具有增強(qiáng)的作用持續(xù)時間和降低的免疫原性的工程改造的多肽的制作方法
【專利摘要】提供具有特別良好的作用持續(xù)時間、高效能和/或方便的給藥方案(包括口服給藥)以及降低的免疫原性的化合物。所述化合物是工程改造的多肽，其包含白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一種或多種生物活性多肽的組合。還提供治療疾病和病癥的藥物組合物和方法，所述疾病和病癥包括肥胖和超重、糖尿病、血脂障礙、高血脂、阿爾茨海默氏病、脂肪肝病、短腸綜合征、帕金森病和心血管病。
【專利說明】具有增強(qiáng)的作用持續(xù)時間和降低的免疫原性的工程改造的 多肽
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求提交于2011年7月8日的USSN 61/505982和提交于2012年1月11日的 USSN 61/585577的優(yōu)先權(quán)，這兩者通過引用予以結(jié)合用于所有目的。
[0002] 序列表 本申請包含序列表，其通過EFS-Web以ASCII格式提交，并通過引用以其整體予以結(jié) 合。所述ASCII副本創(chuàng)建于2012年6月22日，命名為0263W01.txt，大小為366, 392字節(jié)。
[0003] 發(fā)明背景 本申請涉及具有良好的作用持續(xù)時間、高效能和/或方便的給藥方案（包括口服給藥） 的化合物以及其使用方法。本文提供了工程改造的多肽，其包含白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域與生物 活性肽的組合。不希望被任何理論所束縛，認(rèn)為因為本文所述的工程改造的多肽可結(jié)合白 蛋白，因此當(dāng)在循環(huán)時所述化合物可被螯合（例如，結(jié)合到白蛋白），由于例如腎清除率和/ 或降解減少而導(dǎo)致作用持續(xù)時間增力卩?？身槒乃鲋委煹募膊“ǚ逝趾统?、糖尿病、血 脂障礙、高血脂、短腸綜合征、阿爾茨海默氏病、脂肪肝病、帕金森病、心血管病和其它中樞 神經(jīng)系統(tǒng)病癥或其組合。
[0004] 仍有需要開發(fā)可用于上文所述代謝疾病、病況和病癥的多肽。因此，本發(fā)明的一個 目標(biāo)是提供可用于治療上述病況的具有延長半壽期的工程改造的多肽和制備及利用所述 多肽的方法。
[0005] 本文引用的每個專利、專利申請和出版物通過引用以其整體結(jié)合到本文中并用于 所有目的。
[0006] 發(fā)明簡述 提供了具有對白蛋白的結(jié)合親和力和另外治療效用的工程改造的多肽化合物。所述 化合物是工程改造的多肽，其包含能夠結(jié)合白蛋白的如本文所定義的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (ABD)多肽和激素結(jié)構(gòu)域（HD)多肽，所述HD多肽與ABD共價連接，可具有生物學(xué)活性并且 可誘發(fā)有益的生物學(xué)反應(yīng)。本文所述的ABD或HD多肽中的任一個可任選在工程改造的多 肽中通過接頭L (例如，如本文所述的LI)共價鍵合。不希望受任何理論的束縛，認(rèn)為因為 本文所述的工程改造的多肽可結(jié)合白蛋白，所述化合物可在受試者中被螯合，導(dǎo)致在受試 者中的作用持續(xù)時間增加。
[0007] 在第一方面，提供如本文所述的工程改造的多肽。所述工程改造的多肽包含如本 文所述的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽（ABD)和激素結(jié)構(gòu)域（HDl)。所述激素結(jié)構(gòu)域包含其為毒 蜥外泌肽、毒蜥外泌肽的片段或毒蜥外泌肽的類似物的多肽。
[0008] 在另一方面，提供用于在需要治療的受試者中治療疾病或病癥的方法。所述方法 包括將如本文所述的工程改造的多肽給予受試者。
[0009] 在仍另一方面，提供藥物組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合的本文所 述的工程改造的多肽化合物。
[0010] 在仍另一方面，提供編碼工程改造的多肽的多核苷酸和它們的中間體、帶有所述 多核苷酸的表達(dá)載體、表達(dá)所述多核苷酸的宿主細(xì)胞和用于它們表達(dá)、合成、翻譯后修飾和 分離的手段。
[0011] 本發(fā)明的一個優(yōu)勢是所述工程改造的多肽可完全通過重組方法合成，避免了復(fù)雜 的或額外的合成步驟或化學(xué)步驟和相關(guān)的反應(yīng)試劑和催化劑。因此，與具有延長的作用持 續(xù)時間的化學(xué)來源的化合物相比，本發(fā)明的多肽可以低得多的成本合成。除了長的作用持 續(xù)時間（例如，在人受試者中至少1周，盡管如果需要的化，每日一次也可實現(xiàn)）以外，另一 優(yōu)勢是它們相對小的尺寸，這可允許口服遞送以提高患者順應(yīng)性。
[0012] 本文所公開的化合物在小鼠中在0GTTD0A (針對作用持續(xù)時間的口服葡萄糖耐量 試驗）測試中顯示至少24小時以及甚至更長至兩天的令人驚訝的功效（在人中其轉(zhuǎn)變?yōu)?5-7天或更長）、穩(wěn)健的血糖控制、體重減輕、食物攝取和體重的劑量依賴性減少。在大鼠 中，單次給予時化合物暴露持續(xù)4-7天，在人中其轉(zhuǎn)變?yōu)橹辽僖恢?次暴露?；衔镌谘獫{ 中以及對血漿蛋白酶穩(wěn)定，當(dāng)與血清白蛋白結(jié)合時有活性，并且可在體內(nèi)提供類似于或大 于毒蜥外泌肽-4的最大功效。甚至更令人驚訝的是，所述化合物適合于口服遞送。
[0013] 附圖簡述 圖1是可用于本文公開的工程改造的多肽的白蛋白結(jié)合多肽（SEQ ID N0:301-452、SEQ ID N0:455-461)、通過N-端甘氨酸殘基而延長的來自鏈球菌菌株G148的蛋白G的GA3結(jié) 構(gòu)域（SEQ ID NO:453)和先前由 Jonsson 等（Protein Eng. Design & Selection, 2008， 21:515-527)所述的源自G148-GA3的白蛋白結(jié)合多肽（SEQ ID N0:454)的實例的氨基酸序 列列表。
[0014] 圖2顯示在Biacore儀器上進(jìn)行的結(jié)合分析的結(jié)果，用于研究白蛋白結(jié)合多肽 PEP07912 (SEQ ID NO: 457)與人血清白蛋白的結(jié)合。將三個不同濃度的純化蛋白（40 nM， 粗灰線；10 nM，黑線；2.5 nM，灰線）注入到具有955 RU的固定人血清白蛋白的表面上。
[0015] 圖3A-C顯示通過ELISA進(jìn)行的結(jié)合分析的結(jié)果，其用于研究白蛋白結(jié)合多肽 PEP07913 (SEQ ID NO:453), PEP06923 (SEQ ID NO:454), PEP07271 (SEQ ID N0:455), PEP07912 (SEQ ID NO:457), PEP07554 (SEQ ID NO:456), PEP07914 (SEQ ID N0:458), PEP〇7968 (S卩，與PEPO79Il (SEQ ID NOM59)綴合的D0TA)和PEP〇7844 (SEQ ID N0:46l) 與存在于126份單獨的正常人血清中的IgG分子的結(jié)合，其中A)顯示平均OD值，B)顯示陰 性血清的百分比（由OD〈0. 15定義），和C)顯示陽性血清的百分比（由OD >1. 0定義）。
[0016] 圖4A-C為顯示在CD3+ CD4+細(xì)胞增殖測定法中白蛋白結(jié)合多肽PEP07913 (SEQ ID N0:453)、PEP07912 (SEQ ID N0:457)、PEP07914 (SEQ ID N0:458)和 PEP07968 (即， 與PEP07911 (SEQ ID N0:459)綴合的D0TA)的免疫原性評估的圖示。A)顯示，在52個高 加索人供體中，與重組人白蛋白比較，響應(yīng)所述白蛋白結(jié)合多肽的個體的數(shù)量。B)顯示與含 有重組人白蛋白的陰性對照相比，PEP07913、PEP07912、PEP07914和PEP07968的平均刺激 指數(shù)（SI)。C)顯示與緩沖液對照相比，對研究中所有蛋白有響應(yīng)的個體的數(shù)量。
[0017] 圖5A-5C。給予四周后，白蛋白結(jié)合的工程改造的多肽在ob/ob小鼠中的作用。 圖5A :與以7. 2或100納摩爾/kg/天持續(xù)輸注（CSI)毒蜥外泌肽-4比較，在以25或250 nmol/kg每周兩次注射Cmpd 088后在指定天時HbAlc (血紅蛋白Alc)的改變。圖5B :在 如圖5A所述的劑量后血糖的改變。圖5C :在如圖5A所述的劑量后體重的改變。* p〈0. 5 vs.溶媒對照；Anova, Dunnett ' s 檢驗。
[0018] 圖6A-6C。在正常的Harlan Sprague-Dawley (HSD)大鼠中給予的不例性工程改 造的多肽Cmpd 11的藥代動力學(xué)（PK)概況和生物學(xué)活性。圖6A顯示化合物對減少食物攝 取的影響。圖6B顯示化合物對減少體重的影響。圖6C顯示單次劑量后化合物的PK概況。 在圖中，溶媒是實心正方形，工程改造的多肽是空心倒三角形。
[0019] 圖7A-7C。在正常的Harlan Sprague-Dawley (HSD)大鼠中給予的示例性工程改 造的多肽Cmpd 9的藥代動力學(xué)（PK)概況和生物學(xué)活性。圖7A顯示化合物對減少食物攝 取的影響。圖7B顯示化合物對減少體重的影響。圖7C顯示單次劑量后化合物的PK概況。 在圖中，溶媒是實心正方形，工程改造的多肽是實心三角形。
[0020] 圖 8A-8C。圖 8A-8C 顯示，在正常的 Harlan Sprague-Dawley (HSD)大鼠中，與靜 脈內(nèi)給予的未綴合的毒蜥外泌肽類似物相比，示例性工程改造的多肽Cmpd 11的藥代動力 學(xué)（PK)概況和生物學(xué)活性。圖8A顯示化合物對減少食物攝取的影響。圖8B顯示化合物 對減少體重的影響。圖8C顯示單次靜脈內(nèi)劑量后示例性化合物的PK概況。結(jié)果以皮摩爾 血漿水平顯示。圖例：溶媒（菱形）；以2 nmol/kg IV的[14Leu]毒蜥外泌肽-4 (框）；以 2 nmol/kg IV的毒蜥外泌肽-4 (圓形）；以2 nmol/kg IV的Cmpd 11 (空心三角形和實 心三角形）。
[0021] 圖9A-9F。圖9A-9F顯示每日一次或每周兩次經(jīng)亞長期給予的示例性工程改造的 多肽Cmpd 11的藥代動力學(xué)（PK)概況和生物學(xué)活性。如向下箭頭指示的每周兩次（BIW; 空心倒三角形）或每日一次（QD ;空心正方形）經(jīng)14天以25 nmol/kg皮下給予Cmpd 11， 并與溶媒比較（實心圓形）。圖9A顯示累積的食物攝取。圖9B顯示每日食物攝取的百分 比變化。圖9C顯示累積的食物攝取的百分比變化。圖9D顯示總體重。圖9E顯示體重的 百分比變化。圖9F顯示BIW或QD給予的Cmpd 11的PK概況。
[0022] 圖10。該圖顯示，與未綴合的毒蜥外泌肽類似物相比，多肽（Cmpd 088)在口服遞 送后對較低血糖的生物學(xué)活性時間進(jìn)程。參見實施例。平均治療前葡萄糖：約623 mg/dL。 圖例：溶媒（實心正方形）；毒蜥外泌肽-4類似物（空心框）；Cmpd 088 (菱形）。
[0023] 發(fā)明詳述 I.定義 "肥胖"和"超重"是指體重大于正常預(yù)期的哺乳動物，并且可通過例如身體外觀、本領(lǐng) 域已知的體重指數(shù)（BMI)、腰臀圍比率、皮褶厚度、腰圍等確定。疾病控制與預(yù)防中心（CDC) 將超重定義為具有25-29. 9 BMI的成人；并將肥胖定義為具有30或更高BMI的成人。存在 確定肥胖的其他測定法。例如，CDC規(guī)定腰臀圍比率大于I. 0的人為超重。
[0024] "瘦體重"是指身體的無脂肪質(zhì)量，即總體重減去身體脂肪重量為瘦體重。瘦 體重可通過例如本領(lǐng)域已知的流體靜力學(xué)稱重（hydrostatic weighing)、計算機(jī)化室 (computerized chamber)、雙能X-射線吸收測定法、皮膚測徑器、磁共振成像（MRI)和生物 電阻抗分析（BIA)等方法測量。
[0025] "哺乳動物"是指通常具有毛皮或毛發(fā)的溫血動物，其活胎產(chǎn)后代并用乳喂養(yǎng)其后 代。哺乳動物包括人類、伴侶動物（例如狗、貓）、農(nóng)畜（例如奶牛、馬、綿羊、豬、山羊）、野 生動物等。在一個實施方案中，所述哺乳動物為雌性。在一個實施方案中，所述哺乳動物為 女人。在一個實施方案中，所述哺乳動物為貓或狗。在一個實施方案中，所述哺乳動物是糖 尿病哺乳動物，例如具有2型糖尿病的人類。在一個實施方案中，所述哺乳動物是肥胖型糖 尿病哺乳動物，例如具有2型糖尿病的肥胖哺乳動物。在本文所述方法的背景下，術(shù)語"受 試者"是指哺乳動物。
