專利名稱：半抗原標記的肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生半抗原標記肽的方法，按此方法產(chǎn)生的半抗原標記肽及其在免疫檢測方法中的應用。
體液中，特別是人類血清中免疫球蛋白的測定用于診斷微生物感染，特別是病毒感染，例如HIV、肝炎病毒等。通常應用能與特異免疫球蛋白反應的一種或數(shù)種抗原與待檢樣品進行反應，以檢測特異免疫球蛋白的存在。測定液體樣品中特異免疫球蛋白的方法必須靈敏、可靠、簡單易行且又快速。
近幾年來，已經(jīng)發(fā)展了越來越多的以非放射活性標記基團為基礎的檢測方法，在這些檢測方法中，待測樣品中的分析物，比如一種特異抗體，可在光學(例如發(fā)光的或熒光的)檢測法、NMR-活性或金屬沉淀檢測方法的幫助下檢測出來。
EP-A-0 307 149描述一種用兩種重組多肽做為抗原的檢測抗體的免疫學檢測方法，其中一種多肽固定于固相上，另一種攜帶一個信號基團，兩種多肽可在不同的菌內(nèi)進行表達以提高檢測的特異性。
EP-A-0 366 673中描述一種檢測樣品中抗體的方法。在此方法中，樣品通過與純化的標記抗原和同樣純化的與固相固定的抗原起反應來檢測抗體。例如，公開了人類IgG做為一種抗原。
EP-A-0 386 713中敘述了一種應用兩種固體支持物來檢測抗HIV抗體的方法。在這一方法中，將不同的HIV抗原固定在這兩種固體支持物上，且每種支持物都與樣品及一種標記的HIV抗原相接觸，這樣通過至少一個實驗中的陽性反應檢測出抗體的存在。公開了重組產(chǎn)生的多肽作為HIV抗原。
EP-A-0 507 586敘述了一種檢測特異免疫球蛋白的免疫學檢測方法，此方法中將能與免疫球蛋白結合的兩種抗原與樣品相接觸，第一種抗原攜帶一種適合與固相支持物相連接的基團，第二種抗原攜帶一種信號基團。信號基團可以是直接標記基團，比如一種酶、色原、金屬顆粒，也可以是間接標記基團，即與抗原相連的標記基團可以與其受體相反應，而其受體攜帶一種產(chǎn)生信號的基團。提到熒光衍生物作為間接標記基團的例子，其受體是與一種酶相偶聯(lián)的抗體。公開了如乙肝表面抗原一類的多肽作為抗原。通過衍生作用將SH基團導入這種抗原以與熒光劑相連。
EP-A-0 507 587描述了一種檢測IgM抗體的特異方法。此方法中樣品與可與待測抗體直接結合的標記抗原及可與待測抗體直接結合并能與固相相連的二抗一同孵育。
現(xiàn)有技術中測定抗體的免疫學方法中，通常所用的多肽抗原一般是用重組DNA的方法生產(chǎn)的。然而，使用此類多肽抗原時可能帶來許多問題。這些重組多肽常常只能以融合多肽的形式產(chǎn)生，這樣在檢測中融合部分可導致假陽性結果。另外由重組表達產(chǎn)生的多肽在樣品溶液中不很穩(wěn)定并且易于凝聚。重組表達方法的另一個缺點是不能選擇性地、可重復地將標記基團導入多肽。
此外，生產(chǎn)重組多肽抗原耗資高，免疫反應中大量不同的重組多肽抗原可發(fā)生大的變異。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)生免疫檢測用抗原的簡單有效的方法，本方法至少部分消除現(xiàn)有技術中已知抗原的缺點。另外，本方法還可選擇性地、可重復地將標記基團導入抗原。
通過產(chǎn)生半抗原標記肽的方法達到本發(fā)明的目的，該方法具有以下特征(a)在固相上由其側(cè)支反應性基團被保護基團阻斷的氨基酸衍生物合成含有目標氨基酸序列的肽，選擇伯氨側(cè)支基團上的保護基團使得需要時可被選擇性地裂解掉，(b)除去保護基團以形成最少一個游離的伯氨基團，(c)將半抗原-活性酯衍生物與肽上至少一個游離伯氨基團相偶連，并且(d)如果需要將仍保留的保護基團裂解掉，半抗原選自甾醇、膽酸、性激素、類皮質(zhì)激素、強心甾、強心甾糖甙、蟾蜍二烯內(nèi)酯、甾類皂角甙元及甾類生物堿。
根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的肽，最大長度優(yōu)選50個氨基酸，特別優(yōu)選30個氨基酸，它們十分適合于免疫檢測方法并特別適于特異免疫球蛋白的測定。令人驚異地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的肽盡管攜帶著龐大的半抗原標記基團，但其對待測免疫球蛋白具有很高的親和力和特異性。
本發(fā)明的方法能夠從結合位點和數(shù)量上有選擇地導入半抗原標記基團。在本發(fā)明的肽合成中，通過在氨基酸衍生物的伯氨基團上應用特定的保護基團來特異性選擇肽上選擇性除去保護基團后可與半抗原反應的位點，這種方法是可行的。這樣就可提高檢測的可重復性和敏感性。
本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)點是使用肽抗原能夠測定出象IgM、IgG、IgE、IgA的所有類別抗體。這一檢測方法使用所限定的小而穩(wěn)定且不易凝聚的抗原，還對干擾不敏感。
根據(jù)本發(fā)明的方法與肽相偶聯(lián)的半抗原是一種選自甾醇、膽酸、性激素、類皮質(zhì)激素、強心甾、強心甾糖甙、蟾蜍二烯內(nèi)酯、甾類皂角甙元和甾類生物堿的含有甾類骨架的分子。這些半抗原能夠與特異受體結合，例如，與對抗半抗原的抗體或抗體片斷結合。特別優(yōu)選從強心甾和強心甾糖甙中選擇出的半抗原。這些半抗原的代表是異羥洋地黃毒甙元、洋地黃毒甙元、芰毒甙元、毒毛旋花甙元，地高辛、洋地黃毒甙、地托辛(ditoxin)和毒毛旋花甙K，優(yōu)選異羥洋地黃毒甙元和地高辛。
