一種小分子多肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小分子多肽，所述小分子多肽包含：(a)小分子多肽氨基酸序列：SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；(b)在(a)限定的小分子多肽中經(jīng)過缺失、插入或置換一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與(a)所述多肽具有相同生物學(xué)功能的由(a)衍生的多肽；所述小分子多肽分子量為2434.99g/mol，等電點(diǎn)為11.6；其可應(yīng)用于制備抗菌和促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的材料中。本發(fā)明是一種小分子多肽，穩(wěn)定性強(qiáng)，結(jié)構(gòu)易于調(diào)控，易于與其它化合物結(jié)合，可以簡(jiǎn)單應(yīng)用于各種形式的材料，具有良好的抗菌能力，同時(shí)具備促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，無毒害作用，具有很明顯的應(yīng)用潛力，這種小分子多肽與大分子多肽相比合成方法簡(jiǎn)便，易于大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種小分子多肽及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種小分子多肽及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 牙種植體，是通過外科手術(shù)的方式將其植入人體缺牙部位的上下頜骨內(nèi)，待其手 術(shù)傷口愈合后，在其上部安裝修復(fù)假牙的裝置。種植牙的核心關(guān)鍵在于種植體部分，種植體 部分相當(dāng)于真牙的牙根，對(duì)于整個(gè)牙齒的固定起到了至關(guān)重要的作用。
[0003] 牙種植體按其材料不同，分為金屬與合金材料類，陶瓷材料類，碳素材料類，高分 子材料類，復(fù)合材料類。
[0004] 隨著醫(yī)療技術(shù)發(fā)展，牙種植體和骨種植體等種植材料被廣泛應(yīng)用在牙列缺損、骨 頭損失等疾病治療。然而該類手術(shù)的感染率很高，可能會(huì)導(dǎo)致大量抗生素治療、去除種植體 甚至死亡等嚴(yán)重后果。種植體相關(guān)感染高發(fā)的主要原因有兩點(diǎn)：菌斑在種植體表面聚集和 種植體骨結(jié)合界面抵抗能力低下。為了避免種植體相關(guān)感染，移植物應(yīng)具有兩方面的優(yōu)良 性能：優(yōu)異的抗菌性能和促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)功能。
[0005] 因此，尋找具有以上兩種性能的化合物用于提高種植體性能和預(yù)防種植體相關(guān)感 染是很有必要的。多肽分子結(jié)構(gòu)由氨基酸組成，通常在人體內(nèi)生物相容性良好，對(duì)人體不產(chǎn) 生刺激。因此，開發(fā)具有抗菌和促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)作用的多肽，對(duì)于疾病的治療和生命的挽 救具有很重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的之一在于提供一種具有抗菌和促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的小分子多肽。本發(fā) 明目的之二在于提供該小分子多肽在制備抗菌和促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的材料中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0008] -種小分子多肽，所述小分子多肽包含：
[0009] (a)小分子多肽氨基酸序列：SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列；
[0010] (b)在（a)限定的小分子多肽中經(jīng)過缺失、插入或置換一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與（a) 所述多肽具有相同生物學(xué)功能的由（a)衍生的多肽。
[0011] 優(yōu)選的是，所述小分子多肽分子量為2434. 99g/mol。
[0012] 優(yōu)選的是，所述小分子多肽等電點(diǎn)為11. 6。
[0013] 優(yōu)選的是，其在制備抗菌和促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的材料中的應(yīng)用。種植體的鈦表面 可用連接子預(yù)處理，并且可將含有-SH基團(tuán)的氨基酸（例如半胱氨酸）引入本發(fā)明小分子 多肽的N末端或C末端中，以結(jié)合所述連接子的官能團(tuán)。也可用連接子對(duì)鈦表面預(yù)處理后連 接多肽中的-NH2基團(tuán)，將多肽連接在鈦表面。舉例來說，結(jié)合連接子，本發(fā)明小分子多肽在N 末端含有半胱氨酸以便借助于連接子與半胱氨酸之間的相互作用容易地被引入種植體中。 另外，為了將本發(fā)明小分子多肽穩(wěn)定地引入種植體的鈦（Ti)表面中，優(yōu)選利用硅烷-連接 子-肽的連接關(guān)系將這些小分子多肽引入種植體表面中。這樣處理得到的鈦金屬可作為牙 種植體和骨種植體使用，由于其優(yōu)異的抗菌性能和促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)功能，對(duì)于避免種植 體細(xì)菌感染和挽救病人生命有重大意義。
