重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法及其應(yīng)用。上述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，通過(guò)使用親和層析法將重組菌表達(dá)的可溶性植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白進(jìn)行提純，尤其是將包涵體裂解，結(jié)合利用透析法和親和層析法對(duì)包涵體中的不溶性植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白進(jìn)行提純，并通過(guò)對(duì)提純的條件和工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，從而大大提高重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化效果，提純度可達(dá)95%，而傳統(tǒng)方法的提純度為60%。該方法工藝簡(jiǎn)單、易于操作，并且產(chǎn)出量高、降低了生產(chǎn)成本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法 及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 植原體（phytoplasma)是一類(lèi)GC含量比較低，無(wú)細(xì)胞壁，僅有3層單位膜包被的 原核微生物，專(zhuān)性寄生于植物和昆蟲(chóng)。植物染病主要癥狀包括叢枝、黃化、花變?nèi)~、花器退化 等，由于植原體侵染性強(qiáng)，危害寄主廣泛，曾造成許多經(jīng)濟(jì)作物、林木的大量死亡，帶來(lái)嚴(yán)重 的經(jīng)濟(jì)損失。由于植原體為無(wú)細(xì)胞壁原核微生物，尚不能在人工培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，給分 類(lèi)鑒定、傳播機(jī)制、致病機(jī)制的研究帶來(lái)許多困難。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是最終遺傳信息功能的實(shí)施 者，而且植原體缺乏細(xì)胞壁，其膜蛋白可以直接與植物的細(xì)胞質(zhì)或介體昆蟲(chóng)的細(xì)胞接觸，在 寄主和病原的相互作用中起著重要作用。因此研究植原體膜蛋白對(duì)于建立植原體血清學(xué)檢 測(cè)方法，揭示植原體的進(jìn)化、致病性及其與寄主的相互作用具有重要意義。
[0003] 而免疫主導(dǎo)膜蛋白（immunodominant membrane proteins，IDPs)是大多數(shù)植原體 總細(xì)胞膜蛋白的主要部分。將各組植原體的免疫膜蛋白IDPs分成三種類(lèi)型：（1)免疫主導(dǎo) 膜蛋白（immunodominant membrane protein，Imp)，代表性植原體有 SPWB、AP、ESFY、]3〕和 PYLR ; (2)免疫主導(dǎo)膜蛋白 A (immunodominant membrane protein A，IdpA)，代表性植原 體是WX ;(3)免疫抗原膜蛋白（antigenic membrane protein, Amp),代表性植原體是AY和 CP。1999年Michael Berg等從蘋(píng)果叢枝植原體中分離出免疫主導(dǎo)膜蛋白（immunodominant membrane protein, Imp),并外源表達(dá)基因不同片段產(chǎn)物。研究中Berg等人分別在長(zhǎng)春花 和煙草染病植株中檢測(cè)到了分子量大約為19KDa大小相似的蛋白，序列分析表明該類(lèi)蛋白 具有整合膜蛋白的特征，其N(xiāo)端暴露在細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，一個(gè)疏水跨膜片段形成α螺旋錨定在 膜中，親水的C端暴露在細(xì)胞外。2004年，Kakizawa等人克隆了植原體Sec (細(xì)胞分泌）系 統(tǒng)蛋白A、E、Y，且研究發(fā)現(xiàn)SecA有較強(qiáng)的免疫原性，其抗血清能檢測(cè)多種植原體。但是由 于不同植原體膜蛋白特異性的差異，有些膜蛋白能夠在大腸桿菌體系內(nèi)完整表達(dá)，有些則 表達(dá)困難，且易形成包涵體，另一方面即使膜蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，但由于膜蛋 白的疏水性、溶解度等性質(zhì)為后續(xù)下游分離純化膜蛋白造成了困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種有效提高重組植原體免疫 主導(dǎo)膜蛋白純化度的方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0007] 獲得表達(dá)植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的重組菌，誘導(dǎo)表達(dá)；
[0008] 破碎經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌，分離得到上清液一和沉淀物一；
[0009] 將上述上清液一加入至樹(shù)脂懸液與結(jié)合緩沖液混合液中，所述樹(shù)脂懸液與所述結(jié) 合緩沖液的體積比為1?4 :1?5,在4?8°C的溫度下振蕩1?2小時(shí)后靜置沉降，然后 依次經(jīng)漂洗、洗脫處理，得到可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液；
[0010] 將上述沉淀物一懸重洗滌后并經(jīng)孵育處理，得到所述沉淀物一的溶解液；將所述 沉淀物一的溶解液加入至所述樹(shù)脂懸液與所述結(jié)合緩沖液混合液中，該樹(shù)脂懸液與結(jié)合緩 沖液的體積比為1?4 :1?5,在4?8°C的溫度下振蕩1?2小時(shí)后靜置沉降，然后依次 經(jīng)漂洗、洗脫處理，得到包涵體重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的溶液；
[0011] 將所述可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液與所述包涵體中重組植原體免疫 主導(dǎo)膜蛋白的溶液進(jìn)行透析濃縮，得到所述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白。