本發(fā)明的方法中，半抗原活性酯衍生物和肽上的氨基末端和/或游離伯氨側(cè)支基團相連。本發(fā)明中“活性酯”這一術語包括不會與肽的其它反應性基團產(chǎn)生干擾性副反應且能與游離氨基基團反應的活化酯基團。優(yōu)選使用N-羥基-琥珀酰亞胺酯做為活性酯衍生物。半抗原活性酯衍生物的合適的代表為地高辛-4-戊二酸半酯-N-羥基-琥珀酰亞胺酯、異羥洋地黃毒甙元-3-羧甲基醚-N-羥基琥珀酰亞胺酯、異羥洋地黃毒甙元-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯、異羥洋地黃毒甙元-3-琥珀酸半酯-N-羥基琥珀酰亞胺酯、洋地黃毒甙-4-戊二酸半酯-N-羥基琥珀酰亞胺酯和洋地黃毒甙元-3-琥珀酸半酯-N-羥基琥珀酰亞胺酯。這些半抗原衍生物均由Boehringer mannheim Company GmbH(MannheimGER)銷售。除了N-羥基琥珀酰亞胺酯外，也可能使對硝基苯酯、五氟苯酯、咪唑酯或N-羥基苯并三唑酯。
在本發(fā)明的方法中，含有所需氨基酸序列的肽是優(yōu)選使用市售肽合成儀(例如、應用生物系統(tǒng)中的A 431或A 433)在固相上合成的。根據(jù)已知的方法用氨基酸衍生物優(yōu)選從肽的羧基末端開始合成肽。優(yōu)選使用偶聯(lián)所需的氨基末端被芴基甲氧羰基(Fmoc)衍生化的氨基酸衍生物。所用氨基酸的反應性側(cè)支基團含有肽合成完成后易于被除去的保護基團。這種保護基團的優(yōu)選代表是三苯甲基(Trt)、叔丁基醚(tBu)、叔丁基酯(O-tBu)、叔丁氧羰基(Boc)或2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)。位于肽上準備后期與半抗原進行衍生化位置上的含有伯氨基分支基團的賴氨酸或其它氨基酸衍生物的氨基側(cè)鏈，與在特定反應條件下(比如，在酸性條件下)能定量除去的第一種氨基保護基團相偶聯(lián)。酸不穩(wěn)定性保護基團的適宜代表是BOC。含有伯氨側(cè)支基團而不希望與半抗原偶聯(lián)的賴氨酸或其他氨基酸殘基的側(cè)支基團與在第一種氨基保護基團可被除去的條件下本身不被除去的第二種氨基保護基團相偶聯(lián)。在肽與固相分離及所有其他保護基團從肽上裂解下來的條件下，優(yōu)選第二種保護基團仍是穩(wěn)定的。這種第二保護基團的代表是象苯乙酰的耐酸保護基團。除了20種天然氨基酸外，肽也可以含有人工合成的氨基酸，例如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、正亮氨酸或鳥氨酸。這些人工合成的氨基酸以類似于天然氨基酸的保護方式用于合成肽。
合成結束后，包括第一氨基保護基團在內(nèi)的位于半抗原所要偶聯(lián)位置上的保護基團，在任選地肽從固相上釋放下來之后被除去。然后這樣得到的產(chǎn)品優(yōu)選使用HPLC進行純化。隨后通過肽與所需的半抗原活性酯衍生物反應將半抗原標記物引入肽，半抗原活性酯衍生物與游離伯氨基團，即與肽的氨基末端基團或/和氨基側(cè)支基團發(fā)生反應。每個游離的伯氨基團優(yōu)選使用1.5至2.5當量的活性酯。然后產(chǎn)物經(jīng)HPLC進行純化。
如果肽仍然含有被第二保護基團如苯乙酰衍生的氨基基團，那么在合成的最后一步將這些保護基團除去。例如室溫下，可在含有機溶劑的水溶液中用固定化或溶解的毒霉素G酰胺酶除去苯乙酰保護基團。
如果通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的肽含有分子內(nèi)部的二硫鍵，那么在合成結束后在除去最后一個氨基酸N-末端的Fmoc保護基團之前，用(例如)六氟異丙醇/二氯甲烷中的碘(Kamber andHiskey in Gross E.and Meienhofer J.，The Peptides，AcademicPress，New York，1981，Pages 145-147)在固相上將這種肽序列氧化，然后再除去N-末端的Fmoc保護基團。
優(yōu)選合成的肽含有一個免疫活性表位區(qū)，即抗體結合的肽序列，和一個間隔區(qū)。這樣至少一個半抗原標記物優(yōu)選與間隔區(qū)相偶聯(lián)。標記物位于間隔區(qū)的肽在免疫檢測中常具有較好的敏感性。
1至10個氨基酸長度的間隔區(qū)由于含有電荷或/和可形成氫鍵，因而具有穩(wěn)定化和加溶的雙重作用。另外，它可以在空間上促進幾種受體，比如高分子量受體結合到半抗原標記的肽上。間隔區(qū)的氨基酸優(yōu)先選自甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基已酸、賴氨酸和具有NH2-〔(CH2)nO〕x-CH2-CH2-COOH結構的化合物，其中n是2或3，X是1至10。另外，間隔區(qū)優(yōu)選含有至少一些人工合成的氨基酸衍生物。間隔區(qū)位于肽的氨基末端或/和羧基末端。
根據(jù)本發(fā)明方法合成的肽優(yōu)選含有來自病原體，例如細菌、病毒和原生物，或來自自體免疫抗原的表位區(qū)。免疫活性表位區(qū)優(yōu)選是從病毒抗原，比如HIVI、HIVzzII、HIV O亞型或丙型肝炎病毒(HCV)的氨基酸序列衍生而來。
HIV I、HIV II或HIV O亞型的表位區(qū)優(yōu)選自gp32、gp41、及gp120。HCV表位優(yōu)選自非結構蛋白區(qū)HS3、NS4或NS5的核心/EnV。
