專利名稱：氧硫雜環(huán)戊烷、其制備方法和含此類化合物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，更確切地說，涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域。
更具體地說，其對象物質(zhì)是在2位上有一個氧硫雜環(huán)戊烷環(huán)取代的2′，3′-二脫氧核苷。
具體地說，本發(fā)明的對象物質(zhì)是有順式構(gòu)型(2R-5S)或(2S-5R)的5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷，其通式為 可以用以下兩種空間表達(dá)式中的一種來代表 式中R是一個從單環(huán)或雙環(huán)氮雜環(huán)衍生的?；鶊F(tuán)或芳烷基基團(tuán)，且2位上的羥甲基基團(tuán)相對于2和5這兩個位置所確定的平面而言處于順式位置。
取代基R所取的各種定義當(dāng)中，可區(qū)分為a)煙酸衍生物，其中該雜環(huán)是一種吡啶結(jié)構(gòu)，且酰基片斷處于2、3或4位上，其通式為Ia 式中X是一個氫、一個鹵原子、一個硝基、一個低級烷氧基或一個三氟甲基基團(tuán)，而n是1～3的一個整數(shù)；b)二氫吡啶酸衍生物，其中該雜環(huán)是一個1，4-二氫吡啶結(jié)構(gòu)，且酰基處于2、3或4位上，其通式為Ib 式中R1是一個有1～10個碳原子的烷基基團(tuán)，X和n的定義同上；c)季銨化煙酸衍生物，其中氮原子帶有一個烷基取代基，且酰基在2、3或4位上，其通式為Ic 式中A是一個無機(jī)或有機(jī)陰離子，R1、X和n的定義同上；d)喹啉酸衍生物，其中該雜環(huán)是一個雙環(huán)結(jié)構(gòu)，其通式為Id 式中羧基基團(tuán)可以在2、3或4位上，X代表一個氫、一個鹵素、一個三氟甲基基團(tuán)、一個低級烷氧基或一個硝基基團(tuán)，n′代表1～6的一個整數(shù)；e)二氫喹啉酸類，通式為Ie 式中R1和X的定義同上，n′是1～6的一個整數(shù)；f)季銨化喹啉酸類，通式為If 式中R1、X和n′的定義同上，?；鶊F(tuán)在2、3或4位上，而A是一個無機(jī)或有機(jī)陰離子；g)(二氫吡啶基)烷基衍生物，通式為Ig 式中R1、X和n的定義同上，m是1～6的一個整數(shù)；以及它們與無機(jī)或有機(jī)酸的酸加成鹽。
通式I的化合物可以拆解成其光學(xué)活性異構(gòu)體。因此，可以得到異構(gòu)體(+)和異構(gòu)體(-)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒感染是嚴(yán)重感染的原因，尤其是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)感染的原因，后者是一種往往致死和在較小程度上導(dǎo)致肝炎的病毒性感染。目前有幾種核苷型或雜核苷型化合物在臨床上用于治療這些退行性病毒感染。先有化合物是AZT(3′一疊氮基-2′，3′-二脫氧胸苷)衍生物(Proc.Natl.Acad.Sci.82，7096-7100，1985)、ddC(2′，3′-二脫氧胞苷)衍生物(Proc.Natl.Acad.Sci.86，1911-15，1986)、d4T(2′，3′-二脫氫-3′-脫氧胸苷)衍生物(Biochem.Biophys.Res.Comm.142，128-34，1987)、ddl(2′，3′-二脫氧肌苷)衍生物(Antiviral.Chem.Chemother 2，221，1991)、歐洲專利申請90301335.7中公開的BCH-189或3TC(2′，3′-二脫氧-3′-硫代胞苷)衍生物等?？晒┽t(yī)師利用的抗退行性病毒化合物的數(shù)目有限和有限療效，表明需要探索能提高療效和減少副作用的新化合物。
已經(jīng)知道2-[(1-羥甲基)-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷-5-基]胞嘧啶的一些衍生物，即羥甲基官能的酯類(歐洲專利申請0382526)或嘧啶環(huán)5位的鹵代衍生物(R.F.SCHINAZI et al.Antimicrob.Agents and Chemotherapy 36(1992)2423-2431)。
