一種固相樹脂及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固相樹脂及其制備方法和用途。所述方法涉及的固相樹脂結(jié)構(gòu)如式Ⅰ所示；HMPA-AAn-AM樹脂Ⅰ，其中的AA為下述相同或不相同的帶側(cè)鏈保護的氨基酸：Arg、Lys、Asn、Gln、Asp、Glu、Pro、Gly；n為0-8的整數(shù)。所述固相樹脂可用于胸腺法新的固相合成。
【專利說明】一種固相樹脂及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽固相合成領(lǐng)域，尤其涉及胸腺法新的固相合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胸腺法新是一種由28個氨基酸組成的多肽，其序列為=Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-GIu-Ala-Glu-Asn。它的分子式為=C129H215N33O55，分子量 3108.37。
[0003]胸腺法新原名胸腺肽α 1，又稱胸腺素α I或Ta I。胸腺法新是胸腺肽中的一種。胸腺肽是胸腺組織分泌的具有生理活性的一組多肽，能促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化，增強巨噬細胞吞噬活性，可用于治療多種免疫缺陷病。臨床研究表明，胸腺肽a I是胸腺素中最重要、生物活性最強的組分。胸腺法新具有顯著的雙向免疫調(diào)節(jié)作用，被認為是一個化學成分明確、刺激作用適中的理想的免疫調(diào)節(jié)劑。
[0004]胸腺法新可以用以治療慢性乙肝、慢性丙肝、肝炎后肝硬化(包括代償期和失代償期)、原發(fā)性肝癌、病毒性重型肝炎。中內(nèi)外的臨床研究表明，單用胸腺法新治療慢性乙肝，持續(xù)應(yīng)答率與單用干擾素相近，但沒有干擾素的毒副作用。雖然胸腺法新的治療效果并不顯著，但在停止治療后，病毒清除率反而有上升的趨勢，也就是說胸腺法新在抑制乙肝病毒上有很強的后續(xù)效應(yīng)。
[0005]目前胸腺法新的合成方法主要是用多肽固相合成法，雖然多肽固相合成技術(shù)已經(jīng)相當成熟，但是在合成 胸腺法新時，其粗品純度往往不高(低于50%)。這主要是由于胸腺法新形成了 β折疊，使得某些氨基酸的偶聯(lián)及去保護非常困難。另外，合成過程中使用的王樹脂或者CTC樹脂容易發(fā)生DKP副反應(yīng)，這也是純度下降的重要的原因。CN201110069876公開了一種合成胸腺法新的方法，該方法使用PEG Wang樹脂，能有效的減少胸腺法新的β折疊，使得粗品的純度大大提高。但是，DKP還是沒能控制得很好，而且PEG王樹脂的成本非常高，不利于大生產(chǎn)。
[0006]因此，本領(lǐng)域迫切需要找到一種有效合成胸腺法新的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明旨在提供一種多肽固相合成胸腺法新的制備方法。
[0008]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種結(jié)構(gòu)如式I所示的固相合成樹脂；
[0009]HMPA-AAn-AM 樹脂 I
[0010]其中的AA為下述相同或不相同的帶側(cè)鏈保護的氨基酸:Arg、Lys、Asn、Gin、Asp、Glu、Pro λ Gly ；
[0011]n 為 0-8 的整數(shù)；例如 η 為 O、1、2、3、4、5、6、7 或 8。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述AA為下述相同或不相同的帶側(cè)鏈保護的氨基酸:Arg、Lys、Proλ Gly0
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述η為0-4的整數(shù)；例如η為O、1、2、3或4。[0014]在另一優(yōu)選例中，所述側(cè)鏈保護基團選自Pbf、Boc、Trt、OtBu。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述AA為下述相同或不相同的帶側(cè)鏈保護的氨基酸:Arg (Pbf)、Lys (Boc)、Asn (Trt)、Gln (Trt)、Asp (OtBu)、Glu (OtBu)、Pro、Gly。
[0016]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種如上所述的本發(fā)明提供的固相合成樹脂的制備方法，所述方法包括步驟:
[0017](I)將 Fmoc-AAn-OH 和 AM 樹脂縮合，得到 Fmoc-AAn-AM 樹脂；
[0018](2)將Fmoc-AAn-AM樹脂和去保護劑混合、洗滌得到AAn-AM樹脂；
[0019](3)將HMPA-Linker和AAn-AM樹脂縮合，得到如上所述的本發(fā)明提供的固相合成樹脂；
[0020]其中的AA為下述相同或不相同的帶側(cè)鏈保護的氨基酸:Arg(Pbf)、Lys (Boc)、Asn (Trt)、Gln (Trt)、Asp (OtBu)、Glu (OtBu)、Pro、Gly ；
[0021]η 為 0-8 的整數(shù)；例如 η 為 O、1、2、3、4、5、6、7 或 8。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的去保護劑以其總體積計，其中含有3%_20%哌啶，0.5%-10% 二環(huán)脒(DBU)JP 0.1Μ-0.5Μ1 —羥基苯并三唑(HOBt)。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的去保護劑以其總體積計，其中含有1%_10%哌啶和0.1M-0.5M1 —羥基苯并三唑(HOBt)。 [0024]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)和(3)中所述的氨基酸和樹脂的縮合在選自下述的一種或多種縮合劑的存在下進行:N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)、0-(苯并三唑-1-基)-N, N, N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、三羥甲基丙烷(TMP)、二異丙基乙胺(DIPEA)、1 一羥基苯并三唑(HOBt);更佳地，所述的縮合劑中含有N，N’- 二異丙基碳二亞胺(DIC)U 一羥基苯并三唑(H0Bt)、0-(苯并三唑-1-基)-N，N, N, N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和三羥甲基丙烷TMP);最佳地，所述的縮合劑中含有N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)U -羥基苯并三唑(HOBt)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和二異丙基乙胺(DIPEA)。
[0025]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)和(3)中所述的Fmoc-氨基酸和樹脂的縮合在縮合劑的存在下進行，所述縮合劑由N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)、I 一羥基苯并三唑(HOBt)和N，N-二甲基吡啶(DMAP)組成。
[0026]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種如上所述的本發(fā)明提供的固相合成樹脂的用途，用于結(jié)構(gòu)如式II所示的胸腺法新的固相合成；
[0027]Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val5-Asp6-Thr7-Ser8-Ser9-Glu10-1le11-Thr12-Thr13-Lys14-AsP15-Leul6-Lys17-Glul8-Lys19-Lys20-Glu21-Val22-Val23-Glu24-Glu25-Ala26-Glu27-Asn28-OH II
[0028]
[0029]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種如式II所示的胸腺法新的固相合成制備方法，以如上所述的本發(fā)明提供的固相合成樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護基團的氨基酸或多肽，獲得保護的二十八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，用縮合劑進行接肽反應(yīng)，得保護的二十八肽樹脂后，同步進行脫側(cè)鏈保護基團及切肽，獲得胸腺法新。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述的制備方法包括步驟:
[0031 ] (i )連接 Fmoc-Asn (Trt) -OH,得到 Fmoc-Asn (Trt) -HMPA-AAn-AM 樹脂；[0032](ii )將 Fmoc-Asn (Trt) -HMPA-AAn-AM 樹脂與去保護試劑混合，脫除 Fmoc ；
[0033](iii)按照Fmoc固相合成法重復(fù)步驟(i)中氨基酸與樹脂偶聯(lián)的操作與步驟
(ii)中脫保護操作，將具有側(cè)鏈保護基團的氨基酸從肽鏈碳端到氮端依次偶聯(lián)，獲得結(jié)構(gòu)如式III所示的 Fmoc保護的二十八肽樹脂；和
[0034](iv) Fmoc保護的二十八肽樹脂經(jīng)裂解液裂解得到胸腺法新；
[0035]FmocSer (tBu) Asp (OtBu) AlaAlaValAsp (OtBu) Thr (tBu) Ser (tBu)IIISer(tBu)Glu(OtBu)IleThr(tBu)Thr(tBu)Lys(Boc)Asp(OtBu)LeuLys(Boc)Glu (OtBu)Lys (Boc)Lys(Boc)Glu(0tBu)ValValGlu(0tBu)Glu(0tBu)AlaGIu(0tBu)Asn (Trt) -HMPA-AAn-AM 樹脂
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述的去保護劑以其總體積計，其中含有1%_50%哌啶，
0.5%-10% 二環(huán)脒(DBU)，1%-10% 哌嗪，0.5%-10%1 一羥基苯并三唑(HOBt)，0.1%_10%1，4- 二硫代蘇糖醇(DTT)，5%-50%乙醇胺，5%-50%叔丁基胺(TBA)，1%-10%環(huán)己亞胺，和/或3%-30%N-甲基吡咯烷。
[0037]在另一優(yōu)選例中，連接或偶聯(lián)具有Fmoc保護基團的氨基酸或多肽時的縮合劑為下述的一種或一種以上的混合:DIC、HATU, TBTU、HBTU, PyBop, HOBt、Cl-HOBt, DIEA、NMM。
[0038]在另一優(yōu)選例中，所述裂解液中含有下述一種或一種以上的混合:三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、三異丙基硅烷、水、苯甲硫醚、苯甲醚。
[0039]據(jù)此，本發(fā)明提供了一種有效合成胸腺法新的新方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1顯示了本發(fā)明提供的制備胸腺法新的合成工藝流程圖。
[0041 ] 圖2顯示了實施例制備得到的胸腺法新產(chǎn)品的HPLC圖。
[0042]圖3顯示了實施例制備得到的胸腺法新產(chǎn)品的LC-MS圖。
[0043]圖 4 顯示了用王樹脂(Wang resin)的 Fmoc-[20_28] ,Fmoc-[20-22] ,Fmoc-[20-23]、Fmoc-[20-24]和 Fmoc-[20-25]的 LCMS 圖。
[0044]圖 5 顯示了用 HMPA-AM 樹脂的 Fmoc-[20-28]、Fmoc-[20-22]、Fmoc-[20-23]、Fmoc-[20-24]和 Fmoc-[20-25]的 LCMS 圖。
【具體實施方式】