HIV I、HIV II或HIV O亞型表位區(qū)的氨基酸序列特別優(yōu)先選自以下氨基酸序列或其長度至少為6個氨基酸，優(yōu)選至少8個氨基酸的部分氨基酸序列NNTRKSISIG PGRAFYT (I)NTTRSISIGP GRAFYT (II)IDIQEERRMR IGPGMAWYS(III)QARILAVERY LKDQQLLGIW GASG (IV)LGIWGCSGKL ICTTAVPWNA SWS (V)KDQQLLGIWG SSGKL(VI)ALETLLQNQQ LLSLW(VII)LSLWGCKGKL VCYTS(VIII)WGIRQLRARL LALETLLQN (IX) 和QAQLNSWGCA FRQVCHTTVP WPNDSLT (X)I至III的氨基酸序列是從HIV I的gp120區(qū)衍化而來，IV至IX的氨基酸序列是從HIV I的gp41區(qū)衍化而來，X的氨基酸序列是從HIV II的gp32區(qū)衍化而來。I至X的氨基酸序列還顯示在序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10中。第V、VIII和X的氨基酸序列都含有兩個以二硫鍵形式相連的半胱氨酸。這些序列優(yōu)選含有一個如上文定義的N-末端或/和一個C末端間隔區(qū)，該間隔區(qū)攜帶一個半抗原標記物，優(yōu)選異羥洋地黃毒甙元或地高辛標記物，特選優(yōu)選異羥洋地黃毒甙元-3-羧甲基醚標記物。位于表位區(qū)內(nèi)的賴氨酸殘基也可任選地以被標記的形式出現(xiàn)。
HCV表位區(qū)的氨基酸序列優(yōu)先選自以下的氨基酸序列或其長度至少為6個氨基酸、優(yōu)選至少8個氨基酸的部分序列SRRFAQALPV WARPD(XI)PQDVKFPGGG QIVGGV (XII)EEASQHLPYI EQ (XIII)QKALGLLQT(XIV)SRGNHVSPTH YVPESDAA (XV)PQRKNKRNTN RRpQDVKFPGGGQIVGVV (XVI)和AWYELTPAET TVRLRAYMNT PGLPV (XVII)XI序列是從HCV的NS5區(qū)衍化而來，XII和XIV序列是從HCV的核心區(qū)衍生而來，XIII、XIV XV序列從NS4區(qū)、XVII是從HCV的NS3區(qū)衍化而來。氨基酸序列XI至XVII也顯示在序列表SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.17中。具有上述表位區(qū)的肽優(yōu)選還含有一個攜帶半抗原標記物的間隔區(qū)。
本發(fā)明另外一個主題是一種最大長度為50個氨基酸、優(yōu)選30個氨基酸的半抗原標記肽，其氨基末端或/和氨基側(cè)支基團至少與一個半抗原活性酯衍生物相偶聯(lián)。半抗原優(yōu)選為異羥洋地黃毒甙元或地高辛，活性酯優(yōu)選為N-羥基琥珀酰亞胺酯。
本發(fā)明的肽優(yōu)選含有一個能與來自如人類血清的抗體反應的免疫反應表位區(qū)和一個攜帶至少一個半抗原標記物的非免疫反應間隔區(qū)。間隔區(qū)位于肽的氨基末端，其長度為1至10個氨基酸。表位區(qū)優(yōu)選是從HIV I、HIV II或HCV(包括其變型如亞型，例如HIV的O亞型)的氨基酸序列衍化而來，是I至XVII氨基酸序列或其部分氨基酸序列之一。
本發(fā)明也涉及將半抗原標記肽作為抗原應用于樣品液中特異抗體的測定。優(yōu)選測定能指示微生物感染，比如細菌、病毒或原生動物感染的抗體。特別優(yōu)選測定針對病毒的抗體，比如針對HIV或肝炎病毒的抗體。待測樣品液優(yōu)選血清，特別優(yōu)選人類血清。另外，優(yōu)選在橋式(bridge)檢測模式的免疫方法中使用本發(fā)明的半抗原標記肽。
本發(fā)明也涉及一種測定樣品液中特異抗體的免疫學方法，這一方法具有以下特征樣品液與(a)一種針對待測抗體且含有以上所定義的半抗原標記肽的第一標記抗原，(b)一種攜帶信號產(chǎn)生基團的半抗原受體共同孵育，通過與所述肽的結合來測定抗體。優(yōu)選使用用地高辛或異羥洋地黃毒甙元標記的肽作為第一抗原，抗異羥洋地黃毒甙元或/和地高辛的抗體作為受體。本文中“抗體”這一術語也包含抗體片斷，例如Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2片斷，或者其他抗體片斷，比如被遺傳工程修飾過的片斷。受體與一種信號產(chǎn)生基團相偶聯(lián)，優(yōu)選酶類，例如過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶或Q-β-復制酶。但信號產(chǎn)生基團也可以是一種產(chǎn)色素的、放射活性或NMR活性基團或是金屬顆粒(比如金顆粒)。信號產(chǎn)生基團優(yōu)選為酶類。
本發(fā)明中的免疫測定方法實際上可根據(jù)任何已知的檢測模式進行，例如具有單一反應相的同質(zhì)免疫測定法或具有1個以上反應相的異質(zhì)免疫測定法。優(yōu)選使用異質(zhì)檢測方法，其中抗體的檢測是在固相存在的條件下進行的。這種檢測方式的一個實例是所謂的雙抗原橋式檢測設計。這樣在固相存在的條件下，樣品液與第一抗原及針對待測抗體的第二抗原共同孵育，第二抗原能夠(a)固定于固相上，或(b)以能與固相結合的形式存在。通過測定固相上或/和液相中的標記物來檢測樣品液中的待測抗體。第二抗原優(yōu)選用生物素標記，且能與被鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包被的固相相結合。優(yōu)選被生物素標記的肽作為第二抗原。
優(yōu)選檢測步驟包括將第一抗原和固相上的第二抗原與樣品液相混合，以獲得一種含有第一抗原、抗體和與固相結合的第二抗原的標記的固定化復合物。與其他測定抗體的檢測方式相比，橋式檢測方式提高了檢測的敏感性和特異性，即可檢測出IgG、IgM、IgA和IgE等所有類別的免疫球蛋白且使非特異性反應降低。如果檢測步驟分為兩步，雙抗原橋式檢特異性和敏感性可進一步提高，第一步將第一和第二抗原與樣品液混合，第二步加入攜帶信號產(chǎn)生基團的第一抗原的半抗原標記物的受體。
將固相結合的肽和半抗原標記的肽作為抗原的雙抗原橋式檢測方式的另一個優(yōu)點是，作為Hook效應的結果，即通過提高每個肽上標記基團的數(shù)量，最好是2至10個標記基團，可降低含有高滴度待測抗體樣品的假陰性評估結果。與攜帶直接可檢測的標記基團的檢測方法相比，增加每個肽上半抗原標記基團的數(shù)目通過受體的信號放大作用可提高Hook敏感性。