本發(fā)明的化合物具有抑制人體逆轉(zhuǎn)錄病毒、尤其VIH和B型肝炎(HBV)復(fù)制的能力。從BCH-189或TC-3衍生的化合物在其結(jié)構(gòu)中包括一個與胞嘧啶的外環(huán)代氨基結(jié)合的1，4-二氫-1-甲基-3-喹啉甲酰基。這種特定結(jié)構(gòu)實(shí)體使得在實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)上能增加和促進(jìn)血-腦屏障的滲透(Pharmacol.Ther.19，337-396，1983-MethodsEnzymol 112，381-396，1985-Drug Des.Del，1，51-64，(1986)-J.Med.Chem.31，244-249，1988-J.Med.Chem.32，1782-1788，1989-J.Med.Chem.32，1774-1781，1989)。
這些化合物的化學(xué)合成已經(jīng)用經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行。這些新型雜核苷的性能要求用化合物2′，3′-二脫氧-3′-硫代胞嘧啶作為起始原料，在化學(xué)文獻(xiàn)上已報(bào)道了它的幾種合成方法(J.Org.Chem.56，6503，1991-J.Org.Chem.57，2217，1992-Tet.Letter 33，4625，1992-Nucleosides and Nucleotides 12，225，1993)。本申請中也描述了從這種衍生物出發(fā)的、作為本發(fā)明對象物質(zhì)的化合物的合成和與其有關(guān)的中間體化合物的合成。
本發(fā)明也涉及通式I化合物的生產(chǎn)工藝，該工藝在于讓一種順式5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷與通式ROH羧酸的一種官能衍生物發(fā)生作用，式中R是從一個芳族或二氫芳族單環(huán)或雙環(huán)氮雜環(huán)衍生的一個酰基片斷，或與通式R′Z的一種芳烷基化活性衍生物發(fā)生作用，式中R′是從一個芳族或二氫芳族單環(huán)或雙環(huán)氮雜環(huán)衍生的一個芳烷基基團(tuán)，而Z是一個易斷裂的不穩(wěn)定基團(tuán)。
更準(zhǔn)確地說，ROH酸的官能衍生物是一種鹵化物，一種酐，一種從碳化二亞胺得到的混酐，或一種活潑酯如苯酚酯。
在芳烷基化衍生物的情況下，Z是一個鹵原子或一個烷基-或芳基磺?；?。
本發(fā)明也涉及作為對象物質(zhì)的、有抗病毒作用的藥物組合物，其特征在于它們包括至少一種通式I化合物或其與無機(jī)酸或有機(jī)酸的酸加成鹽作為活性組分，并摻合或締合一種惰性、無毒、藥物上可接受的載體或賦形劑，使之尤其適合于局部或全身性施用。
在這些組合物中，通式I活性組分的含量范圍因給藥方式而異，為每單元劑量0.1mg～100mg。
實(shí)例I順式2-(二苯基權(quán)丁基甲硅氧基甲基)-5-[N4-(3″-吡啶基羰基)胞嘧啶-1′-基]-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷異構(gòu)體1在室溫、氮?dú)饬飨拢蚨燃淄?7ml)和二甲基甲酰胺(2ml)的混合物中添加1當(dāng)量煙酸(27mg，0.21mmol)、1.1當(dāng)量BOP(93mg，0.23mmol)、1.1當(dāng)量HOBT(31mg，0.23mmol)、1當(dāng)量5′-叔丁基二苯基甲硅烷基-2′，3′-二脫氧-3′-硫代胞苷(39mg，0.23mmol)和4當(dāng)量DIEA(146μl，0.84mmol)。混合物在室溫?cái)嚢柽^夜，用5％檸檬酸溶液(10ml)洗滌，然后用5％碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗滌。得到的混合物用乙酸乙酯(3×10ml)萃取，用Na2SO4干燥，蒸發(fā)。殘留物在硅膠板上純化，得到48mg純化合物。[1H]NMRδ(CDCl3)＝1.1(s，9H，tBu)，3.1-3.6(m，2H，CH2-O)，3.7-4.2(m，2H，C4H2)5.25(t，1H，C5-H)，3.1-3.6(m，2H，CH2-O)，5.5(d，1H，C5.-H)，6.35(q，1H，C2-H)；7.4-7.8(m，1H，芳基)；8.0(d，1H，C6′-H)；8.3(d，1H，煙酸基)；8.8(d，1H，煙酸基)；8.8(d，1H，煙酸基)；9.1(d，1H，煙酸基)。