[0012] 以及，一種上述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法所獲得的重組植原體免疫 主導(dǎo)膜蛋白在醫(yī)學(xué)免疫、克隆抗體、致病機(jī)理研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0013] 上述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，通過(guò)使用親和層析法將表達(dá)植原體 免疫主導(dǎo)膜蛋白的重組菌表達(dá)的可溶性蛋白進(jìn)行提純，尤其是將包涵體裂解，結(jié)合利用透 析法和親和層析法對(duì)包涵體中的不溶性蛋白進(jìn)行提純，并通過(guò)對(duì)提純的條件和工藝參數(shù)進(jìn) 行優(yōu)化，從而大大提高重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化效果，提純度可達(dá)95%，而傳統(tǒng)方 法的提純度為60%。該方法工藝簡(jiǎn)單、易于操作，并且產(chǎn)出量高、降低了生產(chǎn)成本。
[0014] 正是由于上述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法所獲得的重組植原體免疫 主導(dǎo)膜蛋白具有很高的純度，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)免疫、克隆抗體、分類(lèi)鑒定、生理生化及其 致病機(jī)理的研究等領(lǐng)域。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白純化的方法工藝流程示意圖；
[0016] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET_28a ( + ) -Imp的示意圖；
[0017] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例分別將引物對(duì)一、引物對(duì)二、引物對(duì)三進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到 的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白（Imp)基因后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到三種引物對(duì)擴(kuò) 增的檢測(cè)結(jié)果，其中Μ列為Marker，即分子量標(biāo)準(zhǔn)，1列為引物對(duì)一的檢測(cè)結(jié)果，2列為引物 對(duì)二的檢測(cè)結(jié)果，3列為引物對(duì)三的檢測(cè)結(jié)果；
[0018] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌和含空質(zhì)粒的大腸桿菌得到的可溶 性蛋白和包涵體進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳得到的檢測(cè)結(jié)果，其中Μ列為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（marker)的 分子量，1列為包涵體的檢測(cè)結(jié)果，2列為可溶性蛋白的檢測(cè)結(jié)果，BSA列為參照的蛋白分子 量；
[0019] 圖5是將本發(fā)明實(shí)施例1?9中不同咪唑濃度條件下純化得到的可溶性重組植 原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳得到的檢測(cè)結(jié)果，其中Μ列為標(biāo)準(zhǔn)蛋白 (marker)的分子量，1?9列分別對(duì)應(yīng)實(shí)施例1?9的檢測(cè)結(jié)果；
[0020] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例獲得的不同量的可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白與 lml50%Ni-NTA-His ·Β?ικ!樹(shù)脂結(jié)合后再進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳得到的檢測(cè)結(jié)果，其中Μ列 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（marker)的分子量，1列為10mg的可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的結(jié)合檢 測(cè)結(jié)果，2列為8mg的可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的結(jié)合檢測(cè)結(jié)果，3列為5mg的可 溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的結(jié)合檢測(cè)結(jié)果；
[0021] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例純化得到的包涵體重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳得到的檢測(cè)結(jié)果，其中Μ列為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（marker)的分子量，1列為第一 次洗脫的檢測(cè)結(jié)果、2列為第二次洗脫的檢測(cè)結(jié)果、3列為第三次洗脫的檢測(cè)結(jié)果、4列為第 四次洗脫的檢測(cè)結(jié)果；可見(jiàn)，隨著洗脫次數(shù)的增加，洗脫得到蛋白的濃度越來(lái)越少，但純度 會(huì)增加。
[0022] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例獲得的包涵體重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液濃縮后進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳得到的檢測(cè)結(jié)果，其中Μ列為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（marker)的分子量，1列為包涵 體重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的分子量；