而本發(fā)明的另一主題是檢測特異抗體的免疫檢測方法中的試劑，它至少含有一個本發(fā)明的半抗原標記肽，與待測抗體相反應。如果這種試劑用于雙抗原橋式檢測，那么它優(yōu)選包括(a)半抗原標記肽，(b)攜帶一個信號產(chǎn)生基團的半抗原受體，和(c)與固相結合或以能與固相結合的形式存在的可與待測抗體反應的另一種抗原。半抗原優(yōu)選為強心甾或強心甾糖甙，特別是地高辛或異羥洋地黃毒甙元，半抗原受體優(yōu)選抗半抗原的抗體，信號產(chǎn)生基團優(yōu)選酶類，另一種抗原優(yōu)選為被生物素標記的且能與被鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包被的固相相結合。
通過以下的實施例和序列表進一步描述本發(fā)明。
SEQ ID NO.1顯示來自HIV I gp120區(qū)表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.2說明來自HIV I gp120區(qū)另一個表位的氨基酸列；SEQ ID NO.3來自在HIV I和HIV I O亞型的gp120區(qū)另一表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.4來自HIV I gp41區(qū)表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.5來自HIV I gp41區(qū)另一個表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.6來自HIV I gp41區(qū)又一個表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.7來自HIV I O亞型gp41區(qū)表位的氨基酸序列SEQ ID NO.8來自HIV I O亞型gp41區(qū)另一個表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.9來自HIV I O亞型gp41區(qū)又一個表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.10來自HIV II gp32區(qū)表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.11來自HCV NS5區(qū)表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.12來自HCV 核心區(qū)表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.13來自HCV NS4區(qū)表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.14來自HCV NS4區(qū)另一個表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.15來自HCV NS4區(qū)又一個表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.16來自HCV 核心區(qū)另一個表位的氨基酸序列；SEQ ID NO.17來自HCV NS3區(qū)表位的氨基酸序列。
實施例1半抗原標記肽的產(chǎn)生在一批肽合成儀上，例如來自應用生物系統(tǒng)的A431或A433合成儀上按芴基甲氧羰基(Fmoc)固相肽合成法合成半抗原標記肽。為產(chǎn)生半抗原標記肽，使用4當量如表1所示的各種氨基酸衍生物
表1
<p>賴氨酸衍生物K1用于不需導入半抗原標記物的位置。賴氨酸衍生物K2用于導入半抗原標記物的位置。賴氨酸衍生物K3用于連接ε-氨基基團和肽的間隔區(qū)。
將氨基酸或氨基酸衍生物溶于N-甲基吡咯烷酮。在400～500mg容量為0.4～0.7mmol/g(JACS95(1973)，1328)的4-(2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基樹脂上(Tetrahedron Letters 28(1987)，2107)合成肽。以二甲基甲酰胺作為反應溶劑與相對Fmoc-氨基酸衍生物4當量的二環(huán)己基碳化二亞胺和4當量的N-羥基苯并三唑進行偶聯(lián)反應20分鐘。每步合成反應后，用二甲基甲酰胺中20％的哌啶在20分鐘內(nèi)除去Fmoc基團。
如果肽序列中存在半胱氨酸殘基，那么在合成結束后立即用六氟異丙醇/二氯甲烷中的碘在固相上進行氧化。
室溫下，用20ml三氟醋酸、0.5ml乙二硫醇、1ml硫代茴香醚、1.5g苯酚和1ml水處理合成樹脂40分鐘，將肽從合成樹脂上釋放出來并可除去苯乙酰保護基團以外的酸不穩(wěn)定性保護基團。隨后，反應液與300ml冷二異丙醚混合，0℃下保持40分鐘以徹底沉淀多肽。過濾沉淀，用二異丙醚沖洗，然后溶解于少量的50％的醋酸，凍干。用制備性HPLC在大約120分鐘處純化粗制品，使用適當?shù)奶荻?洗脫液A水、0.1％三氟醋酸，洗脫液B乙腈，0.1％的三氟醋酸)在delta-PAK Rp C18材料(50×300mm柱，100A，15μ)上進行純化。用離子噴霧質(zhì)譜法測定洗脫物質(zhì)。
用適當?shù)幕钚怎パ苌锖碗牡挠坞x氨基基團將半抗原標記物(比如異羥洋地黃毒甙元或地高辛標記物)導入溶液。將待衍化的肽溶于DMSO和0.1M PH為8.5的磷酸鉀緩沖液的混合液中，隨后在室溫下滴加入溶于少量DMSO的活性酯并不斷攪拌，每當量游離伯氨功能基團需加入2當量的活性酯。用分析型HPLC監(jiān)控反應過程。用制備性HPLC純化產(chǎn)品。
如果肽仍含有苯乙酰保護的賴氨酸，那么在最后一步反應中，用含有一定比例有機溶液的毒霉素G酰胺鹽水溶液室溫酶解除去保護基團。過濾分離出酶，用制備性HPLC純化肽。用離子噴霧質(zhì)譜法測定洗脫物質(zhì)。
