化合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了化合物及其制備方法和應(yīng)用，其中，該化合物具有如式1所示的結(jié)構(gòu)：利用該化合物能夠?qū)⒍嚯腘端的氨基轉(zhuǎn)化為疊氮基團(tuán)，進(jìn)而在短肽連接制備蛋白時，將用于連接的短肽N端的半胱氨酸氨基掩蔽為疊氮基團(tuán)，能夠?qū)崿F(xiàn)一次將三個短肽進(jìn)行連接，即連接兩個短肽后不需要立即進(jìn)行分離純化處理，在解除掩蔽后可直接進(jìn)行下一個短肽的連接。
【專利說明】化合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于多肽合成【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及化合物及其制備方法，以及制備多肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酸敏性離子通道(Acid sensing ion channels, ASICs)主要分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，是一類在痛覺產(chǎn)生過程中起重要作用的PH敏感型離子通道。因此，尋找這種離子通道的抑制劑成為研發(fā)新型止痛藥的重要方向。黑曼巴毒肽(Mambalgins)，被發(fā)現(xiàn)可以通過抑制ASICs而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用(Diochot.Nature, 2012)。在Diochot的研究表明，Mambalgins具有與嗎啡相似的鎮(zhèn)痛作用。但由于該毒肽具有與嗎啡完全不同的鎮(zhèn)痛機(jī)制(嗎啡是通過結(jié)合于阿片受體而起作用)，所以其可耐受嗎啡拮抗劑納洛酮的作用，且不會產(chǎn)生阿片樣呼吸抑制作用，也不會像嗎啡那樣快速產(chǎn)生耐藥性和依賴性，因此，Mambalgins具有較好的開發(fā)成為新型止痛藥的醫(yī)用前景。
[0003]黑曼巴蛇毒肽為含有四對二硫鍵的57肽，基于第四個氨基酸的不同可以分為兩種，即第四個氨基酸為Tyr的mambalgins-Ι和第四個氨基酸為Phe的mambalgins-2。具體
結(jié)構(gòu)如下所示:
[0004]
【權(quán)利要求】
1.一種化合物，其特征在于，具有如式I所示的結(jié)構(gòu):
2.一種制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括: (O使疊氮化鈉與三氟甲磺酸酐接觸，以便獲得三氟甲磺酸疊氮； (2)使所述三氟甲磺酸疊氮與S-三苯甲基-L-半胱氨酸反應(yīng)，以便得到權(quán)利要求1所述的化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)進(jìn)一步包括: (1-1)將疊氮化鈉水溶液與二氯甲苯混合； (1-2)將步驟(1-1)所得到的混合物進(jìn)行冰浴冷卻； (1-3)在冰浴條件下，向步驟(1-2)中所得到的經(jīng)過冷卻的混合物中添加三氟甲磺酸酐；以及 (1-4)在室溫下，使步驟(1-3)中所得到的混合物反應(yīng)，以便獲得所述三氟甲磺酸疊氮。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)進(jìn)一步包括: (2-1)將所述三氟甲磺酸疊氮與含有S-三苯甲基-L-半胱氨酸、碳酸鉀、五水硫酸銅和甲醇的溶液混合，以及 (2-2)在室溫下，將步驟(2-1)所得到的混合物攪拌過夜，以便獲得權(quán)利要求1所述的化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，包括: 將154mmol疊氮化鈉溶于25ml去離子水，向所獲得的疊氮化鈉水溶液中加入40ml 二氯甲烷，以便獲得第一混合物； 將所述第一混合物進(jìn)行冰浴冷卻lOmin，以便獲得經(jīng)過冰浴冷卻的第一混合物； 在冰浴條件下，向所述經(jīng)過冰浴冷卻的第一混合物中添加30mmol三氟甲磺酸酐，以便獲得第二混合物； 在室溫下，使所述第二混合物反應(yīng)3h，以便獲得所述三氟甲磺酸疊氮； 將15mmol S-三苯甲基-L-半胱氨酸、22.5mmol碳酸鉀、0.15mmol五水硫酸銅溶于50ml去離子水和100ml甲醇的混合溶液中，向所獲得的混合物中加入所述三氟甲磺酸疊氮，以便獲得第三混合物；以及 在室溫下，將所述第三混合物攪拌過夜，將所得到的產(chǎn)物旋干有機(jī)相，將所獲得的水相稀釋至100ml，利用濃鹽酸將經(jīng)過稀釋的水相的pH調(diào)節(jié)至2后，利用乙二酸二乙酯進(jìn)行萃取，將所獲得的有機(jī)相通過硅膠柱進(jìn)行純化處理，以便獲得權(quán)利要求1所述的化合物。
6.一種制備多肽的方法，其特征在于，包括: Ca)提供第一短肽和第二短肽，所述第一短肽的C端形成有酰肼基團(tuán)，所述第二短肽的N端為疊氮半胱氨酸，所述疊氮半胱氨酸是利用權(quán)利要求1所述的化合物形成的； (b)將所述第二短肽進(jìn)行還原處理，以便將所述疊氮半胱氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸；以及 (c)將所述第一短肽和步驟(b)中所得到的經(jīng)過還原處理的第二短肽進(jìn)行連接，以便獲得所述多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，利用三(2-羧乙基)膦對所述第二短肽進(jìn)行所述還原處理， 任選地，所述還原處理是在6.8-7.2的pH下進(jìn)行I小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(c)進(jìn)一步包括: (c-1)將所述第一短肽和亞硝酸鈉接觸，以便對所述第一短肽的酰肼基團(tuán)進(jìn)行氧化處理； (c-2)將步驟(c-1)中所得到的氧化處理產(chǎn)物與4-巰基苯乙酸溶液混合，并將所得到混合物的PH調(diào)節(jié)至5;以及 (c-3)向步驟(c-2)所得到的混合物中添加步驟(b)中所得到的經(jīng)過還原處理的第二短肽，并在6.2-6.5的pH下進(jìn)行連接反應(yīng)， 任選地，進(jìn)一步包括: Cd)將步驟(C)中所得到的多肽與還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽進(jìn)行混合，并將所得到的混合物攪拌過夜，以便對所得到的多肽進(jìn)行氧化折疊處理， 其中， 氧化型谷胱甘肽的終濃度為100 μ M，還原型谷胱甘肽的終濃度為ImM，所述多肽的終濃度為10 μ M.
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二短肽是通過以下步驟獲得的: (a-Ι)通過固相多肽合成方法制備第三短肽和第四短肽，所述第三短肽的N端形成有半胱氨酸基團(tuán)，所述第四短肽的C端形成有酰肼基團(tuán)； (a-2)將所述第四短肽與權(quán)利要求1所述的化合物接觸，以便在所述第四短肽的N端形成疊氮半胱氨酸基團(tuán)；以及 (a-3)將N端形成疊氮半胱氨酸基團(tuán)的第四短肽與所述第三短肽進(jìn)行連接，以便獲得所述第二短肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于， 所述第一短肽具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列， 所述第三短肽具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列， 所述第四短肽具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
【文檔編號】C07K1/08GK103787938SQ201410043816
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月29日
【發(fā)明者】劉磊, 潘漫, 黃軼超, 李宜明, 李奕潼 申請人:清華大學(xué)