給藥包含皮下給藥。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，給藥包含鼻內(nèi)給藥。[0053]除非另作說明，否則本文所用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中任一普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管與本文所述的那些方法和材料相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡梢杂糜趯?shí)施或測試本發(fā)明的實(shí)施方案，但是示例性的方法和/或材料如下描述。在矛盾的情況下，本專利的說明書(包含定義)將具有控制權(quán)。此外，所述的材料、方法和實(shí)例僅是示例性的，無意于一定是限定性的。
[0054]附圖簡述
[0055]本發(fā)明的一些實(shí)施方案在本文中僅以實(shí)例的方式參照附圖進(jìn)行描述?，F(xiàn)在詳細(xì)地參見附圖，重點(diǎn)在于所示的具體特征為實(shí)例，并且其目的在于示例性地討論本發(fā)明的實(shí)施方案。就此而言，說明以及附圖使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員如何可以實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方案而變得顯而易見。
[0056]在附圖中:
[0057]如圖1A-B為具有多種哺乳動物有機(jī)體的蛋白質(zhì)序列的特征的⑶44V6 (圖1A)和⑶44V10 (圖1B)的多個(gè)蛋白質(zhì)序列比對。使用蛋白質(zhì)Blast在線算法(NCBI)進(jìn)行比對。保守殘基被標(biāo)記為框，其中在所述的保守殘基中，在任何物種中具有至多I個(gè)保守的替代。在保守殘基中的非保守替代標(biāo)記為紅色字母。
[0058]圖2示出了 V6 (小鼠)和VlO (A)肽的列表，其中所述的肽的合成是根據(jù)圖1所示的保守區(qū)域來指導(dǎo)的。
[0059]圖3為柱狀圖，其示出了 V6和VlO肽在3種濃度下對使用80 μ M Αβ (1-42)處理48小時(shí)后的SK-N-SH人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存能力的影響。使用XTT比色測定來確定細(xì)胞的生存能力。
[0060]圖4Α-Β為柱狀圖，其示出了 V6和VlO肽在InM下對使用25 μ M Αβ (25-35)處理48小時(shí)后的Ν2Α小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存能力的影響。示出(圖4Α)通過XTT測量的相對的細(xì)胞生存能力以及(圖4Β)相對的Caspase3活性水平。
[0061]圖5A-B為柱狀圖，其示出了 V6和VlO肽在I μ M下對使用200 μ MMPTP處理48小時(shí)后的Ν2Α小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存能力的影響。示出相對的細(xì)胞生存能力(圖5Α)以及Caspase3活性水平(圖5B)。
[0062]圖6A-C為這樣的圖，其示出了在表1和圖2中所列的人V6和VlO肽在IpM下對使用30 μ M處理48小時(shí)后的Ν2Α小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存能力的影響。示出相對的生存能力(圖6Α)以及Caspase3活性(圖6B)。在各種濃度下，測試N-乙酰化的和C-酰胺化的V10Al_N+4肽對30 μ M6-0HDA在Ν2Α細(xì)胞中的保護(hù)作用。示出通過阿爾瑪藍(lán)熒光測量的相對生存能力。
[0063]圖7Α-Β為柱狀圖，其示出了在表1和圖2中所列的人V6和VlO肽在IpM下對使用25 μ M Αβ (25-35)處理48小時(shí)后的SK-N-SH人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存能力的影響。示出通過阿爾瑪藍(lán)熒光測量的相對生存能力(圖7Α)和Caspase3活性(圖7B)。