[0023] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例純化后獲得的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)的結(jié)果，其中Μ列為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（marker)的分子量，1列為重組植原體免疫主 導(dǎo)膜蛋白的檢測(cè)結(jié)果、2列為空白對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果；可見(jiàn)1列中所出現(xiàn)的條帶為重組植原體 免疫主導(dǎo)膜蛋白；
[0024] 圖10為將發(fā)明實(shí)施例獲得的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白用于制備免疫抗體，并 用間接ELISA法測(cè)定的效價(jià)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0026] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種有效提高重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白純化度的方法。該 重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白純化方法的工藝流程如圖1所示，包括如下步驟：
[0027] S01，獲得表達(dá)植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的重組菌，誘導(dǎo)表達(dá)；
[0028] S02,破碎步驟S01中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌，分離得到上清液一和沉淀物一；
[0029] S03,將步驟S02中得到的上清液一加入至樹(shù)脂懸液與結(jié)合緩沖液混合液中，所述 樹(shù)脂懸液與所述結(jié)合緩沖液的體積比為1?4 :1?5,在4?8°C的溫度下振蕩1?2小時(shí) 后靜置沉降，然后依次經(jīng)漂洗、洗脫處理，得到可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液；
[0030] S04,將所述沉淀物一洗滌，用溶解緩沖液懸重洗滌后的沉淀物一并經(jīng)孵育處理， 得到所述沉淀物一的溶解液；將所述沉淀物一的溶解液加入至樹(shù)脂懸液與結(jié)合緩沖液混合 液中，所述樹(shù)脂懸液與所述結(jié)合緩沖液的體積比為1?4 :1?5,在4?8°C的溫度下振蕩 1?2小時(shí)后靜置沉降，然后依次經(jīng)漂洗、洗脫處理，得到包涵體重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋 白的溶液；
[0031] S05,將所述可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液與所述包涵體中重組植原體 免疫主導(dǎo)膜蛋白的溶液進(jìn)行透析濃縮，得到所述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白。
[0032] 具體地，上述步驟S01中，獲得表達(dá)植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白重組菌的方法優(yōu)選為：
[0033] ⑴擴(kuò)增基因片段：首先，選取植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白（Imp)的基因，該基因的DNA 序列在Gene bank已有公布，其中AP株基因序列登錄號(hào)為AJ011678 ;為后續(xù)利用His標(biāo)簽 親和層析法來(lái)純化植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白，因此合成含有6XHis Tag序列的植原體免疫主 導(dǎo)膜蛋白基因，該優(yōu)選的6XHis Tag可以位于植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白基因的C端或N端， 其對(duì)NTA瓊脂糖中的鎳離子有較強(qiáng)的親和吸附作用，可以使被標(biāo)簽的植原體免疫主導(dǎo)膜蛋 白基因在親和層析的過(guò)程中更容易純化。接著，根據(jù)上述含有6XHis Tag序列的植原體免 疫主導(dǎo)膜蛋白基因設(shè)計(jì)引物對(duì)，利用常規(guī)的PCR反應(yīng)進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。
[0034] 進(jìn)一步地，上述引物對(duì)為引物對(duì)一、引物對(duì)二、引物對(duì)三中的任一種；其中， 上述引物對(duì)一包含上游引物（FI) F' 5' -ACCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3' 和 下游引物（Rl) R'5'-CGCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3' ；上述引物對(duì)二包 R' 5' -CCCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3' ；上述引物對(duì)三包含上游引物（F1) F'5'-GGGTTTCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3' 和下游引物（R1)R'5'-CCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'。如圖2所示，上述上游引物（F1)引入的酶切位點(diǎn)為Nde I，下游引物（R1)引入的酶切位點(diǎn)為Xho I。
