專利名稱：Na－2－(4－硝基苯磺酰)乙氧羰基－氨基酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種被護氨基酸衍生物，該衍生物的合成法及利用該衍生物進行固相肽合成的反應(yīng)過程。
具有生物活性的肽可以用于醫(yī)學和生物學研究，也可以作為藥學、獸醫(yī)和診斷上的活性物質(zhì)，目前其制備廣泛采用固相肽合法的方法。
固相肽合成的實質(zhì)可以概括為，由被附加到一不溶性載體上的第一個C一端氨基酸開始，通過反復循環(huán)的化學反應(yīng)，逐步增長肽鏈。在這類合成路線中，多步反應(yīng)的目標產(chǎn)生一直被鏈合在所用的載體上，而過多的反應(yīng)物和副反應(yīng)，則可以通過過濾和載體的洗滌被除去。
為了完成肽的固相合成，第一個帶有被護α-氨基的氨基酸(目標氨基酸序列的C一端)，通過其與一個不溶性高分子載體上的自由α-羰基成酰鍵或酰胺鍵，共價鍵合到該載體。然后，Nα-保護基從所得到的Nα-被護氨?；?高分子上選擇性地被消除，于是得到具有自由的氨基的氨?；?高分子。這個高分子進一步與下一個Nα-被護氨基酸?；?，于是得到Nα-被護二肽-高分子。這樣合成的循環(huán)，即，消除Nα-保護基，接著這個自由的氨基與跟隨的Nα-被護氨基酸酰化，不斷重復，直到得到目標氨基酸序列的集合體。
在實際固相合成中，為了保證全部轉(zhuǎn)化，酰化試劑通常需要大摩爾過量(2～10倍)，因此在氨基酸側(cè)健上的所有活性基團，如胺基、羰基、羥基、巰基、胍基要用適當?shù)谋Ｗo基團封端。用于該目的的保護基團必須謹慎地選擇，以使在肽-高分子酰化條件下和消除臨時的Nα-保護過程中，這些側(cè)鍵可靠永久地被保護。另外，這些側(cè)鏈保護基團必須在一或兩步反應(yīng)中定量地不保護合成的肽，并且不破壞其結(jié)構(gòu)。在大多數(shù)情況下，肽-高分子之間的鏈也會被同時消除。很明顯，既要根據(jù)被護活性基團的性質(zhì)，很大程度上也要根據(jù)所用的臨時Nα-保護基團的化學性質(zhì)和結(jié)構(gòu)來確定氨基酸側(cè)鏈永久保護基團的化學性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。因此，臨時Nα-保護是整個固相肽合成的關(guān)鍵要素。
在固相肽合成中廣為人知和廣泛應(yīng)用的是由R.B.Merrified inBiochemistry，1964，V.3，p.1385報導的Nα-叔-丁氧基羰基氨基酸(Boc-氨基酸)。利用中等強度的酸性試劑，例如，三氟乙酸及它的氯代烷溶液，溶在有機溶劑中氯化氫溶液，三氟化硼/乙醚混合物和其它酸，可以消除叔-丁氧基(Boc)，同時生成異丁烯和二氧化碳。
用于側(cè)鏈永久保護以及Nα-Boc保護的保護基團在Nα-Boc消除時是穩(wěn)定的，但可為更強的酸消除，并伴隨肽-高分子之間的鍵的斷開。用于該目的的已知試劑有液態(tài)氟化氫、三氟甲基硫酸及它們與苯甲醚、硫代苯甲醚、硫酸二甲酯的混合物。使用臨時的Nα-Boc-保護基的合成路線的主要缺陷是消除臨時和永久性保護均用酸解，而它不能保證永久性保護的穩(wěn)定性。伴隨合成肽的增長，永久性保護基團在Boc消除階段不斷受到酸性試劑的進攻，這樣能夠引起這些基團的部分減少，而且增加副反應(yīng)。除此之外，最終用超強酸對組織在一起的肽-高分子進行處理會引起目標肽的部分破壞。還值得注意的是，超強酸是極危險的，在操護過程中它需要特殊的設(shè)備和適當?shù)陌踩珯z測。