[0064]圖8A-B為柱狀圖，其示出了在表3中所列的人P26衍生的肽在IOfM和IpM下對使用30 μ M6-0HDA(圖8A)或40 μ M (圖8Β)處理22小時(shí)后的Ν2Α小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存能力的影響。在圖8Β中，將細(xì)胞與所述的肽預(yù)溫育2.3小時(shí)，然后加入6-0HDA ;而在圖8Α中，將6-0HDA與所述的肽一起加入。示出通過阿爾瑪藍(lán)熒光測量的相對生存能力。
[0065]圖9為柱狀圖，其示出了在新目標(biāo)識別(NOR)任務(wù)中，在保持測試階段上，重復(fù)IH/ICV 給藥 P26(SEQ ID NO:26, I, 10 IOOng/大鼠)或 P34(SEQ ID NO: 34，10 和 IOOng/大鼠)對鑒別指數(shù)的影響。**Ρ〈0.ΟΙΑβ (1_42)是媒介物VS對照組(無Αβ (1_42))并且##P〈0.01是VS媒介物對照的情況。
[0066]圖1OA-B為皮下(SC)給藥所述的肽對微注射A β后的摩里斯水迷宮(MWM)空間記憶測試的影響的圖。A為在MWM中經(jīng)過4段訓(xùn)練時(shí)期后的平均潛伏期。在肽處理組中，Ρ26組示出與賦形劑組相比較低水平的平均潛伏期(在第2、3和4天中為#ρ〈0.001)。B示出了在測試時(shí)期上在目標(biāo)象限中的時(shí)間消耗。Ρ26示出了在目標(biāo)象限中與賦形劑組(UV未處理組)相比較高水平的時(shí)間消耗(#Ρ〈0.05)。
[0067]圖11為柱狀圖，其示出了 SC給藥的肽對微注射A β后的NOR測試的影響。示出在保持測試階段上的鑒別指數(shù)。*p〈0.05VS對照組并且#p〈0.05VS只有A β組的情況。
[0068]圖12 為示出 P26(SEQ ID NO:26)和 P26-RI (SEQ ID NO:45)的藥代動力學(xué)的圖，其中所述的藥代動力學(xué)是在雄性Sprague Dawley大鼠中皮下給藥劑量為lmg/kg的肽之后進(jìn)行評價(jià)的。使用LC-MS/MS方法來定量血漿樣品中的兩種肽。最低定量限(LLOQ)為22.34ng/mL。
[0069]圖13為⑶44的基因組結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0070]本發(fā)明的具體實(shí)施方案的描述
[0071]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及神經(jīng)保護(hù)肽試劑及其用途。
[0072]在詳細(xì)地講解本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)該理解的是本發(fā)明并非一定使其用途局限于在以下說明書中列出的或通過實(shí)施例舉例說明的詳細(xì)情況。本發(fā)明可以為其他實(shí)施方案，或者以不同的方式實(shí)施或執(zhí)行。
[0073]之前發(fā)現(xiàn)，與非AD的個(gè)體相比，剪接變體CD44V3、CD44V6和CD44V10的表達(dá)在AD患者的海馬體中顯著升高。表達(dá)的⑶44變體被進(jìn)一步表征，并發(fā)現(xiàn)為主要的神經(jīng)元[23]。
[0074]本發(fā)明人表征了由⑶44V6和VlO外顯子序列衍生的多個(gè)肽的功能，并發(fā)現(xiàn)這些肽賦予神經(jīng)元細(xì)胞對神經(jīng)毒素(例如β淀粉樣肽(Αβ)、ΜΡΤΡ和6-0HDA)的抗性，表明這些肽或衍生物可以作為用于治療神經(jīng)退行性紊亂的藥品。
[0075]本發(fā)明人進(jìn)行了結(jié)構(gòu)-功能分析，從而揭示賦予神經(jīng)保護(hù)的最小活性結(jié)構(gòu)域。結(jié)果在用于帕金森氏疾病和阿爾茨海默氏疾病的動物模型中進(jìn)一步證實(shí)。這些發(fā)現(xiàn)使得本發(fā)明的肽成為用于藥品研發(fā)的前導(dǎo)化合物。
[0076]因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了分離的肽，其包含⑶44V10氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過所述的CD44V10氨基酸序列的20個(gè)氨基酸，其中所述的肽包含神經(jīng)保護(hù)活性。
[0077]根據(jù)本發(fā)明的其他或備選方面，提供了分離的肽，其包含CD44V6氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過所述的CD44V6氨基酸序列的20個(gè)氨基酸，所述的肽包含神經(jīng)保護(hù)活性。