表2所示的從HIV I和HIV II的gp120、gp 41和gp32區(qū)衍生而來的肽化合物是用異羥洋地黃毒甙元-3-羧甲基醚-N羥基琥珀酰亞胺酯(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，GER)制備的。
表2
< /p><p>表3所示的肽是從HCV的NS5、NS4和核心區(qū)合成的。
表3<
生物素標記肽或者是在樹脂上(生物素活性酯)通過衍生化從N-末端合成的或者通過在序列中使用生物素-ε-衍生的賴氨酸殘基(Fmoc-LYS(生物素)-OH)合成的。實施例2
通過優(yōu)選的檢測步驟提高檢測的特異性和敏感性。
用本發(fā)明的肽進行的雙抗原橋式檢測方法的特異性和敏感性，通過一定的檢測步驟可一步提高.在這一檢測步驟中，第一步混合樣品、半抗原標記抗原和固相抗原；然后優(yōu)選在1～4小時后，特別優(yōu)選1.5至2.5小時后，加入抗半抗原的抗體。
將HIV的表位區(qū)gp41/1和gp41/2(表2)用作抗原。
優(yōu)選的兩步檢測步驟的檢測條件如下-50mmol/L的中性磷酸鉀緩沖液，PH7.2，0.2％牛血清白蛋白(BSA)，0.2％月桂硫酸鈉(SLS)去垢劑-孵育時間-半抗原標記抗原和固相抗原與血清孵育120分鐘-與抗異羥洋地黃毒甙元的抗體和過氧化物酶的偶聯(lián)物孵育(<Dig>-POD)60分鐘-孵育溫度25℃-所有孵育步驟之間的結合狀/游離態(tài)的分離。
兩步檢測方法的另一檢測條件如下-50mmol/L PH為7.2的中性磷酸鉀緩沖液，0.2％BSA，0.2％SLS去垢劑-孵育時間
-固相抗原與血清孵育90分鐘-與半抗原標記抗原和<Dig>-POD孵育90分鐘-與ABST孵育60分鐘-孵育溫度25℃-所有孵育步驟之間的結合態(tài)/游離態(tài)的分離。
一步檢測法的檢測條件如下-50mmol/L PH為7.2的中性磷酸鉀緩沖液，0.2％的BSA，0.2％的SLS的去垢劑-孵育時間-兩種抗原與血清和<Dig>-POD孵育120分鐘-與ABTS孵育60分鐘-孵育溫度25℃-所有孵育步驟之間的結合態(tài)/游離態(tài)的分離檢測結果如表4所示?？梢钥闯?，在優(yōu)選的檢測方法中得到了非常高的信號區(qū)別，即測定的陽性樣品的信號與陰性樣品信號之比大。
表4
實施例3在雙抗原橋式檢測法中將本發(fā)明的肽抗原與重組多肽抗原進行比較。在本發(fā)明的一個實例中，異羥洋地黃毒甙元標記的肽抗原gp41/2(表2)與具有相同序列的生物素標記肽抗原結合進行檢測。在另一個對比實例中，異羥洋地黃毒甙元標記的多肽抗原rec gp41(Chang等.，Science 228(1985)，93-96)與具有相同序列的生物素標記多肽結合進行檢測。
本檢測的結果如表5所示。“NC”代表陰性對照，“PC”代表陽性對照?！敖刂埂敝笖?shù)(cut-off index)是實驗中陽性和陰性評價的界限。將其定義為2×NC。從表5中可以很明顯地看出，用重組多肽抗原時，陰性和陽性樣品之間可能沒有區(qū)別，而用肽抗原可看出很明顯的區(qū)別。
表5
序列表(1)一般信息(I)申請人(A)姓名Boehringer Mannheim GmhH(B)街道Sandhcfer Str 116(C)城市曼海姆(E)國家德國(F)郵政編碼68305(ⅱ)申請題目半抗原標記的肽(ⅲ)序列數(shù)目17(ⅳ)電腦可讀形式(A)資料載體軟盤(B)電腦IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release # 1.0 Version # 1.25(EPA)
(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體1型人類免疫陷病毒(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷gp120(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO 1Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr1 5 10 15Thr(2)SEO ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體1型人類免疫缺陷病毒(ⅷ)在基團組中的位置(A)染色體/片斷gp120(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO 2Asn Thr Thr Arg Ser Ile Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr1 5 10 15(2)SEO ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形
(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體1型人類免疫缺陷病毒(B)菌株O亞型(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷gp120(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO3Ile Asp Ile Gln Glu Glu Arg Arg Met Arg Ile Gly Pro Gly Met Ala1 5 10 15Trp Tyr Ser(2)SEO ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽
(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體1型人類免疫缺陷病毒(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷gp41(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO4Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu1 5 10 15Leu Gly Ile Trp Gly Ala Ser Gly20(2)SEO ID NO5的信息(I)序列特征(A)長度23個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源
(A)生物體1型人類免疫缺陷病毒(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷gp 41(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO5Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val1 5 10 15Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser20(2)SEO ID NO6的信息(I)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體1型人類免疫缺陷病毒(ⅷ)在基因組中的位置
(A)染色體/片斷gp41(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO6Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Ser Ser Gly Lys Leu1 5 10 15(2)SEO ID NO7的信息(I)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體1型人類免疫缺陷病毒(B)菌株O亞型(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷gp41(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO7Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Ser Leu Trp1 5 10 15
(2)SEO ID NO8的信息(I)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體1型人類免疫缺陷病毒(B)菌株O亞型(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷gp 41(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO8Leu Ser Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15(2)SEO ID NO9的信息(I)序列特征(A)長度19個氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體1型人類免疫缺陷病毒(B)菌株O亞型(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷gp 41(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO9Trp Gly Ile Arg Gln Leu Arg Ala Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu1 5 10 15Leu Gln Asn(2)SEO ID NO10的信息(I)序列特征(A)長度27個氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體2型人類免疫缺陷病毒(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷gp 32(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO10Gln Ala Gln Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His1 5 10 15Thr Thr Val Pro Trp Pro Asn Asp Ser Leu Thr20 25(2)SEO ID NO11的信息(I)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽
(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體丙型肝炎病毒(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷NS5(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO11Ser Arg Arg Phe Ala Gln Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp1 5 10 15(2)SEO ID NO12的信息(I)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體丙型肝炎病毒(ⅷ)在基因組中的位置