[0026] 多肽背景下的"片段"在慣例的化學(xué)意義上在本文是指多肽的一部分。例如，片段 可由母體多肽N-端缺失或C-端缺失一個或多個殘基產(chǎn)生，和/或片段可由母體多肽內(nèi)部 缺失一個或多個殘基產(chǎn)生?？贵w背景下的"片段"是指抗體的一部分，其可與生物學(xué)活性分 子連接以調(diào)節(jié)在受試者內(nèi)的溶解性、分布等。例如，毒蜥外泌肽-4 (1-30)描述毒蜥外泌 肽-4的生物學(xué)活性片段，其中毒蜥外泌肽第31-39位氨基酸的C-端"尾"缺失。多肽背景 下的術(shù)語"母體"在慣例意義上是指作為修飾（例如插入、缺失和/或取代）前的參照結(jié)構(gòu) 的多肽。本文所述的工程改造的多肽背景下的術(shù)語"綴合物"是指組分多肽（例如ABD、HD1 等）之間的共價連接。本文所述的工程改造的多肽背景下的術(shù)語"融合物"是指組分多肽 (例如ABD、HD1等）之間通過肽骨架的末端氨基或羧基官能團(tuán)的任一個或兩者的共價連接。 工程改造的多肽可合成制備或重組制備。通常，融合物使用重組生物技術(shù)制備，然而還可通 過化學(xué)合成和綴合方法制備。
[0027] 多肽背景下本文所用的"類似物"是指相對于母體化合物，具有氨基酸的插入、缺 失和/或取代的化合物。多肽背景下本文所用的"類似物序列"是指相對于母體氨基酸序 列（例如野生型序列、天然序列），具有氨基酸的插入、缺失和/或取代的氨基酸序列。類 似物可具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、溶解性、功效、半壽期等。在一些實施方案中，類似物是與母體 化合物具有至少 50%、例如 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98% 或甚至更高 的序列同一性的化合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，類似物具有1-5個氨基酸修飾，所述 修飾獨立選自插入、缺失、添加和取代中的任一個或組合。在任一個本文的實施方案中，毒 蜥外泌肽類似物可具有1-5個氨基酸修飾，所述修飾獨立選自插入、缺失、添加和取代中的 任一個或組合，并且所述類似物優(yōu)選保留與母體化合物至少50%、例如50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性，并且甚至更優(yōu)選保留與母體化 合物至少80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性，并且母體化合物優(yōu)選是毒蜥外 泌肽-4、毒蜥外泌肽-4 (1-38)、毒蜥外泌肽-4 (1-37)、毒蜥外泌肽-4 (1-36)、毒蜥外泌 肽-4 (1-35)、毒蜥外泌肽-4 (1-34)、毒蜥外泌肽-4 (1-33)、毒蜥外泌肽-4 (1-32)、毒蜥 外泌膚-4 (1-31)、毒晰外泌膚-4 (1-30)、毒晰外泌膚-4 (1-29)、毒晰外泌膚-4 (1-28) 或它們的Leu-14取代對應(yīng)物，例如LeuH毒蜥外泌肽-4 (1-38)、LeuH毒蜥外泌肽-4 (1-38)、Leul4毒晰外泌膚-4 (1-37)、Leul4毒晰外泌膚-4 (1-36)、Leul4毒晰外泌膚-4 (1-35)、Leul4毒晰外泌膚-4 (1-34)、Leul4毒晰外泌膚-4 (1-33)、Leul4毒晰外泌膚-4 (1-32)、LeuH毒蜥外泌肽-4 (1-31)、LeuH毒蜥外泌肽-4 (1-30)、LeuH毒蜥外泌肽-4 (1-29)、Leul4毒蜥外泌肽-4 (1-28)，并且母體化合物最優(yōu)選具有毒蜥外泌肽-4或LeuH 毒蜥外泌肽-4的序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，毒蜥外泌肽類似物片段不是毒蜥外泌 肽-4 (1-28)或其氨基酸取代類似物例如LeuH毒蜥外泌肽-4 (1-28)。毒蜥外泌肽類似 物片段長度優(yōu)選為至少29個氨基酸。在一個實施方案中，至少對應(yīng)于毒蜥外泌肽-4的第 1、4、6、7和9位的氨基酸與天然毒蜥外泌肽-4的氨基酸相同，此外1-5個修飾是在除了毒 蜥外泌肽-4的第1、4、6、7和9位之外位置上的保守氨基酸取代。例如，在本文實施方案的 又一另外的實施方案中，毒蜥外泌肽類似物保留至少存在于毒蜥外泌肽-4的第3、4、6、5、 7、8、9、10、11、13、15、18、19、22、23、25、26和/或30位上的氨基酸，并且進(jìn)一步優(yōu)選剩余位 置中的不超過1-5個被另一氨基酸、最優(yōu)選化學(xué)保守氨基酸取代。在本文的所有類似物中， 在第1和/或2位上的任何取代或修飾將保留對DPP-IV切割的抵抗，同時保留或改進(jìn)促胰 島素活性，如本領(lǐng)域?qū)Χ掘嵬饷陔?4類似物例如脫氨基-組氨酰基-毒蜥外泌肽-4所已 知。按本領(lǐng)域的慣例，氨基酸取代背景下術(shù)語"保守的"是指保持電荷類型的性質(zhì)（例如陰 離子、陽離子、中性、極性等）、疏水性或親水性、體積（bulk)(例如范德華接觸等）和/或官 能性（例如羥基、胺、巰基等）的取代。術(shù)語"非-保守的"是指不是保守的氨基酸取代。 [0028] 在比較兩個或更多個核酸或多肽序列的背景下，"同一性"、"序列同一性"等是指 相同的或具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸（即，當(dāng)在比較窗或指定區(qū)域內(nèi)比較 和比對最大一致性時，在特定區(qū)域內(nèi)約50%同一性、優(yōu)選50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性）的兩個或更多個序列或 亞序列，如使用本領(lǐng)域已知的序列比較算法例如BLAST或BLAST 2. 0所測定。該定義包括具 有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列，以及天然存在的例如多態(tài)性或等位基因 變體和人工變體。在優(yōu)選的算法中，如本領(lǐng)域已知的，計算空位等。對于序列比較，通常一 個序列作為參照序列，測試序列與其比較。當(dāng)使用序列比較算法時，將測試和參照序列輸入 計算機(jī)，如果必要的話指定亞序列的坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選地，可使用默認(rèn) 程序參數(shù)，或者可指定備選參數(shù)。然后，基于程序參數(shù)，序列比較算法計算測試序列相對于 參照序列的百分比序列同一性。可例如通過Smith & Waterman, 1981，XoV.々7/?乂 2:482 的局部同源性算法，通過 Needleman & Wunsch, 1970，J 人 48:443 的同 源性比對算法，通過 Pearson & Lipman, 1988，/7TOC. TfeiV. JcatZ 5bi. 85:2444 的類似性檢索方法，通過這些算法（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison, Wis.中的 GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA) 的計算機(jī)化執(zhí)行，或通過人工比對和目測進(jìn)行序列比較的最優(yōu)比對。參見例如 i/? ifo/ecw/ar (Ausubel等編輯，1995年增刊）。適于確定百分比序列 同一性和序列類似性的算法的優(yōu)選實例包括BLAST和BLAST 2. 0算法，其描述于Altschul 等，1977，M/ci. JciifeTfes. 25:3389-3402 和 Altschul 等，1990，7； #〇乂 沿〇人 215:403-410。如本領(lǐng)域已知，使用BLAST和BLAST 2.0確定本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)的百 分比序列一致性。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件是通過國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information)的網(wǎng)站公開可得的。該算法包括首先通過鑒定 查詢序列中長度W的短的字碼（word)來確定高得分序列對（HSP)，所述查詢序列當(dāng)與數(shù)據(jù) 庫序列中相同長度的字碼進(jìn)行比對時，匹配或滿足某一正值閾值得分T。將T稱為鄰近字碼 得分閾值（Altschul等，J iZ )。這些起始的鄰近字碼命中（hit)作為用于開始檢索發(fā)現(xiàn) 含有它們的更長HSP的種子。字碼命中在兩個方向上沿每個序列延伸，直到累積的比對得 分可增加。使用例如用于核苷酸序列的參數(shù)M (對于匹配殘基對的獎分；總是大于0)和N (對于錯配殘基的罰分；總是小于0)計算累積的得分。對于氨基酸序列，使用評分矩陣來計 算累積的得分。在以下情況時，停止在每個方向上字碼命中的延伸：累積比對得分從其最大 獲取值減少了數(shù)量X ;由于一個或多個負(fù)評分殘基比對的積聚，累積得分轉(zhuǎn)為零或零以下； 或者到達(dá)任一個序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN 程序（用于核苷酸序列）默認(rèn)使用字長（W)為11，期望值（E)為10，M=5，N=-4,以及雙鏈比 較。對于氨基酸序列，BLASTP程序默認(rèn)使用字長為3,期望值（E)為10,和BL0SUM62評分 矩陣（參見 Henikoff &Henikoff，1989，Jcaor- 5bi. "5? 89:10915)比對 (B)為50,期望值（E)為10, M=5, N=-4以及雙鏈比較。
[0029] 在數(shù)值背景下術(shù)語"約"是指數(shù)值的+/_ 10%。
[0030] 在本文所述的工程改造的多肽的組分背景下，術(shù)語"肽"和"多肽"是同義的。
[0031] II.化合物 在第一方面，工程改造的多肽化合物提供有序列，其包含白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABD)多 肽序列和至少一個多肽激素結(jié)構(gòu)域（HDl)序列。術(shù)語"白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域"、"ABD"等是指 能夠結(jié)合本文所述的白蛋白的多肽。術(shù)語"激素結(jié)構(gòu)域"、"激素結(jié)構(gòu)域多肽"等是指能夠在 受試者中激發(fā)生物學(xué)反應(yīng)的GLP-I受體激動劑多肽。示例性激素結(jié)構(gòu)域包括但不限于毒蜥 外泌肽、毒蜥外泌肽片段或毒蜥外泌肽類似物。
[0032] 令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽類似物或活性片段可與極高親和力的 白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABD)融合（所述ABD源自鏈球菌菌株G148的細(xì)菌G蛋白的白蛋白結(jié) 合結(jié)構(gòu)域并與其具有顯著的氨基酸序列同一性），同時保留足夠的毒蜥外泌肽-4生物學(xué)活 性和具有延長的作用持續(xù)時間，例如在嚙齒動物中至少3天和甚至5天，其在人受試者中轉(zhuǎn) 變?yōu)橹辽?周或更長的持續(xù)時間。"持續(xù)時間"在慣常意義上是指在治療方案中允許更不頻 繁的給藥。因此，延長的作用持續(xù)時間將允許更不頻繁和/或更方便的給藥方案。這令人 吃驚，部分是因為所述ABD肽未曾廣泛證實作為治療蛋白載體是一個穩(wěn)健的平臺，它們相 對疏水，其可不利地與所連接的治療肽相互作用，并且對于至少一個家族的肽激素而言其 不能作為載體。特別地，大鼠胰島淀粉樣多肽當(dāng)與本文所述的ABD綴合或融合時，在相同的 嚙齒動物模型未顯示出任何明顯的或長效的體內(nèi)活性，其中發(fā)現(xiàn)各種毒蜥外泌肽-ABD構(gòu) 建體具有活性和長的作用持續(xù)時間。
