含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法
【專利摘要】含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,通過在該含有胰液成分的生物試樣中添加至少一種以上的具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿瑢υ撋镌嚇又械牡鞍酌傅拿富钚赃M(jìn)行抑制。此外,該含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑是具有氟磺酰基的化合物,具有蛋白酶抑制活性且為了抑制該生物試樣中的蛋白酶而被添加到含有胰液成分的生物試樣中。進(jìn)而,該含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒,含有至少1種以上的具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿挥糜诒4婧幸纫撼煞值纳镌嚇?。
【專利說明】含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于抑制含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的酶活性的方法,對胰液或十二指腸液中的來自胰液的成分的分解的抑制有效的蛋白酶抑制劑、及含有該蛋白酶抑制劑的胰液等生物試樣保存用試劑盒。
[0002]本申請基于2011年9月13日在日本提出的日本特愿2011-199357號主張優(yōu)先權(quán),在此引用該內(nèi)名
【背景技術(shù)】
[0003]體液是用于獲知臟器狀態(tài)的重要的生物試樣。胰液也是用于了解胰腺狀態(tài)的重要的生物試樣,可以用于細(xì)胞診斷、碳酸氫鹽測定、細(xì)菌檢查、由蛋白質(zhì)和/或核酸等組成的標(biāo)志物的檢查等。在研究中,也在廣泛進(jìn)行胰腺癌等胰腺相關(guān)疾病的新標(biāo)記物的探索。
[0004]由于胰液是消化液,因此含有各種各樣的消化酶。已經(jīng)知道這些消化酶雖然在胰腺內(nèi)以非活性狀態(tài)存在,在排出到十二指腸后活化。胰液中的消化酶,在由十二指腸上皮細(xì)胞分泌的小腸腸激酶的作用下,進(jìn)行分解級聯(lián)反應(yīng)。已知胰液中含有的胰蛋白酶原在小腸腸激酶的作用下活化,變成胰蛋白酶,進(jìn)而該胰蛋白酶成為誘因,將胰凝乳蛋白酶原、酯酶原等各種消化酶(蛋白酶)活化。另外,據(jù)說胰蛋白酶原占胰液總蛋白量的約12%左右(例如,參照非專利文獻(xiàn)2)。通過這些各種消化酶的活化,胰液中含有的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、細(xì)胞等生物分子在排出到十二指腸之后被分解、變性。因此,在對排向十二指腸的胰液進(jìn)行細(xì)胞檢查、生物分子測定等 檢查、研究發(fā)揮作用的場合,擔(dān)心胰液中的作為目的物的細(xì)胞、蛋白質(zhì)等會受到蛋白酶的影響,導(dǎo)致不能進(jìn)行準(zhǔn)確地測定。因此,如何抑制排出到十二指腸的胰液中的蛋白酶活性變得重要。
[0005]作為以往為使胰液、十二指腸液中的各種分解酶的活性降低的方法之一,已有將采集到的胰液在冷卻狀態(tài)下保存,通過避開酶活性的最適溫度來抑制活性的方法。一般而言,需要將采集到的胰液等立即置入冰中,并且,也需要迅速對該胰液等進(jìn)行檢查(例如,參照非專利文獻(xiàn)I)。但是,在該方法中,一旦胰液等的溫度升高,有可能再次進(jìn)行酶反應(yīng)。因此,通常使采集到的胰液總是保存在低溫下,處理繁雜。此外,根據(jù)蛋白質(zhì)的種類不同,即使是低溫有時也會進(jìn)行分解,因此單純在低溫下保存,對于抑制來自胰液成分的分解/變性等是不充分的。
[0006]已經(jīng)公開為了測定胰液中的蛋白質(zhì),在于內(nèi)窺鏡下采集到的胰液0.5mL中添加抑肽酶0.2mL進(jìn)行冷凍保存的方法(例如,參照非專利文獻(xiàn)2)。通過冷凍保存,在保存期間內(nèi)可以抑制胰液中幾乎全部的蛋白酶的活性,可以穩(wěn)定保存該胰液中的細(xì)胞、蛋白質(zhì)等。但是,冷凍保存的胰液需要在測定前進(jìn)行溶解,有時會再次進(jìn)行溶解后的細(xì)胞、蛋白質(zhì)等的分解。并且,在冷凍保存中作為解析對象的分子本身也有可能受損。
[0007]此外,作為保存生物試樣、特別是保存血液的方法,已經(jīng)公開在含有至少兩種以上的蛋白酶抑制劑的容器中直接采集血液的方法(例如參見專利文獻(xiàn)I。)。通過使采集到的血液立即與蛋白酶抑制劑接觸,可以防止血液中的蛋白質(zhì)的分解等。在該方法中,使用絲氨酸蛋白酶抑制劑和其他蛋白酶抑制劑,例如,將血液采集到含有AEBSF、抑肽酶、亮抑酶肽等絲氨酸蛋白酶抑制劑和E-64等半胱氨酸蛋白酶等的容器中。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)
[0010]專利文獻(xiàn)1:日本專利第4496407號公報(bào)
[0011]非專利文獻(xiàn)
[0012]非專利文獻(xiàn)1:勝沼等I人、“分析”、1978年、第10卷、第682~689頁。
