培和肽及其在制備藥物和飼料添加劑中的應(yīng)用、制備方法
【專利摘要】本發(fā)明“培和肽及其在制備藥物和飼料添加劑中的應(yīng)用、制備方法”，涉及生物制藥技術(shù)。本發(fā)明的培和肽具有Seq ID No.1所示的氨基酸序列，經(jīng)細胞試驗驗證，其具有對乙肝病毒的明顯抑制作用，經(jīng)動物試驗驗證，其還有全面改善動物健康狀態(tài)的作用；本發(fā)明還提供了基因工程方法制備該多肽的方案，能制備得到克級以上的培和肽產(chǎn)物。本發(fā)明的培和肽在抗病毒、全面改善動物健康狀態(tài)等方面的作用，使其能夠作為制備人和動物都可以使用的治療藥物和保健產(chǎn)品的主要成分，應(yīng)用于治療藥物、健康產(chǎn)品和飼料添加劑中。
【專利說明】培和肽及其在制備藥物和飼料添加劑中的應(yīng)用、制備方法
[0001] 第一部分：【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，特別是涉及一種培和肽及其在制備治療藥物、健康產(chǎn) 品和飼料添加劑中的應(yīng)用、制備方法。
[0003] 第二部分：【背景技術(shù)】
[0004] 防御素是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，天然免疫物 質(zhì)，分子量在3000?7000左右，由20?60個氨基酸殘基組成，多個二硫鍵。這類活性多 肽多數(shù)具有強堿性、熱穩(wěn)定性、以及廣譜抗菌等特點。天然的防御素分布在從植物、低等動 物到哺乳動物等幾乎所有的生物類群中，是生物自身防御體系的重要組成部分。
[0005] 多數(shù)防御素能有效殺滅革蘭陰性細菌和革蘭陽性細菌。在體外濃度為10? IOOmg / L的防御素即對多種細菌具有殺傷作用，而防御素在中性粒細胞中的濃度為g / L 級，遠遠超過上述數(shù)值，這表明在體內(nèi)防御素可能具有更強的殺菌活性，目前研究發(fā)現(xiàn)防御 素對革蘭陽性細菌的殺傷能力明顯要強于革蘭陰性細菌。在體外，HBD-2對大腸桿菌的半數(shù) 致死量（LD50)為0. 46nmol / ml，最小抑菌濃度（MIC)為15yg / ml，而對綠膿桿菌、金黃 色葡萄球菌的MIC為62yg / ml。體外實驗證明大多數(shù)防御素的MIC范圍為0. 5-ΙΟμπιοΙ / L〇
[0006] 防御素還能殺滅一些被膜病毒，如HIV、皰疹病毒、水泡型口炎病毒，但對無衣殼病 毒卻無效。Θ-防御素還具有抗濾過性病原體和抗毒素作用。防御素主要通過與病毒外殼 蛋白結(jié)合從而導(dǎo)致病毒喪失生物活性，這一特殊作用機理也使得微生物不易對其產(chǎn)生抵抗 性。防御素可直接抑制病毒，對病毒的抑制程度依賴于防御素濃度以及分子內(nèi)二硫鍵的緊 密程度，其抗病毒功效同樣受時間、PH值、離子強度和溫度等因素的影響，在中性及低離子 強度條件下，防御素具有較強的抗病毒活性。
[0007] 防御素不僅可以直接抵抗病原微生物，而且還具有免疫調(diào)節(jié)作用。防御素通過細 胞信號傳遞的作用，增強非特異性免疫細胞，尤其是巨噬細胞的活性和趨化性。防御素還可 以促進機體T細胞的趨化和增殖，增強機體免疫應(yīng)答能力，調(diào)節(jié)特異性免疫，增強生物機體 主動防御功能。防御素能夠作為一種效應(yīng)分子激活巨噬細胞、DC、氣管上皮細胞等細胞表 面受體從而啟動獲得性免疫系統(tǒng)，并將先天性免疫和獲得性免疫有機連接?，F(xiàn)已證明一些 α -防御素 、β -防御素對T細胞、單核細胞以及未成熟的DC具有趨化活性，可誘導(dǎo)單核細 胞和上皮細胞產(chǎn)生細胞因子。人、鼠、豬、兔的中性粒細胞防御素可以誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒 并釋放組胺。β-防御素還能通過與人趨化因子受體6 (CCR6)結(jié)合，從而吸引不成熟的樹突 狀細胞（DC)和記憶T細胞（Tm)至炎癥部位，激活細胞免疫和體液免疫。此外，防御素還可 以直接促進感染部位中性粒細胞的補充和積聚。
