一種治療頭頸部腫瘤單克隆抗體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及的是一種制備治療頭頸部腫瘤單克隆抗體的方法，其特征在于，通過(guò)同位素標(biāo)記，多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析口腔癌前病變細(xì)胞樣本與口腔粘膜細(xì)胞樣本找出在癌變細(xì)胞中特異表達(dá)的頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白，并對(duì)這些蛋白進(jìn)行分離純化；用分離純化出來(lái)的頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白對(duì)6-8周齡的雌性BALB／c小鼠進(jìn)行免疫，如果抗體滴度在1：10000以上時(shí)，可將免疫小鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞融合并篩選，得到分泌頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；向6-8周齡的BALB／c小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，注射細(xì)胞后10天左右收集腹水，protein?G／A柱子純化腹水，獲得治療頭頸部腫瘤的單克隆抗體。
【專利說(shuō)明】一種治療頭頸部腫瘤單克隆抗體的制備方法
(—)【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種治療頭頸部腫瘤單克隆抗體的制備方法。
(二)【背景技術(shù)】:
[0002]頭頸部腫瘤(HNSCC)包括頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤以及口腔頜面部腫瘤。涉及鼻腔、鼻竇、唇和口腔、口咽、喉咽、喉部、甲狀腺、大唾液腺、鼻咽部。一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查表明，癌癥已成為造成我國(guó)成年人死亡的主要原因之一,而頭頸部惡性腫瘤發(fā)病率約占全身惡性腫瘤5-7%，由于在早期檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)缺乏生物標(biāo)記，這使得50%以上HNSCC病人在確診的時(shí)候就已經(jīng)是癌癥晚期了。目前還沒(méi)有用來(lái)診斷或預(yù)測(cè)HNSCC的標(biāo)記物，因此迫切需要找到蛋白標(biāo)記物或治療靶點(diǎn)，從而提高病人的存活率和生存質(zhì)量。對(duì)付HNSCC，關(guān)鍵在于及時(shí)發(fā)現(xiàn)、盡早干預(yù)。目前對(duì)于HNSCC的治療方式主要采用手術(shù)和放療結(jié)合的方式，但是這些方式均可能造成相應(yīng)的功能、外觀損害，如進(jìn)食困難、聲音撕?jiǎn)?、喪失語(yǔ)言功能、面癱、頭面部疤痕、色素沉著、甚至頭目部畸形等等。而單克隆抗體類藥物具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高效、低毒等特點(diǎn)，目前還沒(méi)有上市的用于治療HNSCC的抗體藥物。
[0003]Ranju Ralhan, Leroi V.DeSouza等人通過(guò)同位素標(biāo)記、多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)HNSCC組織與正常組織中蛋白表達(dá)差異的研究，發(fā)現(xiàn)三種最好的生物標(biāo)記:YWHAZ，stratif in，和S100-A7，用它們來(lái)區(qū)分頭頸部癌變組織和非癌變組織時(shí)的靈敏度是0.92，特異性是0.91。用免疫組織化學(xué)、免疫雜交、RT-PCR對(duì)臨床上的樣本差異表達(dá)分析也證明YWHAZ, stratif in,和 S100-A7 在 HNSCCs 中過(guò)量表達(dá)；Ranju Ralhan, Leroi V.等人通過(guò)同位素標(biāo)記、多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法及蛋白組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)了 HNSCC的兩種好的生物標(biāo)記，stratifin (14-3-3 o )和 YffHAZ (14-3-3 I )，通過(guò)對(duì) 51 個(gè) HNSCC 病人和 36 個(gè)正常人的樣本進(jìn)行免疫組化學(xué)研究證明這兩種蛋白在HNSCC病人中表達(dá)量顯著升高；口腔粘膜白斑病是一種異質(zhì)性病變，很有可能發(fā)展成癌癥；但是目前還沒(méi)有生物標(biāo)記可以預(yù)測(cè)到這種惡性轉(zhuǎn)變。用同位素標(biāo)記、多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)口腔粘膜白斑組織進(jìn)行分析表明異質(zhì)核糖體蛋白KQinRNP K)過(guò)量表達(dá)。用`免疫組化的方法進(jìn)行對(duì)100個(gè)HNOSCCs組織、199個(gè)口腔粘膜白斑組織和55個(gè)正常組織進(jìn)行分析，表明口腔粘膜白斑組織比正常組織中hnRNPK含量顯著增加(p〈0.001)，口腔粘膜白斑組織比HNOSCCs組織細(xì)胞質(zhì)中hnRNP K含量顯著增加(p〈0.001)，我們后序研究中最重要的一個(gè)發(fā)現(xiàn)是組織細(xì)胞質(zhì)中hnRNP K是一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)HNOSCCs復(fù)發(fā)的因素。國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究主要集中在HNSCC的放化療及流行病學(xué)方面。