[0013]非專利文獻(xiàn)2:橫山等8人、Pancreas、2002年、第24卷、第4號、第344~347頁
【發(fā)明內(nèi)容】
[0014]發(fā)明要解決的問題
[0015]為了使采集到的胰液、十二指腸液等穩(wěn)定且容易處理,可以認(rèn)為與專利文獻(xiàn)I中所記載的方法同樣地在采集到的體液中添加蛋白酶抑制劑的方法是有用的。
[0016]但是,在血液中和胰液中含有的蛋白酶的種類差異很大。因此,即使在胰液、十二指腸液等含有胰液成分的體液中添加專利文獻(xiàn)I中記載的有效地降低血液中的蛋白酶活性的蛋白酶抑制劑,也不能抑制該體液中的蛋白酶的活性。
[0017]本發(fā)明的目的在于,提供能夠有效抑制胰液、十二指腸液等含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶活性的蛋白酶抑制劑,使用該抑制劑的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法及含有該蛋白酶抑制劑的胰液等生物試樣保存用試劑盒。
`[0018]用于解決問題的方案
[0019]本發(fā)明人等為了解決上述課題進(jìn)行了銳意研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿σ纫褐泻械牡鞍酌傅幕钚砸种菩Ч罡撸瑥亩瓿闪吮景l(fā)明。
[0020](I)本發(fā)明的第一方式是一種含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,其通過在含有胰液成分的生物試樣中添加至少I種以上的具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿瑢υ撋镌嚇又械牡鞍酌傅拿富钚赃M(jìn)行抑制。
[0021](2)在前述(I)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中,所述具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿﹥?yōu)選為選自由PMSF、AEBSF、p-APMSF、4-(氟磺酰)苯甲酸、3_(氟磺酰)苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟及4-硝基苯磺酰氟組成的組中的I種以上的化合物。
[0022](3)在前述(I)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中,所述具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿﹥?yōu)選為選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的I種以上的化合物。
[0023](4)在前述(I)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中,所述具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿﹥?yōu)選為選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的2種以上。
[0024](5)在前述(I)~(4)的任一項(xiàng)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中,優(yōu)選按照PMSF的最終濃度為ImM以上、AEBSF的最終濃度為4mM以上、或p-APMSF的最終濃度為2mM以上的方式,在所述生物試樣中添加PMSF、AEBSF或p-APMSF。
[0025](6)在前述(I)~(5)的任一項(xiàng)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中,優(yōu)選在所述生物試樣中進(jìn)而添加至少I種以上的具有磺?;牡鞍酌敢种苿0026](7)在前述(6)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中,所述具有磺?;牡鞍酌敢种苿﹥?yōu)選為氨基酸氯甲基酮類。
[0027](8)在前述(6)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中,所述具有磺?;牡鞍酌敢种苿﹥?yōu)選為選自由TLCK及TPCK組成的組中的I種以上。
[0028](9)在前述(6)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中,所述具有磺?;牡鞍酌敢种苿﹥?yōu)選為TLCK。
[0029](10)在前述(I)~(9)的任一項(xiàng)的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法中,所述生物試樣優(yōu)選為胰液或十二指腸液。
[0030](I I)本發(fā)明的第二方式是含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑,其是具有氟磺?;幕衔铮哂械鞍酌敢种苹钚郧覟榱艘种圃撋镌嚇又械牡鞍酌付惶砑釉诤幸纫撼煞值纳镌嚇又?。
