一種從雷公藤葉中分離雷公藤內(nèi)酯二醇的方法
【專利摘要】一種從雷公藤葉中分離雷公藤內(nèi)酯二醇的方法，步驟為：雷公藤葉粉末通過乙醇水溶液提取，蒸去乙醇得到水懸浮物，向水懸浮物中加正己烷脫脂，取下相，加有機混合溶劑萃取，取有機相，蒸干得到有機相萃取物，有機相萃取物上硅膠柱層析，蒸干洗脫劑得到雷公藤內(nèi)酯二醇粗品，用四元兩相體系，對該粗品進行分配，取上相蒸干得到四元分配物，最后通過高速逆流色譜精制得到雷公藤內(nèi)酯二醇精品。本發(fā)明的提取方法工藝簡單、耗時短、易操作，所涉及到的溶劑不含對環(huán)境和人體損害較大的氯代溶劑，生產(chǎn)過程安全環(huán)保，而且成本低，提取的雷公藤內(nèi)酯二醇的純度在95%以上，提取率也較高。
【專利說明】一種從雷公藤葉中分離雷公藤內(nèi)酯二醇的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物有效成分的分離【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從雷公藤葉中分離雷公藤內(nèi)酯二醇的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]雷公藤(TripterygiumWilfordii Hook F，簡稱 TWHF)是衛(wèi)矛科(Celastraceae)雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，是雷公藤(Tripterygium)屬植物的一種，主要分布于我國長江以南地區(qū)和東北長白山區(qū)。雷公藤，作為一種傳統(tǒng)中藥(tradit1nal Chinesemedicine，TCM)在中國有數(shù)百年的應(yīng)用歷史，最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，名莽草，在《綱目拾遺》中有詳細記載，又名斷腸草、山砒霜、南蛇藤，由于毒性大，民間也有用于殺蟲、毒鼠等。作為藥物，雷公藤的主要藥理作用是免疫系統(tǒng)作用、抗炎、抗生育作用。雷公藤提取物在治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、紅斑狼瘡等顯示出了良好的效果。
[0003]雷公藤中的藥效成分主要是雷公藤二萜內(nèi)酯、雷公藤三萜類、雷公藤生物堿等。雷公藤內(nèi)酯二醇(tripd1lide)，又名雷公藤乙素(CAS N0.38647_10_8)，有的文獻上稱為T8，是從雷公藤中分離出來的含有3個環(huán)氧基的二萜內(nèi)酯化合物，為無色針狀晶體(二氯甲燒-乙醚結(jié)晶)，相對分子質(zhì)量為376,分子式為C2tlH24O7,分子結(jié)構(gòu)中有α, β -不飽和醒酮內(nèi)酯環(huán)，熔點210?211° C，易溶于氯仿、二氯甲烷、乙醇、甲醇等，不溶于石油醚、正己烷、微溶于水。雷公藤內(nèi)酯二醇是雷公藤的主要活性成分之一，為中藥雷公藤多甙片的主要有效化合物。
[0004]現(xiàn)有文獻報道分離得到雷公藤內(nèi)酯二醇的方法:雷公藤提取物經(jīng)過反復(fù)柱層析分離，過程繁瑣、耗時長；也有文獻報道采用制備高效液相制備分離雷公藤內(nèi)酯二醇，但每次進樣操作樣品少，成本高；還有采用柱層析結(jié)合結(jié)晶方法分離雷公藤內(nèi)酯二醇的，但該方法雷公藤內(nèi)酯二醇損失較大。
[0005]高速逆流色譜(high-speedcountercurrent chromatography, HSCCC)是 20 世紀80年代發(fā)展起來的一種高效的液-液分配色譜分離技術(shù)。高速逆流色譜與柱色譜(columnchromatography, CC)相比，不存在固體支撐,避免了不可逆吸附,從而避免了樣品的損失、失活、變性，分離時間短，節(jié)省溶劑；與制備高效液相色譜(PHPLC)相比，樣品可以直接進樣，沒有純度要求，而且樣品可以全部回收，上樣量大，重復(fù)性好，設(shè)備操作方便簡單。通過以上對高速逆流色譜的了解，高速逆流色譜適用于植物有效成分的提取分離，特別是適用于植物有效成分分離的最后精制純化步驟。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從雷公藤葉中分離雷公藤內(nèi)酯二醇的方法，具有工藝簡單、耗時短、生產(chǎn)過程環(huán)保、成本低的特點，同時提取的雷公藤內(nèi)酯二醇的提取率和純度均較高。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種從雷公藤葉中分離雷公藤內(nèi)酯二醇的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0008]I)將雷公藤葉磨成粉末，過篩，用乙醇水溶液回流提取后，將得到的提取液蒸去乙醇得到水懸浮物；