通過(guò)同位素標(biāo)記、多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、組織芯片法分析病人的樣本，找出HNSCC的幾種標(biāo)記蛋白，制出相應(yīng)抗體，這樣就可以實(shí)現(xiàn)用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè)病人體液中的這些標(biāo)記蛋白，從而在臨床上實(shí)驗(yàn)微創(chuàng)檢測(cè)，并可以達(dá)到早期診斷的目的；進(jìn)而進(jìn)行臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從而達(dá)到對(duì)HNSCC的有效治療的目的。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種制備可以有效治療頭頸部腫瘤的單克隆抗體的方法，它針對(duì)上述情況，發(fā)明一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉、高效的制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種制備可以有效治療頭頸部腫瘤的單克隆抗體的方法，其特征在于它包括以下步驟:
[0006](I)收集大量口腔癌前病變細(xì)胞樣本與口腔粘膜細(xì)胞樣本，并通過(guò)同位素標(biāo)記，多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析在癌變細(xì)胞中特異表達(dá)的頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白，對(duì)這些蛋白進(jìn)行測(cè)序；
[0007](2)完成HNSCC標(biāo)記蛋白單克隆抗體的表達(dá)和純化；
[0008]1、用分離純化出來(lái)的頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白進(jìn)行動(dòng)物免疫。選擇6-8周齡的雌性BALB / c小鼠。按照每只鼠IOOug的量，與等體積的完全弗氏佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點(diǎn)注射。2-3周后加強(qiáng)免疫，抗原劑量同上，與弗氏不完全佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點(diǎn)或腹腔內(nèi)注射。免疫7-10天后小鼠尾靜脈采血，收集血清。間接法ELISA測(cè)定血清中針對(duì)的抗體滴度。如果抗體滴度在1:lw以上，可以在融合前三天加強(qiáng)免疫，100 ii L的PBS溶解50ug頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白腹腔內(nèi)注射或靜脈注射。否則，繼續(xù)進(jìn)行每?jī)芍芤淮蚊庖撸钡竭_(dá)到較高的抗體滴度。
[0009]2、細(xì)胞融合和篩選。為了產(chǎn)生分泌頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液混合，然后在聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的條件下融合:脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在10:1的比例混合。將細(xì)胞的混合物用無(wú)血清MDM培養(yǎng)基洗滌至少3次。于37°C水浴中，向細(xì)胞團(tuán)中逐滴加入50% PEG,并輕輕搖動(dòng)細(xì)胞沉淀，再經(jīng)無(wú)血清的MDM培養(yǎng)基洗滌I次。用含有HAT的完全培養(yǎng)基重懸融合后的細(xì)胞團(tuán)，輕輕吹打至細(xì)胞團(tuán)散開(kāi),并按200ul / well接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。之后，每隔2-3天半量更換培養(yǎng)基，直到雜交瘤細(xì)胞克隆足夠大可以篩選。間接法ELISA篩選分泌針對(duì)頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白的抗體陽(yáng)性細(xì)胞孔。首次確定為陽(yáng)性細(xì)胞孔，經(jīng)過(guò)有限稀釋法，至少亞克隆3次，保證陽(yáng)性率在100%，獲得可以穩(wěn)定分泌頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株?！?br> [0010]3、腹水制備:選擇6-8周齡的BALB / c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油，7-10天后注射雜交瘤細(xì)胞。注射細(xì)胞后10天左右收集腹水，protein G / A柱子純化腹水，獲得純度較高的頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白單克隆抗體。
(四)【具體實(shí)施方式】:
[0011]以下將通過(guò)【具體實(shí)施方式】的形式再對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅局限于以下的【具體實(shí)施方式】，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0012]實(shí)施例1:頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白的獲得
[0013]通過(guò)同位素標(biāo)記、多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析200多個(gè)口腔癌前病變細(xì)胞樣本與200多個(gè)正?？谇徽衬ぜ?xì)胞樣本，找出5-8個(gè)在癌變細(xì)胞中特異表達(dá)的頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白，分離純化出這幾個(gè)標(biāo)記蛋白；