為了避免在最終肽解保護時使用超強酸，目前有12種高酸性基團被用于臨時Nα-保護，它們可以認為與利用中等強度酸消除所謂叔-丁基型的永久性保護相一致。例如，在Collect.Czech.Chem.Cokmmun.，1992，V.57，p.1707中描述了1-(3，5-二叔丁基苯基)-1-甲基-乙氧羰基(叔-Bumeoc)基團，該基團可以用1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液消除，并且可以與叔-丁基型永久性保護基團一起使用，后者可為純?nèi)宜峄蚱錆馊芤核?。這樣就避免使用超強酸，但酸解差別的一般原則仍然保持不變。
R.B.Merrifield in Science，1986，V.232，p.341中提出了另一種固相肽合成路線，這種稱之為"正交規(guī)則"的方法是根據(jù)臨時和永久性保護可為相應(yīng)于完全不同的化學機理的完全不同的試劑消除這一假定，即臨時Nα-保護可以絕對選擇性的消除，并保證永久性保護完全保留，反之亦然。目前，這種"正交規(guī)則"巳作為發(fā)展固相肽合成有效路線的準則被普遍采用。
在Int.J.Peptide and Protein Res.，1987，V.30.p.740文獻中報導，將Nα-二硫雜琥珀?；被?Dts-氨基酸)應(yīng)用于固相肽合成是"正交規(guī)則"的一個應(yīng)用實例。Nα-二硫雜琥珀?；?Dts)保護基團是非常耐中等強度的酸性試劑，卻很容易在自然介質(zhì)中為含硫代基試劑消除并釋出氨基生成硫氧化碳(Carbonthiooxide)。由于Dts-氨基酸的合成缺乏有效的方法，因而限制了該方法的應(yīng)用。
最廣為人知且廣泛應(yīng)用的"正交規(guī)則"的固相肽合成路線是使用如C.D.Changand J.Meienhofer in Int.J.Peptide and Protein Res.，1975，V.11，p.246所報導的Nα-9-芴基甲氧基羰基氨基酸(Fmoc-氨基酸)。Nα-9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)耐酸性試劑，卻可在非質(zhì)子性溶劑中用有機堿，例如，嗎啉、二乙胺、哌嗪或哌啶在二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷根據(jù)β-消除機理除去。其氨基被釋出，并且生成CO2與二苯并富烯，在固相合成中，將Nα-被護肽-高分子在含20～50％哌啶的DMF溶液中處理10～30分鐘，F(xiàn)moc基團可以完全消除，該條件允許叔-丁基型永久酸的靈敏的保護與臨時Nα-Fmoc-保護一起使用，因此提供了合成路線的"正交性"。
Nα-Fnoc-氨基酸被廣泛用于手動固相肽合成，也可以用在多種類型的自動和半自動合成裝置中。然而，應(yīng)該注意，Nα-Fmoc-保護的極堿敏性及其在自然非質(zhì)子性溶劑的略微的不穩(wěn)定性，要求謹慎地控制酰化條件和所用藥品的純度，特別是用該氨基酸合成長度大于30的多肽。此外，產(chǎn)品相對高的價格限制了Fmoc-衍生物在大規(guī)模肽生產(chǎn)上的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是開發(fā)出一種新型Nα-被護的氨基酸衍生物，它可以作為發(fā)展固相肽合成的有效路線。具體地說這種氨基酸衍生物是Nα-2-(4-硝基苯磺?；?乙氧羰基-氨基酸(Nα-Nsc-氨基酸)，其分子式I為
式中R1是氫原子，R2可為氫，甲基，異丙基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，叔-丁氧基甲基，1-叔-丁氧基乙基，2-甲基硫代乙基，芐基，酰胺基甲基，2-酰脘基乙基，叔-丁氧基羰基甲基，2-(叔-丁氧基羰基)乙基，4-(叔-丁氧基酰胺基)丁基，4-叔-丁氧基芐基，吲哚基-3-甲基，S-(三苯基甲基)硫代甲基，1-(三苯基甲基)咪唑基-4-甲基，3-(NG-磺?；?胍基丙基，N-呫噸基酰胺基甲基，2-(N-呫噸基酰胺基)乙基或S-(乙酰胺甲基)硫代甲基；或者，R1和R2合為烯丙基團。