[0078]根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，CD44V10氨基酸序列并非由以下序列構(gòu)成:
[0079]DSTDRIPATIRNDVTGGRR(SEQ ID NO:49);或
[0080]NSNVNRSLS⑶QDTFHPSG(SEQ ID NO:50)。
[0081]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，CD44V6氨基酸序列并非由以下序列構(gòu)成:
[0082]DSTDRIPATIQATPSSTTE(SEQ ID NO:51);或[0083]DSHSTTGTAGDQDTFHPSG(SEQ ID NO:52)。
[0084]包含在SEQ ID N0:49_52中所列的氨基酸序列的肽被考慮用于治療神經(jīng)退行性疾病，其在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0085]如本文所用，“CD44”是指如在RefSeq編號No:NM_000610.3中所列的在大量的哺乳動物細(xì)胞類型中表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。根據(jù)具體的實(shí)施方案，CD44為人CD44基因。包含外顯子1-5和16-20的標(biāo)準(zhǔn)的同工型(命名為⑶44)在大部分的細(xì)胞類型中表達(dá)。在圖13中提供了基因結(jié)構(gòu)，包含剪接變體⑶44V6和⑶44V10的基因結(jié)構(gòu)。
[0086]如本文所用，術(shù)語“CD44V10”相當(dāng)于SEQ ID N0:53(RefSeq編號 Νο:ΝΜ_000610.3，人⑶44抗原同工型I前體，NCBI參照序列)的氨基酸配合物537-604，并且通過SEQ ID NO: 2舉例說明。
[0087]如本文所用，術(shù)語“CD44V6”相當(dāng)于SEQ ID NO: 53 (RefSeq 編號 Νο:ΝΡ_000601.3，人⑶44抗原同工型I前體，NCBI參照序列)的氨基酸配合物386-427，并且通過SEQ ID NO: 8舉例說明。[0088]如本文所用，短于“神經(jīng)保護(hù)活性”是指防止神經(jīng)細(xì)胞死亡。其作用可以采用保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞(即，神經(jīng)元)凋亡或退化的形式。合格地用于神經(jīng)保護(hù)活性的測試包含細(xì)胞生存能力測試(例如χττ、ΜΤΤ)、形態(tài)學(xué)測試(例如細(xì)胞染色)、或者凋亡生物化學(xué)測試(例如Caspase3 活性等)。
[0089]根據(jù)具體的實(shí)施方案，⑶44V6氨基酸序列為人⑶44V6氨基酸序列。
[0090]根據(jù)具體的實(shí)施方案，⑶44V10氨基酸序列為人⑶44V10氨基酸序列。
[0091]根據(jù)另一個(gè)具體的實(shí)施方案，所述的肽由⑶44V6氨基酸序列(SEQ IDN0:2)構(gòu)成。
[0092]盡管將本發(fā)明進(jìn)一步簡化為實(shí)踐，但是本發(fā)明人揭示賦予神經(jīng)保護(hù)的肽部分(氨基酸序列)包含核心序列X1-X2-S-H,其中X1和X2為酸性氨基酸。
[0093]如本文所用，短語“酸性氨基酸”是指在生理pH下為極性且?guī)ж?fù)電荷的天然存在的或合成的氨基酸。
[0094]根據(jù)具體的實(shí)施方案，X1包含谷氨酸。
[0095]根據(jù)具體的實(shí)施方案，X2包含天冬氨酸。
[0096]根據(jù)具體的實(shí)施方案，所述的肽包含SEQ ID N0:6或7的氨基酸序列。
[0097]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，CD44V6由CD44V6氨基酸序列(SEQ ID NO:2)構(gòu)成。
[0098]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述的肽包含在SEQ ID NO:2-7, 16或17中所列的氨基酸序列。