[0008] 抗生素添加劑的使用嚴重破壞了動物腸道的微生態(tài)平衡，藥物殘留也影響了畜產(chǎn) 品的品質(zhì)和人類健康，而來源于貝類、哺乳動物的防御素相對分子質(zhì)量較小，熱穩(wěn)定性和水 溶性均較好，可以在腸道內(nèi)吸收。由于防御素屬于多肽成分，在體內(nèi)容易被蛋白酶降解為 氨基酸，動物采食后在體內(nèi)一般無殘留。利用基因工程方法生產(chǎn)環(huán)保型防御素飼料添加劑 或通過日糧添加，都可有效提高免疫、防止疾病和促進生長，如減少死胎、木乃伊及殘疾；提 高初生重及仔豬出生均勻度；提高仔豬斷奶重、斷奶成活率，降低哺乳期仔豬發(fā)病率；降低 哺乳母豬發(fā)病率，減少母、仔豬各種應(yīng)激；改善母豬亞健康和繁殖障礙，延長母豬使用年限； 提高保育豬成活率，降低發(fā)病率；提高保育豬日增重、降低料肉比；改善免疫抑制，提高免 疫應(yīng)答能力，抗體水平更整齊。
[0009] 源自地中海貽貝的防御素 Mytilin B氨基酸序列如Seq ID No. 3所示，其由34個 氨基酸殘基組成，4個二硫鍵，復(fù)合螺旋和β結(jié)構(gòu)。Mytilin B防御素具有廣譜活性，能抑 制革蘭氏陽性和陰性菌，同時具有抗病毒的活性。Mytilin B防御素利用N端所帶的正電荷 與原核細胞的細胞的細胞膜磷脂雙分子層密集的負電荷靜電相吸，C端柔性的插入疏水區(qū)， 在兩親性α -螺旋作用下，在原核細胞膜上形成4nm的離子通道，離子通道的形成改變了細 胞膜內(nèi)外的滲透壓，細胞膜內(nèi)物質(zhì)大量外滲，致細菌細胞死亡，起到殺菌作用。Mytilin B防 御素的抗病毒機理是與病毒的衣殼特異性結(jié)合，從而抑制病毒的復(fù)制。
[0010] 法國科學(xué)家在貽貝的防御素 Mytilin研究方面做了大量的工作，天然的貽貝防 御素有 MytiIin A (Seq ID No. 8)，Mytilin B (Seq ID No. 3)，Mytilin C (Seq ID No. 9)， Mytilin D(Seq ID No. 10)和 Mytilin G(Seq ID No. 11)等。由于防御素 Mytilin 分子小， 分離提純存在一定的困難，且天然資源有限，很難產(chǎn)業(yè)化；因為防御素的二硫鍵和多肽空間 結(jié)構(gòu)決定了其基本的特性，化學(xué)合成不可能得到具有良好活性的產(chǎn)品，多方研究表明，化學(xué) 合成的活性產(chǎn)品只有天然產(chǎn)物的百分之一或更低；只有基因工程途徑才能獲得具有良好活 性的防御素，由于高濃度Mytilin防御素多肽可殺滅絕大多數(shù)宿主細胞，同時在分泌表達 過程中，防御素容易被宿主菌的酶系統(tǒng)所降解，從而產(chǎn)生兩敗俱傷的情形而無法真正獲得 足量的表達產(chǎn)物。所以，目前還沒有Mytilin防御素多肽的工程菌表達產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，也 未見到準確表達和獲得足量的該多肽以供試驗用的報道，更未見到其在乙肝治療、免疫藥 物、飼料添加劑等方面的應(yīng)用報道。
[0011] 第三部分：
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域的空白和需求，提供一種源自地中海貽貝防御素的變構(gòu)肽 (培和肽）及其在制備治療藥物、健康產(chǎn)品和飼料添加劑中的應(yīng)用、制備方法