[0033] 此外，本文的治療綴合物或融合物化合物令人驚訝地保留了白蛋白結(jié)合親和力和 特異性，同時具有較低的免疫原性和毒蜥外泌肽-4治療活性。所述化合物令人驚訝地具有 活性，盡管在毒蜥外泌肽和ABD之間不存在血漿蛋白酶切割位點。更令人驚訝的是，認(rèn)為治 療化合物即使當(dāng)與白蛋白結(jié)合時也具有活性。本文所述的ABD化合物提供白蛋白結(jié)合親和 力和特異性，同時具有比之前描述的ABD化合物更低的免疫原性，所述之前描述的ABD化 合物基于鏈球菌G蛋白菌株148 (G148)的白蛋白結(jié)合區(qū)并在Jonsson等（Protein Eng. Design & Selection, 2008，21:515-527)中。最近，通過實驗鑒定了在鏈球菌G蛋白菌株 148 (G148)的白蛋白結(jié)合區(qū)內(nèi)的幾個T-細(xì)胞和B-細(xì)胞表位（Goetsch等，Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10:125-32，2003)。作者對在疫苗中利用G148的T-細(xì)胞表位感興趣，即 利用白蛋白結(jié)合區(qū)的固有免疫刺激特性。Goetsch等另外在G148序列中發(fā)現(xiàn)一個B-細(xì)胞 表位，即免疫后與抗體結(jié)合的區(qū)域。在用于人給藥的藥物組合物中，無免疫反應(yīng)是合乎需要 的。因此，由于白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域G148的上述免疫刺激特性，從而不優(yōu)選用于所述組合物 中。
[0034] 生物學(xué)活性組分 預(yù)期用于本文所述的化合物和方法的生物學(xué)活性化合物組分包括毒蜥外泌肽。術(shù)語 "生物學(xué)活性化合物"等在慣常意義上是指化合物例如多肽等，其可誘發(fā)生物學(xué)反應(yīng)。
[0035] 毒蜥外泌肽。毒蜥外泌肽是亞利桑那州和北墨西哥內(nèi)生的爬行動物毒蜥（Gila monster)和墨西哥鬃獅蜥（Mexican Bearded Lizard)的唾液分泌物中發(fā)現(xiàn)的肽。毒蜥 外泌肽-3存在于墨西哥珠毒蜥（ZfeJWe/ma Aorrii/w? )(墨西哥鬃獅蜥）的唾液分泌物 中，毒蜥外泌肽-4存在于鈍尾毒蜥〇%^oofer?a siAspeciWB)(毒蜥）的唾液分泌物中。參 見Eng等，1990，t7；沒io7.C?e?.，265:20259-62 ;Eng等，1992，t7；沒io7.C?e?·， 267:7402-7405。毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4的序列分別如下：HSDGTFTSDLSKQMEEEAV rlfiewlknggpssgappps-nh2 (seq id no：i) ；hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgappps -NH2 (SEQ ID NO:2)。
[0036] Hargrove 等（Tfegw/aio/y 2007，141:113-119)報道一種毒晰外泌 肽-4肽類似物，其為全長的C-端酰胺化的毒蜥外泌肽-4肽類似物，與天然毒蜥外泌肽-4 相比，在第14位上具有單個的核苷酸差異。[14Leu]毒蜥外泌肽-4的序列如下：HGEGTFTSD lskqleeeavrlfiewlknggpssgappps-nh 2 (seq id no:3)。LeuH毒蜥外泌肽-4 是用于工程 改造的多肽的優(yōu)選類似物，所述多肽的用途在本文描述。另一個毒蜥外泌肽-4肽類似物是 一種嵌合體，所述嵌合體為在第14和28位上具有氨基酸取代的毒蜥外泌肽-4的起始32個 氨基酸和隨后的來自非哺乳動物（青蛙）GLPl的C-端的5個氨基酸的序列：[Leu 14, Gln28] 毒蜥外泌肽-4 (1-32)-fGLP-1 (33-37)。該化合物具有下列序列：HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLF IEWLKQGGPSKEIIS (SEQ ID N0:4)。本領(lǐng)域還已知毒蜥外泌肽-4的C-端截短的生物學(xué)活 性形式，例如毒蜥外泌肽-4 (1-28)、毒蜥外泌肽-4 (1-29)、毒蜥外泌肽-4 (1-30)、毒蜥 外泌肽-4 (1-31)、毒蜥外泌肽-4 (1-32)和它們的酰胺化形式。所有的這些毒蜥外泌肽 類似物都適于作為本發(fā)明的工程改造的多肽的組分。如本領(lǐng)域慣例的，在肽化合物名稱中 的方括號（即"[]"）表示方括號內(nèi)的殘基取代或化學(xué)特征。例如，[ 14Leu]毒蜥外泌肽-4、 [14Leu]Ex-4等是指在第14位上具有亮氨酸的毒蜥外泌肽-4。氨基酸的數(shù)字位置可以本領(lǐng) 域常規(guī)采用的多種方式通過前置或后置的數(shù)字表示。例如，術(shù)語 14Leiu Leul4、14Leu、Leu14 等在指第14位的亮氨酸時是同義的。
[0037] 應(yīng)理解，在一些實施方案中，C-端酰胺或其他C-端封端部分可存在于本文所述的 化合物中。
[0038] 盡管毒蜥外泌肽與胰高血糖素樣肽家族的數(shù)個成員具有一定的序列相似性，與 GLP-I (7-36) NH2 (Goke 等，1993，7；沿〇乂 泛6?.，268:19650-55) [GLP-1 (7-37) NH2 的 序列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQIDN0:5，有時亦稱為"GLP-Γ')]具有53% 的最高同源性，所述GLP-I具有刺激胰腺β -細(xì)胞的胰島素分泌的促胰島素作用，但毒蜥外 泌肽不是GLP-I的同源物。
[0039] 藥理學(xué)研究已產(chǎn)生報道，毒蜥外泌肽_4可在某些胰島素分泌細(xì)胞中體外作用于 GLP-I受體，然而，還報道毒蜥外泌肽-4可作用于不通過GLP-I起作用的受體。此外，毒蜥 外泌肽-4與GLP-I在體內(nèi)共有一些但不是全部的生物學(xué)性質(zhì)，并且其具有比GLP-I明顯更 長的作用持續(xù)時間?；谒鼈兊拇僖葝u素活性，已提議了毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽_4 在治療糖尿病和預(yù)防高血糖癥中的用途（Eng，U.S. Pat. No. 5,424,286,通過引用以其 整體結(jié)合到本文中并用于所有目的），事實上，毒蜥外泌肽-4已在美國和歐洲被批準(zhǔn)用作 用于治療2型糖尿病的治療劑。
[0040] 事實上，認(rèn)為毒蜥外泌肽不是哺乳動物GLP-I的物種同源物，如從毒蜥中克隆了 毒蜥外泌肽基因的Chen和Drucker所報道C/沿〇乂泛6?· 272:4108-15 (1997))。毒蜥 還具有單獨的胰高血糖素原（由此加工GLP-1，其中與毒蜥外泌肽相比，所述胰高血糖素原 更類似于哺乳動物胰高血糖素原）基因的觀測結(jié)果表明毒蜥外泌肽不僅僅是GLP-I的物種 同源物。
[0041] 使用毒蜥外泌肽激動劑調(diào)節(jié)胃腸運動的方法描述于美國專利號6, 858, 576 (即， 基于提交于1997年8月8日的美國申請序列號08/908, 867,其是提交于1996年8月8日 的美國申請序列號08/694, 954的部分繼續(xù)申請）。使用毒蜥外泌肽激動劑減少食物攝取 的方法描述于美國專利號6, 956, 026 (S卩，基于提交于1998年1月7日的美國申請序列號 09/003, 869,其要求提交于1997年1月7日的美國申請?zhí)?0/034, 905、提交于1997年8月 7日的美國申請?zhí)?0/055, 404、提交于1997年11月14日的美國申請?zhí)?0/065, 442和提 交于1997年11月14日的美國申請?zhí)?0/066, 029的權(quán)益）。
[0042] 可用于本文所述的工程改造的多肽的新的毒蜥外泌肽激動劑化合物序列描述于 WO 99/07404 (即，提交于 1998 年 8 月 6 日的 PCT/US98/16387)、WO 99/25727 (即，提交 于 1998 年 11 月 13 日的 PCT/US98/24210)、WO 99/25728 ( SP，提交于 1998 年 11 月 13 日 的 PCT/US98/24273)、WO 99/40788、WO 00/41546 和 WO 00/41548,其連同它們授權(quán)的對應(yīng) 美國專利一起通過引用結(jié)合到本文中并用于所有目的。本領(lǐng)域已知的體外和體內(nèi)測定毒蜥 外泌肽活性的方法（包括促胰島素、食物攝取抑制活性和體重減少活性）在本文以及上述 參考文獻(xiàn)和本文列舉的其他參考文獻(xiàn)中描述。
[0043] 某些示例性毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽激動劑和毒蜥外泌肽類似物激動劑包括：毒 晰外泌膚片段毒晰外泌膚-4 (1-30) (His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe He Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly) (SEQ ID NO: 680);毒晰外泌膚_4 (1-28)、毒晰外泌膚_4 (1-298)、毒晰外泌膚_4 (1-30)、毒晰外 泌肽-4 (1-31)和毒蜥外泌肽-4 (1-32)。類似物包括在14Met位置（S卩，14Met)上用非氧化 氨基酸例如亮氨酸的取代。實例包括[ 14Leu]毒蜥外泌肽-4、[14Leu]毒蜥外泌肽-4(1-30)、 [14Leu]毒蜥外泌肽-4 (1-28)和[14Leu, 25Phe]毒蜥外泌肽-4。
[0044] 用于本文所述的工程改造的多肽的毒蜥外泌肽類似物激動劑包括描述于美國專 利號7,223, 725 (通過引用結(jié)合到本文并用于所有目的）中的那些，例如下式的化合物： Xaa1 Xaa2 Xaa3 Gly Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28-Z1 ;其中 Xaa1 為 His、 Arg 或 Tyr ;Xaa2 為 Ser、Gly、Ala 或 Thr ;Xaa3 為 Ala、Asp 或 Glu ;Xaa5 為 Ala 或 Thr ;Xaa6 為 Ala、Phe、Tyr ;Xaa7 為 Thr 或 Ser ;Xaa8 為 Ala、Ser 或 Thr ;Xaa9 為 Asp 或 Glu ;Xaa10 為 Ala、Leu、Ile、Val 或 Met ;Xaan 為 Ala 或 Ser ;Xaa12 為 Ala 或 Lys ;Xaa13 為 Ala 或 Gln ;Xaa14 為 Ala、Leu、lie、Val 或 Met ;Xaa15 為 Ala 或 Glu ;Xaa16 為 Ala 或 Glu ;Xaa17 為 Ala 或 Glu ; Xaa19 為 Ala 或 Val ;Xaa20 為 Ala 或 Arg ;Xaa21 為 Ala 或 Leu ;Xaa22 為 Ala、Phe、Tyr ;Xaa23 為 lie、Val、Leu 或 Met ;Xaa24 為 Ala、Glu 或 Asp ;Xaa25 為 Ala、Trp、Phe、Tyr ;Xaa26 為 Ala 或 Leu ;Xaa27 為 Ala 或 Lys ;Xaa28 為 Ala 或 Asn !Z1 為-OH、-NH2、Gly_Z2、Gly Gly_Z2、Gly Gly Xaa31-Z2、Gly Gly Xaa31 Ser-Z2 (SEQ ID NO: 681)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z2 (SEQ ID NO: 682) ,Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z2 (SEQ ID NO: 683) ,Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z2 (SEQ ID NO: 684)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2 (SEQ ID NO: 685)、 Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z2 (SEQ ID NO: 686)或 Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z2 (SEQ ID NO: 687) ;Xaa31、Xaa36、Xaa3JP Xaa38 獨立地 為Pro或不存在；和Z2為-OH或-NH2。在上文所述的毒蜥外泌肽類似物中的任一個和每一 個中，還特別預(yù)期的是其中對應(yīng)于Xaal的組氨酸被置換為以下中的任一個的那些類似物： D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β -羥基-組氨酸、同型組氨酸、N- α -乙酰 基-組氨酸、α -氟甲基-組氨酸、α -甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、 4_吡啶基丙氨酸、4-咪唑并乙?；⒚摪被?組氨?；ㄟ溥虿⒈；?、β -羥基-咪唑 并丙酰基、N-二甲基-組氨?；颚?羧基-咪唑并丙?；１疚倪M(jìn)一步特別預(yù)期的是 本文描述的毒蜥外泌肽類似物，其中在Xaa2上的甘氨酸被置換為以下中的任一個：D-Ala、 ￥ &1、1^11、1^84讓、（1-氨基環(huán)丙基）甲酸、（1-氨基環(huán)丁基）甲酸、（1-氨基環(huán)戊基）甲酸、 (1-氨基環(huán)己基）甲酸、（1-氨基環(huán)庚基）甲酸或（1-氨基環(huán)辛基）甲酸。