[0031](12)前述(11)的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑優(yōu)選為選自由PMSF、AEBSF, p-APMSF、4-(氟磺酰)苯甲酸、3_(氟磺酰)苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟及4-硝基苯磺酰氟組成的組中的化合物。
[0032](13)前述(11)的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑優(yōu)選為選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的化合物。
[0033](14)本發(fā)明的第三方式是蛋白酶抑制劑混合物,其含有至少I種以上的前述
(11)~(13)中任一項(xiàng)的生物試樣用蛋白酶抑制劑。
[0034](15)前述(14)的蛋白酶抑制劑混合物進(jìn)而優(yōu)選為含有至少I種以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制劑。
[0035](16)本發(fā)明的第四方式是含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒,其含有至少I種以上的具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿?,被用于保存含有胰液成分的生物試樣。
[0036](17)前述(16)的含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒,進(jìn)而優(yōu)選為含有至少I種以上的具有磺?;牡鞍酌敢种苿?。
[0037](18)前述(16)或(17)的含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒,進(jìn)而優(yōu)選含有具有用于儲存所采集的體液的儲存部的保存用容器,并且在所述儲存部預(yù)先包含所述具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿?。
[0038]發(fā)明的效果
[0039]本發(fā)明的第二方式的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑及本發(fā)明的第三方式的蛋白酶抑制劑混合物能夠非常有效地抑制胰液、十二指腸等含有胰液成分的生物試樣中含有的蛋白酶。因此,使用該蛋白酶抑制劑的本發(fā)明的第一方式的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,可以有效抑制含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的活性。因此,通過該抑制方法,可以抑制來自胰液的成分的分解等,可以穩(wěn)定地保存含有胰液成分的生物試樣。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1是表示PMSF、AEBSF及p-APMSF的化學(xué)式的圖。
[0041]圖2是表示在實(shí)施例1中由各胰酶溶液測定的熒光量的圖。[0042]圖3是表示在實(shí)施例2中各試樣溶液的S100P的測定結(jié)果的圖。
[0043]圖4是表示在實(shí)施例3中由各試樣溶液測定的熒光量的圖。
[0044]圖5是表示在實(shí)施例4中由各試樣溶液測定的熒光量的圖。
[0045]圖6是表示在實(shí)施例5中由各試樣溶液測定的熒光量的圖。
[0046]圖7是表示在實(shí)施例5中由各試樣溶液測定的熒光量的圖。
[0047]圖8是表示在實(shí)施例6中各試樣溶液的蛋白酶活性(相對值:%)的結(jié)果的圖。
[0048]圖9是表示在實(shí)施例7中添加了 PMSF的各試樣溶液的蛋白酶活性(相對值:%)的結(jié)果的圖。
[0049]圖10是表示在實(shí)施例7中添加了 AEBSF的各試樣溶液的蛋白酶活性(相對值:%)的結(jié)果的圖。
[0050]圖11是表示在實(shí)施例7中添加了 P-APMSF各的試樣溶液的蛋白酶活性(相對值:%)的結(jié)果的圖。
[0051]圖12是表示在實(shí)施例8中由添加了 I種蛋白酶抑制劑的各試樣溶液測定的熒光量的圖。
[0052]圖13是表示在實(shí)施例8中由添加了 2種蛋白酶抑制劑的各試樣溶液測定的熒光量的圖。
[0053]圖14是表示在實(shí)施例9中由添加了各種蛋白酶抑制劑的各試樣溶液測定的熒光量的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0054]胰液是指從胰管排出的體液。在本發(fā)明及本申請說明書中,所謂的含有胰液成分的生物試樣是指含有包含來自胰液的成分的體液的試樣。作為含有來自胰液的成分的體液,可以列舉通過導(dǎo)管直接從胰腺采集到的胰液、在十二指腸采集到的液體(十二指腸液)等。在十二指腸液中,除了含有胰液,還含有同樣地從乳頭部排出的膽汁、原本就存在于十二指腸的液體、血液等。關(guān)于胰液、十二指腸液,可以通過常用方法進(jìn)行采集。
[0055]<含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑>