上述化合物作為Nα-被護氨基酸衍生物，可以用于固相肽合成。
本發(fā)明的另一目的是提供制備該Nα-Nsc-氨基酸的方法。本發(fā)明的第三個目的是提供一種用該Nα-Nsc-氨基酸的固相肽合成的過程。上述目的及本發(fā)明的其它目的將在下面給予論述。
本發(fā)明的Nα-Nsc-氨基酸可以通過分子式如II所表示的氨基酸(式中R1和R2代表的意義與分子式I中相同)與2-(4-硝基苯磺酰)氯甲酸乙酯III，在水-有機混合溶劑中于0～40℃(最好為0～20℃)用堿處理得到，其反應(yīng)如下式
氯甲酸酯III以相對氨基酸0.5～1.5摩爾當量(最好為0.7～0.9)引入反應(yīng)體系。所用的溶劑可以是任何能溶解?；瘎┎⒛芘c水相混合的非質(zhì)性溶劑，如乙腈，DMF，四氧呋喃或二噁烷。堿可以是有機或無機堿，例如，碳酸鈉或鉀、氧化鎂或鈣、三乙胺、N-甲基嗎啉。
本發(fā)明的另一方法是，具有分子式II的氨基酸首先用已知方法轉(zhuǎn)化為N，O-雙-三甲基甲硅烷基衍生物IV，然后在無水溶劑中，如二氯甲烷，與氯甲酸酯III反應(yīng)。中間產(chǎn)物三甲基甲硅烷基衍生物水解后，得到自由的欲制的Nα-Nsc-氨基酸I，其過程如下式
如果分子式I的衍生物中R1是氫，R2是N-呫噸基酰胺基甲基或2-(N-呫噸基酰胺基)乙基時，那么在酸性存在下，利用分子式I的衍生物，這時R1為氫，而R2為酰胺基甲基或2-(酰胺基)乙基，與呫噸氫醇在非質(zhì)子性溶劑中反應(yīng)可以制得。在該反應(yīng)中可以用DMF為溶劑，而比較好的酸是有機酸，例如三氟乙酸、甲基硫酸或?qū)妆交撬帷?br> 由分子式I可知，化合物I有一個不對稱α-碳原子(除非R1＝R2＝H)，由于α-碳原子不參于制備化合物I的反應(yīng)，所以存在于氨基酸II的這個手性碳的構(gòu)型保持在所制Nα-Nsc-衍生物I中。因此很明顯，本發(fā)明中的方法可以制備任何手性構(gòu)型(L或D)，以及內(nèi)消旋的Nα-Nsc-氨基酸I，這些構(gòu)型取決于起始物II的構(gòu)型。
本發(fā)明中分子式I型衍生物的R1和R2取代基與含有或不含有保護基團的天然氨基酸的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相同。這些保護基團為叔-丁基型或消除條件與其相似，如表1如述。
很明顯表1給出的分子式I型化合物是合成具有任意氨基酸組分的肽所需的被護蛋白基因的氨基酸衍生物總匯。此外，它尚有另一種基本保護類型的氨基酸Nα-Nsc-衍生物和非基因或特殊氨基酸的Nα-Nsc-衍生物也可以用該方法合成。
Nα-Nsc-氨基酸I是結(jié)晶化合物，不溶于或微溶于水，可溶于有機溶劑，在-10℃～25℃可以長時間保存。
本發(fā)明提出了用分子式I型的Nα-Nsc-氨基酸進行固相肽合成的過程。在這個過程中，第一個Nα-Nsc-氨基酸(目標氨基酸序列的碳端)通過其自由的α-羧基與不溶的高分子載體成酯鏈或酰胺鍵，共價鍵合到該載體，生成Nα-Nsc-氨基酸-高分子?？梢杂米鞲叻肿虞d體的高分子有交聯(lián)或大孔聚苯乙烯，粒狀或與硅藻土復合交聯(lián)聚N，N-二甲基丙烯酰胺，交聯(lián)葡聚糖，纖維，紙和其它在本領(lǐng)域中已知的高分子。
為了連接第一個Nα-Nsc-氨基酸，高分子載體應(yīng)含有適當?shù)腻^定基團，在大量的示例中，這些錨定基團很完美。它們在與三氟乙酸或它的溶液或氯化氫的有機溶液之類酸性試劑作用下，可以使所合成的肽從高分子載體上分裂出來，釋出碳端的羧基或酰胺基。用于成酯型的錨定基團可以是4-羥基甲基酚氧基、4-氯或4-溴甲基酚氧基烷基，α-羥基二酚基-甲基和其它已知基團。用于成酰胺型的錨定基團是二或三烷氧基二苯甲胺基，4-胺甲基-3，5-二甲氧基酚氧基烷基和其它可以用于此目的的已知基團。