[0045] 根據(jù)一個實施方案，示例性化合物包括上式的那些化合物，其中Xaa1為His或 Arg ;Xaa2 為 Gly 或 Ala ;Xaa3 為 Asp 或 Glu ;Xaa5 為 Ala 或 Thr ;Xaa6 為 Ala 或 Phe ;Xaa7 為 Thr 或 Ser ;Xaa8 為 Ala、Ser 或 Thr ;Xaa9 為 Asp 或 Glu ;Xaa10 為 Ala 或 Leu ;Xaan 為 Ala 或 Ser ;Xaa12 為 Ala 或 Lys ;Xaa13 為 Ala 或 Gln ;Xaa14 為 Ala 或 Leu ;Xaa15 為 Ala 或 Glu ;Xaa16 為 Ala 或 Glu ;Xaa17 為 Ala 或 Glu ;Xaa19 為 Ala 或 Val ;Xaa20 為 Ala 或 Arg ;Xaa21 為 Ala 或 Leu ;Xaa^ 為 Phe ;Xaa23 為 Ile、Val ;Xaa24 為 Ala、Glu 或 Asp ;Xaa25 為 Ala、Trp 或 Phe ;Xaa26 為 Ala 或 Leu ;Xaa27 為 Ala 或 Lys ;Xaa28 為 Ala 或 Asn !Z1 為-〇H、-NH2、Gly_Z2、Gly Gly_Z2、 Gly Gly Xaa31_Z2、Gly Gly Xaa31 Ser-Z2 (SEQ ID NO: 681)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z2 (SEQ ID NO: 682) ,Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z2 (SEQ ID NO: 683) ,Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z2 (SEQ ID NO: 684) ,Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2 (SEQ ID NO: 685)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z2 (SEQ ID NO: 686)、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z2 (SEQ ID NO: 687) ;Xaa31、Xaa36、Xaa37 和 Xaa3Jilj 立為 Pro 或不存在并且 Z2 為-OH 或-NH2 ;條件是 Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa 1(l、Xaan、Xaa12、 Xil￡li3、Xil￡li4、Xil￡li5、Xil￡li6、X￡l￡l20、X&&21、X&&24、X&&25、X&&26、X&&27 Xil￡l28 中白勺 不超過三個是Ala。在上文所述的毒蜥外泌肽類似物中的任一個和每一個中，還特別預(yù)期 的是其中對應(yīng)于Xaal位上的組氨酸被置換為以下中的任一個的那些類似物：D-組氨酸、脫 氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β -羥基-組氨酸、同型組氨酸、N- α -乙?；?組氨酸、 α -氟甲基-組氨酸、α -甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨 酸、4-咪唑并乙?；?、脫氨基-組氨?；ㄟ溥虿⒈；?、β -羥基-咪唑并丙?；-二 甲基-組氨?；颚?羧基-咪唑并丙?；１疚倪M(jìn)一步特別預(yù)期的是本文描述的毒蜥外 泌肽類似物，其中在Xaa2上的甘氨酸被置換為以下中的任一個：D-Ala、Val、Leu、Lys、Aib、 (1-氨基環(huán)丙基）甲酸、（1-氨基環(huán)丁基）甲酸、（1-氨基環(huán)戊基）甲酸、（1-氨基環(huán)己基） 甲酸、（1-氨基環(huán)庚基）甲酸或（1-氨基環(huán)辛基）甲酸。
[0046] 其他示例性化合物包括在WO 99/25727中所列舉的那些化合物，在其中它們被鑒 定為化合物2-23。根據(jù)另一實施方案，提供這樣的化合物，其中Xaa 14是Leu、11 e或Val，更 優(yōu)選Leu,和/或Xaa25是Trp、Phe或Tyr,更優(yōu)選Trp或Phe。這些化合物在體內(nèi)和體外兩 者中以及在化合物的合成期間對氧化降解較不敏感。
[0047] 適合用于本發(fā)明融合多肽的毒蜥外泌肽類似物的其他實例包括在公布于2003年 3月4日的美國專利6528486 (通過引用結(jié)合到本文并用于所有目的）中描述的那些類似 物。特別地，毒蜥外泌肽類似物包括由毒蜥外泌肽或與毒蜥外泌肽-4具有至少90%同源性 的毒蜥外泌肽類似物組成的那些類似物，所述毒蜥外泌肽-4任選在第34-39位上具有1-5 個缺失和與所述毒蜥外泌肽共價結(jié)合的4-20個氨基酸單位的肽序列C-端延伸，其中在所 述肽延伸序列中的每一個氨基酸單位選自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gin、Asp、Glu、Lys、 Arg、His和Met。更優(yōu)選所述延伸為4-20個氨基酸殘基的肽序列，例如在4-15的范圍內(nèi)， 更優(yōu)選在4-10的范圍內(nèi)，特別是在4-7個氨基酸殘基的范圍內(nèi)，例如4、5、6、7、8或10個氨 基酸殘基，其中優(yōu)選6個氨基酸殘基。最優(yōu)選地是，根據(jù)美國專利6528486,延伸肽包含至少 1個Lys殘基，并且甚至更優(yōu)選3-7個賴氨酸，并且甚至最優(yōu)選6個賴氨酸。
[0048]例如，一個類似物為 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPSKKKKKK (SEQ IDN0:118)(亦稱為[脫-36Pro]毒蜥外泌肽-4(l-39)-Lys6)。另外的示例性類似物 包括 Lys6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Al a-Pr〇-Pr〇-Ser-(Lys) 6 (H-Lys6-脫Pro 36毒蜥外泌肽-4(l-39)-Lys6) (SEQ ID NO: 688)、 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser (Η-[脫 36Pro, 37'38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2) (SEQ ID NO: 689)、Lys-Lys-Lys-Lys -Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu -Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser (H-(Lys)6-njP6Pro，37'38Pro]exendin-4(l-39)(SEQIDN0:690)、Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser (H-Asn-(Glu)5_[脫 36Pro, 37'38Pro]毒蜥外泌肽-4 (1-39) (SEQIDN0:691)、His_Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys) 6 ([脫 36Pro, 37'38Pro]毒蜥外泌肽-4(l-39)-(Lys) 6) (SEQ ID NO: 692)、（Lys)6-His-Gly-Glu-Gly-T hr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-LyS-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-G Iu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys) 6 (Η-(Lys) 6-[脫 36Pro, 37'38Pro]毒蜥外泌肽-4(l-39)-(Lys) 6) (SEQ ID NO: 693)和 Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Gl u-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-LyS-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va I-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys) 6 (Asn-(Glu)5-[脫 36Pro, 37'38Pro]毒蜥外泌肽-4 (1-39)-(Lys) 6) (SEQ ID NO: 694)。如本 領(lǐng)域慣例，氨基酸的重復(fù)可通過說明重復(fù)數(shù)量的下標(biāo)數(shù)字表示，即Lys6 (SEQ IDNO: 695)、 (Lys)6 (SEQ ID NO: 695)等是指六賴氨酰（SEQ ID NO: 695)。在上文所述的毒蜥外泌肽 類似物的任一個和每一個中，特別預(yù)期的是其中對應(yīng)于第1位的組氨酸被置換為以下中的 任一個的那些類似物：D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β -羥基-組氨酸、同 型組氨酸、N- α -乙?；?組氨酸、α -氟甲基-組氨酸、α -甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨 酸、2-卩比陡基丙氨酸、4-卩比陡基丙氨酸、4-咪唑并乙?；⒚摪被?組氨?；ㄟ溥虿⒈?基）、β-羥基-咪唑并丙酰基、N-二甲基-組氨?；颚?羧基-咪唑并丙酰基。本文 進(jìn)一步特別預(yù)期的是本文描述的毒蜥外泌肽類似物，其中在第2位上的甘氨酸被置換為以 下中的任一個：D-Ala、Val、Leu、Lys、Aib、（1-氨基環(huán)丙基）甲酸、（1-氨基環(huán)丁基）甲酸、 (1-氨基環(huán)戊基）甲酸、（1-氨基環(huán)己基）甲酸、（1-氨基環(huán)庚基）甲酸或（1-氨基環(huán)辛基） 甲酸。
[0049] 適合用于工程改造的多肽構(gòu)建體的毒蜥外泌肽類似物的其他實例是在公布的PCT 申請W02004035623 (通過引用結(jié)合到本文中并用于所有目的）中所描述的那些，特別是由 天然存在的氨基酸組成的那些，所述申請描述了具有特別是在 13Gln、14Met、25Trp或28Asn位 置上（參考毒蜥外泌肽-4 (1-39)的相應(yīng)位置）的至少一個修飾的氨基酸殘基的毒蜥外泌 肽類似物。根據(jù)該公布，另外的所述類似物還包含1-7個氨基酸的C-端延伸，其包括至少 1個Lys氨基酸和更優(yōu)選至少5個Lys氨基酸單位，例如6個或7個Lys氨基酸單位。