[0014] 此外，本發(fā)明的小分子多肽也可簡(jiǎn)單應(yīng)用于其他日常使用的材料表面，如塑料、玻 璃和其他金屬表面，可有效預(yù)防日常接觸引起的細(xì)菌感染。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供的一種小分子多肽，具有良好的抗菌能力，對(duì)于 多種菌種均能有效殺菌，并且殺菌效果能達(dá)到99% ;同時(shí)本發(fā)明的小分子多肽具備提高成 骨細(xì)胞活性的能力，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化能力的作用；通過細(xì)胞毒性分析，可知利用本發(fā)明制 作的材料無毒，作用于人體不會(huì)造成健康危害；本發(fā)明提供了一種小分子多肽，穩(wěn)定性強(qiáng)， 結(jié)構(gòu)易于調(diào)控，易于與其它化合物結(jié)合，可以簡(jiǎn)單應(yīng)用于各種形式的材料，具有很明顯的應(yīng) 用潛力，易于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0016] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義
[0017] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者 類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
[0018] 術(shù)語"氨基酸"意指構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，賦予蛋白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu)形態(tài)，使 它的分子具有生化活性。蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)重要的活性分子，包括催化新陳代謝的酶，兩個(gè) 或兩個(gè)以上的氨基酸化學(xué)聚合成肽，一個(gè)蛋白質(zhì)的原始片段，是蛋白質(zhì)生成的前體，氨基酸 廣義上是指既含有一個(gè)堿性氨基又含有一個(gè)酸性羧基的有機(jī)化合物，正如它的名字所說的 那樣。但一般的氨基酸，則是指構(gòu)成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位。在生物界中，構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的氨 基酸具有其特定的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即其氨基直接連接在α-碳原子上，這種氨基酸被稱為α-氨 基酸。在自然界中共有300多種氨基酸，其中α-氨基酸21種。α-氨基酸是肽和蛋白質(zhì) 的構(gòu)件分子，也是構(gòu)成生命大廈的基本磚石之一。
[0019] 術(shù)語"多肽"意指α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，它也是蛋白質(zhì)水 解的中間產(chǎn)物。由兩個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽，同理類推還有三肽、四 肽、五肽等，通常由10?100氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫多肽，它們的分子量低于 10000道爾頓，能透過半透膜，不被三氯乙酸及硫酸銨所沉淀，也有文獻(xiàn)把由2?10個(gè)氨基 酸組成的肽稱為寡肽（小分子肽）；10?50個(gè)氨基酸組成的肽稱為多肽；由50個(gè)以上的氨 基酸組成的肽就稱為蛋白質(zhì)。
[0020] 術(shù)語"缺失"意指一個(gè)正常染色體斷裂后丟失了一個(gè)片段，這片段上的基因也隨之 失去，在本發(fā)明中意指小分子多肽除了為SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列之外，還包括小分 子多肽氨基酸序列中丟失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的不影響其功能的新的氨基酸序列的小分子 多肽。
[0021] 術(shù)語"插入"意指利用基因操作技術(shù)把一段DNA接入另一段DNA中或克隆載體中 去，在本發(fā)明中意指小分子多肽除了為SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列之外，還包括小分子 多肽氨基酸序列中插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的不影響其功能的新的氨基酸序列的小分子多 肽。
[0022] 術(shù)語"置換"意指一種基因重組載體，一般利用同源重組將基因組中的某段基因替 換，而達(dá)到基因敲除的目的，在本發(fā)明中意指小分子多肽除了為SEQIDNo. 1所示的氨基酸 序列之外，還包括小分子多肽氨基酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被其他種類的氨基酸置換后 的不影響其功能的新的氨基酸序列的小分子多肽。