[0009]2)在水懸浮物中加入I?3倍體積的正己烷或60?90°C石油醚或庚烷攪拌混合，過濾分層后取水相，加入I?2倍水相體積的有機混合溶劑攪拌，分層后分液，取上相蒸干得到有機相萃取物；
[0010]3)將有機相萃取物上硅膠柱層析，然后用體積比為1:2?3的正己烷和乙酸乙酯的混合物洗脫，洗脫液濃縮蒸干得到雷公藤內(nèi)酯二醇粗品；
[0011]4)雷公藤內(nèi)酯二醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水所構(gòu)成的四元兩相體系分配，其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為I?2:8?10:1?2:8?10，分液，下相蒸干得到四元分配物；
[0012]5)將上述四元分配物上高速逆流色譜進行精制，所用的溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-7K，其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為I?2:4?6:1?2:4?6，置于分液漏斗中，搖勻、靜置分層，平衡后，將上、下相分開；用上相作固定相，下相作流動相；或者下相作為固定相，上相作為流動相，控制儀器轉(zhuǎn)速為450?550r/min，流速為4.5?
5.5mL/min，根據(jù)檢測器的譜圖分步收集目標物，減壓濃縮得到雷公藤內(nèi)酯二醇精品。
[0013]作為改進，所述步驟I)中的乙醇水溶液為含水體積濃度10?30%的乙醇，回流提取為2?4次，每次提取0.5?2小時，每次每克雷公藤葉粉末用含水體積濃度10?30%的乙醇6?10毫升。
[0014]作為改進，所述步驟2)中的過濾后濾液分層是采用靜置放置I?12小時。
[0015]作為優(yōu)選，所述步驟2)中的有機混合溶劑為乙酸乙酯和甲醇的混合物，其體積比為20?5:1。
[0016]作為改進，所述步驟3)中的正己烷和乙酸乙酯中的正己烷可采用60?90°C石油醚或庚烷進行替換。
[0017]再改進，所述步驟3)中的硅膠柱層析的具體參數(shù)為:每克有機相萃取物吸附在一克硅膠上，每克有機相萃取物需硅膠填料50?100克，需用體積比為1:2?3的正己烷和乙酸乙酯的混合物250?500毫升洗脫。
[0018]再改進，所述步驟5)中上相作固定相，下相作流動相時，用上相充滿整個高速逆流色譜中色譜柱，調(diào)整高速逆流色譜主機正轉(zhuǎn)，將下相從柱子的首端泵入柱內(nèi)進行洗脫，待整個體系建立動態(tài)平衡后由進樣閥進樣。
[0019]再改進，所述步驟5)中用下相作為固定相，上相作為流動相，用下相充滿整個高速逆流色譜中色譜柱，調(diào)整高速逆流色譜主機正轉(zhuǎn)，將上相從柱子的尾端泵入柱內(nèi)進行洗脫；待整個體系建立動態(tài)平衡后，由進樣閥進樣。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:從雷公藤內(nèi)酯二醇的溶解特性出發(fā)，用幾種對環(huán)境影響較小的常用溶劑，通過乙醇水溶液提取，正己烷萃取脫脂，盡可能地減少了提取過程中雷公藤內(nèi)酯二醇的損失，有效除雜減少后續(xù)工序的處理量，同時減少了柱層析上樣負荷，降低了成本；用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水構(gòu)成的四元兩相體系對雷公藤內(nèi)酯二醇粗品進行分配，有效減少了高速逆流色譜步驟的進樣量，提高生產(chǎn)效率。本發(fā)明的提取方法工藝簡單、耗時短、易操作，所涉及到的溶劑不含對環(huán)境和人體損害較大的氯代溶劑，生產(chǎn)過程安全環(huán)保，而且成本低，提取的雷公藤內(nèi)酯二醇的質(zhì)量純度在95%以上，提取率也較聞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明的雷公藤內(nèi)酯二醇的結(jié)構(gòu)式。

【具體實施方式】