[0050] 適合用于工程改造的多肽構(gòu)建體的毒蜥外泌肽類似物的又一實例為在公布的標(biāo) 題為''N-Terminus Conformationally Constrained GLP-I Receptor Agonist Compounds (N-端構(gòu)象限制的GLP-I受體激動劑化合物）"PCT申請W0/2010/120476 (通過引用結(jié)合 到本文并用于所有目的）中描述的那些，所述申請描述了在毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽類似 物的N-端部分上具有修飾的氨基酸殘基以在該區(qū)域創(chuàng)建高β -轉(zhuǎn)角特征的毒蜥外泌肽類 似物。例如，設(shè)計類似物為通過創(chuàng)建構(gòu)象限制區(qū)域來模擬氨基酸殘基Hisl Gly2 Glu3,包括 在Hisl Gly2 Glu3含有噻唑烷-脯氨酸肽模擬物的毒蜥外泌肽類似物（參見例如在其中 的圖17A-F中描述的化合物），所述肽模擬物可在毒蜥外泌肽-4、利西拉肽（Iixisenatide) 或本文所述的其他類似物中用作修飾。
[0051] 在所述毒蜥外泌肽中的任一個和每一個中，例如本文所述的毒蜥外泌肽_4、類 似物和式，特別預(yù)期的是其中對應(yīng)于第一位的組氨酸被置換為以下中的任一個的那些： L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β -羥基-組氨酸、同型組氨酸、 N-α -乙?；?組氨酸、α -氟甲基-組氨酸、α -甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶 基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-咪唑并乙酰基、脫氨基-組氨酰基（咪唑并丙?；?、β -羥 基-咪唑并丙酰基、N-二甲基-組氨?；颚?羧基-咪唑并丙酰基。例如，用于本文所 述的工程改造的多肽綴合物的優(yōu)選毒蜥外泌肽類似物（其中Hisl位被修飾）為（4-咪唑 并乙?；┒掘嵬饷陔?4、（脫氨基-組氨?；┒掘嵬饷陔?4 (或（咪唑并丙?；┒?蜥外泌肽-4)、（ β -羥基-咪唑并丙?；┒掘嵬饷陔?4、（Ν-二甲基-組氨?；┒掘嵬?泌肽-4和（β -羧基-咪唑并丙?；┒掘嵬饷陔?4。本文進(jìn)一步特別預(yù)期的是本文所 述的毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽類似物，其中第2位上的甘氨酸被置換為以下中的任一個： D-Ala、Val、Leu、Lys、Aib、（1-氨基環(huán)丙基）甲酸、（1-氨基環(huán)丁基）甲酸、（1-氨基環(huán)戊 基）甲酸、（1-氨基環(huán)己基）甲酸、（1-氨基環(huán)庚基）甲酸或（1-氨基環(huán)辛基）甲酸。因此 例如，所述工程改造的多肽包括（4-咪唑并乙?；┒掘嵬饷陔?4一Gly-PEP07986,其中 所述毒蜥外泌肽-4類似物通過其C-端α羧基上的肽鍵連接到作為接頭的甘氨酸，所述接 頭通過肽鍵連接到ΡΕΡ07986序列的N-端。
[0052] 上文的毒蜥外泌肽類似物或它們的活性片段中的任一個適合用于本發(fā)明的工程 改造的多肽，帶有或不帶有連接到ABD的接頭。
[0053] 白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABD)肽。對于之前所公開的源自鏈球菌G蛋白菌株 148 (G148)的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和對于對白蛋白具有高親和力的一些變體，例如 W009/016043,較高的親和力以降低熱穩(wěn)定性為代價獲得。此外，已報道在G148的白蛋白 結(jié)合區(qū)內(nèi)實驗性地鑒定了 T-細(xì)胞和B-細(xì)胞表位（Goetsch等，Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32，2003)。研究背后的作者對在疫苗中利用G148的T-細(xì)胞表位感興趣，即利用 白蛋白結(jié)合區(qū)的固有免疫刺激特性。Goetsch等另外發(fā)現(xiàn)了在G148序列中的一個B-細(xì)胞 表位，即免疫后與抗體結(jié)合的區(qū)域。因此，白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域G148和源自G148的多肽以及 由此含有它們的融合物/綴合物，具有上述免疫刺激特性的風(fēng)險。在用于人給藥的藥物組 合物中，沒有（或降低）免疫反應(yīng)是合乎需要的。
[0054] 所述融合物和/或綴合物的上述缺點和缺陷通過使用本文所公開的用于本發(fā)明 的工程改造的多肽的改進(jìn)的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABD)肽來克服或降低。所述ABD是具有可 比較的對白蛋白高親和力的那些結(jié)構(gòu)域，其源自鏈球菌菌株G148的細(xì)菌G蛋白的白蛋白結(jié) 合結(jié)構(gòu)域并與其具有顯著的氨基酸序列同一性，然而其如本文所述被修飾以提供所需要的 免疫學(xué)性質(zhì)，例如降低的免疫原性。因此，包含本文所述的長持續(xù)時間的工程改造的多肽綴 合物或融合物的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽是三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域，其包含白蛋白結(jié)合基序和 包括三螺旋構(gòu)象的其他序列。本文所述的和預(yù)期用于本文所述的工程改造的多肽的ABD肽 優(yōu)于如 Jonsson 等 O0Toiei/?你盡 4 2008，21:515-527)所述具有白 蛋白結(jié)合序列的那些肽以及其中所述的ABD肽，并且那些ABD肽還描述于PCT公布申請?zhí)?W02009/016043。將本文所述的ABD多肽與毒蜥外泌肽或其類似物或其活性片段融合以創(chuàng) 建本文所述的工程改造的多肽。適合用于與毒蜥外泌肽化合物綴合或融合的白蛋白結(jié)合結(jié) 構(gòu)域多肽可包含改進(jìn)的ABD氨基酸序列，其包含選自下式的序列： 式（i) LA X3 AK X6 X7 AN XlO ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP (SEQ ID NO: 300) 其中彼此獨立地， X3選自E、S、Q和C ; X6選自E、S和C ; X7選自A和S ; X14 選自 A、S、C 和 K; XlO選自A、S和R; X26選自D和E ; X39選自D和E ; X40選自A和E ; X43選自A和K ; X44選自A、S和E ; 第45位上的亮氨酸是存在或不存在的；并且 第46位上的脯氨酸是存在或不存在的；和 式（ii)與（i)中定義的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列， 條件是X7不是U E或D ; 或者備選地， 條件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申請?zhí)朩O 2009/016043中定義的下列序列 所定義：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X2tl AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此獨立地， Xa選自V和E ; Xb選自L、E和D ; X。選自N、L和I ; Xd選自R和K ; Xe選自D和K ;和 X5選自Y和F ; X8選自N、R和S ; X9 選自 V、I、L、M、F和 Y ; X11 選自 N、S、E 和 D ; X12選自R、K和N ; X14選自K和R ; X2。選自 D、N、Q、E、H、S、I^PK; X23選自K、I和T ; Xm 選自 A、S、T、G、H、L 和 D ;和 X25選自H、E和D。
[0055] 在根據(jù)上文第一方面一式（i)或（ii)的白蛋白結(jié)合多肽的其他實施方案中，X6為 E。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X6為S。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié) 合多肽的另一實施方案中，X3為S。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X3 為E。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X7為A。在根據(jù)該方面的白蛋 白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X7為S。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案 中，X14為S。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X14為C。在根據(jù)該方面 的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X14為A。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實 施方案中，X14為K。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，XlO為A。在根據(jù) 該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，XlO為S。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的 另一實施方案中，X26為D。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X26為E。 在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X39為D。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合 多肽的另一實施方案中，X39為E。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X40 為A。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X40為E。在根據(jù)該方面的白蛋 白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X43為A。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案 中，X43為K。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X44為A。在根據(jù)該方面 的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X44為S。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實 施方案中，X44為E。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，第45位上的亮氨 酸是存在的。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，第45位上的亮氨酸是不 存在的。在另一實施方案中，第46位上的脯氨酸是存在的。在另一實施方案中，第46位上 的脯氨酸是不存在的。
[0056] 在其他優(yōu)選的實施方案中，適合于與毒蜥外泌肽化合物綴合或融合的白蛋白結(jié)合 結(jié)構(gòu)域多肽可包含改進(jìn)的ABD氨基酸序列，其選自： 式（iii) LA X3 AK X6 X7 AN XlO ELD X14 YGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 678) 其中彼此獨立地， X3選自E、S、Q和C ; X6選自E、S和C ; X7選自A和S ; XlO選自A、S和R; X14 選自 A、S、C 和 K; 第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和 第46位的脯氨酸是存在或不存在的；和 式（iv)與（iii)中定義的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列， 條件是X7不是U E或D ; 或者備選地， 條件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申請?zhí)朩O 2009/016043中定義的下列序列 所定義：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X2tl AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此獨立地， Xa選自V和E ; Xb選自L、E和D ; X。選自N、L和I ; Xd選自R和K ; Xe選自D和K ;和 X5選自Y和F ; X8選自N、R和S ; X9 選自 V、I、L、M、F和 Y ; X11 選自 N、S、E 和 D ; X12選自R、K和N ; X14選自K和R ; X2。選自 D、N、Q、E、H、S、I^PK; X23選自K、I和T ; Xm 選自 A、S、T、G、H、L 和 D ;和 X25選自H、E和D。