(A)染色體/片斷核心區(qū)(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO12Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val1 5 10 15(2)SEO ID NO13的信息(I)序列特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體丙型肝炎病毒(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷NS4(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO13Glu Glu Ala Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln1 5 10SEO ID NO14的信息
(I)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體丙型肝炎病毒(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷NS4(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO14Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr1 5(2)SEO ID NO15的信息(I)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體丙型肝炎病毒(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷NS4(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO15Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp1 5 10 15Ala Ala(2)SEO ID NO16的信息(I)序列特征(A)長度28個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽
(ⅲ)假擬非(ⅵ)原始來源(A)生物體丙型肝炎病毒(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷核心區(qū)(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO16Pro Gln Arg Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val1 5 10 15Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Val Val20 25(2)SEO ID NO17的信息(I)序列特征(A)長度25個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線形(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬非
(ⅵ)原始來源(A)生物體丙型肝炎病毒(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體/片斷NS3(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO17Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala1 510 15Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val20 2
權利要求
1.產(chǎn)生半抗原標記肽的方法，其中(a)在固相上由反應性側(cè)支基團被保護基團阻斷的氨基酸衍生物合成具有目標氨基酸序列的肽，選擇伯氨側(cè)支基團上的保護基團使得需要時可選擇性地被裂解掉，(b)除去保護基團以形成至少一個游離的伯氨基團，(c)將半抗原-活性酯衍生物與肽上至少一個游離的伯氨基團相偶聯(lián)，并且(d)如果需要，將仍保留的保護基團裂解掉，半抗原選自甾醇、膽酸、性激素、類皮質(zhì)激素、強心甾、強心甾糖甙、蟾蜍二烯內(nèi)酯、甾類皂角甙元和甾類生物堿。
2.權利要求1的方法，其中半抗原選自強心甾和強心甾糖甙。
3.權利要求2的方法，其中半抗原選自異羥洋地黃毒甙元、洋地黃毒甙元、芰毒甙元、毒毛旋花甙元、地高辛、洋地黃毒甙、地托辛(ditoxin)和毒毛旋花甙K。
4.權利要求3的方法，其中用異羥洋地黃毒甙元或地高辛為半抗原。
5.權利要求1至4之一的方法，其中帶有在特定反應條件下可定量除去的第一氨基側(cè)鏈保護基團的氨基酸衍生物用于半抗原將要偶聯(lián)的肽位置上，帶有第二氨基側(cè)鏈保護基團的氨基酸用于半抗原不偶聯(lián)的肽位置上，在第一保護基團可被裂解掉的反應條件下，第二保護基團自身不會被裂解。
6.權利要求5的方法，其中使用酸不穩(wěn)定性第一保護基團和酸穩(wěn)定性第二保護基團。
7.權利要求1至6之一的方法，其中用N-羥基琥珀酰亞胺酯作為活性酯衍生物。
8.權利要求1至7之一的方法，其中合成的肽含有一個免疫活性表位區(qū)和一個至少有一個半抗原標記物偶聯(lián)的間隔區(qū)。
9.權利要求8的方法，其中間隔區(qū)的長度為1到10個氨基酸。
10.權利要求8或9的方法，其中間隔區(qū)位于肽的氨基或/和羧基末端。
11.權利要求8至10之一的方法，其中間隔區(qū)含有帶電荷或/和可形成氫鍵的氨基酸。
12.權利要求8至11之一的方法，其中間隔區(qū)的氨基酸選自甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、賴氨酸和具有NH2-〔(CH2)n-O〕x-CH2-CH2-COOH結構的化合物，其中的n是2或3，X是1到10。
13.權利要求1至12之一的方法，其中合成的肽含有來自HIVI、HIVII或HCV氨基酸序列的表位區(qū)。