[0022]以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0023]本發(fā)明從雷公藤內(nèi)酯二醇的溶解特性(雷公藤內(nèi)酯二醇易溶于氯仿、二氯甲烷、乙醇、甲醇等，不溶于石油醚、正己烷、微溶于水)出發(fā)，用幾種對環(huán)境影響較小的常用溶劑，通過乙醇水溶液提取，正己烷萃取脫脂，盡可能地減少了提取過程中雷公藤內(nèi)酯二醇的損失，同時減少了柱層析的上樣負荷，降低了成本，通過一次簡單柱層析，得到雷公藤內(nèi)酯二醇粗品。為了減少高速逆流色譜的進樣負荷，提高生產(chǎn)效率，將雷公藤內(nèi)酯二醇粗品用高速逆流色譜常用的四元兩相溶劑體系進行分配，能夠進一步除雜，富集雷公藤內(nèi)酯二醇。最后通過高速逆流色譜(HSCCC)精制得到質(zhì)量純度在95%以上的雷公藤內(nèi)酯二醇精品。
[0024]實施例1
[0025]Ikg干燥的雷公藤葉磨成粉末，先用含水10%的乙醇水溶液攪拌回流提取三次，每次提取0.5小時，每次乙醇水溶液用量為6L，合并乙醇水溶液提取液，蒸去乙醇得到水懸浮液。向水懸浮物中加I倍體積的正己烷攪拌混合，過濾，濾液分層I小時，分液，上相為有機相，下相為水相。取下相，加入2倍水相體積的有機混合溶劑(乙酸乙酯和甲醇組成的體積比為20:1)，攪拌混合、并靜置分層12小時，取上相蒸干得到有機相萃取物。有機相萃取物上硅膠柱層析，用體積比為1:2的正己烷和乙酸乙酯洗脫，收集全部洗脫液濃縮蒸干得雷公藤內(nèi)酯二醇粗品。雷公藤內(nèi)酯二醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水所構(gòu)成的四元兩相體系分配，其體積比為1:10:1:10 (10暈升:100暈升:10暈升:100暈升),分液,下相蒸干得到雷公藤內(nèi)酯二醇富集物。雷公藤內(nèi)酯二醇富集物用高速逆流色譜精制，所用的兩相溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-7K，其體積比為2:5:2:5，上相為固定相下相為流動相，儀器操作轉(zhuǎn)速為500r/min，流速為5mL/min，收集含雷公藤內(nèi)酯二醇部分濃縮蒸干得到雷公內(nèi)酯二醇精品50mg，質(zhì)量純度96%。
[0026]實施例2
[0027]Ikg干燥的雷公藤葉磨成粉末，先用含水20%的乙醇水溶液攪拌回流提取兩次，每次提取2小時，每次乙醇水溶液用量為10L，合并乙醇水溶液提取液，蒸去乙醇得到水懸浮液。向水懸浮物中加2倍體積的60-90 °C石油醚拌混合，過濾，濾液分層6小時，分液，上相為有機相，下相為水相。取下相，加入I倍水相體積的有機混合溶劑(乙酸乙酯和甲醇組成的體積比為10:1)，攪拌混合、并靜置分層12小時，取上相蒸干得到有機相萃取物。有機相萃取物上硅膠柱層析，用體積比為1:2.5的正己烷和乙酸乙酯洗脫，收集全部洗脫液濃縮蒸干得雷公藤內(nèi)酯二醇粗品。雷公藤內(nèi)酯二醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水所構(gòu)成的四兀兩相體系分配，其體積比為2:8:2:8 (20暈升:80暈升:20暈升:80暈升)，分液,下相蒸干得到雷公藤內(nèi)酯二醇富集物。雷公藤內(nèi)酯二醇富集物用高速逆流色譜精制，所用的兩相溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-7K，其體積比為1:4:1:4，上相為固定相下相為流動相，儀器操作轉(zhuǎn)速為500r/min,流速為5mL/min,收集含雷公藤內(nèi)酯二醇部分濃縮蒸干得到雷公內(nèi)酯二醇精品40mg，質(zhì)量純度97%。
[0028]實施例3
[0029]Ikg干燥的雷公藤葉磨成粉末，先用含水30%的乙醇水溶液攪拌回流提取兩次，每次提取I小時，每次乙醇水溶液用量為8L，合并乙醇水溶液提取液，蒸去乙醇得到水懸浮液。向水懸浮物中加3倍體積的正庚烷拌混合，過濾，濾液分層12小時，分液，上相為有機相，下相為水相。取下相，加入I倍水相體積的有機混合溶劑(乙酸乙酯和甲醇組成的體積比為5:1)，攪拌混合、并靜置分層8小時，取上相蒸干得到有機相萃取物。有機相萃取物上硅膠柱層析，用體積比為1:3的正己烷和乙酸乙酯洗脫，收集全部洗脫液濃縮蒸干得雷公藤內(nèi)酯二醇粗品。雷公藤內(nèi)酯二醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水所構(gòu)成的四元兩相體系分配，其體積比為1:9:1:9 (10暈升:90暈升:10暈升:90暈升),分液,下相蒸干得到雷公藤內(nèi)酯二醇富集物。雷公藤內(nèi)酯二醇富集物用高速逆流色譜精制，所用的兩相溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-7K，其體積比為1:6:1:6，上相為固定相下相為流動相，儀器操作轉(zhuǎn)速為500r/min，流速為7mL/min，收集含雷公藤內(nèi)酯二醇部分濃縮蒸干得到雷公內(nèi)酯二醇精品45mg，質(zhì)量純度96%。