將碳端Nα-Nsc-氨基酸連結(jié)到高分子載體的錨定基團上可以通過眾所周知的方法實現(xiàn)。
為了將Nα-保護基團從所得到的Nα-Nsc-氨酰基-高分子上除去，用堿試制作用該被護氨?；?高分子。用于此目的的堿試劑最好是含氮原子的堿基，例如氨、嗎啉、哌啶、哌嗪、二乙胺、1，8-二氮雜二環(huán)[5，4，0]十一-7-烯、1，1，3，3-四甲基胍和它們在非質(zhì)子性有機溶劑中，更理想的堿試劑是20～50％的DMF的哌啶溶液。本例中，Nsc-基團消除的同時，伴隨N-[2-(4-硝基苯磺酰)乙基]哌啶和二氧化碳生成，釋放出α-氨基。
這個帶有自由α-氨基的氨基酰基-高分子與下一個Nα-Nsc-氨基酸進一步?；贸鯪α-Nsc-二肽-高分子。如此，酰化時，可選用的試劑有4-硝基苯基，五氯化苯基，五氟化苯基，1-羥基苯并三唑基的Nα-Nsc-氨基酸酯和其它可用于固相肽合成的已知活潑酯，Nα-Nsc-氨基酸的對稱酸酐。?；部梢栽谝阎呐悸?lián)劑如，雙環(huán)已基二酰亞胺，二異丙基二酰亞胺，苯并三唑基-1-氧代-(三個-二甲胺基)鏻六氟磷酸鹽中與Nα-Nsc-氨基酸反應(yīng)實現(xiàn)。
包含Nα-Nsc-基團消除以及自由氨基與跟隨的Nα-Nsc-氨基酸的?；铣裳h(huán)反應(yīng)可以重復進行直到完成目標氨基酸的集合體為止。
在所需Nα-Nsc-肽-高分子的集合體完成之后，Nα一端保護基團可以用前面所述的方法除去。大量實驗表明，目標肽從載體上的錨定基團上的分離不會引起永久性保護基團由氨基酸側(cè)鏈的除去。為此，用于消除叔-丁基型保護基團的酸試劑可以利用如三氟乙酸、甲磺酸溶液或?qū)妆交撬幔鼈兛梢园虿话东@生成正碳離子的已知添加劑，例如水、苯甲醚、苯甲硫醚、硫酸二甲酯、乙二硫趕-1，2-三異丙基硅烷。
目標肽能用任意方法封端而不會引起高分子載體的脫去。所以用于此類實驗的錨定基團應(yīng)該保證生成耐酸的肽-高分子鍵合。
與Fmoc相比，Nsc-基團更耐堿試劑，并且在相同條件下，其消除速度要慢很多。但是固相合成擬定除去Nα-保護基團的時間(15～20分鐘)，足夠用于將Nα-Nsc-基團，利用20～50％的哌啶DMF溶液之類的堿液從被護肽-高分子上定量消除。另外，Nsc-基團的耐堿性使其在中性和弱堿性介質(zhì)中具有令人稱適的穩(wěn)定性，可以更好地實現(xiàn)?；磻?yīng)。
綜上所述，利用堿試劑在有耐有機堿叔-丁基型保護基存在下，Nsc-基團可以被消除。此外，Nsc-基團非常耐通常用于消除叔-丁基型保護基團的酸試劑的進攻。因此，應(yīng)用通式為分子式I的Nα-Nsc-氨基酸，其側(cè)鏈會有非常好的叔-丁基型保護基團或在消除條件與它們類似的保護基團，可以開發(fā)出符合"正交規(guī)則"的固相肽合成。
下面將通過實例對本發(fā)明進行描述，這些實例只作為說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明進行限制。在下述描述中除非另加注釋之外，所有氨基酸均為L-構(gòu)型的氨基酸。
實例1 Nα-Nsc-天冬酰胺(I-10)將3.95g天冬酰胺與7.7g碳酸鉀溶于100ml水-二噁烷(體積比為3∶1)混合溶劑中，將該溶液在冰浴中冷卻。在不斷攪拌下，于15分鐘內(nèi)，將7.5g2-(4-硝基苯磺?；?氯甲酸乙酯III滴入溶于70ml二噁烷中，除去冰浴，將上述兩溶液混合，并繼續(xù)攪拌20分鐘，然后減壓濃縮成100ml后，轉(zhuǎn)移到分液漏斗，加入100ml水，所得溶液用50mlo酸乙酯萃取二次。除去水層，用40％硫酸酸化，然后在冰浴中冰卻。30分鐘后，過濾出沉淀物，用大量冰冷卻水洗滌，自然干燥，所得產(chǎn)物I-10是白色結(jié)晶粉末(71％)，其表征見表2(實例5)。