[0057] 在根據(jù)該方面--式（iii)或（iv)的白蛋白結(jié)合多肽的其他實施方案中，X6為 E。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X6為S。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié) 合多肽的另一實施方案中，X3為S。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X3 為E。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X7為A。在根據(jù)該方面的白蛋 白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X7為S。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案 中，X14為S。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X14為C。在根據(jù)該方面 的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，X14為A。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實 施方案中，X14為K。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，XlO為A。在根據(jù) 該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實施方案中，XlO為S。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的 另一實施方案中，第45位上的亮氨酸是存在的。在根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽的另一實 施方案中，第45位上的亮氨酸是不存在的。在另一實施方案中，第46位上的脯氨酸是存在 的。在另一實施方案中，第46位上的脯氨酸是不存在的。
[0058] 在式（i)-(iv)中的任一個的另一實施方案中，ABD包含一個或多個N-端螺旋封 端的氨基酸，并且在另一實施方案中，所述螺旋封端的氨基酸可以是絲氨酸，或者可以是甘 氨酸-絲氨酸。因此對于本文所公開的每個白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列，包括在附圖和序列表 中的那些，對在工程改造的多肽中如本文公開的所有方面所特別預(yù)期的還為對應(yīng)于包含在 其中的式（i)-(iv)中任一個的ABD的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、它們的Ser-ABD、Gly-Ser-ABD、 Gly-ABD、Ala-ABD和它們的脫C-端-脯氨酸序列。
[0059] 因此，還包括（i)或（iii)的修飾變體，其使得得到的序列與屬于（i)或（iii)所 定義的類別的序列具有至少95%同一性。例如，有可能的是，屬于氨基酸殘基的某一功能性 分類（例如疏水性、親水性、極性等）的氨基酸殘基可替換為來自相同功能組的其他氨基酸 殘基。
[0060] 對白蛋白具有結(jié)合親和力的上文定義的序列相關(guān)ABD多肽類別源自共同的母體 多肽序列，其折疊成三α螺旋束結(jié)構(gòu)域。更具體地，上述多肽源自基于血清白蛋白和白 蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（G148-GA3)之間的復(fù)合物結(jié)構(gòu)的模型構(gòu)建（Lejon等，J. Biol. Chem. 279:42924-8，2004)，以及共同母體多肽序列的大量突變變體的結(jié)合和結(jié)構(gòu)特征分析。與 母體多肽序列相比，式（i)-(iv)中任一個的上文定義的氨基酸序列包含氨基酸取代，其產(chǎn) 生了一類多肽，所述多肽期望折疊成幾乎相同的三螺旋束結(jié)構(gòu)域。當(dāng)母體多肽序列已經(jīng)包 含與白蛋白相互作用的結(jié)合表面時，所述結(jié)合表面通過一些上文定義的取代來修飾。與母 體多肽序列相比，上文定義的取代提供改進(jìn)的白蛋白結(jié)合能力。重要及令人驚訝的是，除了 保留和/或改進(jìn)對白蛋白的強(qiáng)親和力之外，上文定義的取代還提供增強(qiáng)的免疫學(xué)性質(zhì)。
[0061] 因此，根據(jù)公開內(nèi)容的第一方面，改進(jìn)的ABD多肽顯示一組特性，所述特性例如使 它們適合用作用于人給藥的治療性分子的融合物或綴合物配偶體。重要及令人驚訝的是， 例如與相關(guān)的白蛋白結(jié)合多肽例如白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域G148-GA3和公開于W009/016043中 的白蛋白結(jié)合多肽相比較，本公開內(nèi)容的改進(jìn)的ABD顯示下列6個特性中的至少5個： (1)與例如G148-GA3和其他細(xì)菌來源的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域相比，所述ABD多肽顯示不 同的表面。該差異可降低或消除受試者（例如人）中抗體反應(yīng)的任何風(fēng)險，所述受試者先 前已暴露于這類細(xì)菌蛋白。
[0062] (2)所述ABD多肽包含比，例如，G148-GA3和共同母體多肽序列的其他相關(guān)但不同 的突變變體更少的潛在T-表位，由此當(dāng)給予受試者（例如人）時顯示低和/或較低的免疫 原性。
[0063] (3)所述多肽當(dāng)給予受試者（例如人）時，顯示較低的與循環(huán)抗體的反應(yīng)性。因 此，通過在暴露于循環(huán)抗體的多肽表面上（即，在不涉及與白蛋白結(jié)合相互作用的多肽表 面上）的氨基酸取代，如在測試組的人血清中所測量，與例如由G148-GA3引起的抗體交叉 反應(yīng)性相比，降低了抗體交叉反應(yīng)性。
[0064] (4)根據(jù)比，例如，已知天然存在的白蛋白結(jié)合多肽（例如源自細(xì)菌蛋白的白蛋白 結(jié)合結(jié)構(gòu)域）更高的由K d值定義的結(jié)合親和力和更慢的由koff值定義的解離速率兩者， 所述多肽具有高白蛋白結(jié)合能力。
[0065] (5)所述多肽包含比，例如，已知天然存在的白蛋白結(jié)合多肽（例如源自細(xì)菌蛋白 的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域）更少的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基與多肽的穩(wěn)定性問題相關(guān)。因 此，例如所述多肽不包含氧化傾向的甲硫氨酸或色氨酸，和僅包含一個天冬酰胺。
[0066] (6)所述多肽具有比先前的白蛋白結(jié)合多肽（例如在W009/016043中公開的那 些）更高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，如由大于55°C的熔點所定義。
[0067] 在一個實施方案中，根據(jù)第一方面的綴合物/融合物的白蛋白結(jié)合多肽顯示所有 6個上文所列的特性。在另一實施方案中，根據(jù)第一方面的白蛋白結(jié)合多肽當(dāng)與白蛋白結(jié)合 時，顯示比，例如，先前的白蛋白結(jié)合多肽（例如在W009/016043中公開的那些）更具親水 性的特征。當(dāng)所述多肽與白蛋白相互作用時，暴露于環(huán)境的白蛋白結(jié)合多肽的表面包含較 少的賦予表面疏水性的氨基酸殘基。
[0068] 對于ABD序列的本文每一個實施方案而言進(jìn)一步的是，C-端脯氨酸（對應(yīng)于上文 的第46位）可任選不存在。對于ABD序列的每一個實施方案而言更進(jìn)一步的是，第45位 的亮氨酸可任選存在或不存在。"ABD序列"是其為單價或二價的ABD化合物的序列，如合 適的話，其形成本文公開的工程改造的多肽的一部分。"肽激素結(jié)構(gòu)域（HDl)序列"是其為 單價或二價的肽激素結(jié)構(gòu)域（HDl)化合物的序列，如果合適的話，其形成本文公開的工程 改造的多肽的一部分。"毒蜥外泌肽序列"是其為單價或二價的毒蜥外泌肽化合物的序列， 如果合適的話，其形成本文公開的工程改造的多肽的一部分。"毒蜥外泌肽類似物序列"是 其為單價或二價的毒蜥外泌肽類似物化合物的序列，如果合適的話，其形成本文公開的工 程改造的多肽的一部分。"毒蜥外泌肽活性片段序列"是其為單價或二價的毒蜥外泌肽活 性片段化合物的序列，如果合適的話，其形成本文公開的工程改造的多肽的一部分。"毒蜥 外泌肽類似物活性片段序列"是其為單價或二價的毒蜥外泌肽類似物活性片段化合物的序 列，如果合適的話，其形成本文公開的工程改造的多肽的一部分。"白蛋白結(jié)合基序（ABM) 序列"是其為單價或二價的ABM的序列，如果合適的話，其形成本文公開的工程改造的多肽 的一部分。除非另外說明，否則應(yīng)理解為，當(dāng)工程改造的多肽"包含"化合物（例如ABD或 HD1)時，所述工程改造的多肽的序列包括所述化合物的序列（例如ABD序列或HDl序列）。 [0069] 因為白蛋白結(jié)合基序的存在，ABD肽與白蛋白以至多I X KT6 M、甚至更優(yōu)選至多 I X KT9 M (甚至更緊密的親和力）的相互作用的Kd值結(jié)合。更優(yōu)選相互作用的Kd值為 至多I X KTki M、甚至更優(yōu)選至多I X KT11 M、甚至更優(yōu)選至多I X KT12 M和甚至進(jìn)一步 至多I X KT13 M。所述值最優(yōu)選是對人血清白蛋白（"HSA"）的親和力。
[0070] 本文所用的術(shù)語"白蛋白結(jié)合"和"白蛋白結(jié)合親和力"是指多肽的一種性質(zhì)，其 可通過例如使用表面等離振子共振技術(shù),例如在本領(lǐng)域已知的Biacore儀器上檢測。例如， 如下文實施例中所述，白蛋白結(jié)合親和力可在這樣的實驗中檢測，在所述實驗中，將白蛋白 或其片段固定在儀器的傳感器芯片上，并且使含有待檢測多肽的樣品通過所述芯片。或者， 將待檢測的多肽固定在儀器的傳感器芯片上，并使含有白蛋白或其片段的樣品通過所述芯 片。在這點上，白蛋白可以是來自哺乳動物的血清白蛋白，例如人血清白蛋白。然后，技術(shù)人 員可分析通過所述實驗獲得的結(jié)果，以至少建立多肽對白蛋白的結(jié)合親和力的定性測量。 如果需要定量測量，例如測定相互作用的K d值，也可使用表面等離振子共振方法。可例如在 Biac〇re2000儀器（GE Healthcare)上確定結(jié)合值。將白蛋白合適地固定在測量的傳感器 芯片上，通過連續(xù)稀釋制備其親和力待測定的多肽樣品，并將其注入。然后，可使用例如由 儀器制造商（GE Healthcare)提供的BIAevaluation 4.1軟件的1:1 Langmuir結(jié)合模型 從結(jié)果計算Kd值。
[0071] 在一個實施方案中，根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽與白蛋白結(jié)合，使得相互作用 的Iwf值為至多5 X KT5 s'例如至多5 X KT6 s'
[0072] 在另一實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽的氨基酸序列選自SEQ ID N0:301-344中 的任一個。更具體的，氨基酸序列選自SEQ ID N0:304-305、SEQ ID N0:307-308、SEQ ID N0:310-31U SEQ ID NO: 313-314, SEQ ID NO: 316-317, SEQ ID NO: 319-320, SEQ ID NO:322-323, SEQ ID NO:325-326, SEQ ID NO:328-329, SEQ ID NO:331-332, SEQ ID NO:334-335、SEQ ID NO:337-338、SEQ ID NO:341-342 和 SEQ ID NO:349-350。