[0045]發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)使用一種特定的樹脂可以有效控制胸腺法新固相合成過程中的DKP。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0046]本文中所使用的化合物、化學基團和試劑等的表示方法均為所屬領(lǐng)域公認的表示方法。為了方便查閱，下表將列出本文中所用到的縮略語及其具體名稱:
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)構(gòu)如式I所示的固相合成樹脂； HMPA-AAn-AM 樹脂 I 其中的AA為下述相同或不相同的帶側(cè)鏈保護的氨基酸:Arg、Lys、Asn、Gln、Asp、Glu、Pro、Gly ； η為0-8的整數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的固相合成樹脂，其特征在于，所述側(cè)鏈保護基團選自Pbf、Boc,Trt、OtBu。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的固相合成樹脂的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (1)將Fmoc-AAn-OH和AM樹脂縮合，得到Fmoc-AAn-AM樹脂； (2)將Fmoc-AAn-AM樹脂和去保護劑混合、洗滌得到AAn-AM樹脂； (3)將HMPA-Linker和AAn-AM樹脂縮合，得到如權(quán)利要求1或2所述的固相合成樹脂； 其中的AA為下述相同或不相同的帶側(cè)鏈保護的氨基酸:Arg (Pbf)、Lys (Boc)、Asn (Trt)、Gln (Trt)、Asp (OtBu)、Glu (OtBu)、Pro、Gly ；
η為0-8的整數(shù)。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)和(3)中所述的Fmoc-氨基酸和樹脂的縮合在縮合劑的存在下進行，所述縮合劑由N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)U -羥基苯并三唑(HOBt)和N，N-二甲基吡啶(DMAP)組成。
5.一種如權(quán)利要求1或2所述的固相合成樹脂的用途，其特征在于，用于結(jié)構(gòu)如式II所示的胸腺法新的固相合成；
Ser1-Asp2-Ala3-Ala4-Val5-Asp6-Thr7-Sers-Ser9-Glu10-1le11-Thr12-Thr13-Lys14-Asp15-Leul6-Lys17-Glul8-Lys19—Lys20—Glu21—Val22—Val23—Glu24—Glu25—Ala26—Glu27—Asn28—0H。 II
6.一種如式II所示的胸腺法新的固相合成制備方法，以如權(quán)利要求1或2所述的固相合成樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護基團的氨基酸或多肽，獲得保護的二十八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，用縮合劑進行接肽反應(yīng)，得保護的二十八肽樹脂后，同步進行脫側(cè)鏈保護基團及切肽，獲得胸腺法新。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括步驟:
(i )連接 Fmoc-Asn (Trt) -OH,得到 Fmoc-Asn (Trt) -HMPA-AAn-AM 樹脂； (ii )將Fmoc-Asn (Trt) -HMPA-AAn-AM樹脂與去保護試劑混合,脫除Fmoc ； (iii)按照Fmoc固相合成法重復(fù)步驟(i)中氨基酸與樹脂偶聯(lián)的操作與步驟(ii)中脫保護操作，將具有側(cè)鏈保護基團的氨基酸從肽鏈碳端到氮端依次偶聯(lián)，獲得結(jié)構(gòu)如式III所示的Fmoc保護的二十八肽樹脂； (iv)Fmoc保護的二十八肽樹脂經(jīng)裂解液裂解得到胸腺法新； FmocSer(t B u) Asp (OtBu)AlaAlaValAsp (OtBu)Thr (t Bu)Ser (t B u)Ser (tBu)Glu (OtBu) IIeThr (tBu)Thr (tBu)Lys (Boc) Asp (OtBu)LeuLys (Boc)Glu (OtBu)Lys(Boc)Lys(Boc)Glu (OtBu)ValValGlu(OtBu)Glu(OtBu)AlaGlu(OtBu)Asn(Trt)-HMPA-AAn-AM 樹脂。III
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的去保護劑以其總體積計，其中含有 1%-50% 哌啶，0.5%- 10% 二環(huán)脒(DBU)，1%-10% 哌嗪，0.5%-10%1 一羥基苯并三唑(HOBt)，.0.1%-10%1，4- 二硫代蘇糖醇(DTT)，5%-50% 乙醇胺，5%-50% 叔丁基胺(TBA)，1%_10% 環(huán)己亞胺，和/或3%-30%N-甲基吡咯烷。
9.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，連接或偶聯(lián)具有Fmoc保護基團的氨基酸或多肽時的縮合劑為下述的一種或一種以上的混合:DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIEA、NMM。
10.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述裂解液中含有下述一種或一種以上的混合:三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、三異丙基硅烷、水、苯甲硫醚、苯甲醚。
【文檔編號】C07K1/06GK103951744SQ201410105039
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】張巍, 袁劍琳, 張成廣, 譚松暖, 陳超 申請人:海南雙成藥業(yè)股份有限公司