實例2 Nα-Nsc-白氨酸(I-5)在裝有四流冷凝管和滴液漏斗的250ml圓底燒瓶中加入4.92g白氨酸和90ml無水二氯甲烷。在劇烈攪拌下，9.5ml三甲基氯硅烷加入上面的懸濁液中，混合物加熱沸騰1小時。所得溶液，用冰浴冷卻，然后將9.1ml三乙胺和9.0g氯甲酸酯III在攪拌下加入。混合物在冰浴下攪拌20分鐘，在室溫繼續(xù)攪拌1.5小時。減壓除去溶劑，殘余物在200ml乙酸乙酯與250ml 2.5％硫酸鈉水溶液之間分配。除去水層，用50ml乙醚洗滌，然后用1N鹽酸酸化到pH2，再用70ml乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑，用己烷-乙酸乙酯重結(jié)晶殘余物，得到白色粉末(80％)的產(chǎn)品I-5。其表征見表2(實例5)。
實例3 Nα-Nsc-天冬氨酸β-叔丁酯(I-12)在裝有四流冷凝管和滴液漏斗的250ml圓底燒瓶中加入7.09g天冬氨酸β-叔丁酯和90ml無水二氯甲烷。在劇烈攪拌下，向該混合物中加入12.7ml二異丙基乙基胺，再加入9.5ml三甲基氯硅烷?；旌衔锛訜岱序v1.5小時。用冰浴冷卻反應(yīng)混合物，立刻加入9.0g氯甲酸酯III，在室溫攪拌1.5小時。減壓除去溶劑，殘余物在200ml乙酸乙酸和250ml 2.5％碳酸鈉水溶液間分配。除去水層，用50ml乙醚洗滌，再用1N HCl酸化到pH2，然后用70ml乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液用無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑。殘余物用乙烷-乙酸乙酯重結(jié)晶得到白色晶狀粉末(86％)的產(chǎn)物I-12。其表征見表2(實例5)。
實例4 Nα-Nsc-N-呫噸基-天冬酰胺(I-20)
將3.98g Nα-Nsc-天冬酰胺(I-10)和2.6g呫噸醇溶于20ml干燥過的DMF中，向該溶液加入0.4ml甲基硫酸，該混合物在室混靜置2天。然后在攪拌下將所得混合物倒入100ml冰冷水中，過濾沉淀物，用水洗再分別用乙酸乙酯和乙醚洗滌。粗產(chǎn)物滲入10ml DMF，過濾，用乙醚再沉淀。過濾收集沉淀物，用乙醚洗滌，在真空下干燥制得晶狀粉末(74％)的產(chǎn)物I-20。其表征見表2(實例5)。
實例5 Nα-Nsc-氨基酸I的性質(zhì)表2列出了用實例1～4中詳盡描述的方法制備的如分子式I型化合物。表中方法一欄中的數(shù)字對應(yīng)于描述特殊方法的實例號。特性旋光度[a]D25用10cm小池在DIP-320旋光度(JASCO，日本)測出，熔點用開放式量熱器測定且來校正。色譜流動值R1由Alnfolien硅膠的F254(Merck，Darmstadt，德國)的薄層色譜條給出；氯仿/甲酸/乙酸，95∶5∶3(A)和苯/丙酮/乙酸，100∶50∶3(B)是所用淋洗溶劑。斑點用紫外吸收和/或茚滿三酮反應(yīng)進行檢測。以Cf252輻射-促進解吸作用的MS-BC-1時間正行質(zhì)譜儀(Electro SPA，Sumy，Vkraine)測定分子離子質(zhì)量。
實例6 十二肽固相合成Ala-Ser-Ser-Thr-Ile-Ile-Lys-Phe-Gly-Ile-Asp-Lysa)在多分子載體上嵌入錨定基團向溶于3ml DMF的250mg胺甲基化的苯乙烯-1％二乙烯基苯的共聚物加入0.75mmol的2，4，5-三氯苯基-4-羥甲基苯氧基丙酸酯和0.75mmol 1-羥基苯并三唑，然后該懸浮液在室溫震搖24小時。過濾出的高分子用DMF，乙酸，乙醚，最后用己烷洗滌，用五氧化磷在真空下干燥24小時。