[0035] 更進(jìn)一步地，取上述PCR反應(yīng)的體系為50ul，其中包含2ul的Imp基因 DNA模板、 lul的上游引物（Fl)、lul的下游引物（Rl)、25ul的DNA聚合酶(優(yōu)選型號(hào)為Prime MIX)， 21ul的重蒸水（ddH20)。該P(yáng)CR反應(yīng)擴(kuò)增的條件為：在95°C下預(yù)變性5min，在94°C下變性 2min，在50°C?60°C下退火lmin，在72°C下延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，然后在72°C下延伸 lOmin，接著在4°C下保溫。
[0036] 將上述三種引物對(duì)置于上述PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的重組植原體免疫 主導(dǎo)膜蛋白（Imp)基因進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到三種引物對(duì)擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果請(qǐng) 參見(jiàn)圖3,其中Μ列為marker，即DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1列為引物對(duì)一的檢測(cè)結(jié)果，2列為引物 對(duì)二的檢測(cè)結(jié)果，3列為引物對(duì)三的檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)對(duì)比可知引物對(duì)一在上述PCR反應(yīng)體系 下的擴(kuò)增效果最好，在該擴(kuò)增反應(yīng)中，退火溫度優(yōu)選為50°C。
[0037] (2)構(gòu)建重組質(zhì)粒：選用質(zhì)粒pET_28a ( + )作為轉(zhuǎn)化的載體，先用上述內(nèi)切酶Nde I和Xho I同時(shí)酶切上述擴(kuò)增好的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白（Imp)基因，并用同樣的內(nèi)切 酶Nde I和Xho I同時(shí)酶切上述質(zhì)粒pET-28a( + )，再用連接酶將同樣雙酶切過(guò)的Imp基因 片段和質(zhì)粒pET-32a ( + )進(jìn)行連接，連接酶優(yōu)選為T(mén)7連接酶，從而獲得重組質(zhì)粒pET-28a (+ )-Imp,該重組質(zhì)粒如圖2所示。
[0038] (3)構(gòu)建重組大腸桿菌：將上述重組質(zhì)粒pET_28a ( + ) -Imp轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿 菌，該感受態(tài)大腸桿菌為BL21 (DE3)、DH5 a、JM109中的任一種，優(yōu)選為BL21 (DE3)，得到表 達(dá)重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白（Imp)的重組菌BL21(DE3)/pET-28a ( + )-lmp。
[0039] 進(jìn)一步地，該步驟SOI中，在誘導(dǎo)表達(dá)之前，還可以包含篩選陽(yáng)性植原體免疫主導(dǎo) 膜蛋白（Imp)重組菌的步驟：將上述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-28a ( + ) -Imp接種在氨 芐青霉素（AMP)LB培養(yǎng)基上，由于質(zhì)粒pET-28a ( + )與氨芐青霉素存在細(xì)菌抗性，經(jīng)篩選獲 得陽(yáng)性菌落。
[0040] 再進(jìn)一步地，該步驟S01中，誘導(dǎo)上述重組菌BL21(DE3)/pET-28a ( + )-lmp表達(dá) 的方法為：先將上述重組菌BL21 (DE3)/pET-28a ( + )-lmp接入10ml的LB液體培養(yǎng)基中過(guò) 夜培養(yǎng)，其中，該LB液體培養(yǎng)基中包含濃度為40ug/ml的硫酸卡那霉素（Kana)，培養(yǎng)的溫度 為35?37°C，優(yōu)選為37°C，攪拌的轉(zhuǎn)速為200?250rpm，優(yōu)選為200rpm ;然后按1%的接種 量轉(zhuǎn)接至50ml的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2?3小時(shí)；培養(yǎng)至0D600為0. 5?0. 8時(shí)，優(yōu)選 0D600為0. 6,再加入誘導(dǎo)劑IPTC誘導(dǎo)植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白（Imp)重組菌表達(dá)蛋白質(zhì)至濃 度為0. 4mmol/L?0. 6mmol/L，接著在溫度為35?37°C下培養(yǎng)4?6小時(shí)，優(yōu)選為在37°C 下培養(yǎng)6小時(shí)。
[0041] 取含空質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)/pET-28a ( + )作為空白對(duì)照組，用上述重組菌 BL21(DE3)/pET-28a ( + ) -Imp的誘導(dǎo)表達(dá)方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。分別取lml的上Imp重組 菌菌液和空白對(duì)照組菌液，先離心收集菌體，用PBS緩沖液重懸，再用抽提試劑溶解菌體得 到上清液和沉淀物，其中抽提試劑優(yōu)選為默克公司生產(chǎn)的Bugbuster Master Mix, 500ml規(guī) 格，貨號(hào)為70548-4,該上清液為可溶性蛋白，該沉淀物為包涵體。將該上清液和包涵體懸 液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)掃描，對(duì)目的蛋白Imp進(jìn)行可溶性分析。分析結(jié)果如圖4， 結(jié)果顯示構(gòu)建于pET-28a(+)原核表達(dá)載體中的植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白（Imp)基因，在宿主 菌BL21(DE3)中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，目的蛋白Imp主要以包涵體形式存在。經(jīng)凝膠掃描后，以已 知蛋白分子量的BSA為參照，通過(guò)Gene Tools半定量分析，得知包涵體的含量占總蛋白的 70%以上。