實(shí)例II順式2-(羥甲基)-5-[N4-(3"-吡啶基羰基)胞嘧啶-1′-基]-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷異構(gòu)體2化合物1(25mg，0.05mmol)溶解在3ml無水四氫呋喃中。向此溶液中添加3當(dāng)量(135μl，0.15mmol)氟化四丁銨。此溶液在室溫混合3小時。蒸發(fā)溶劑后，得到的產(chǎn)物在制備硅膠板上色譜法分離(洗脫劑甲苯/CH3OH 15％)。得到13mg所希望的化合物。[1H]NMRδ(CDCl3)＝3.1-3.6(m，2H，CH2-O)，3.7-4.2(m，2H，C4H2)，5.25(t，1H，C5-H)，5.5(d，H，C5′-H)；6.35(q，1H，C2-H)，7.4-7.8(m，1H，ar芳基ue)；8.0(d，1H，C6′-H)，83(d，1H，煙酸基)；8.8(d，1H，煙酸基)，91(s，1H，煙酸基)。
實(shí)例III順式2-(叔丁基二苯基甲硅氧基甲基)-5-[N4-(3″-(甲苯磺酰基))胞嘧啶-1′-基]-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷異構(gòu)體4向化合物5(56mg，0.12mmol)的吡啶(3ml)溶液中，在60℃、氮?dú)夥障拢砑?當(dāng)量對甲苯磺酰氯(46mg，0.24mmol)。在室溫?cái)嚢?0小時后，混合物蒸發(fā)、用5％檸檬酸溶液(10ml)洗滌，然后用乙酸乙酯(3×10ml)萃取。合并的有機(jī)相用Na2SO4干燥、蒸發(fā)，分離出48mg所希望的化合物。[1H]NMR(CDCl3)＝1.1(s，9H，叔丁基)；2.45(s，3H，CH3甲苯磺酰基)；3.15-3.55(m，2H，C2-CH2-O)；3.85-4.2(m，2H，C4H2)；5.25(t，1H，C5-H)；6.3(t，1H，C2-H)；7.3-7.7(m，14H，ArH)；8.05(d，1H，C6-H)。
實(shí)例IV順式2-(二苯基叔丁基甲硅氧基甲基)-5-[N4-(3"-(吡啶基羰基)胞嘧啶-1′-基]-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷異構(gòu)體3在90℃、氮?dú)夥障拢蜓苌?(47mg，0.075mmol)的盧剔啶(2ml)溶液中添加6當(dāng)量(46μl，0.45mmol)吡啶基甲胺。在攪拌下使加熱保持48小時。冷卻后混合物蒸發(fā)、用5％檸檬酸溶液(10ml)洗滌，然后用乙酸乙酯(3×10ml)萃取，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)后殘留物用硅膠板色譜法(洗脫劑EtOAc/MeOH，10/1)純化。
實(shí)例V順式2-(叔丁基二苯基甲硅氧基甲基)-5-(胞嘧啶-1′-基)-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷異構(gòu)體52′，3′-二脫氧-3′-硫代胞苷(105mg，0.45mmol)的吡啶(6ml)溶液在氮?dú)夥障掠枚交宥』坠柰榛?140μl，0.5mmol)處理。反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?4小時。真空濃縮后向其中添加30ml水，用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。然后，合并的有機(jī)相用Na2SO4干燥，濃縮至干，得到白色固體形式的化合物5(210mg，定量產(chǎn)率)。Rf(AcOEt/MeOH2/1)＝0，62[1H]NMR(CDCl3)δ1，1(s，9H，叔丁基)；3，1-3，6(m，2H，C2-CH2-O)；3，7-4，2(m，2H，C4-H2)；5，25(t，1H，C5-H)；5，5(d，H，C5.-H)；6，35(q，1H，C2-H)7，4-7，8(m，10H，2Ph)；8，0(d，1H，C6′-H)。