b)Nsc-Lys(Boc)-OH與錨定基團鍵合所得高分子在4ml 1，2-二氯甲烷/N-甲基吡咯烷(3∶1)混合溶劑中溶脹，將0.75mmol的Nsc-Lys(Boc)-OH(I-14)，0.1mmol 4-二甲基胺吡啶和0.75mmol的二環(huán)已烷碳化二亞胺加入。該懸浮液在室溫震搖24小時。過濾出的高分子用氯仿，氯仿/甲醇(1∶1)混合溶劑，乙醇，乙醚，最后用己烷洗滌干燥后得400mg Nsc-Lys(Boc)-高分子。
c)肽集合體Nsc-Lys(Boc)-高分子(200mg)盛于底部有聚丙烯玻璃的10ml聚丙烯注射器中，注射器中的高分子用DMF洗，然后進一步的合成循環(huán)按如下實驗方案進行。
1.預先洗滌 33％ 哌啶/DMF，4ml；0.5分鐘。
2.去封端33％ 哌啶/DMF，4ml；15分鐘。
3.洗滌 DMF 6×(4ml；1分鐘)。
4.?；? Nα-Nsc-氨基酸I，0.5mmol；苯異三唑基-1-氧-(三個二甲基胺)鏻六氟磷酸鹽，0.5mmol；1-羥基苯三唑，0.5mmol；N-甲基-嗎啉，0.75mmol；DMF，2ml；60分鐘(對于Nsc-Ile-OH；90分鐘)。
5.洗滌 DMF，5×(4ml；1分鐘)。
Nα-Nsc-氨基酸按如下順序被引入合成循環(huán)。
Nsc-Asp(OtBu)-OH，Nsc-Ile-OH，Nsc-Gly-OH，Nsc-Phe-OH，Nsc-Lys(Boc)-OH，Nsc-Ile-OH，Nsc-Ile-OH，Nsc-Thr(tBu)-OH，Nsc-Ser(tBu)-OH，Nsc-Ser(tBu)-OH，Nsc-Ala-OH。
目標氨基酸序列集合體完后，肽-多分子用33％哌啶/DMF 4ml處理20分鐘，然后用DMF，二氯甲烷，乙醇，乙醚最后用己烷洗滌。
d)去端基多肽-高分子在室溫與5ml 50％的三氟乙酸的1，2-二氯乙烷溶液一起震搖。過濾出的多分子用5ml 50％的三氟乙酸的1，2-二氯乙烷洗滌，合并洗滌液用100ml冰冷的無水乙醚稀釋。濾出的沉淀用乙醚洗滌，真空干燥后，得170mg粗十二肽(用反相高效液相色譜分析儀測得其純度為70％)。將粗產(chǎn)物溶于30ml1M醋酸中，通過用TSKHW-40F(Merk，Darmstadt，德國)填充的1.5×70cm柱子分離，用相同的緩沖液平衡，洗提，含有純肽部分被收集，凍干，最終得到目標多肽104mg(41％)，由反相高效液相色譜分析儀估計其純度大于95％。氨基酸組分(6NHCl在110℃水解24和48小時后)Asp 1.02(1)；Ser 1.84(2)；Thr 0.93(1)；Glu 0.94(1)；Gly 1.03(1)；Ala 1.00(1)；Ile 2.78(3)；Lys 2.04(2)。
表1 在化合物I中R1和R2表示的物質(zhì)No R1R2氨基酸 縮寫I-1 H H 甘氨酸 Nsc-Gly-OHI-2 H 甲基丙氨酸 Nsc-Ala-OHI-3 H 異丙基 纈氨酸 Nsc-Val-OHI-4 H 1-甲基丙基 異白氨酸 Nsc-Ile-OHI-5 H 2-甲基丙基 白氨酸 Nsc-Leu-OHI-6 H 叔-丁氧基甲基 O-叔丁基-絲氨酸 Nsc-Ser(tBu)-OHI-7 H 1-叔-丁氧基甲基 O-叔丁基-蘇氨酸 Nsc-Thr(tBu)-OHI-8 H 2-甲基硫代乙基 蛋氨酸 Nsc-Met-OHI-9 H 芐基苯基丙氨酸 Nsc-Phe-OHI-10 H 酰胺甲基天冬酰胺 Nsc-Asn-OHI-11 H 2-酰胺乙基 谷酰胺 Nsc-Gln-OHI-12 H 叔-丁氧基羰基甲基 天冬氨酸β-叔丁酯Nsc-Asp(OtBu)-OHI-13 H 2-(叔-丁氧基羰基)乙基 谷氨酸γ-叔丁酯 Nsc-Glu(OtBu)-OHI-14 H 4-(叔-丁氧基酰胺基) Nε-叔-丁氧基 Nsc-Lys(Boc)-OH丁基 羰基-賴氨酸I-15 H 4-叔-丁氧基芐基 O-叔丁基酪氨酸 Nsc-Tyr(tBu)-OHI-16 H 吲哚基-3-甲基 色氨酸 Nsc-Trp-OHI-17 H S-(三苯基甲基)硫代甲基 S-三苯基甲基-半胱Nsc-Cys(Trt)-OH氨酸I-18 H 1-(三苯基甲基)咪唑基- Nτ-三苯基甲基 Nsc-His(Trt)-OH4-甲基 -組氨酸I-19 H 3-(NG-磺?