[0013] 培和肽其特征在于具有Seq ID No. 1所示的氨基酸序列。
[0014] 編碼上述培和肽的基因。
[0015] 所述基因的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0016] 含有上述基因的表達載體。
[0017] 所述表達載體的骨架載體為PKLACl。
[0018] 上述培和肽的制備方法，其特征在于將上述表達載體轉(zhuǎn)入到酵母細胞中，發(fā)酵培 養(yǎng)。
[0019] 所述酵母細胞為K. Iactis YCT799。
[0020] 上述培和肽在制備治療藥物、健康產(chǎn)品和飼料添加劑中的應(yīng)用、制備方法。
[0021] 所述藥物和產(chǎn)品為口服制劑。
[0022] 本發(fā)明根據(jù)源自地中海貽貝的防御素 Mytilin B，同源度97%，為改善其的制造 性，對其氨基酸序列進行變構(gòu)，在其N端增加一個G，得到如Seq ID No. 1所示的多肽，命名 為培和肽，由35個氨基酸組成，分子量為4038. 8Da，等電點9. 58,疏水比率40%，凈電荷 +10。通過變構(gòu)，使得分泌表達出的多肽變得穩(wěn)定，不會在發(fā)酵、純化和保存過程中被蛋白酶 迅速降解，從而實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化制造。通過變構(gòu)，增加了該多肽在動物體內(nèi)的半衰期，可取得 更有效的作用效果。本發(fā)明通過氨基酸序列變構(gòu)，在易制造性和穩(wěn)定性上改變了 Mytilin B ;試驗證明，本發(fā)明采用基因工程方法制備的培和肽的產(chǎn)率為0. 2%以上（指純化得到的 表達產(chǎn)物與折干的培養(yǎng)基質(zhì)量相比的比例）。同樣的氨基酸序列變構(gòu)，即在N端增加一個 G，以得到良好的制造性，也可以用于Mytilin A，Mytilin C，Mytilin D和Mytilin G的變 構(gòu)和制備，變構(gòu)后的氨基酸序列分別為Seq ID No. 4, Seq ID No. 5, Seq ID No. 6和Seq ID No. 7。這些序列可用于藥物的制備、健康產(chǎn)品和飼料添加劑。
[0023] 本發(fā)明根據(jù)上述Seq ID No. 1所示的氨基酸序列，設(shè)計了編碼該氨基酸序列的基 因序列，利用密碼子的兼并性，調(diào)整了核苷酸序列使其符合酵母表達系統(tǒng)對密碼子的偏好 性而得到Seq ID No. 2所示的核苷酸序列，有利于穩(wěn)定高效表達防御素。
[0024] 本發(fā)明還提供了含有上述基因的表達載體，所采用的骨架載體為pKLACl或 PKLAC2, pKLAC2的結(jié)構(gòu)見說明書附圖1，通過pKLACl或pKLAC2,其中的重組蛋白可在細胞 內(nèi)表達，也可分泌表達。有利于獲得高產(chǎn)量和純度的防御素。
[0025] 本發(fā)明還提供了培和肽的制備方法，本發(fā)明將構(gòu)建得到的表達載體轉(zhuǎn)入到酵母表 達系統(tǒng)中，使其表達培和肽，通過后續(xù)的分離純化干燥步驟的得到培和肽純品。本發(fā)明優(yōu) 選采用的酵母感受態(tài)細胞K. Iactis YCT799,非營養(yǎng)缺陷體，也沒有遺傳標(biāo)記，適用于線性 化pKLAC或pKLMF為基礎(chǔ)的表達載體的轉(zhuǎn)化。使用該表達系統(tǒng)，可進一步確保分泌表達的 培和肽不會被降解和具備活性，該表達系統(tǒng)也可以工業(yè)化表達Mytilin A(Seq ID No. 8)， Mytilin B(Seq ID No. 3),Mytilin C(Seq ID No. 9),Mytilin D(Seq ID No. 10)和Mytilin G(Seq ID No. 11)，使其可用于藥物制造、健康產(chǎn)品和飼料添加劑。