[0014]實(shí)施例2:頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白單克隆抗體的表達(dá)
[0015]1、用分離純化出來(lái)的頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白進(jìn)行動(dòng)物免疫。
[0016]選擇6-8周齡的雌性BALB / (:小鼠。按照每只鼠IOOug的量，與等體積的完全弗氏佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點(diǎn)注射。2-3周后加強(qiáng)免疫，抗原劑量同上，與弗氏不完全佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點(diǎn)或腹腔內(nèi)注射。免疫7-10天后小鼠尾靜脈采血，收集血清。間接法ELISA測(cè)定血清中針對(duì)的抗體滴度。如果抗體滴度在1:lw以上，可以在融合前三天加強(qiáng)免疫，100 y L的PBS溶解50ug頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白腹腔內(nèi)注射或靜脈注射。否則，繼續(xù)進(jìn)行每?jī)芍芤淮蚊庖?，直到達(dá)到較高的抗體滴度。
[0017]2、細(xì)胞融合和篩選。
[0018]為了產(chǎn)生分泌頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液混合，然后在聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的條件下融合:脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在10:1的比例混合。將細(xì)胞的混合物用無(wú)血清MDM培養(yǎng)基洗滌至少3次。于37°C水浴中，向細(xì)胞團(tuán)中逐滴加入50% PEG，并輕輕搖動(dòng)細(xì)胞沉淀，再經(jīng)無(wú)血清的IMDM培養(yǎng)基洗滌I次。用含有HAT的完全培養(yǎng)基重懸融合后的細(xì)胞團(tuán)，輕輕吹打至細(xì)胞團(tuán)散開(kāi)，并按200ul / well接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。之后，每隔2_3天半量更換培養(yǎng)基，直到雜交瘤細(xì)胞克隆足夠大可以篩選。間接法ELISA篩選分泌針對(duì)頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白的抗體陽(yáng)性細(xì)胞孔。首次確定為陽(yáng)性細(xì)胞孔，經(jīng)過(guò)有限稀釋法，至少亞克隆3次，保證陽(yáng)性率在100%，獲得可以穩(wěn)定分泌頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0019]實(shí)施例3:頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白單克隆抗體的純化
[0020]選擇6-8周齡的BALB / c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油，7_10天后注射雜交瘤細(xì)胞。注射細(xì)胞后 10天左右收集腹水，protein G / A柱子純化腹水，獲得純度較聞的頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白單克隆抗體。
【權(quán)利要求】
1.一種制備治療頭頸部腫瘤單克隆抗體的方法，其特征在于它包括以下步驟:(1)頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白的分離純化；(2)頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白單克隆抗體的表達(dá)；(3)頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白單克隆抗體的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備治療頭頸部腫瘤單克隆抗體的方法，其特征在于通過(guò)同位素標(biāo)記、多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法找出在癌變細(xì)胞中特異表達(dá)的頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備治療頭頸部腫瘤單克隆抗體的方法，其特征在于，用頭頸部腫瘤標(biāo)記蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，如果抗體滴度在1:8000-1:12000以上時(shí)，可將免疫小鼠脾細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞融合并篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備治療頭頸部腫瘤單克隆抗體的方法，其特征在于向小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，注射細(xì)胞后8-12天收集腹水，protein G / A柱子純化腹水，獲得治療頭頸部腫瘤的單克隆抗體。`
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK103626870SQ201310653214
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】李鳳娟, 趙寶娟, 王翔 申請(qǐng)人:天津工業(yè)大學(xué)