[0042] 具體地，上述步驟S02中，由于大部分的目的蛋白以包涵體的形式存在于重組菌 中，因此需要將步驟S01中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌破碎。破碎重組菌的方法包含直接破碎 法或復(fù)合破碎法，優(yōu)選復(fù)合破碎法。其中，上述直接破碎法為采用裂解液破碎重組菌，裂解 液優(yōu)選為默克公司生產(chǎn)的Bugbuster Master Mix(500ml規(guī)格，貨號(hào)為70548-4)，此法使重 組菌的細(xì)胞粘度增大，并且鏡檢細(xì)胞的破碎率只有80%。上述復(fù)合破碎法為凍融和裂解液裂 解相結(jié)合的方法，裂解液優(yōu)選為默克公司生產(chǎn)的Bugbuster Master Mix (500ml規(guī)格，貨號(hào) 為70548-4):先將步驟SOI中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌液體離心分離成上清液和沉淀物，將 沉淀物在-40?-20°C的溫度下凍融2?4次后，優(yōu)選為在-20°C下凍融2次，加入裂解液， 該裂解液優(yōu)選為默克公司生產(chǎn)的Bugbuster Master Mix(500ml規(guī)格，貨號(hào)為70548-4);再 在室溫下重懸，在20?25°C下振蕩孵育30?60分鐘，優(yōu)選為在25°C下將重懸的細(xì)胞液振 蕩孵育30分鐘，使重組菌充分裂解；其中，上述抽提試劑與上述沉淀物的體積質(zhì)量比為5? l〇ml/g，優(yōu)選為5ml/g。上述復(fù)合破碎法使重組菌的細(xì)胞粘度降低，并且鏡檢細(xì)胞的破碎率 為 100%。
[0043] 該步驟S02中，將裂解后得到的混合物在4°C的溫度下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心 20分鐘，分離得到上清液一和沉淀物一。
[0044] 具體地，上述步驟S03中，采用親和層析法提純上清液一中的可溶性重組植原體 免疫主導(dǎo)膜蛋白（Imp)，提純的方法優(yōu)選為：首先，將樹(shù)脂懸液與結(jié)合緩沖液輕柔吹打混 勻，待樹(shù)脂自然地沉降后獲得混合液，所述樹(shù)脂懸液與所述結(jié)合緩沖液的體積比為1?4 : 1?5,優(yōu)選為1:4 ;進(jìn)一步地，該樹(shù)脂懸液優(yōu)選為50%的Ni-NTA His ·Β?ικ!樹(shù)脂懸液，該結(jié) 合緩沖液優(yōu)選為lXNi-NTA結(jié)合漂洗緩沖液，該混合液為將上述50%的Ni-NTA His · Bind 樹(shù)脂懸液加入1 XNi-NTA結(jié)合漂洗緩沖液中；更進(jìn)一步地，上述50%的Ni-NTA His · Bind 樹(shù)脂懸液的用量可根據(jù)重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白（Imp)的表達(dá)量或者待純化樣品的量而 定，通常lml的50%的Ni-NTA His ·Β?η(1樹(shù)脂可結(jié)合5?10mg的6XHis Tag的Imp蛋白， 優(yōu)選為lml的50%的Ni-NTA His · Bind樹(shù)脂結(jié)合5mg的6XHis Tag的Imp蛋白。取lml 的50%的Ni-NTA His .Bind樹(shù)脂，分別加入5mg、8mg、10mg的6XHis Tag的重組Imp,吸附 后收集流出液，分別進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示，可見(jiàn)當(dāng)重組Imp質(zhì)量大 于5mg時(shí)，流出液中有未被吸附的重組Imp,因此最好選擇重組Imp的量為5mg/ml。
[0045] 進(jìn)一步地，上述步驟S03中，上述IXNi-NTA結(jié)合漂洗緩沖液中含有濃度為0? 10mM/L的咪唑，PH值為7?8。接著，用槍吸取步驟S02中得到的上清液一使加入至上述 混合液中，使之與平衡好的Ni-NTA His ·Β?ικ!樹(shù)脂混勻，在4?8°C的溫度下振蕩1?2小 時(shí)，優(yōu)選為4°C下振蕩1小時(shí)。此時(shí)上清液中的重組Imp已經(jīng)較好地與Ni-NTA His · Bind 樹(shù)脂結(jié)合，將該結(jié)合好的Ni-NTA His*Bind樹(shù)脂加入層析住中，靜置等待樹(shù)脂自然沉降。由 于上述重組菌BL21(DE3)/pET-28a ( + )-lmp表達(dá)的Imp由于帶有6個(gè)His-Tag (組蛋白標(biāo) 簽)，與Ni-NTA His ·Β?ικ!樹(shù)脂中的過(guò)渡金屬離子Ni2+有較強(qiáng)的親和吸附作用，當(dāng)上清液一 中的可溶性重組Imp蛋白與Ni-NTA His ·Β?η(1樹(shù)脂混合時(shí)，帶有組氨酸標(biāo)簽的重組Imp特 異性結(jié)合到Ni-NTA His · Bind樹(shù)脂里，使其他的雜蛋白游離。此外，咪唑也可以與Ni-NTA His · Bind樹(shù)脂中的Ni2+競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，當(dāng)1 XNi-NTA結(jié)合緩沖液含有低濃度咪唑時(shí)，除了幫 助重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白更好地與樹(shù)脂結(jié)合，還有助于洗滌摻雜到樹(shù)脂里的雜蛋白； 而PH值為7?8的Ni-NTA結(jié)合緩沖液可以避開(kāi)等電點(diǎn)，防止蛋白質(zhì)沉淀，尤其在PH值為 7. 0時(shí)可有效提高純化的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白量。