實(shí)例VI順式2-(羥甲基)-5-[N4-(1"-甲基-3"-吡啶基羧基)胞嘧啶-1′-基]-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷異構(gòu)體6，呈碘化物形式在氮?dú)夥障拢?當(dāng)量(46mg，0.14mmol)化合物2的4ml無水乙腈溶液中添加9當(dāng)量(1.25mmol，77μl)甲基碘。得到的溶液在50℃加熱48小時。蒸發(fā)溶劑后，殘留物用閃急色譜法純化，洗脫劑為BuOH/H2O/乙酸(5∶2.5∶2.5)。得到一種黃色固體(55mg)。[1H]NMR(DMSO d6)δ＝3.25(t，2H，CH2-4)；3.90(dd，2h，C2-CH2)；4，45(s，3H，N+-CH3)；5.25(t，1H，CH-5)；6.30(t，1H，CH-2)；6.92(d，1H，CH-6′)；7.30(d，1H，煙酸基)；7.85(d，1H，煙酸基)；8.05(d，1H，CH-5′)；8.20(d，1H，煙酸基)；7.85(d，1H，煙酸基)；9.01(d，1H，煙酸基)。質(zhì)譜(FAB+)349(M-1)+實(shí)例VII順式2-(羥甲基)-5-[N4-(1″-甲基-1"，4″-二氫-3"-吡啶基羰基)胞嘧啶-1′-基]-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷異構(gòu)體7在3ml含10％水的脫氣甲醇溶液中溶解30mg(0.06mM)化合物6。向此溶液中添加15mg碳酸氫鈉和60mg連二亞硫酸鈉。反應(yīng)混合物在氮?dú)庀聰嚢?小時。溶液變成橙色。蒸發(fā)溶劑，然后把這些鹽重新懸浮在少量甲醇中。過濾。濾液用薄層(1mm)制備色譜法(洗滌劑∶甲苯/甲醇，1∶1)純化，得到6mg黃白色固體。質(zhì)譜(FAB+)349(M-1)+實(shí)例VIII順式2-羥甲基-5-[N4-(3"-喹啉基羧基)胞嘧啶-1′-基]-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷異構(gòu)體8向2ml無水二甲基甲酰胺中添加74.4mg(0.43mmol)喹啉基-3-羧酸，然后添加96mg(0.47mmol)1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺和63.4mg(0.47mmol)羥基苯并三唑水合物。混合物在室溫、氮?dú)庀聰嚢?小時。出現(xiàn)一種二環(huán)己基脲白色沉淀，然后添加100mg(0.43mmol)2，3′-二脫氧-3′-硫代胞苷。混合物攪拌過夜。然后在減壓下蒸發(fā)二甲基甲酰胺，殘留物用NaCl飽和水溶液(10ml)水解。殘留物用乙酸乙酯(2×10ml)萃取2次。把有機(jī)相合并、用硫酸鎂干燥、過濾。蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)物用閃急色譜法(洗脫劑∶乙酸乙酯/甲醇，98∶2)純化，得到78mg白色固體(0.2mmol)，產(chǎn)率為46.5％。MP＝116-118℃ IR＝1656cm-1(酰胺官能團(tuán)的羰基)。[1H]NMR(DMSO d6)δ＝11，75(s，1H，NH)；9，40(d，1H，CH-2”)；9，15(d，1H，CH-4”)；8，65(d，1H，CH-5′)；8，20(m，2H，CH-8″et-CH-5＂)；8，0(m，1H，CH-6＂)；7，80(m，1H，CH-7″)；7，45(d，1H，CH-6′)；6，35(t，1H，CH-2)；5，55(t，1H，CH-5)；3，98(t，2H，C2-CH2-4)[13C]NMR(DMSO d6)δ＝37，14(C-4)；61，95(CH2O-C2)；87，28(C-2)；88，29(C-5)；95，85(C-5′)；122，21(C-3″)；126，28(C-6″)；127，71(C-5″)；129，63(C-10″)；129，87(C-7″)；132，08(C-8″)；137，65(C-4″) 138，89(C-6′)；148，91(C-9″)；149，29(C-2″)；163，16(C-2′)；164.51(C-4′)質(zhì)譜(Fab+)385(M＋1)+，769(2M＋1)+實(shí)例IX順式2-羥甲基-5-[N4-(1"-甲基-3"-喹啉基羰基)胞嘧啶-1′-基]-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷異構(gòu)體9，呈碘化物形式制備化合物8(78mg，0.20mmol)的4ml乙腈溶液。向此溶液中添加112μl(1.8mmol)甲基碘，混合物在氮?dú)庀略?0℃加熱24小時。脫除溶劑，然后把粗殘留物溶解在少量乙腈中。添加乙醚使之沉淀。由此得到一種橙色固體(60mg，產(chǎn)率55％)。MP＝156-159℃[1H]NMR(CD3OD)δ＝3.32(t，2H，CH2-4)3.99(dd，2H，C2-CH2)，4.80(s，3H+N-CH3)5.38(t，1H，CH-5)，6.0(d，1H，CH-6′)，6.33(t，1H，CH-2)，8.13(m，1H，CH-7＂)，8.39(m，1H，CH-6″)，8.60(m，2H，CH-8＂)，8.72(d，1H，CH-5′)， 9.79(d，1H，CH-4＂)，9.95(d，1H，CH-2″)。