[0056]本發(fā)明的第二方式的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑(以下,有時稱作“本發(fā)明的蛋白酶抑制劑”),其特征在于,其是具有氟磺酰基的化合物,具有蛋白酶抑制活性且為了抑制該生物試樣中的蛋白酶而被添加到含有胰液成分的生物試樣中。
[0057]本發(fā)明的蛋白酶抑制劑只要是具有氟磺?;揖哂械鞍酌敢种苹钚缘幕衔锞蜎]有特別的限制,但是優(yōu)選具有氟磺?;苯踊蛲ㄟ^碳原子數(shù)為I~6的烴基鍵合在苯環(huán)上的結(jié)構(gòu)的化合物,優(yōu)選為PMSF (苯甲基磺酰氟),AEBSF (4- (2-氨乙基)-苯磺酰氟)),P-APMSF (對脒基苯基甲磺酰氟鹽酸鹽),4-(氟磺酰)苯甲酸(CAS號:455-26-5)、3-(氟磺酰)苯甲酸(CAS號:454-95-5)、2_氨基苯磺酰氟(CAS號:392_86-9)、3_氨基苯磺酰氟(CAS號:368-50-3)、4_氨基苯磺酰氟(CAS號:98-62_4)、2-硝基苯磺酰氟(CAS號:433-98-7)、3-硝基苯磺酰氟(CAS號:349-78-0)或4-硝基苯磺酰氟(CAS號:349_96_2),更優(yōu)選為PMSF、AEBSF或p-APMSF。PMSF、AEBSF及p-APMSF的化學(xué)式如圖1所示。圖1中被虛線包圍的官能團(tuán)是氟磺?;?。
[0058]本發(fā)明的蛋白酶抑制劑也可以作為由多種蛋白酶抑制劑組成的混合物中的有效成分之一。作為蛋白酶抑制劑混合物,可以是僅由本發(fā)明的蛋白酶抑制劑組成的物質(zhì),也可以是I種或2種以上的本發(fā)明的蛋白酶抑制劑與其他的蛋白酶抑制劑的混合物。作為其他的蛋白酶抑制劑,只要是不損害本發(fā)明的蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制活性的物質(zhì)就沒有特別的限制,可以列舉例如抑肽酶、亮抑酶肽、抗蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制劑、彈性酶抑制劑(elastatinal)、抗凝血酶等肽系蛋白酶抑制劑,EDTA等螯合劑,彈性蛋白酶酶抑制劑(Elastase Inhibitor), TLCK, TPCK,膜蛋白酶抑制劑,Ecotin, E.coli 等。此外,也可以使用甲磺酸加貝酯(FOY)、甲磺酸卡莫司他(Foipan)、甲磺酸萘莫司他(Futhan)、烏司他丁等胰腺炎治療藥。
[0059]作為與本發(fā)明的蛋白酶抑制劑組合使用的其他蛋白酶抑制劑,優(yōu)選至少一種以上的具有磺?;牡鞍酌敢种苿鼉?yōu)選為氨基酸氯甲基酮類。作為該氨基酸氯甲基酮類,只要是具有蛋白酶抑制活性的物質(zhì)就沒有特別的限制,可以列舉TLCK (N-a-甲苯磺酰-L-賴氨酰氯甲基酮)、TPCK (N-a-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮)等。在本發(fā)明中,特別優(yōu)選選自由TLCK及TPCK組成的組中的I種以上物質(zhì),更優(yōu)選為TLCK。
[0060]作為包含以本發(fā)明的蛋白酶抑制劑為首的多種蛋白酶抑制劑的混合物,優(yōu)選含有2種以上的本發(fā)明的蛋白酶抑制劑,更優(yōu)選含有2種以上的本發(fā)明的蛋白酶抑制劑和至少I種具有磺酰基的蛋白酶抑制劑,進(jìn)而優(yōu)選含有2種以上的本發(fā)明的蛋白酶抑制劑和至少I種具有蛋白酶抑制活性的氨基酸氯甲基酮類,特別優(yōu)選含有選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的2種以上和選自由TLCK及TPCK組成的組中的I種以上。
[0061]<含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法>
[0062]本發(fā)明的第一方式的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法(以下,有時稱作“本發(fā)明的蛋白酶抑制方法”),其特征在于,通過在含有胰液成分的生物試樣中添加至少I種以上的具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿?即、本發(fā)明的蛋白酶抑制劑),抑制該生物試樣中的蛋白酶的酶活性。本發(fā)明的蛋白酶抑制劑與其他的蛋白酶抑制劑相比,對胰液、十二指腸液中含有的蛋白酶的抑制活性非常高。因此,通過在含有胰液成分的生物試樣中添加本發(fā)明的蛋白酶抑制劑,能夠簡便且`有效地抑制該生物試樣中的來自胰液、十二指腸液的蛋白酶引起的胰液成分的分解。
[0063]供于本發(fā)明的蛋白酶抑制方法的含有胰液成分的生物試樣,只要是含有包含來自胰液的成分的體液的試樣就可以。例如,可以是僅由含有來自胰液成分的體液組成的物質(zhì),也可以是以適當(dāng)緩沖液等對該體液進(jìn)行稀釋后的液體,也可以是在該體液或其稀釋液中添加了各種添加劑的物質(zhì)。作為添加劑,可以列舉表面活性劑、核酸酶抑制劑、pH調(diào)整劑、pH指示劑等。作為供于本發(fā)明的蛋白酶抑制方法的含有胰液成分的生物試樣,優(yōu)選為含有胰液、十二指腸液的試樣。具體而言,可以列舉胰液、十二指腸液、胰液或十二指腸液的稀釋液、或在這些液體中添加了前述各種添加劑的液體等。