[0073] 在用于本文所述的工程改造的多肽的ABD的另一優(yōu)選的實施方案中，工程改造的 多肽的白蛋白結(jié)合多肽部分的氨基酸序列包含選自本文所述序列中的任一個的ABD，包括 來自表1或圖1、本文的序列表中的那些，并還包括它們的脫-Pr 〇46和/或脫-Leu45形式。
[0074] 在一個實施方案中，根據(jù)該方面的白蛋白結(jié)合多肽還包含一個或多個另外的氨基 酸殘基，其位于在（i)或（iii)中定義的ABD序列的N-端和/或C-端。這些另外的氨基酸 殘基可起進(jìn)一步增強(qiáng)白蛋白與多肽結(jié)合和改進(jìn)所折疊的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象穩(wěn)定性 的作用，但可等同地良好用于其他目的，例如涉及多肽的生產(chǎn)、純化、體內(nèi)或體外的穩(wěn)定性、 偶聯(lián)、標(biāo)記或檢測中的一個或多個以及其任何組合。所述另外的氨基酸殘基可包括添加用 于與例如HDl化學(xué)偶聯(lián)目的的一個或多個氨基酸殘基。
[0075] 例如，在一個實施方案中，緊接ABD氨基酸序列⑴或（iii)的N-端或C-端上的 α螺旋之前或之后的氨基酸可由此影響構(gòu)象的穩(wěn)定性?？捎兄诟纳茦?gòu)象穩(wěn)定性的氨基 酸殘基的一個實例是位于上文所定義的ABD氨基酸序列（i)或（iii)的N-端的絲氨酸殘 基。在某些情況下，N-端絲氨酸殘基可通過包括絲氨酸側(cè)鏈的Y氧和谷氨酸殘基的多肽 骨架NH之間的氫鍵，形成典型的S-X-X-E封端盒。該N-端封端可有助于構(gòu)成本公開內(nèi)容 第一方面的白蛋白結(jié)合多肽的三螺旋結(jié)構(gòu)域的第一 α螺旋的穩(wěn)定。
[0076] 因此，在一個實施方案中，所述另外的氨基酸殘基包括在多肽的N-端上的至少一 個絲氨酸殘基。換言之，一個或多個絲氨酸殘基在ABD氨基酸序列之前。在白蛋白結(jié)合多 肽的另一實施方案中，所述另外的氨基酸包括在ABD序列的N-端上的甘氨酸殘基。應(yīng)理 解，ABD氨基酸序列（i)或（iii)的前面可以有1個、2個、3個、4個或任何合適數(shù)量的氨 基酸殘基。因此，ABD氨基酸序列的前面可以有單一的絲氨酸殘基、單一的甘氨酸殘基或 兩者的組合，例如甘氨酸-絲氨酸（GS)組合或甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸（GSS)組合。在 N-端包含另外的氨基酸殘基的白蛋白結(jié)合多肽的實例在SEQ ID N0:445-463、例如SEQ ID N0:445-448和SEQ ID N0:462-463中以及在表1和圖1中列出。在又一實施方案中，所述 另外的氨基酸殘基包含在如序列式（i)或（iii)所定義的多肽的N-端上的絲氨酸。一個 這樣的具有 N-端絲氨酸的 ABD 的實例為 SGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKD AILAALP (SEQ ID NO. 696)。對應(yīng)的脫-脯氨酸形式為 SGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLID KAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 697)。對應(yīng)的脫-Leu 形式為 SGSLAEAKEAANAELDSYGV SDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAP (SEQ ID NO: 698)。對應(yīng)的脫-Pro 脫-Leu 形式為 SGSL AEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 699)〇
[0077] 在又一實施方案中，另外的一個或多個氨基酸殘基包括在本文定義的ABD多肽的 N-端上的丙氨酸，或與絲氨酸組合作為在上述ABD序列的N-端上的丙氨酸-絲氨酸序列。 在又一實施方案中，所述另外的一個或多個氨基酸殘基包括在本文定義的ABD多肽的N-端 上的谷氨酸。在又一實施方案中，所述另外的一個或多個氨基酸殘基包括在本文定義的ABD 多肽的N-端上的半胱氨酸。所述另外的殘基當(dāng)存在時優(yōu)選為1-5個氨基酸。
[0078] 類似地，可利用C-端封端以提高構(gòu)成白蛋白結(jié)合多肽的三螺旋結(jié)構(gòu)域的第三α 螺旋的穩(wěn)定性。在（i)或（iii)定義的ABD氨基酸序列的C-端存在的C-端脯氨酸殘基可至 少部分起到封端殘基的作用。C-端上脯氨酸殘基后的賴氨酸殘基通過賴氨酸殘基的ε氨 基和在多肽骨架上位于賴氨酸之前的兩個和三個殘基的氨基酸的羰基（例如（i)或（iii) 定義的ABD氨基酸序列的亮氨酸和丙氨酸殘基的羰基）之間的氫鍵，可有助于白蛋白結(jié)合 多肽的第三螺旋的進(jìn)一步穩(wěn)定。因此，在一個實施方案中，所述另外的氨基酸包括在多肽的 C-端上的賴氨酸殘基。所述另外的殘基當(dāng)存在時優(yōu)選為1-5個氨基酸。
[0079] 如上所述，所述另外的氨基酸可與白蛋白結(jié)合多肽的生產(chǎn)有關(guān)。具體而言，當(dāng)通過 化學(xué)肽合成來生產(chǎn)第一方面的白蛋白結(jié)合多肽時，C-端脯氨酸后的一個或多個可選的氨基 酸殘基可提供優(yōu)勢。所述另外的氨基酸殘基可例如阻止形成非所需的物質(zhì)，例如在合成的 二肽階段的二酮哌嗪。所述氨基酸殘基的一個實例是甘氨酸。因此，在一個實施方案中，所 述另外的氨基酸包括在多肽C-端的甘氨酸殘基，其緊接脯氨酸殘基或緊接如上文所說明 的另外的賴氨酸和/或甘氨酸殘基之后?；蛘撸嚯纳a(chǎn)可獲益于ABD氨基酸序列（i)或 (iii)的C-端脯氨酸殘基的酰胺化。在這種情況下，C-端脯氨酸在羧基碳上包含另外的胺 基。
[0080] 在C-端包含另外的氨基酸殘基的白蛋白結(jié)合多肽的實例在SEQ ID N0:445-452、 例如SEQ ID N0:449-450中以及表1和圖1中列出。技術(shù)人員知道實現(xiàn)C-端修飾的方法， 例如通過用于肽合成的不同類型的預(yù)制基質(zhì)。
[0081] 在另一實施方案中，所述另外的氨基酸殘基包括在多肽的N-端和/或C-端上的 半胱氨酸殘基。所述半胱氨酸殘基可緊接（i)或（iii)定義的ABD氨基酸序列之前和/或 之后，或者可在上述任何其他另外的氨基酸殘基之前和/或之后。在多肽鏈的N-端和/或 C-端包含半胱氨酸殘基的白蛋白結(jié)合多肽的實例在SEQ ID N0:449-450 (C-端）和SEQ ID N0:451-452 (N-端）中以及表1和圖1中列出。通過將半胱氨酸殘基添加到多肽鏈中，可 獲得用于白蛋白結(jié)合多肽的位點定向綴合的巰基?；蛘?，可將硒代半胱氨酸殘基以與引入 半胱氨酸殘基類似的方式引入到多肽鏈的C-端，以利于位點特異性綴合（Cheng等，Nat Prot 1:2， 2006)。
[0082] 在一個實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽包含不超過兩個半胱氨酸殘基。在另一實施 方案中，白蛋白結(jié)合多肽包含不超過一個半胱氨酸殘基。
[0083] 在另一實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽的另外的氨基酸殘基包含用于純化或檢測多 肽的"標(biāo)簽"，例如六組氨酰基（His6)標(biāo)簽（SEQ ID NO: 49)、或"myc"（ "c-Myc"）標(biāo)簽或 "FLAG"標(biāo)簽，用于與特異性針對標(biāo)簽的抗體相互作用和/或用于純化。技術(shù)人員知道其他 替代物。
[0084] 示例性ABD種類包括但不限于以下表1和實施例中所列的化合物。
[0085] 表1所選的ABD肽。
【權(quán)利要求】
1.工程改造的多肽，包含：白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽（ABD)序列和選自毒蜥外泌肽序列、 毒蜥外泌肽類似物序列或其活性片段序列的第一肽激素結(jié)構(gòu)域（HD1)序列，其中所述ABD 序列包含選自包括以下的氨基酸序列的氨基酸序列： 式（i) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDFYKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP (SEQ ID NO: 300) 其中彼此獨立地， X3選自E、S、Q和C ; X6選自E、S和C ; X7選自A和S ; X14 選自 A、S、C 和 K; X10選自A、S和R; X26選自D和E ; X39選自D和E ; X40選自A和E ; X43選自A和K ; X44選自A、S和E ; 第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和 第46位的脯氨酸是存在或不存在的；和 式（ii)與（i)中定義的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列， 條件是X7不是L、E或D ; 或者備選地， 條件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申請?zhí)朩0 2009/016043中定義的下列序列 所定義：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X12 A X14 TVEGV X2(l AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此獨立地， Xa選自V和E ; Xb選自L、E和D ; X。選自N、L和I ; Xd選自R和K ; Xe選自D和K ;和 X5選自Y和F ; X8選自N、R和S ; X9 選自 V、I、L、M、F和 Y ; Xn選自N、S、E和D ; X12選自R、K和N ; X14選自K和R ; X2。選自 D、N、Q、E、H、S、I^PK; X23選自K、I和T ; 選自 A、S、T、G、H、L 和 D ;和 X25選自H、E和D。
2. 權(quán)利要求1的工程改造的多肽，還包含將所述HD1序列和所述ABD序列共價連接的 第一接頭（L1)。
3. 權(quán)利要求1或2的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含所述ABD序列作 為C-端部分和所述HD1序列作為N-端部分。
4. 權(quán)利要求3的工程改造的多肽，包含結(jié)構(gòu)：HD1-ABD。
5. 權(quán)利要求3的工程改造的多肽，包含結(jié)構(gòu)：HD1-L1-ABD。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項的工程改造的多肽，其中所述HD1序列是所述毒蜥外泌肽或 毒蜥外泌肽類似物序列。
7. 權(quán)利要求6的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽序列是毒蜥外泌肽-4序列，并 且毒蜥外泌肽類似物序列是Leul4毒蜥外泌肽-4序列（SEQ ID NO: 3)。
8. 權(quán)利要求6的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽片段序列是毒蜥外泌肽-4 (1-28) (SEQ ID NO: 980)、毒蜥外泌肽-4 (1-29) (SEQ ID NO: 981)、毒蜥外泌肽-4 (1-30) (SEQ ID NO: 680)、毒蜥外泌肽-4 (1-31) (SEQ ID NO: 982)或毒蜥外泌肽-4 (1_32) (SEQ ID NO: 983)的序列。