[0099]如所提及的那樣，本發(fā)明還考慮了⑶44V10的肽。因此，根據(jù)示例性實(shí)施方案，所述的肽包含在 SEQ ID N0:8-15, 18-46、或者具體為 SEQ ID N0:8_15, 18-38，39-42 或43-46中所列的氨基酸序列。
[0100]盡管將本發(fā)明進(jìn)一步簡化為實(shí)踐，但是本發(fā)明人能夠鑒別在賦予神經(jīng)保護(hù)中為活性的⑶44V10的最小部分。
[0101]因此，根據(jù)示例性實(shí)施方案，⑶44V10肽包含式I的氨基酸序列:
[0102]X1-G-Y-T-S,
[0103]其中X1為谷氨酸或谷氨酰胺的任一者。[0104]下文將進(jìn)一步詳細(xì)描述，所述的肽的氨基酸序列包含擬肽，例如逆反模擬物(例如SEQ ID NO:45 或 46)。
[0105]根據(jù)示例性的實(shí)施方案，所述的肽在SEQ ID N0:26中列出。
[0106]根據(jù)示例性的實(shí)施方案，所述的肽在SEQ ID NO:26, 45或46中列出。
[0107]根據(jù)另一個(gè)具體的實(shí)施方案，所述的肽由⑶44V10氨基酸序列(SEQ ID NO:8)構(gòu)成。 [0108]如本文所用，術(shù)語“肽”是指天然或合成的氨基酸的聚合物，涵蓋了天然的肽(或者降解產(chǎn)物，以合成方式合成的多肽或重組多肽)和擬肽(例如翻轉(zhuǎn)、反向或逆反的，通常為以合成方式合成的肽)，以及作為多肽類似物的類肽和半類肽(其可以具有例如修飾，從而使所述的肽在肌體中時(shí)甚至更穩(wěn)定，或者更能夠滲透到細(xì)胞中)。
[0109]此類修飾包含但不限于N-末端修飾、C-末端修飾、多肽鍵修飾，包含但不限于CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH, CF=CH、主鏈修飾、和殘基修飾。用于制備擬肽化合物的方法是本領(lǐng)域公知的，并且在例如Quantitative DrugDesign, C.A.Ramsden Gd., Chapter 17.2, F.Choplin Pergamon Press (1992)中詳述，所述的文獻(xiàn)以引用方式并入本文，如同在本文中全部列出一樣。下文將提供這方面的其他細(xì)節(jié)。
[0110]所述的多肽中的多肽鍵(-C0-NH-)可以被例如N-甲基化的鍵(-N(CH3)-C0_)、酯鍵(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亞甲基鍵(-CO-CH2-), α-氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R為任何的烷基，例如甲基、碳胺鍵(-CH2-NH-)、羥亞乙基鍵(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺鍵(-CS-NH-)、烯烴雙鍵(-CH=CH-)、反向酰胺鍵(-NH-C0-)、多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-,其中R為天然存在于碳原子上的“正常的”側(cè)鏈)。
[0111]這些修飾可以在沿著多肽鏈的任何鍵上以及甚至在多處(2-3)同時(shí)形成。
[0112]天然的芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以取代合成的非天然酸，例如苯基甘氨酸、naphthylelanine (Nol)、Phe的環(huán)甲基化的衍生物、Phe的鹵化衍生物或者O-甲基-Tyr。
[0113]除了上文所述，本發(fā)明的多肽還可以包含一種或多種修飾的氨基酸、或者一種或多種非氨基酸單體(例如脂肪酸、絡(luò)合的碳水化合物等)。
[0114]如在以下說明書和權(quán)利要求書部分所用，術(shù)語“一種氨基酸”或“多種氨基酸”可以理解為包含:20種天然存在的氨基酸；這些氨基酸通常在體內(nèi)經(jīng)過翻譯后修飾，包含例如羥脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；以及其他不常見的氨基酸，包含但不限于2-氨基己二酸、羥基賴氨酸、異鎖鏈素、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。此外，術(shù)語“氨基酸”包含D-和L-氨基酸(立體異構(gòu)體)。
[0115]下表A和B列出了可以在本發(fā)明中使用的天然存在的氨基酸(表A)和非常規(guī)的或修飾的氨基酸(表B)。
[0116]表A
[0117]