[0046] 再進(jìn)一步地，該步驟S03中，漂洗步驟使用Ni-NTA漂洗緩沖液，優(yōu)選為1 X Ni-NTA 漂洗緩沖液，其中Ni-NTA漂洗緩沖液中的咪唑濃度為20?60mM/L，PH值為7?8 ;洗脫步 驟使用Ni-NTA洗脫緩沖液，優(yōu)選為1 X Ni-NTA洗脫緩沖液，Ni-NTA洗脫緩沖液中的咪唑濃 度為200?300mM/L，PH值為7?8。如上所述，咪唑也可以與Ni-NTA His · Bind樹(shù)脂中 的Ni2+競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，當(dāng)緩沖液中含有低濃度的咪唑時(shí)，可以洗滌摻雜到樹(shù)脂里的雜蛋白；當(dāng) 緩沖液中含有高濃度的咪唑時(shí)，可以將結(jié)合到樹(shù)脂中的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白洗脫出 來(lái)；而PH值為7?8的緩沖液可以避開(kāi)等電點(diǎn)，防止蛋白質(zhì)沉淀，尤其在PH值為7. 0時(shí)可 有效提高純化的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白量。因此，上述上清液一與Ni-NTA His · Bind 樹(shù)脂混勻、靜置沉降后，用上述Ni-NTA漂洗緩沖液漂洗兩次、再用Ni-NTA洗脫緩沖液洗脫， 得到純化的可溶性所述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白（Imp)。具體lXNi-NTA結(jié)合緩沖液、 Ni-NTA漂洗緩沖液以及Ni-NTA洗脫緩沖液中咪唑的濃度優(yōu)化過(guò)程見(jiàn)后續(xù)具體實(shí)施案例， 優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖5,其中Μ列為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（marker)的分子量，1?9列分別對(duì)應(yīng)實(shí)施例1?9 的檢測(cè)結(jié)果。上述得到的可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白（Imp)，在4?8°C的溫度下， 用不含DTT的透析緩沖液透析3?4小時(shí)，替換緩沖液并繼續(xù)透析2?3次，脫去高濃度咪 唑。優(yōu)選為在4°C下透析4小時(shí)后，更換透析緩沖液繼續(xù)透析2次，每次4小時(shí)，得到可溶 性頂P蛋白溶液；其中上述透析緩沖液包含0. 01?0. 02mol/L的Tris-HC1，PH值為8. 2? 8. 5。，優(yōu)選為包含 0· 02mol/L 的 Tris-HCl，PH 值為 8. 5。
[0047] 具體地，上述步驟S04中，首先，將步驟S02得到的沉淀物一進(jìn)行進(jìn)行溶解：將沉 淀物一重懸洗滌兩次，洗滌步驟使用洗滌液，該洗滌劑優(yōu)選為包涵體洗滌液，該洗滌液與 沉淀物一的體積質(zhì)量比為15?20ml/g。優(yōu)選地，上述包涵體洗滌液包含50?60mmol/L Tris-HCl，90 ?100mmol/L NaCl，0· 5 ?lmmol/L 乙二胺四乙酸，7 ?8mmol/L 聚乙二醇辛 基苯基釀，ρΗ8· 0 ?8. 2,優(yōu)選為包含 50mmol/L 的 Tris-HCl、100mmol/L 的 NaCl、lmmol/L 的 乙二胺四乙酸（EDTA)、0. 5%的聚乙二醇辛基苯基醚，PH值為8. 0。
[0048] 接著，將洗滌后的沉淀物一用溶解緩沖液懸重并經(jīng)孵育處理，得到所述沉淀物一 的溶解液。進(jìn)一步地，在用溶解緩沖液懸重的步驟之前還包含離心分離的步驟：將洗滌后的 沉淀物一在4°C下以轉(zhuǎn)速為12000rpm離心處理20分鐘，收集沉淀物，該沉淀物主要為沉淀 物一中的包涵體。再進(jìn)一步地，上述溶解緩沖液優(yōu)選為包涵體溶解緩沖液，該包涵體溶解緩 沖液包含500?BOOmmol /T,的3_ (環(huán)己胺）_1_丙橫酸鹽（CAPS)、10?15mmol/L的N-十二 烷基肌氨酸鈉和0. 8?1. Ommol/L的二硫蘇糖醇，PH值為10?11，再優(yōu)選為包含500mM的 CAPS、0. 3%的N-十二烷基肌氨酸鈉和ImM的二硫蘇糖醇，PH值為11. 0 ;其中，上述包涵體 溶解緩沖液與沉淀物的體積質(zhì)量比為50?100ml/g，并且發(fā)明人通過(guò)大量的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) 沉淀物的量大于〇. 〇lg時(shí)，包涵體難以全部溶解，會(huì)有沉淀殘留，因此包涵體溶解緩沖液與 沉淀物的體積質(zhì)量比優(yōu)選為l〇〇ml/g，可以徹底溶解該包涵體。再進(jìn)一步地，上述孵育處理 優(yōu)選為在室溫下孵育15分鐘。
[0049] 進(jìn)一步地，該步驟S04中，將得到的沉淀物一的溶解液加入至所述樹(shù)脂懸液與所 述結(jié)合緩沖液混合液之前還包含還包含離心分離的步驟：將上述沉淀物一的溶解液在4°C 下以轉(zhuǎn)速為12000rpm離心處理20分鐘，得到上清液，該上清液主要包含包涵體中的重組 lmp〇
[0050] 進(jìn)一步地，該步驟S04中，采用親和層析法提純沉淀物一的溶解液中的包涵體重 組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白（Imp):將上述沉淀物一的溶解液與上述50%的Ni-NTA His ·Β?ικ! 樹(shù)脂混勻，在4°C下振蕩結(jié)合1小時(shí)，此時(shí)沉淀物一溶解液的重組Imp蛋白已經(jīng)較好地與樹(shù) 脂結(jié)合，將該結(jié)合好的樹(shù)脂加入層析住中，靜置等待樹(shù)脂自然沉降，用上述1 XNi-NTA漂洗 緩沖液漂洗兩次、用上述lXNi-NTA洗脫緩沖液洗脫，得到蛋白溶液；用上述包涵體溶解緩 沖液稀釋該蛋白溶液一，該包涵體溶解緩沖液稀釋與蛋白溶液一的體積比為50:1，在4? 8°C的溫度下，透析3?4小時(shí)，替換緩沖液并繼續(xù)透析2?3次，用不含DTT的透析緩沖液 繼續(xù)透析2?3次，每次透析3?4h，重新折疊變性蛋白，脫咪唑。優(yōu)選為在4°C下透析4小 時(shí)后，更換透析緩沖液繼續(xù)透析3次，每次4小時(shí)，用不含DTT的透析緩沖液繼續(xù)透析3次， 每次透析4h，得到蛋白溶液二。其中上述透析緩沖液包含0. 01?0. 02mol/L的Tris-HCl、 0. 05?0. lmmol/L的二硫蘇糖醇，PH值為8. 2?8. 5。，優(yōu)選為包含0. 02mol/L的Tris-HCl、 0. ImM的二硫蘇糖醇，PH值為8. 5。如果透析后樣品中有可見(jiàn)的不溶物，在4°C的溫度下 12000rpm (請(qǐng)核對(duì)是否有誤？）離心10分鐘去除沉淀。
[0051] 具體地，上述步驟S05中，將S03和S04得到的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白用 Millipore超濾管以十倍體系進(jìn)行濃縮，濃縮電泳檢測(cè)的結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖8,其中Μ列為標(biāo)準(zhǔn) 蛋白（marker)的分子量，1列為包涵體重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白。