；? NG磺?；? Nsc-Arg(Mts)-OH-胍基丙基 精氨酸I-20 H N-呫噸基酰胺基-甲基 N-呫噸基天冬酰胺 Nsc-Asn(Xan)-OHI-21 H 2-(N-呫噸基酰胺基)乙基 N-呫噸基-谷酰胺 Nsc-Gln(Xan)-OHI-22 H S-(乙酰胺甲基)硫代甲基 S-乙酰胺甲基-半胱Nsc-Cys(Acm)-OH氨酸I-23 R1+R2＝丙烯 脯氨酸 Nsc-Pro-OH
表2 Nα-Nsc-氨基酸I的性質(zhì)條目 化合物 方法 [a]D25熔點℃ Rf(A) Rf(B) 分子離子(M+H)+(cl.DMF)計算 實測1 23 4567 8 9I-1 Nsc-Gly-OH 2 - 152-1540.40 0.21 333.30 333.4I-2 Nsc-Ala-OH 2-25.6° 134-1360.53 0.35 347.32 347.4I-3 Nsc-Val-OH 2-12.0° 72-74 0.62 0.50 375.38 375.4I-4 Nsc-Ile-OH 2-13.0° 120-1210.62 0.52 389.41 389.6I-5 Nsc-Leu-OH 2-33.0° 160-1620.68 0.42 389.41 389.7I-6 Nsc-Ser(tBu)-OH 3+3.3° 109-1110.68 0.46 419.43 418.9I-7 Nsc-Thr(tBu)-OH 3-9.0° 64-66 0.68 0.50 433.46 433.2I-8 Nsc-Met-OH 2-28.7° 88-90 0.65 0.37 407.47 406.9I-9 Nsc-Phe-OH 2-23.0° 160-1630.66 0.40 423.42 423.3I-10 Nsc-Asn-OH 1-1.3° 205-2070.05 0.05 390.35 390.2I-11 Nsc-Gln-OH 1-9.7° 192-1940.10 0.05 404.38 404.3I-12 Nsc-Asp(OtBu)-OH 3-12.7° 72-75 0.64 0.38 447.44 447.2I-13 Nsc-Gln(OtBu)-OH 3-17.0° 94-96 0.67 0.38 461.47 461.4I-14 Nsc-Lys(Boc)-OH 3-11.8° 110-1120.62 0.35 504.54 505.9I-15 Nsc-Tyr(tBu)-OH 3-6.3° 82-84 0.68 0.44 495.53 495.2I-16 Nsc-Trp-OH 3-14.7° 188-1900.53 0.33 462.46 461.7I-17 Nsc-Cys(Trt)-OH 3+22.3° 108-1100.75 0.52 621.71 619.3I-18 Nsc-His(Trt)-OH 3+5.0° 112-1150.42 0.1 655.71 656.8I-19 Nsc-Arg(Mts)-OH 3-4.0° 115-1200.25 0.05 615.68 614.4I-20 Nsc-Asn(Xan)-OH 4+2.7° 198-2000.43 0.25 570.56 568.8I-21 Nsc-Gln(Xan)-OH 4-13.7° 155-1580.58 0.23 584.58 582.9I-22 Nsc-Cys(Acm)-OH 2-31.0° 124-1260.17 0.05 450.47 451.2I-23 Nsc-Pro-OH 2-31.5° 115-1170.53 0.37 371.35 371.權(quán)利要求