[0064]在本發(fā)明的蛋白酶抑制方法中,可以在從生物體采集后被保存等的含有胰液成分的生物試樣中添加本發(fā)明的蛋白酶抑制劑,但是優(yōu)選從生物體采集含有胰液成分的體液時到添加本發(fā)明的蛋白酶抑制劑時的間隔短,特別優(yōu)選在剛從生物體采集后的胰液或十二指腸液中添加本發(fā)明的蛋白酶抑制劑。
[0065]作為胰液中含有的蛋白酶,有絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、羧肽酶等各種物質(zhì)。因此,在此前被用于胰液等的蛋白酶抑制劑中,僅僅添加I種的場合得到的蛋白酶抑制效果非常有限,即使將多種蛋白酶抑制劑進(jìn)行組合的場合也沒有得到充分的蛋白酶抑制效果的報(bào)告。與此相反,作為本發(fā)明的蛋白酶抑制劑,即使僅使用I種的場合,通過適當(dāng)?shù)卣{(diào)整添加量也能得到充分的蛋白酶抑制效果。
[0066]在本發(fā)明的蛋白酶抑制方法中使用的本發(fā)明的蛋白酶抑制劑,即使只有I種也能充分發(fā)揮蛋白酶抑制活性,但是優(yōu)選將2種以上進(jìn)行組合使用。此外,也可以與本發(fā)明的蛋白酶抑制劑組合使用I種或2種以上的其他蛋白酶抑制劑。作為本發(fā)明的蛋白酶抑制方法中使用的本發(fā)明的蛋白酶抑制劑,優(yōu)選至少含有選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的一種以上物質(zhì),更優(yōu)選組合含有選自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的2種以上。由于胰液中含有活性不同的各種蛋白酶,因此通過混合使用多種蛋白酶抑制劑,可以期待更有效地抑制生物試樣中的蛋白酶活性。進(jìn)而,可以期待與單獨(dú)使用的場合相比,以低濃度組合來抑制蛋白酶活性。
[0067]被添加到含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶抑制劑的量,只要是通過該蛋白酶抑制劑能夠發(fā)揮蛋白酶抑制效果的量就沒有特別的限制,可以考慮含有胰液成分的生物試樣的種類、使用的蛋白酶抑制劑的種類等,進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。例如,在含有胰液成分的生物試樣中,作為蛋白酶抑制劑僅添加PMSF的場合,可以按照最終濃度為ImM以上,優(yōu)選為5mM以上,更優(yōu)選為IOmM以上的方式進(jìn)行添加。此外,作為蛋白酶抑制劑僅使用AEBSF的場合,可以按照最終濃度為4mM以上,優(yōu)選為IOmM以上,更優(yōu)選為20mM以上的方式在含有胰液成分的生物試樣中添加AEBSF。作為蛋白酶抑制劑僅使用p-APMSF的場合,可以按照最終濃度為2mM以上,優(yōu)選為5mM以上,更優(yōu)選為IOmM以上的方式在含有胰液成分的生物試樣中添加 p-APMSF。
[0068]此外,作為與至少一種以上的具有氟磺酰基的蛋白酶抑制劑(本發(fā)明的蛋白酶抑制劑)組合使用的其 他蛋白酶抑制劑僅添加TLCK的場合,可以按照最終濃度為0.1mM以上、優(yōu)選為ImM以上、更優(yōu)選為5mM以上、進(jìn)而優(yōu)選為IOmM以上的方式進(jìn)行添加。此外,作為該其他蛋白酶抑制劑僅添加TPCK的場合,可以按照最終濃度為0.1mM以上,優(yōu)選為ImM以上,更優(yōu)選為5mM以上,進(jìn)而優(yōu)選為IOmM以上的方式進(jìn)行添加。
[0069]在本發(fā)明的蛋白酶抑制方法中,被添加到含有胰液成分的生物試樣中的本發(fā)明的蛋白酶抑制劑及其他蛋白酶抑制劑,可以是粉末狀、顆粒狀等的固體狀,也可以是使其溶解到合適的緩沖液等中的蛋白酶抑制劑溶液。此外,本發(fā)明的蛋白酶抑制劑和其他蛋白酶抑制劑,可以同時添加到含有胰液成分的生物試樣中,也可以先添加其中之一,然后再添加其他的。從能夠?qū)ι镌嚇又械牡鞍酌赋浞职l(fā)揮抑制效果的觀點(diǎn)出發(fā),優(yōu)選將具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿┖颓笆銎渌鞍酌敢种苿┩瑫r進(jìn)行添加。
[0070]通過在含有胰液成分的生物試樣中添加本發(fā)明的蛋白酶抑制劑,由于該生物試樣中含有的蛋白酶的活性被有效地抑制,因此可以顯著抑制該生物試樣中含有的胰液成分的分解/變性等。因此,作為蛋白酶被本發(fā)明的蛋白酶抑制方法抑制的含有胰液成分的生物試樣,對來自胰液成分的生物體成分可以更穩(wěn)定地保存。此外,通過對蛋白酶被本發(fā)明的蛋白酶抑制方法抑制的含有胰液成分的生物試樣進(jìn)行胰液成分解析,可以提高解析精度,得到可靠性高的結(jié)果。
[0071 ] 作為蛋白酶被本發(fā)明的蛋白酶抑制方法抑制的含有胰液成分的生物試樣,可以與其他生物試樣一樣,作為用于各種檢查的測定試樣。作為檢查對象的物質(zhì),只要是預(yù)期胰液或十二指腸液中含有的生物體成分就沒有特別的限制,可以是蛋白質(zhì),也可以是DNA、RNA等核酸,還可以是細(xì)胞。例如,該生物試樣可以在應(yīng)用ELISA、免疫層析、雙向電泳、免疫印跡法、質(zhì)譜分析法等的各種蛋白質(zhì)分析中和在應(yīng)用PCR、RT-PCR、用探針的雜交等的各種核酸解析中,在細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞診斷這樣的細(xì)胞解析等中使用。