[0026] 本發(fā)明提供的培和肽可以作為治療藥物、保健產(chǎn)品和飼料添加劑的主要成分，制 備成各種劑型的藥物和產(chǎn)品。如乙肝藥物、抗病毒藥物、免疫增強產(chǎn)品、睡眠改善產(chǎn)品、飼料 添加劑、功能食品、獸藥、生長促進劑等。體外藥物試驗表明，培和肽對乙型肝炎病毒活性有 明顯的抑制作用，見實施例2。動物試驗表明，其還有全面改善動物健康狀態(tài)的作用，見實施 例3。本發(fā)明優(yōu)先制備成口服制劑。
[0027] 第四部分：【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1.骨架載體pKLACl結(jié)構(gòu)圖
[0029] New England Biolabs，Inc 提供
[0030] 圖2.本發(fā)明制備的培和肽的質(zhì)粒測序報告
[0031] 將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒PMD19-T的克隆，測序結(jié)果顯示克隆完全正確。
[0032] 第五部分：【具體實施方式】
[0033] 實施例1.培和肽的制備
[0034] 步驟1.外源DNA合成
[0035] 利用DNA化學(xué)合成儀制備外源基因，得到編碼培和肽的外源DNA片段，如Sequence ID No. 2 所示。
[0036] 驗證：將酶切鑒定正確的克隆送至北京諾賽基因組研究中心進行序列測定，測序 報告見（圖2)。
[0037] 步驟2.表達載體的構(gòu)建
[0038] 表達載體為K. Iactis蛋白質(zhì)表達試劑盒所提供的pKLACl (購于New England Biolabs，Inc)在 pKLACl(9097bp)上，Lac4 啟動子（PUC4_PBI)的 5'和 3'端被編碼 β -內(nèi) 酰胺酶的基因（ApR)和pMBl的復(fù)制原點所隔丌。K. Iactisa-結(jié)合因子分泌引導(dǎo)序列 (a -MF)、多克隆位點（MCS)和Lac4轉(zhuǎn)錄終止子（TT)位于3' PUC4_PBI的下游；酵母的Padh2 調(diào)控乙酰胺酶標(biāo)記基因（amdS)的表達。
[0039] 用Sac II或Bst XI酶切載體pKLACl使其線性化，將外源DNA片段Sequence ID No. 2插入到酵母K. Iactis基因組自身的Lac4啟動子位點，獲得重組載體。該重組載體中， 目的基因被克隆到pKLACl上的K. Iactis α結(jié)合因子（a Mating Factor，a -MF)的下游， 見圖1，在酵母K. Iactis的細胞核中，編碼a-MF結(jié)構(gòu)域和外源重組蛋白的DNA與酵母基因 組整合，編碼的a -MF最終將在高爾基體上被剪切以使目的蛋白質(zhì)分泌表達。
[0040] Phpm啟動子調(diào)控表達：一旦融合蛋白質(zhì)TT始表達，位于a -MF上的信號肽就會 指導(dǎo)融合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)膜上，在此信號肽酶（SP)將信號肽切除。分泌小泡（環(huán) 形）將融合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至高爾基體，Kex蛋白酶在此將α-MF結(jié)構(gòu)域切除，釋放成熟的目的 蛋白質(zhì)。隨后，目的蛋白質(zhì)通過分泌小泡運輸?shù)劫|(zhì)膜（PM)，從質(zhì)膜分泌到胞外.