1.一種Nα-2-(4-硝基苯磺酰)乙氧羰基-氨基酸，其特征是分子式用下式表示
式中R1是氫原子，R2可為氫，甲基，異丙基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，叔-丁氧基甲基，1-叔-丁氧基乙基，2-甲基硫代乙基，芐基，酰胺基甲基，2-酰脘基乙基，叔-丁氧基羰基甲基，2-(叔-丁氧基羰基)乙基，4-(叔-丁氧基酰胺基)丁基，4-叔-丁氧基芐基，吲哚基-3-甲基，S-(三苯基甲基)硫代甲基，1-(三苯基甲基)咪唑基-4-甲基，3-(NG-磺?；?胍基丙基，N-呫噸基酰胺基甲基，2-(N-呫噸基酰胺基)乙基或S-(乙酰胺甲基)硫代甲基；或者，R1和R2合為烯丙基團。
2.一種用于權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于是由下分子式表示的氨基酸與2-(4-硝基苯磺酰)氯甲酸乙酯在水-有機混合深劑中用堿處理而得到，HNR1-CHR2-COOH式中R1和R2所表示的原子團與權(quán)利要求1 R1和R2相同。
3.一種用于權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于是按下步驟a)下分子式表示的氨基酸首先轉(zhuǎn)變成O，N-三甲基甲硅烷衍生物HNR1-CHR2-COOH式中R1和R2所表示的原子團與權(quán)利要求1 R1和R2相同；b)然后，O，N-三甲基甲硅烷衍生物在非質(zhì)子性溶劑中用堿處理與2-(4-硝基苯磺酰)氯甲酸乙酯反應(yīng)，反應(yīng)得到中間產(chǎn)物再進行水解得到產(chǎn)品。
4.一種用于權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于化合物中R1為氫原子，R2為N-呫噸基酰胺基甲基或2-(N-呫噸基酰胺基)乙基時，用化合物中R1為氫原子，R2為酰胺基甲基或2-(酰胺基)乙基與呫噸氫醇在非質(zhì)子性溶劑中用酸處理制得。
5.一種用于以權(quán)利要求1所述的化合物作為被護氨基酸單體，通過該被護氨基酸單體被連續(xù)加成鍵合到增長的被護肽鏈上的方法制備肽的過程，而該肽鏈鍵合在不溶性高分子載體上，其特征在于按下步驟a)通過上述被護單體的自由羧基，使被護單體C端鍵合到錨定基團的氨基或羥基上，而該錨定基團已鍵合到上述高分子載體上，來制得被護氨?；?高分子；b)用堿性試劑處理，消除上述被護氨?；?高分子得到帶有自由α-氨基的氨?；?高分子；c)使跟隨的被護氨基酸單體與上述氨?；?高分子的自由α-氨基鍵合得到被護肽-高分子；d)重復步驟b)和c)，直到最后被護氨基酸單體完全被鍵合，結(jié)束過程b)。
6.按照權(quán)利要求5所述的制備肽的過程，其特征在于所述堿性試劑為含氮的堿，選用氨、嗎啉、哌啶、哌嗪、二乙胺、1，8-二氮雜二環(huán)[5，4，0]十一-7-烯、1，1，3，3-四甲基胍和它們在非質(zhì)子性有機溶劑中的溶液。
7.按照權(quán)利要求6所述的制備肽的過程，其特征在于所述的含氮的堿為哌啶，有機溶劑為二甲基甲酰胺。
全文摘要
Na－2－(4－硝基苯磺酰)乙氧羰基—氨基酸衍生物用分子式Ⅰ表示:式中:R
文檔編號C07C317/18GK1173865SQ96191913
公開日1998年2月18日 申請日期1996年1月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月15日
發(fā)明者維拉德米亞·瓦沙里維奇·沙莫克夫, 愛達·那佳哈托維奇·沙比洛夫, 帕娃·伊萬諾維奇·鮑茲德尼雅克夫 申請人:現(xiàn)代藥品工業(yè)株式會社