質(zhì)譜(Fab+)399[M-1]+，799[2(M-1)]+實(shí)例X順式2-羥甲基-5-[N4-(1″-甲基-1″，4"-氫-3″-喹啉基羰基)胞嘧啶-1′-基]-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷異構(gòu)體10向30mg(0.057mmol)化合物9的3ml脫氣含水甲醇(3ml含水10％的甲醇)溶液中添加15mg碳酸氫鈉和60mg連二亞硫酸鈉。整個混合物在氮?dú)庀聰嚢?小時。蒸發(fā)溶劑，粗殘留物用制備色譜法(洗脫劑∶乙酸乙酯/甲醇1∶1)純化。最后得到10mg玻璃態(tài)黃色固體，產(chǎn)率46％。[1H]NMR(D2O)δ＝3.24(m，3＋2H，NCH3＋CH2-4＂)；3.48(m，2H，CH2-4)；3.93(m，2H，C2H2)；5.29(t，1H，CH-5)；6.96(d，1H，CH-6′)；7.13(m，2H，CH-6＂＋CH-7＂)；7.27(m，2H，CH-5＂＋CH-8＂)；7.45(d，1H，CH-2＂)；8.23(d，1H，CH-5′)質(zhì)譜(Fab+)399(M-1)+實(shí)例XI順式2-羥甲基-5-[N4-(2-(α，α，α-三氟間甲苯胺基)煙酸基)胞嘧啶-1′-基]-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷異構(gòu)體11向2′，3′-二脫氧-3′-硫代胞苷(50mg，0.2mmol)的5ml無水DMF溶液中添加1.1當(dāng)量BOP(93mg，0.23mmol)、1當(dāng)量硝氟滅酸(2-(α，α，α-三氟間甲苯胺基)煙酸)和4當(dāng)量DIEA(146μl，0.84mmol)?；旌衔镌谑覝?cái)嚢柽^夜，用5％檸檬酸溶液(10ml)洗滌，然后用5％碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗滌。得到的混合物用乙酸乙酯(3×10ml)萃取、用硫酸鈉干燥，然后蒸發(fā)。
殘留物用硅膠柱色譜法(洗脫劑∶乙酸乙酯/甲苯1∶9)純化。得到一種白色固體(49mg，產(chǎn)率為48％)。
抗病毒性能評估試驗(yàn)抗HIV試驗(yàn)-實(shí)驗(yàn)方案a)通用條件儀器使用一臺Beckman TL100型超離心機(jī)。放射標(biāo)記粒子的計(jì)數(shù)用一臺惠普公司儀器Tri Carb Model 1600進(jìn)行。多核巨細(xì)胞(syncithia)是用一臺反轉(zhuǎn)顯微鏡Labovert觀察的。
溶菌緩沖劑NTE的組成三羥甲基氨基甲烷 10mMNaCl 100mMEDTA 1mMb)細(xì)胞培養(yǎng)物中抗病毒性能的評估試驗(yàn)抗病毒作用評估是以HIV-1病毒對MT4細(xì)胞系的致細(xì)胞病變效應(yīng)研究為依據(jù)的。MT4細(xì)胞系來源于從患者分離的、已被TLHV-I病毒轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞。HIV-1病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)是通過形成在顯微鏡下可見的多核巨細(xì)胞即所謂《syncithia》而顯示出來的。HIV-1的這種效應(yīng)可在感染之后4～5天觀察到。隨后有細(xì)胞死亡。
這種致細(xì)胞病變效應(yīng)與病毒對細(xì)胞的感染、與其細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并與這些細(xì)胞的病毒抗體表達(dá)呈正相關(guān)。因此，這種效應(yīng)的抑制對應(yīng)于對HIV-1病毒增殖的抑制。
MT4細(xì)胞在如下RPMI 1640培養(yǎng)基中保持3×105個細(xì)胞/ml10％在56℃去補(bǔ)體30分鐘的胎牛血清(激素、血清生長因子……)，1％谷氨酰胺，1％青霉素-鏈霉素，和2μg/ml能促進(jìn)病毒粘著到細(xì)胞上的Polyren。
抗病毒劑處理的作用是連續(xù)的。事實(shí)上，這種效應(yīng)存在于該病毒感染之前、期間和之后。用10％胎牛血清進(jìn)行相繼稀釋，以便能使MT4細(xì)胞培養(yǎng)8天和觀察到形成多核巨細(xì)胞。