[0072]<含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒>
[0073]本發(fā)明的第四方式的含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒(以下,有時稱作“本發(fā)明的保存用試劑盒”),含有至少一種以上的具有氟磺酰基的蛋白酶抑制劑(即、本發(fā)明的蛋白酶抑制劑),被用于保存含有胰液成分的生物試樣。通過使用該試劑盒,可以更簡便地抑制含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶。本發(fā)明的保存用試劑盒中含有的本發(fā)明的蛋白酶抑制劑,可以只是一種,也可以是2種以上的組合。此外,作為該試劑盒,進(jìn)而優(yōu)選含有至少I種以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制劑,更優(yōu)選含有至少一種以上的具有蛋白酶抑制活性的氨基酸氯甲基酮類。
[0074]此外,作為本發(fā)明的保存用試劑盒中含有的本發(fā)明的蛋白酶抑制劑,可以是冷凍干燥粉末,也可以是將冷凍干燥粉末與合適的賦形劑等一起成型的片劑或顆粒劑等,也可以是使其溶解到適當(dāng)?shù)木彌_液中的蛋白酶抑制劑溶液。
[0075]本發(fā)明的保存用試劑盒,進(jìn)而,也可以含有用于將采集到的體液進(jìn)行稀釋的緩沖液、其他蛋白酶抑制劑、表面活性劑、PH調(diào)整劑、pH指示劑等。作為表面活性劑、pH調(diào)整劑、PH指示劑等各種添加劑,可以使其預(yù)先溶解到稀釋用的緩沖液中。
[0076]另外,作為本發(fā)明的保存用試劑盒,也可以含有能夠與該容器的開口部結(jié)合的蓋子,所述蓋子能夠從填充 有該含有胰液成分的試樣的容器中滴加一定量的所調(diào)制的含有胰液成分的試樣(在含有胰液成分的生物試樣中添加本發(fā)明的保存用試劑盒中所含有的各種蛋白酶抑制劑,并根據(jù)需要添加其他成分而成的試樣)。
[0077]作為本發(fā)明的保存用試劑盒,進(jìn)而,也可以含有具備用于儲存采集自生物體的胰液或十二指腸液等的體液的儲存部的保存用容器。這種場合,本發(fā)明的蛋白酶抑制劑及其他蛋白酶抑制劑優(yōu)選預(yù)先包含在該儲存部。在該保存用容器上刻有刻度的場合,可以對被添加到該保存容器的生物試樣的量(在該保存容器內(nèi)預(yù)先填充蛋白酶抑制劑的場合,生物試樣和蛋白酶抑制劑的總量)進(jìn)行目視確認(rèn),甚至可以一眼了解蛋白酶抑制劑的最終濃度。
[0078]此外,含有胰液成分的生物試樣,一般經(jīng)內(nèi)窺鏡進(jìn)行采集。因此,作為本發(fā)明的保存用試劑盒的組成品,也包含經(jīng)內(nèi)窺鏡采集含有胰液成分的生物試樣的采集器具。作為該采集器具,例如包括:在可以插入到內(nèi)窺鏡裝置的導(dǎo)管上組裝了注射器的器具、前端配置有可以插入到內(nèi)窺鏡裝置的吸收體的探針等。作為可以插入到內(nèi)窺鏡裝置的導(dǎo)管,可以列舉例如:日本特開2011-5009號公報(bào)記載的標(biāo)本采集管等。作為這些采集器具,優(yōu)選具有預(yù)先分注了前述蛋白酶抑制劑的儲存部。
[0079][實(shí)施例]
[0080]接下來示出實(shí)施例等對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明,但是本發(fā)明不限于以下的實(shí)施例。
[0081][實(shí)施例1]
[0082]為了調(diào)查對胰液而言效果最好的蛋白酶抑制劑,從市售的8種蛋白酶抑制劑混合物中搜索對胰液的抑制效果最好的蛋白酶抑制劑混合物。使用的蛋白酶抑制劑混合物為:complete (Roche 公司產(chǎn)品)(抑制劑混合物 I)、Halt Pr otease Inhibitor Cocktail(Thermo 公司產(chǎn)品)(抑制劑混合物 2)、Protease In hibitor Cocktail (SIGMA 公司產(chǎn)品)(抑制劑混合物3)、Protease Inhibitor Mix (GE公司產(chǎn)品)(抑制劑混合物4)、ProteaseInhibitor Cocktail set I (M ERCK 公司產(chǎn)品)(抑制劑混合物 5)、Protease InhibitorCocktail set IKME RCK公司產(chǎn)品)(抑制劑混合物6)、Protease Inhibitor Cocktail setIII (ME RCK 公司產(chǎn)品)(抑制劑混合物 7)、及 Protease Inhibitor Cocktail (BioVision公司產(chǎn)品)(抑制劑混合物8)。