[0030]上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種從雷公藤葉中分離雷公藤內(nèi)酯二醇的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)將雷公藤葉磨成粉末，過篩，用乙醇水溶液回流提取后，將得到的提取液蒸去乙醇得到水懸浮物； 2)在水懸浮物中加入I?3倍體積的正己烷或60?90°C石油醚或庚烷攪拌混合，過濾分層后取水相，加入I?2倍水相體積的有機混合溶劑攪拌，分層后分液，取上相蒸干得到有機相萃取物； 3)將有機相萃取物上硅膠柱層析，然后用體積比為1:2?3的正己烷和乙酸乙酯的混合物洗脫，洗脫液濃縮蒸干得到雷公藤內(nèi)酯二醇粗品； 4)雷公藤內(nèi)酯二醇粗品用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水所構(gòu)成的四元兩相體系分配，其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為I?2:8?10:1?2:8?10，分液，下相蒸干得到四元分配物； 5)將上述四元分配物上高速逆流色譜進行精制，所用的溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-7K，其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為I?2:4?6:1?2:4?6，置于分液漏斗中，搖勻、靜置分層，平衡后，將上、下相分開；用上相作固定相，下相作流動相；或者下相作為固定相，上相作為流動相，控制儀器轉(zhuǎn)速為500r/min,流速為4?7mL/min,根據(jù)檢測器的譜圖分步收集目標物，減壓濃縮得到雷公藤內(nèi)酯二醇精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟I)中的乙醇水溶液為含水體積濃度10?30%的乙醇，回流提取為2?4次，每次提取0.5?2小時，每次每克雷公藤葉粉末用含水體積濃度10?30%的乙醇6?10毫升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的過濾后濾液分層是采用靜置放置I?12小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟2)中的有機混合溶劑為乙酸乙酯和甲醇的混合物，其體積比為20?5:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟3)中的正己烷和乙酸乙酯的混合物中的正己烷可采用60?90°C石油醚或庚烷進行替換。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟3)中的硅膠柱層析的具體參數(shù)為:每克有機相萃取物吸附在一克硅膠上，每克有機相萃取物需硅膠填料50?100克，需用體積比為1:2?3的正己烷和乙酸乙酯的混合物250?500毫升洗脫。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟5)中上相作固定相，下相作流動相時，用上相充滿整個高速逆流色譜中色譜柱，調(diào)整高速逆流色譜主機正轉(zhuǎn)，將下相從柱子的首端泵入柱內(nèi)進行洗脫，待整個體系建立動態(tài)平衡后由進樣閥進樣。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟5)中用下相作為固定相，上相作為流動相，用下相充滿整個高速逆流色譜中色譜柱，調(diào)整高速逆流色譜主機正轉(zhuǎn)，將上相從柱子的尾端泵入柱內(nèi)進行洗脫；待整個體系建立動態(tài)平衡后，由進樣閥進樣。
【文檔編號】C07J73/00GK104231032SQ201310237971
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月13日
【發(fā)明者】沈劍, 屠雪姣 申請人:寧波工程學(xué)院