[0041] 步驟2.轉(zhuǎn)化
[0042] 使用 K. Iactis YCT799 (購于 New England Biolabs，Inc)感受態(tài)細胞。
[0043] 將步驟1構(gòu)建得到的重組載體置于感受態(tài)細胞溶液中，使重組質(zhì)粒吸附于感受態(tài) 細胞的表面，冰浴一段時間，細胞膜處于收縮狀態(tài)。然后迅速將感受態(tài)細胞置于42°C，使細 胞在熱環(huán)境中膜通道開放，重組質(zhì)粒由膜外高濃度區(qū)向膜內(nèi)擴散，經(jīng)過45秒時間后，再將 感受態(tài)細胞放回冰浴中，膜通道關(guān)閉，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌。
[0044] 酵母轉(zhuǎn)化子用乙酰胺進行篩選，將細胞轉(zhuǎn)化混合物（含有大量被pKLACl轉(zhuǎn)化或 未轉(zhuǎn)化的細胞）涂于含有5mM乙酰胺的酵母基本碳源（YCB)培養(yǎng)基上。YCB培養(yǎng)基含有 K. Iactis細胞生長所需的所有營養(yǎng)物質(zhì)和碳源，但缺少氮源。只有當(dāng)乙酰胺被乙酰胺酶 (由pKLACl上的amdS基因表達）降解為氨時，才能作為氮源而被利用。因此，只有轉(zhuǎn)化的 細胞才能長成菌落。
[0045] 驗證：
[0046] 挑取菌落，用搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含38mM硫酸銨的YPGal培養(yǎng)基（1 %酵母提取物， 2%蛋白胨，2%半乳糖），28°C?30°C，培養(yǎng)時間70小時。離心3000rpm，取上清液，瓊脂糖 凝膠電泳分析。
[0047] 步驟3.轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)
[0048] 含38mM硫酸銨的YPGal培養(yǎng)基（2%酵母提取物，4%蛋白胨，6%半乳糖），標(biāo)準發(fā) 酵罐深層通氣培養(yǎng)，120°C濕熱蒸汽滅菌30分鐘，冷卻到28°C，接種，28°C?30°C，發(fā)酵過程 中再流補半乳糖6%，培養(yǎng)時間70小時。
[0049] 步驟4培和肽的分離純化
[0050] 發(fā)酵液采用陶瓷膜分離掉菌體；然后用納濾濃縮到蛋白質(zhì)含量在5%左右；加熱 到80度，保持20分鐘，冷卻到20度，離心分離去雜，轉(zhuǎn)速lOOOOrpm，30min ;加10倍量PH5鹽 酸溶液稀釋，使蛋白質(zhì)含量〇. 5 %左右，過DEAE和G50凝膠柱；納濾濃縮蛋白質(zhì)含量在5% 左右，凍干，產(chǎn)物純度為95%，純化產(chǎn)物與折干的培養(yǎng)基質(zhì)量相比，培和肽的產(chǎn)率為0. 2% 左右
[0051] 產(chǎn)率=K發(fā)酵液表達產(chǎn)物總質(zhì)量IX納濾濃縮收率X去雜收率X凝膠分離收 率X濃縮收率X凍干收率）/折干的培養(yǎng)基總質(zhì)量} X 100%。
[0052] 步驟5.配制成備用液
[0053] 上步凍干的純化物，用0. IN鹽酸溶解，制成20mg / ml的培和肽，保存?zhèn)溆谩?br> [0054] 實施例2.培和肽抑制乙型肝炎病毒復(fù)制活性試驗
[0055] 步驟1.藥物處理
[0056] 取H印G2. 2. 15細胞一瓶，用0. 25 %胰酶消化后制備成單細胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細 胞濃度為5X IO4Cell / ml，Iml /孔加入24孔培養(yǎng)板中，置37°C，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)過夜。第二天吸棄上清，加入含有不同藥物濃度（50, 25,12. 5,6. 25, 3. 13和0 μ M)的DMEM 培養(yǎng)基，每組4復(fù)孔。每次作用4d后換同樣藥物濃度的細胞培養(yǎng)液，并于第4和8天，收集 各孔上清至I. 5ml離心管中，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0057] 步驟2.細胞培養(yǎng)上清中HBV表面抗原和E抗原的檢測