MT4試驗(yàn)感染之前把3×106個細(xì)胞/100μl分配在一塊有96孔的微滴板上，以2000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘。然后，將沉淀物與100μl不同濃度的待測試抗病毒劑一起在37℃預(yù)培養(yǎng)1小時。
感染感染是在上述微孔中，在添加100TCIU(感染單位)HIV-1病毒時實(shí)現(xiàn)的(這一數(shù)量的HIV-1病毒被確定為能在4或5天后誘發(fā)形成多核巨細(xì)胞)。在病毒感染和以100TCIU稀釋時，抗病毒劑總是存在的。
感染之后在37℃培養(yǎng)1小時之后，MT4細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌3次，并在24孔的微滴板上，對待測試化合物的每個濃度都以每微升3×105個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)經(jīng)過D3這一天時，把MT4細(xì)胞稀釋到1/3。保持抗病毒劑濃度。在顯微鏡下觀察每天多核巨細(xì)胞的出現(xiàn)，以檢測相對于HIV-1對照組的任何可能延遲。在D8這一天進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶測定。當(dāng)這些細(xì)胞沒有被感染時，這就表明受到所試驗(yàn)抗病毒劑的保護(hù)。
逆轉(zhuǎn)錄酶的測定逆轉(zhuǎn)錄酶是一種依賴于RNA的DNA聚合酶。這種酶使得能發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制。多虧有它，轉(zhuǎn)錄到DNA上的病毒RNA才能進(jìn)入細(xì)胞染色體組。原病毒DNA被細(xì)胞酶轉(zhuǎn)錄到病毒RNA上。為了測定逆轉(zhuǎn)錄酶活性，要用95000轉(zhuǎn)/分超離心5分鐘，使1ml培養(yǎng)物上清液濃縮100倍。超離心后得到的病毒沉淀物重新懸浮于10μl(緩沖劑NTE＋TRITON 0.1％(聚氧乙烯醚))中。后者用來溶解病毒并釋放出逆轉(zhuǎn)錄酶。在離體試驗(yàn)中，逆轉(zhuǎn)錄酶活性就是所要尋找的證據(jù)。這種酶使用一種具有12～18個殘基的引物寡dT的合成板模多聚腺苷酸。這個反應(yīng)的放射標(biāo)記基質(zhì)是[3H]dTTP(1mCi/ml放射活性胸苷三磷酸酯)。新生成的氚標(biāo)記大分子用三氯乙酸沉淀，用過濾法使之與游離態(tài)[3H]TTP分離。逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活性是通過配合物聚-rA/聚-dT中所結(jié)合的放射活性測定的。在添加起放大器作用的閃爍液體之后，用粒子計(jì)數(shù)器測定這種放射標(biāo)記。
抗HBV試驗(yàn)-實(shí)驗(yàn)方案在用于評估化合物對B型肝炎病毒(HBV)的活性的幾種方法學(xué)中，已利用了鴨的B型肝炎病毒(Duck HBV)模式(J.Med.Virology(1990)31，82-89；Viral Hepatitis and LiverDisease(1988)506-509；Hepatology(1989)10，186-191)。離體測試化合物的抗HBV活性所需的培養(yǎng)物材料是用受到鴨B型肝炎病毒(DHBV)感染的鴨肝細(xì)胞制作的(Antimicrob.AgentsChemother.(1989)33，336-339；J.Med.Virology 40，59-64；Antivir Res.(1993)21，155-171；Antimicrob.AgentsChemother.(1993)37，1539-1542)。的確，鴨的B型肝炎病毒被公認(rèn)為非常接近于人體B型肝炎病毒(Viral Hepatitis and LiverDisease(1988)526-529；Antiviral Research(1987)8，189-199)。在標(biāo)準(zhǔn)化條件(Virology(1989)171，564-572)下，鴨肝細(xì)胞的培養(yǎng)物使得能進(jìn)行DHBV的全復(fù)制。所測試化合物的抗病毒活性是作為受感染肝細(xì)胞培養(yǎng)10天期間產(chǎn)生的病毒DNA數(shù)量的函數(shù)測定的。