MMI三字母縮寫I單字母符號
丙氨酸Al^A
精氨酸A^iR
【權(quán)利要求】
1.一種治療有需要的受試對象的神經(jīng)退行性紊亂的方法，包括:向所述的受試對象給藥治療有效量的分離的肽，該肽包含CD44V10氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過所述的⑶44V10氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性，由此治療所述的神經(jīng)退行性紊亂。
2.一種治療有需要的受試對象的神經(jīng)退行性紊亂的方法，包括:向所述的受試對象給藥治療有效量的分離的肽，該肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過所述的CD44V6氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性，由此治療所述的神經(jīng)退行性紊亂。
3.一種分離的肽，包含CD44V10氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過所述的CD44V10氨基酸序列的20個(gè)氨基酸，前提條件是所述的肽并非由SEQ ID NO:49或50所列的氨基酸序列構(gòu)成，所述的肽包含神經(jīng)保護(hù)活性。
4.一種分離的肽，包含CD44V6氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過所述的CD44V6氨基酸序列的20個(gè)氨基酸，所述的肽包含神經(jīng)保護(hù)活性，前提條件是所述的肽并非由SEQID NO: 1、51或52所列的氨基酸序列構(gòu)成。
5.一種藥物組合物，包含作為活性試劑的分離的肽和藥學(xué)上有效的載體，所述的分離的肽包含⑶44V10氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過⑶44V10氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性。
6.一種用于治療神經(jīng)退行性紊亂的分離的肽，包含⑶44V10氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過所述的CD44V10氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性。
7.權(quán)利要求1、3 、5或6所述的方法或分離的肽，其中所述的肽包含式I所示的氨基酸序列:
X1-G-Y-T-S 其中X1為谷氨酸或谷氨酰胺的任意一者。
8.權(quán)利要求7所述的方法或分離的肽，其中所述的氨基酸序列包含擬肽。
9.權(quán)利要求8所述的方法或分離的肽，其中所述的擬肽包含逆反模擬物。
10.權(quán)利要求7-9所述的方法或分離的肽，其中所述的肽如同在SEQID NO:26、45或46中所列。
11.權(quán)利要求1、3、5或6所述的方法或分離的肽，其由⑶44V10氨基酸序列構(gòu)成。
12.權(quán)利要求1、3、5或6所述的方法或分離的肽，其中所述的CD44V10氨基酸序列為人⑶44V10氨基酸序列。
13.權(quán)利要求2或4所述的方法或分離的肽，其中所述的CD44V6氨基酸序列為人CD44V6氨基酸序列。
14.權(quán)利要求2或4所述的方法或分離的肽，包含核心序列X1-X2-S-H,其中X1和X2為酸性氨基酸。
15.權(quán)利要求14所述的方法或分離的肽，其中X1包含谷氨酸。
16.權(quán)利要求14所述的方法或分離的肽，其中X2包含天冬氨酸。
17.權(quán)利要求2或4所述的方法或分離的肽，其中所述的肽由CD44V6氨基酸序列構(gòu)成。
18.權(quán)利要求1、3、5或6所述的方法或分離的肽，其中所述的肽包含在SEQIDNO:8-15、18-45或46中所列的氨基酸序列。
19.權(quán)利要求1所述的方法或權(quán)利要求6所述的分離的肽，其中所述的肽包含在SEQIDNO:49或50中所列的氨基酸序列。
20.權(quán)利要求2或4所述的方法或分離的肽，其中所述的肽包含在SEQID NO:2-7,16或17中所列的氨基酸序列。
21.一種用于治療神經(jīng)退行性紊亂的分離的肽，包含⑶44V6氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過所述的CD44V6氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性。