14.權利要求13的方法，其中表位區(qū)選自下列HIVI、或HIVII的氨基酸序列或其長度至少為6個氨基酸的部分序列NNTRKSISIG PGRAFYT (I)NTTRSISIGP GRAFYT (II)IDIQEERRMR IGPGMAWYS (III)QARILAVERY LKDQQLLGIW GASG(IV)LGIWGCSGKL ICTTAVPWNA SWS (V)KDQQLLGIWG SSGKL (VI)ALETLLQNQQ LLSLW (VII)LSLWGCKGKL VCYTS (VIII)WGIRQLRARL LALETLLQN (IX)和QAQLNSWGCA FRQVCHTTVP WPNDSLT (X)
15.權利要求13的方法，其中表位區(qū)選自下列HCV的氨基酸序列或其長度至少為6個氨基酸的部分氨基酸序列SRRFAQALPV WARPD(XI)PQDVKFPGGG QIVGGV (XII)EEASQHLPYI EQ (XIII)QKALGLLQT(XIV)SRGNHVSPTH YVPESDAA (XV)PQRKNKRNTN RRPQDVKFPGGGQIVGVV (XVI)AWYELTPAET TVRLRAYMNT PGLPV(XVII)
16.最大長度為50個氨基酸的、與至少一個半抗原活性酯衍生物通過氨基末端或/和通過氨基側(cè)支基團偶聯(lián)的半抗原標記肽，其中半抗原選自甾醇、膽酸、性激素、類皮質(zhì)激素、強心甾、強心甾糖甙、蟾蜍二烯內(nèi)酯、甾類皂角甙元和甾類生物堿。
17.權利要求16的肽，其中半抗原是異羥洋地黃毒甙元或地高辛。
18.權利要求16或17的肽，其中該肽含有一個免疫活性表位區(qū)和一個攜帶至少一個半抗原標記物的間隔區(qū)。
19.權利要求18的肽，其中間隔區(qū)位于肽的氨基或/和羧基末端。
20.權利要求16至19之一的肽，其中表位區(qū)從HIVI、HIVII或HCV的氨基酸序列衍化而來。
21.權利要求20中的肽，其中表位區(qū)選自下列HIVI或HIVII的氨基酸序列或其長度至少為6個氨基酸的部分氨基酸序列NNTRKSISIG PGRAFY (I)NTTRSISIGP GRAFYT (II)IDIQEERRMR IGPGMAWYS(III)QARILAVERY LKDQQLLGIW GASG (IV)LGIWGCSGKL ICTTAVPWNA SWS (V)KDQQLLGIWG SSGKL(VI)ALETLLQNQQ LLSLW(VII)LSLWGCKGKL VCYTS(VIII)WGIRQLRARL LALETLLQN(IX)和QAQLNSWGCA FRQVCHTTVP WPNDSLT (X)
22.權利要求20的肽，其中表位區(qū)選自下列的HCV氨基酸序列或其長度至少為6個氨基酸的部分序列SRRFAQALPV WARPD(XI)PQDVKFPGGG QIVGGV (XII)EEASQHLPYI EQ (XIII)QKALGLIQT(XIV)SRGNHVSPTH YVPESDAA (XV)PQRKNKRNTN RRPQDVKFPGGGQIVGVV (XVI)AWYELTPAET TVRLRAYMNT PGLPV(XVII)
23.按權利要求1至15之一的方法產(chǎn)生的半抗原標記肽或權利要求16至22之一中所述的肽，在檢測樣品液中特異抗體的免疫學方法中用作抗原。
24.權利要求23中的用途，其中免疫學方法是橋式檢測方法。
25.免疫測定樣品液中特異抗體的方法，其中樣品液與(a)和(b)一起孵育(a)針對待測抗體的含有按權利要求1至15之一的方法產(chǎn)生的半抗原標記肽或權利要求16至22之一的肽的第一標記抗原，及(b)攜帶一個信號產(chǎn)生基團的半抗原受體，通過與肽的結合檢測抗體。
26.權利要求25的方法，其中用地高辛或異羥洋地黃毒甙元標記的肽作為第一抗原，抗異羥洋地黃毒甙元或/和地高辛的抗體用作受體。
27.權利要求25或26的方法，其中在固相存在的情況下，樣品液與第一抗原和針對待測抗體的第二抗原一起孵育，第二抗原(a)與固相結合或(b)以能與固相相結合的形式存在，通過測定固相或/和液相中的標記物來檢測待測抗體。
28.權利要求27的方法，其中用生物素標記的抗原作為第二抗原，并使用鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包被的固相。
29.權利要求28的方法，其中生物素標記的肽用作第二抗原。
30.權利要求27至29之一的方法，其中樣品液與第一和第二抗原混合，然后加入第一抗原之半抗原的受體。
31.免疫測定特異抗體的試劑，其中試劑包括至少一個與待測抗體反應的按權利要求1至15之一的方法產(chǎn)生的半抗原標記肽，或含有一個與待測抗體反應的權利要求16至22之一的半抗原標記肽。
32.權利要求31的試劑，其中它包括(a)與待測抗體反應的半抗原標記肽，(b)攜帶信號產(chǎn)生基團的半抗原受體和(c)另一個與待測抗體反應的固定于固相上或以能與固相結合的形式存在的抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生半抗原標記肽的方法，其特征在于(a)在固相上，由其反應性側(cè)支基團被保護基團所阻斷的氨基酸衍生物合成具有目標氨基酸序列的肽，選擇伯氨側(cè)支基團上的保護基團使得需要時可被選擇性地裂解掉，(b)除去保護基團以形成至少一個游離伯氨基團，(c)半抗原活性酯衍生物與肽上至少一個游離的伯氨基團相偶聯(lián)和(d)如果需要，除去仍保留的保護基團，半抗原選自甾醇、膽酸、性激素、類皮質(zhì)激素、強心甾、強心甾糖甙、蟾蜍二烯內(nèi)酯、甾類皂角甙元和甾類生物堿。
文檔編號C07K1/00GK1130910SQ95190675
公開日1996年9月11日 申請日期1995年7月24日 優(yōu)先權日1994年7月25日
發(fā)明者E·豪斯, C·塞德爾, U－H·文胡斯, E·法茨, U·史密特 申請人:伯倫格·曼海姆有限公司