實(shí)驗(yàn)步驟一只受DHBV感染的3周齡雄性幼鴨用來產(chǎn)生肝細(xì)胞。這只鴨在麻醉下宰殺，用Guillouzou的方法學(xué)(“分離與培養(yǎng)的肝細(xì)胞研究”，J.Libbey Eurotex Ltd/INSERM 1986)進(jìn)行肝細(xì)胞分離。這些細(xì)胞在Leibowitz′s培養(yǎng)基中培養(yǎng)，向其中添加5μg/ml牛胰島素、7×10-5摩爾可的松半琥珀酸鹽和1.5％二甲基亞砜(DMSO)。細(xì)胞的密度是8×106個細(xì)胞，把它們噴灑在100×20mm的培養(yǎng)盒中。在細(xì)胞分散開之后，向培養(yǎng)物中添加被試化合物。在l0天期間每天更新培養(yǎng)基。細(xì)胞上清液中鴨B型肝炎病毒的病毒DNA產(chǎn)量是借助于Fourel等人的“涂點(diǎn)”(Dot blot)雜化法(Viral Hepatitis andLiver Disease，1988，506-509；Hepatology，1989，10，186-191)測定的。抑制作用用細(xì)胞上清液中存在的DNA數(shù)量相對于未用核苷衍生物處理的DHBV感染培養(yǎng)物的百分率表示。
病毒學(xué)結(jié)果HIV試驗(yàn)已在本專利申請中描述了其合成并在以前的先有技術(shù)中給出了有關(guān)結(jié)構(gòu)的化合物，在受感染細(xì)胞具有MT4類型的情況下，對BRU HIV-1病毒(BRU是有經(jīng)驗(yàn)的病毒菌株)復(fù)制的抑制有影響。表I中描述了這些試驗(yàn)的結(jié)果。第1欄是最有代表性的、所研究的化合物的名稱，而在第2欄中報(bào)告的是所謂IC50值(該成分對于在受感染MT4細(xì)胞中在感染后D7天測定的HIV復(fù)制給出50％抑制的濃度)。觀察和計(jì)數(shù)所形成多核巨細(xì)胞的數(shù)目，并與受感染MT4細(xì)胞但未用抗病毒化合物處理的情況下計(jì)數(shù)的結(jié)果比較，確定IC50值。
DBHV試驗(yàn)按照本文件實(shí)驗(yàn)部分介紹的步驟，對最有代表性的所述化合物測試了它們對鴨HBV病毒(DHBV)復(fù)制的影響。在表II中描述了這些試驗(yàn)的結(jié)果。
縮略語AcOEt乙酸乙酯DNA脫氧核糖核酸PTSA對甲苯磺酸RNA核糖核酸AZT3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧胸苷或ZidovudineBOP苯并三唑甲酰氧三(二甲胺基)鏻六氟磷酸鹽TLC薄層色譜法DCCN，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺DCUN，N′-二環(huán)己基脲DIEAN，N-二異丙基-N-乙基胺DMFN，N-二甲基甲酰胺DHBV鴨B型肝炎病毒FAB+快速正原子轟擊3HdTTP1mCi/ml放射活性標(biāo)記的胸苷三磷酸酯HOBT1-羥基苯并三唑IR紅外光譜MP熔點(diǎn)NMR核磁共振AIDS獲得性免疫缺陷綜合癥MS質(zhì)譜TBAF四丁基二苯基甲硅烷基氟TBDPSCl四丁基二苯基甲硅烷基氯3-TC(-)-(2R，3S)-2-羥甲基-5-(胞嘧啶-1′-基)-1，3-氧雜環(huán)戊烷或LamivudineTCIU感染單位THF四氫呋喃RPM轉(zhuǎn)/分TsCl甲苯磺酰氯UV紫外HIV人體免疫缺陷病毒HBVB型肝炎病毒HLTV人體親淋巴T細(xì)胞病毒
權(quán)利要求
1.通式I順式構(gòu)型(2R-5S)或(2S-5R)的5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷 式中R是一個從單環(huán)或雙環(huán)氮雜環(huán)衍生的?；蚍纪榛?，且2位羥甲基相對于2和5這兩個位置所確定的平面處于順式位置。
2.按照權(quán)利要求1的5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷，具有2R-5S構(gòu)型，其通式為
3.按照權(quán)利要求1的5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷，具有2S-5R構(gòu)型，其通式為
4.按照權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)的煙酸化合物，式中R的通式Ia如下 式中X是一個氫、一個鹵原子、一個硝基、一個低級烷氧基或一個三氟甲基基團(tuán)，n是1～3的一個整數(shù)，且?；?、3或4位上。