22.權(quán)利要求1、2、3、4、6或21的任意一項(xiàng)所述的方法或分離的肽，其中所述的神經(jīng)退行性紊亂選自:帕金森氏疾病、多發(fā)性硬化、ALS、多系統(tǒng)萎縮、阿爾茨海默氏疾病、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、進(jìn)行性核上性麻痹、額顳葉癡呆伴與染色體17相關(guān)的帕金森病、以及Pick疾病。
23.權(quán)利要求1、2、3、4、6或21的任意一項(xiàng)所述的方法或分離的肽，其中所述的神經(jīng)退行性疾病為帕金森氏疾病。
24.權(quán)利要求1、2、3、4、6或21的任意一項(xiàng)所述的方法或分離的肽，其中所述的神經(jīng)退行性疾病為阿爾茨海默氏疾病。
25.權(quán)利要求23-24所述的方法或分離的肽，其中所述的肽包含選自SEQID NO: 12, 15，17，19，24，26，31，32，34，36-38，43-46 中的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求23所述的方法或分離的肽，其中所述的肽包含在SEQID NO:26或45中所列的氨基酸序列。
27.一種藥物組合物，包 含作為活性試劑的分離的肽和藥學(xué)上有效的載體，所述的分離的肽包含CD44V6氨基酸序列的至少3個(gè)氨基酸和不超過CD44V6氨基酸序列的100個(gè)氨基酸，并且包含神經(jīng)保護(hù)活性。
28.權(quán)利要求1-27的任意一項(xiàng)所述的方法、分離的肽或藥物組合物，其中所述的肽附著在細(xì)胞滲透試劑上。
29.權(quán)利要求1-27的任意一項(xiàng)所述的方法、分離的肽或藥物組合物，其中至少一種所述的氨基酸為天然存在的氨基酸。
30.權(quán)利要求1-27的任意一項(xiàng)所述的方法、分離的肽或藥物組合物，其中至少一種所述的氨基酸為合成氨基酸。
31.權(quán)利要求30所述的方法、分離的肽或藥物組合物，其中所述的合成的氨基酸包含D-異構(gòu)體。
32.權(quán)利要求28所述的方法、分離的肽或藥物組合物，其中所述的分離的肽共價(jià)附著在所述的細(xì)胞滲透試劑上。
33.權(quán)利要求28所述的方法、分離的肽或藥物組合物，其中所述的細(xì)胞滲透試劑為肽試劑。
34.權(quán)利要求1-27的任意一項(xiàng)所述的方法、分離的肽或藥物組合物，其中所述的肽不超過20個(gè)氨基酸。
35.權(quán)利要求1-27的任意一項(xiàng)所述的方法、分離的肽或藥物組合物，其中所述的肽的長度為5-10個(gè)氨基酸。
36.一種選擇用于治療神經(jīng)退行性疾病的試劑的方法，所述的方法包括: (a)在神經(jīng)毒劑存在下，使CD44V10/6肽與神經(jīng)元細(xì)胞接觸；以及(b)監(jiān)測所述的神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞死亡，其中與在所述的CD44V10/6肽缺乏下所述的神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞死亡的量或時(shí)間相比，在所述的CD44V10/6肽存在下所述的神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞死亡的量或時(shí)間降低指示用于治療神經(jīng)退行性疾病的試劑。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的神經(jīng)毒劑選自:淀粉樣肽、谷氨酸鹽、6-0HDA、MPTP 以及 MPP+。
38.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的給藥包含皮下給藥。
39.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的給藥包含鼻內(nèi)給藥。
【文檔編號】A61P25/28GK103648517SQ201280014793
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月24日
【發(fā)明者】E·皮納, N·齊薩佩爾 申請人:紐瑞姆制藥（1991）有限公司