[0083]使用胰酶以活化狀態(tài)存在的、由豬胰腺制得的作為消化酶劑的“胰酶”作為模擬人工胰液,按照最終濃度為制造方的推薦濃度(IX)或推薦濃度的5倍濃度(5X)的方式添加各種蛋白酶抑制劑混合物后,測定了蛋白酶的活性。關(guān)于蛋白酶活性,使用EnzCheckProtease Assay Kits (Molecular Probes公司產(chǎn)品)進(jìn)行測定。具體而言,在添加了各種蛋白酶抑制劑混合物的胰液溶液中添加試劑盒中附帶的熒光標(biāo)識過的酪蛋白,在37°C下孵育2小時后,以Ex/Em = 485/535nm的熒光波長測定熒光量。此外,作為對照,對在胰酶中直接添加進(jìn)行過熒光標(biāo)識的酪蛋白的試樣溶液(無抑制劑、無DMS0)、在胰酶中按照達(dá)到與使各種蛋白酶抑制劑混合物為制造方推薦濃度(IX)而添加的場合同樣的DMSO添加量的方式添加DMSO的試樣溶液(無抑制劑、DMS01X),及在胰酶中按照達(dá)到與使各種蛋白酶抑制劑混合物為制造方推薦濃度(5X )而添加的場合同樣的DMSO添加量的方式添加DMSO的試樣溶液(無抑制劑、DMS05X),同樣地測定了蛋白酶活性。
[0084]各種胰酶溶液的熒光量的測定結(jié)果如圖2所示??v軸的熒光量表示分解的酪蛋白的量,將該值粗略算作蛋白酶活性的值。根據(jù)這些結(jié)果,發(fā)現(xiàn)抑制劑混合物4 (GE公司的Protease Inhibitor Mix)的抑制效果最好。
[0085][實(shí)施例2]
[0086]關(guān)于通過抑制蛋白酶活性對胰液中的蛋白質(zhì)的保存穩(wěn)定性產(chǎn)生怎樣的影響進(jìn)行了研究。調(diào)查了在混合有通常存在于胰液中的SlOOP(鈣結(jié)合蛋白)和胰酶(模擬胰液)的溶液中,SlOOP在添加蛋白酶抑制劑的場合和無添加的場合能夠以怎樣的程度被保存。
[0087]具體而言,首先調(diào)制25ng/mL的SlOOP (標(biāo)準(zhǔn)品)溶液(試樣溶液I)、含有25ng/mL的SlOOP (標(biāo)準(zhǔn)品)及l(fā)mg/mL的胰酶的溶液(試樣溶液2)、含有25ng/mL的SlOOP (標(biāo)準(zhǔn)品)及l(fā)mg/mL的胰酶并且含有推薦濃度的2倍濃度(2X )的Protease Inhibitor Mix (GE公司產(chǎn)品)的溶液(試樣溶液3)、含有25ng/mL的SlOOP (標(biāo)準(zhǔn)品)及l(fā)mg/mL的胰酶并且含有推薦濃度的5倍濃度(5X )的complete (Roche公司產(chǎn)品)的溶液(試樣溶液4)。各種試樣溶液應(yīng)用Circu Lex SlOOP ELISA Kit (Cyclex公司產(chǎn)品、目錄編號:CY_8060)附帶的緩沖液進(jìn)行調(diào)制。通過將這些試樣溶液在25°C下進(jìn)行16小時的孵育使其反應(yīng)。然后,對使用Circu Lex SlOOP ELISA Kit (Cyclex公司產(chǎn)品、目錄編號:CY_8060)附帶的緩沖液將各試樣溶液進(jìn)行10倍稀釋而成的稀釋液,使用CircuLex SlOOP ELISA Kit檢測S100P。
[0088]各試樣溶液中的SlOOP的測定結(jié)果如圖3所示。結(jié)果,與未添加蛋白酶抑制劑混合物的試樣溶液2相比,添加了蛋白酶抑制劑混合物的試樣溶液3及4殘留的S100P的量多。此外,添加了比試樣溶液3中添加的蛋白酶抑制劑混合物具有更高蛋白酶抑制活性的蛋白酶抑制劑混合物(參照實(shí)施例1。)的試樣溶液4,其殘留的S100P的量比試樣溶液3更多。根據(jù)這些結(jié)果可知,通過在胰液中添加蛋白酶抑制劑,可以抑制胰液中的蛋白質(zhì)的分解,更穩(wěn)定地進(jìn)行保存。此外,這也暗示蛋白酶活性與SlOOP的檢測濃度存在相關(guān)性。
[0089][實(shí)施例3]
[0090]研究了實(shí)施例1中的蛋白酶抑制活性最高的抑制劑混合物中含有的各種蛋白酶抑制劑中,對于胰液的蛋白酶而言哪種蛋白酶抑制劑具有最高的抑制活性。
[0091]Protease Inhibitor Mix(GE公司產(chǎn)品)中含有的絲氨酸蛋白酶抑制劑有抑肽酶、亮抑酶肽、PMSF, AEBSF4種(濃度非公開)。因此,按照使最終濃度為各蛋白酶抑制劑單劑的推薦最大濃度的方式進(jìn)行調(diào)制,對4種抑制劑的組合共15種,與實(shí)施例1同樣地使用胰酶及2種胰液被檢體對蛋白酶活性進(jìn)行測定。各試樣溶液中添加的蛋白酶抑制劑如表1所示。另外,推薦最大濃度如下:抑肽酶(Roche公司產(chǎn)品)為0.3 μ M、亮抑酶肽(Roche公司產(chǎn)品)為50yM、PMSF (Roche公司產(chǎn)品)為lmM、AEBSF (Roche公司產(chǎn)品)為4mM。此外,同樣地對未添加蛋白酶抑制劑的試樣溶液(對照試樣溶液I)、含有推薦濃度的抑制劑混合物I(Roche公司的complete)的試樣溶液(對照試樣溶液2)、含有推薦濃度的5倍濃度(5X )的抑制劑混合物I的試樣溶液(對照試樣溶液3)、含有推薦濃度的抑制劑混合物4 (GE公司產(chǎn)品Protease Inhibitor Mix)的試樣溶液(對照試樣溶液4)及含有推薦濃度的5倍濃度(5X )的抑制劑混合物4的試樣溶液(對照試樣溶液5)的蛋白酶活性進(jìn)行測定。
[0092]表1
[0093]
【權(quán)利要求】