[0023] 術(shù)語"等電點(diǎn)"意指在某一pH的溶液中，氨基酸或蛋白質(zhì)解離成陽離子和陰離子 的趨勢(shì)或程度相等，成為兼性離子，呈電中性，此時(shí)溶液的pH成為該氨基酸或蛋白質(zhì)的等 電點(diǎn)，生物兩性分子如蛋白質(zhì)即含有酸性的，也含有堿性的官能團(tuán)。組成蛋白質(zhì)的氨基酸可 能是帶正電荷的、帶負(fù)電荷的、中性的或者本生是兩性的，它們的電荷加在一起是蛋白質(zhì)的 電荷，PH值小于等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的總電荷是正的，大于等電點(diǎn)時(shí)是負(fù)的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明所述小分子多肽對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響與普通培養(yǎng)基對(duì)成骨 細(xì)胞增殖活性影響的比較結(jié)果對(duì)照?qǐng)D。
[0025] 圖2為本發(fā)明所述小分子多肽對(duì)初始細(xì)胞分化能力與普通培養(yǎng)基對(duì)初始細(xì)胞分 化能力的比較結(jié)果對(duì)照?qǐng)D。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0027] 實(shí)施例1 :
[0028] -種小分子多肽，氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示；
[0029] SEQIDNo.I：GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM〇
[0030] 實(shí)施例2 :
[0031] 小分子多肽的制備：
[0032] 選用氨基酸-王樹脂作為載體（樹脂），用二氯甲烷將樹脂充分溶脹，用二甲基甲 酰胺清洗幾遍，用適當(dāng)濃度的DBLK，將Fmoc-保護(hù)基團(tuán)脫出，之后用二甲基甲酰胺清洗數(shù) 遍，洗去DBLK，稱取適合的縮合劑苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽和活 化劑甲基嗎啉以及C端第二個(gè)Fmoc-保護(hù)氨基酸（Fmoc-Pro-OH)進(jìn)行偶聯(lián)，通過茚三酮檢 測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)確保連接比較完全，用二甲基甲酰胺清洗幾遍，洗去殘留的各種殘基，活化劑 和縮合劑，依氨基酸序列進(jìn)行偶聯(lián)，將所有的氨基酸連接結(jié)束后，脫去最后的Fmoc-保護(hù)基 團(tuán)，用切割液裂解，去除樹脂和氨基酸保護(hù)基團(tuán)，得到小分子多肽的粗品，送質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)品 分子量2434. 99g/mol符合理論值。
[0033] 實(shí)施例3 :
[0034] 抗菌能力實(shí)驗(yàn)：
[0035] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0036] 在滅菌試管中加入ImL濃度為IXIO6個(gè)/mL的菌液，加入Img本發(fā)明所提供的小 分子多肽，37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，培養(yǎng)基收集起來用倍比稀釋，稀釋倍數(shù)為10倍和涂布培養(yǎng) 法檢測(cè)活菌數(shù)。
[0037] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0038] 表1本發(fā)明所述小分子多肽的殺菌率（％ )
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 一種小分子多肽，其特征在于，所述小分子多肽包含： (a) 小分子多肽氨基酸序列：SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列； (b) 在（a)限定的小分子多肽中經(jīng)過缺失、插入或置換一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與（a)所述 多肽具有相同生物學(xué)功能的由（a)衍生的多肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，所述小分子多肽分子量為 2434. 99g/mol。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，所述小分子多肽等電點(diǎn)為11. 6。
4. 權(quán)利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，其在制備抗菌和促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的 材料中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/00GK104327168SQ201410512231
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】李培源, 蘇煒, 霍麗妮, 陳睿 申請(qǐng)人:廣西中醫(yī)藥大學(xué)