[0058] 采用ELISA法檢測HBsAg和HBeAg，具體操作按照試劑盒的使用說明進行。顯色反 應(yīng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測各孔OD值。
[0059] 步驟3.數(shù)據(jù)處理
[0060] 數(shù)據(jù)表不為means 土 SD。
[0061] IC(Inhibition rate,抑制率）= (1_0D 藥物處理組 / OD 陰性對照組）X 100%
[0062] 步驟4.實驗結(jié)果，對乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制作用
[0063] H印G2. 2. 15細胞在24孔板培養(yǎng)過夜后，加入不同稀釋濃度的藥物，同時設(shè)定細胞 對照組和陽性對照組。在培養(yǎng)4和8d后分別收集細胞上清，采用ELISA法檢測HBsAg和 HBeAg的表達。
[0064] 受試物培和肽和陽性藥3TC使培養(yǎng)液中的HBsAg分泌水平不同程度的下降，在 3. 13?50 μ g的濃度范圍內(nèi)具有明顯的劑量相關(guān)性的抑制作用。與同期空白對照組的OD值 比較，培和肽各濃度組在第4d和第8d細胞上清HBsAg含量明顯下降（p〈0. 05或0. 01)(結(jié) 果見表1)。培和肽對細胞上清HBsAg分泌的半數(shù)抑制濃度IC50大約為10. 9?20 μ g / ml 〇
[0065] 表1培和肽對H印G2. 2· 15細胞分泌HBsAg的抑制作用（X ± )
[0066]
【權(quán)利要求】
1. 培和肽，其特征在于具有Seq ID No. 1所示的氨基酸序列。
2. 以Seq ID No. 1為核心序列多肽的氨基酸序列，以及Seq ID No. 4、Seq ID No. 5、 Seq ID No. 6、Seq ID No. 7所示的人工氨基酸序列。
3. 編碼權(quán)利要求1所述的肽的基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
5. 含有權(quán)利要求3或4所述的基因的表達載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達載體，其骨架載體為pKLACl或pKLAC2。 7?如 Seq ID No. 1、Seq ID No. 3、Seq ID No. 4、Seq ID No. 5、Seq ID No. 6、Seq ID No. 7、Seq ID No. 8、Seq ID No. 9、Seq ID No. 10、Seq ID No. 11 所示的氨基酸序列多肽 采用本專利所述酵母菌K. lactis YCT799制備，及類似酵母菌K. lactis YCT284、YCT389、 YCT390、YCT569、YCT598,釀酒酵母、面包酵母、乳酸克魯維酵母和啤酒酵母制備。 8?如 Seq ID No. 1、Seq ID No. 3、Seq ID No. 4、Seq ID No. 5、Seq ID No. 6、Seq ID No. 7、Seq ID No. 8、Seq ID No. 9、Seq TD No. 10、Seq ID No. 11 所示的氨基酸序列多肽的 制備方法，其特征在于將骨架載體為pKLACl或pKLAC2的表達載體轉(zhuǎn)入到權(quán)利要求7所述 的酵母細胞中進行發(fā)酵培養(yǎng)。 9?如 Seq ID No. 1、Seq ID No. 3、Seq ID No. 4、Seq ID No. 5、Seq ID No. 6、Seq ID No. 7、Seq ID No. 8、Seq ID No. 9、Seq ID No. 10、Seq ID No. 11 所示的氨基酸序列多肽在 制備治療藥物、健康產(chǎn)品、飼料添加劑中乙肝藥物、抗病毒藥物、免疫增強產(chǎn)品、睡眠改善產(chǎn) 品、功能食品、飼料添加劑、獸藥、生長促進劑的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，所述藥物和產(chǎn)品指口服藥物、注射藥物、固體和液體 產(chǎn)品。
【文檔編號】C07K14/435GK104418946SQ201310389439
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】鄧立, 丁杰, 劉勇, 鄧韻蕾, 陸洋, 陳尚衛(wèi) 申請人:鄧立