5.按照權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)的二氫吡啶酸化合物，式中R的通式為 式中R1是一個有1～10個碳原子的烷基，X和n的定義同上，和?；?、3或4位上。
6.按照權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)的季銨化煙酸化合物，式中R的通式Ic為 式中A是一個無機(jī)或有機(jī)陰離子，R1、X和n的定義同上，和?；?、3或4位上。
7.按照權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)的喹啉酸化合物，式中R的通式Id為 式中羰基在2、3或4位上，X代表一個氫、一個鹵素、一個三氟甲基、一個低級烷氧基或一個硝基基團(tuán)，和n′代表1～6的一個整數(shù)。
8.按照權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)的二氫喹啉酰基化合物，式中R的通式Ie為 式中R1和X的定義同上，和n′是1～6的一個整數(shù)。
9.按照權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)的季銨化喹啉?；衔?，式中R的通式If為 式中R1、X和n′的定義同上，?；?、3或4位上，和A是一個無機(jī)或有機(jī)陰離子。
10.按照權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)的(二氫吡啶基烷基)化合物，式中R的通式Ig為 式中R1、X和n的定義同上，和m是1～6的一個整數(shù)。
11.按照權(quán)利要求1～10中任何一項(xiàng)的化合物與一種無機(jī)酸或有機(jī)酸的加成鹽。
12.按照權(quán)利要求1～11中任何一項(xiàng)的化合物的光學(xué)活性異構(gòu)體。
13.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的化合物，即順式2-羥甲基-5-[N4-(3"-吡啶基羰基)胞嘧啶-1′-基]-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷或其與一種無機(jī)酸或有機(jī)酸的加成鹽之一，呈外消旋形式或呈一種光學(xué)活性形式。
14.按照權(quán)利要求1～13中任何一項(xiàng)的化合物的制備方法，在于讓一種順式5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷與一種通式ROH羧酸的官能衍生物發(fā)生作用，式中R是一個從芳族或二氫芳族單環(huán)或雙環(huán)氮雜環(huán)衍生的?；糠?，或與一種通式R′Z的芳烷基化活性衍生物發(fā)生作用，式中R′是一個從芳族或二氫芳族單環(huán)或雙環(huán)氮雜環(huán)衍生的芳烷基，而Z是一個容易斷裂的不穩(wěn)定基團(tuán)。
15.有抗病毒作用的藥物組合物，其特征在于它們包括通式I的至少一種化合物作為活性成分 式中R是從芳族或二氫芳族單環(huán)或雙環(huán)氮雜環(huán)衍生的一個?；蛞粋€芳烷基，和2位上的羥甲基相對于2和5這兩個位置確定的平面處于順式位置，或其與一種酸的加成鹽，呈外消旋形式或呈光學(xué)活性形式，并摻合或締合一種情性、無毒、藥物上兼容的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及治療化學(xué)。本發(fā)明提供通式(I)的順式5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷，式中R是從單環(huán)或雙環(huán)氮雜環(huán)衍生的一個?；蚍纪榛鶊F(tuán)，且2位羥甲基基團(tuán)相對于2位和5位確定的平面處在順式位置。通式(I)的化合物可作為活性成分用于藥物組合物，尤其具有抗病毒活性的藥物組合物。
文檔編號C07D239/00GK1130906SQ9519064
公開日1996年9月11日 申請日期1995年5月24日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月24日
發(fā)明者A·-S·查維-福里, M·坎普羅, J·-L·克勞斯 申請人:拉法爾實(shí)驗(yàn)室