[0052] 上述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，通過(guò)使用親和層析法將重組菌表達(dá) 的可溶性植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白進(jìn)行提純，尤其是將包涵體裂解，結(jié)合利用透析法和親和 層析法對(duì)包涵體中的不溶性植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白進(jìn)行提純，并通過(guò)對(duì)提純的條件和工藝 參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，從而大大提高重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化效果，提純度可達(dá)95%，而 傳統(tǒng)方法的提純度為60%。該方法工藝簡(jiǎn)單、易于操作，并且產(chǎn)出量高、降低了生產(chǎn)成本。
[0053] 本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)一步提供了上述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白在醫(yī)學(xué)免疫領(lǐng)域制 備抗體的方法：
[0054] S06,將步驟S05中得到的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白免疫動(dòng)物：
[0055] 選取體重為2kg左右的家兔2只，每只采血4ml制備陰性對(duì)照血清；將上述重組植 原體免疫主導(dǎo)膜蛋白用PBS稀釋到300ug/ml，取lml蛋白溶液與等體積弗氏完全佐劑充分 乳化。首次免疫通過(guò)背部皮下多點(diǎn)注射，在4個(gè)不同部位分別各注射約500 μ 1弗氏完全佐 劑乳化的抗原溶液；首次免疫兩周后，將Imp蛋白溶液與等量弗氏不完全佐劑充分乳化。采 用同樣的免疫方法加強(qiáng)免疫四次。第三次加強(qiáng)免疫七天后采血測(cè)定血清抗體效價(jià)。第四次 加強(qiáng)免疫后，待效價(jià)達(dá)到要求，用頸動(dòng)脈全采血法收集血液，用5倍體積的PBS緩沖溶液稀 釋?zhuān)?°C的溫度、10, OOOrpm的轉(zhuǎn)速下離心lOmin，分離上清抗血清在-20°C下分裝保存。
[0056] S07,純化多克隆抗體
[0057] 將硫酸銨固體粉末緩慢加入步驟S05中得到的血清上清液，磁力攪拌混勻，使硫 酸銨終濃度達(dá)到50%，于4°C冰箱中靜置過(guò)夜；在10, OOOrpm的轉(zhuǎn)速下離心30min，棄上清 液，將沉淀物用5ml(請(qǐng)?zhí)峁┚唧w容量)50%硫酸銨溶液洗滌1?2次，離心處理后取沉淀物， 該沉淀物用3ml的PBS充分溶解，離心去除不溶物，用于下一步的柱層析；取用lml上述結(jié) 合緩沖液平衡處理后的瓊脂糖Protein A材料，用親和層析法分離純化出多克隆抗體；緩 慢的將抗血清上柱，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗；用洗脫緩沖液洗脫，收集流出液； 洗脫后立刻用1M的Tris-HCl堿性緩沖液將收集到的抗體溶液調(diào)pH至中性，避免抗體失 活，于-80°C的溫度下保存。
[0058] 進(jìn)一步地，用Anti-His · Tag(HRP)標(biāo)記步驟S07中得到的純化多克隆抗體，用 Western blot檢測(cè)帶6XHis-Tag的IMP純化蛋白。結(jié)果如圖9所示，顯示與對(duì)照樣品相 t匕，在18KD?25KD間出現(xiàn)一條特異性條帶。
[0059] 進(jìn)一步地，采用間接ELISA法對(duì)上述多克隆抗體進(jìn)行效價(jià)分析：（1)包被抗原：用 碳酸鹽包被緩沖液稀釋后的抗原蛋白并進(jìn)行包被，加入酶標(biāo)板(聚乙烯板)中，l〇〇uL/孔，在 4°C下包被過(guò)夜；（2)洗滌：棄去孔內(nèi)的包被液，每孔加滿(mǎn)TBST緩沖液洗板3次，輕輕拍干； (3)封閉：用封閉液進(jìn)行封閉，每孔200ul，在37°C下孵育1小時(shí)；（4)孵育一抗：棄去封閉 液，TBST緩沖液洗板3次，加入不同稀釋度的純化的Imp多克隆抗體與抗血清(倍比稀釋比 例為 1 :1000,1 :2000,1 :4000,1 :8000,1 :16000,1 :32000,1 :64000,1 :128000),每孔加入 100 μ 1，在37°C下孵育lh，同時(shí)做空白對(duì)照和陰性對(duì)照；（6)加酶標(biāo)抗體：于每個(gè)孔板中加 入稀釋的羊抗兔IgG-HRP100 μ 1，在37°C下孵育lh，棄去板孔中液體，用TBST緩沖液洗板3 次，輕輕拍干；（7)底物顯色：每孔加入100ul底物顯色液TMB，在37°C下避光作用30min ; (8)終止反應(yīng)：加入終止液50 μ 1終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm處測(cè)定每孔的0D值。計(jì) 算實(shí)驗(yàn)組的〇D45(l與陰性對(duì)照的0D 45(I比值（P/N)。測(cè)定結(jié)果如表1、圖10所示。
[0060] 表1抗血清多克隆抗體效價(jià)測(cè)定
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，包括如下步驟： 獲得表達(dá)植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的重組菌，誘導(dǎo)表達(dá)； 破碎經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌，分離得到上清液一和沉淀物一； 將所述上清液一加入至樹(shù)脂懸液與結(jié)合緩沖液混合液中，所述樹(shù)脂懸液與所述結(jié)合緩 沖液的體積比為1?4 :1?5,在4?8°C的溫度下振蕩1?2小時(shí)后靜置沉降，然后依次 經(jīng)漂洗、洗脫處理，得到可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液； 將所述沉淀物一懸重洗滌后并經(jīng)孵育處理，得到所述沉淀物一的溶解液；將所述沉淀 物一的溶解液加入至所述樹(shù)脂懸液與所述結(jié)合緩沖液混合液中，所述樹(shù)脂懸液與所述結(jié)合 緩沖液的體積比為1?4 :1?5,在4?8°C的溫度下振蕩1?2小時(shí)后靜置沉降，然后依 次經(jīng)漂洗、洗脫處理，得到包涵體重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的溶液； 將所述可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液與所述包涵體中重組植原體免疫主導(dǎo) 膜蛋白的溶液進(jìn)行透析濃縮，得到所述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述 樹(shù)脂懸液為50%的Ni-NTA-His ·Β?