1.一種含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,其通過在含有胰液成分的生物試樣中添加至少I種以上的具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿?,從而對該生物試樣中的蛋白酶的酶活性進(jìn)行抑制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,所述具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿檫x自由PMSF、AEBSF, p_APMSF、4_(氟磺酰)苯甲酸、3-(氟磺酰)苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟及4-硝基苯磺酰氟組成的組中的I種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,所述具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿檫x自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的I種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,所述具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿檫x自由PMSF、AEBSF及p-APMSF組成的組中的2種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4的任一項(xiàng)所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,按照PMSF的最終濃度為ImM以上、AEBSF的最終濃度為4mM以上、或p-APMSF的最終濃度為2mM以上的方式,在所述生物試樣中添加PMSF、AEBSF或p-APMSF。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5的任一項(xiàng)所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,在所述生物試樣中進(jìn)而添加至少I種以上的具有磺酰基的蛋白酶抑制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,所述具有磺酰基的蛋白酶抑制劑為氨基酸氯甲基酮類。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,所述具有磺?;牡鞍酌敢种苿檫x自由TLCK及TPCK組成的組中的I種以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含有胰液`成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,所述具有磺?;牡鞍酌敢种苿門LCK。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9的任一項(xiàng)所述的含有胰液成分的生物試樣中的蛋白酶的抑制方法,所述生物試樣為胰液或十二指腸液。
11.一種含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑,其是具有氟磺?;幕衔?,具有蛋白酶抑制活性且為了抑制該生物試樣中的蛋白酶而被添加在含有胰液成分的生物試樣中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑,其是選自由PMSF、AEBSF、p-APMSF、4-(氟磺酰)苯甲酸、3-(氟磺酰)苯甲酸、2-氨基苯磺酰氟、3-氨基苯磺酰氟、4-氨基苯磺酰氟、2-硝基苯磺酰氟、3-硝基苯磺酰氟及4-硝基苯磺酰氟組成的組中的化合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的含有胰液成分的生物試樣用蛋白酶抑制劑,其是選自由PMSF, AEBSF及p-APMSF組成的組中的化合物。
14.一種蛋白酶抑制劑混合物,其含有至少I種以上的權(quán)利要求11~13中任一項(xiàng)所述生物試樣用蛋白酶抑制劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的蛋白酶抑制劑混合物,其進(jìn)而含有至少I種以上的具有磺?;牡鞍酌敢种苿?。
16.一種含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒,其含有至少I種以上的具有磺?;牡鞍酌敢种苿挥糜诒4婧幸纫撼煞值纳镌嚇?。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒,其進(jìn)而含有至少I種以上的具有磺?;牡鞍酌敢种苿?br>
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的含有胰液成分的生物試樣的保存用試劑盒,其進(jìn)而含有具備用于儲存所采集的 體液的儲存部的保存用容器, 在所述儲存部預(yù)先包含所述具有氟磺?;牡鞍酌敢种苿?。
【文檔編號】C07C309/88GK103781904SQ201280043967
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年6月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月13日
【發(fā)明者】片岡理惠, 中田真理, 守屋奈緒 申請人:奧林巴斯株式會社