ικ!樹(shù)脂懸液；所述結(jié)合緩沖液為Ni-NTA結(jié)合緩沖液，所 述Ni-NTA結(jié)合緩沖液中的咪唑濃度為0?10mM/L，PH值為7?8。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述 漂洗步驟使用Ni-NTA漂洗緩沖液，所述Ni-NTA漂洗緩沖液中的咪唑濃度為20?60mM/L， PH值為7?8 ;所述洗脫步驟使用Ni-NTA洗脫緩沖液，所述Ni-NTA洗脫緩沖液中的咪唑濃 度為200?300mM/L，PH值為7?8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于， 所述沉淀物一洗漆步驟使用包涵體洗漆緩沖液，所述洗漆緩沖液包含50?60mmol/L Tris-HCl，90 ?100mmol/L NaCl，0· 5 ?lmmol/L 乙二胺四乙酸，7 ?8mmol/L 聚乙二醇辛 基苯基醚，ρΗ8· 0?8. 2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述 淀物一經(jīng)洗滌后用包涵體溶解緩沖液重懸，所述包涵體溶解緩沖液包含500?600mmol/L 的3-(環(huán)己胺）-1-丙磺酸鹽、10?15mmol/L的N-十二燒基肌氨酸鈉和0. 8?lmmol/L的 二硫蘇糖醇，PH值為10?11。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述 透析步驟為將所述可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液和包涵體中重組植原體免疫主 導(dǎo)膜蛋白的溶液加入至透析液中，在4?8°C的溫度下透析3?4小時(shí)；所述透析緩沖液包 含 0· 01 ?0· 02mol/L 的 Tris-HCl、0. 05 ?0· lmmol/L 的二硫蘇糖醇，PH 值為 8. 2 ?8. 5。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述 破碎經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌的方法為直接破碎或復(fù)合破碎；其中，所述復(fù)合破碎的方法為： 將所述經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌在-4?_20°C的溫度下凍融2?4次，加入抽提試劑，在20? 25°C的溫度下重懸，振蕩孵育30?60分鐘；其中所述抽提試劑體積與所述經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的 重組菌的質(zhì)量比為5?10ml/g。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述 獲得表達(dá)植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的重組菌的方法如下： 合成含有6XHis Tag序列的植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白基因，設(shè)計(jì)引物對(duì)，擴(kuò)增所述植原 體免疫主導(dǎo)膜蛋白基因； 將所述植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白基因克隆至表達(dá)質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒； 用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，得到表達(dá)植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的重組菌。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在 于，所述引物對(duì)為引物對(duì)一、引物對(duì)二、引物對(duì)三中的任一種；其中，所述引物對(duì)一包 含上游引物 F' 5' -ACCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3' 和下游引物 R' 5' -CGCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'，所述引物對(duì)二包含上游引物 F' 5' -CGCCATATGGAAGGTA AGCAGCAAATAACGA-3' 和下游引物 R' 5' -CCCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'，所 述引物對(duì)三包含上游引物F' 5' -GGGTTTCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3'和下游引物 R' 5'-CCCTCGA GCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'。
10. 如權(quán)利要求1?9所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法所獲得的重組植 原體免疫主導(dǎo)膜蛋白在醫(yī)學(xué)免疫、克隆抗體、致病機(jī)理研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K1/22GK104232710SQ201310253850
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月24日
【發(fā)明者】劉仲健, 李利強(qiáng), 肖新菊, 張麗君, 羅煥亮, 梁楠楠 申請(qǐng)人:深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心