9. 權(quán)利要求6的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽類似物序列選自 以下序列：HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS (SEQ ID N0:3)、HGEGTFTSDLSKQ LEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS (SEQ ID NO:4), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPP S (SEQ ID N0:2) .HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS (SEQ ID NO:111),HGEGTFT SDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS (SEQ ID NO: 112), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNG GPSSGAPPS (SEQ ID NO: 113), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK (SEQ ID NO:114),HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSKKKKKK (SEQ ID NO:115),HGEGTFT SDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISKKKKKK (SEQ ID NO: 116), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIE WLKNGGPSSGAPPSKKKKKK (SEQ ID N0:117)和HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSK KKKKK (SEQ ID NO:118)〇
10. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽類 似物包含在對應(yīng)Hisl的位置上的修飾，所述修飾選自：L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組 氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、同型組氨酸、Ν-α-乙?；?組氨酸、α-氟甲 基-組氨酸、α -甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-咪 唑并乙?；⒚摪被?組氨?；ㄟ溥虿⒈；?、β -羥基-咪唑并丙酰基、Ν-二甲基-組 氨酰基和β-羧基-咪唑并丙?；?。
11. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述類似物包括在對應(yīng)Hisl的位 置上包含修飾的毒蜥外泌肽-4,并且所述類似物選自（4-咪唑并乙?；┒掘嵬饷陔?4、 (脫氨基-組氨?；┒掘嵬饷陔?4 (或（咪唑并丙?；┒掘嵬饷陔?4)、（ β -羥基-咪 唑并丙?；┒掘嵬饷陔?4、（Ν-二甲基-組氨?；┒掘嵬饷陔?4和（β -羧基-咪唑 并丙?；┒掘嵬饷陔?4 (SEQ ID NO: 984)。
12. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽類似物序列與毒 蜥外泌肽-4、權(quán)利要求9的毒蜥外泌肽類似物或權(quán)利要求8的毒蜥外泌肽片段具有至少 70%的氨基酸序列同一'I"生。
13. 權(quán)利要求1-12中任一項的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽類似物與毒蜥外 泌肽-4、權(quán)利要求9的毒蜥外泌肽類似物或權(quán)利要求8的毒蜥外泌肽片段具有至少80%的 同一I"生。
14. 前述權(quán)利要求的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽類似物與毒蜥外泌肽-4、 權(quán)利要求9的毒蜥外泌肽類似物或權(quán)利要求8的毒蜥外泌肽片段具有至少90%的同一性。
15. 前述權(quán)利要求的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽類似物與毒蜥外泌肽-4、 權(quán)利要求9的毒蜥外泌肽類似物或權(quán)利要求8的毒蜥外泌肽片段具有至少95%的同一性。
16. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽類似物序列具有 1-5個氨基酸修飾，所述修飾獨立選自插入、缺失、添加和取代中的任何一種或組合。
17. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含選自包括以下 氨基酸序列的氨基酸序列： 式（i) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDFYKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP (SEQ ID NO: 300) 其中彼此獨立地， X3選自E、S、Q和C ; X6選自E、S和C ; X7選自A和S ; X14 選自 A、S、C 和 K; X10選自A、S和R; X26選自D和E ; X39選自D和E ; X40選自A和E ; X43選自A和K ; X44選自A、S和E ; 第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和 第46位的脯氨酸是存在或不存在的；和 式（ii)與（i)所定義的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列， 條件是X7不是L、E或D。
18. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含包括以下的氨 基酸序列： 式（i) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39 X40 ILX43 X44 LP (SEQIDNO: 300)，其中彼此獨立地，X3選自E、S、Q和C;X6選自E、S和 C ;X7選自A和S ;X14選自A、S、C和K ;X10選自A、S和R ;X26選自D和E ;X39選自D和E ; X40選自A和E ;X43選自A和K ;X44選自A、S和E ;第45位的亮氨酸是存在或不存在的； 和第46位的脯氨酸是存在或不存在的。
19. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含包括以下的氨 基酸序列： 式（ii)與⑴中定義的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，條件是X7不是L、E或 D ;或者備選地，條件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申請?zhí)朩0 2009/016043中定義的 下列序列所定義：LAEAK Xa Xb A X。Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I Xn X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此獨立地，Xa 選自 V 和 E ;Xb 選自 L、E 和D ;X。選自N、L和I ;Xd選自R和K ;Xe選自D和K ;和X5選自Y和F ;X8選自N、R和S ;X9 選自V、I、L、M、F和Y;Xn選自N、S、E和D;X12選自R、K和N;X14選自K和R;X 2Q選自D、N、 Q、E、H、S、R 和 K ;X23 選自 K、I 和 T ;X24 選自 A、S、T、G、H、L 和 D ;和 X25 選自 Η、E 和 D。
20. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含選自包括以下 的氨基酸序列的氨基酸序列： 式（iii) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP (SEQ ID NO: 678) 其中彼此獨立地， X3選自E、S、Q和C; X6選自E、S和C ; X7選自A和S ; X10選自A、S和R; X14 選自 A、S、C 和 K; 第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和 第46位的脯氨酸是存在或不存在的；和 式（iv)與（iii)中定義的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列， 條件是X7不是L、E或D ; 或者備選地， 條件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申請?zhí)朩0 2009/016043中定義的下列序列 所定義：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X12 A X14 TVEGV X2(l AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此獨立地， Xa選自V和E ; Xb選自L、E和D ; X。選自N、L和I ; Xd選自R和K ; Xe選自D和K ;和 X5選自Y和F ; X8選自N、R和S ; X9 選自 V、I、L、M、F和 Y ; Xn選自N、S、E和D ; X12選自R、K和N ; X14選自K和R ; X2。選自 D、N、Q、E、H、S、I^PK; X23選自K、I和T ; 選自 A、S、T、G、H、L 和 D ;和 X25選自H、E和D。
21. 權(quán)利要求20的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含包括以下的氨基酸序列： 式（iii) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP (SEQ ID NO: 678)，其中彼此獨立地，X3選自E、S、Q和C ;X6選自E、S和C ;X7選自A和S ;X10 選自A、S和R ;X14選自A、S、C和K ;第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和第46位的脯 氨酸是存在或不存在的。
22. 權(quán)利要求20的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含包括以下的氨基酸序列： 式（iv)與（iii)中定義的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，條件是X7不是L、E或 D ;或者備選地，條件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申請?zhí)朩0 2009/016043中定義的 下列序列所定義：LAEAK Xa Xb A X。Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I Xn X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此獨立地，Xa 選自 V 和 E ;Xb 選自 L、E 和D ;X。選自N、L和I ;Xd選自R和K ;Xe選自D和K ;和X5選自Y和F ;X8選自N、R和S ;X9 選自V、I、L、M、F和Y;Xn選自N、S、E和D;X12選自R、K和N;X14選自K和R;X 2Q選自D、N、 Q、E、H、S、R 和 K ;X23 選自 K、I 和 T ;X24 選自 A、S、T、G、H、L 和 D ;和 X25 選自 Η、E 和 D。
23. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X6為S (SEQ ID NO: 951) 。
24. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X6為E (SEQ ID NO: 952) 。
25. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X3為S (SEQ ID NO: 953) 。
26. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X3為E (SEQ ID NO: 954) 。
27. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X3為Q (SEQ ID NO: 955) 。
28. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X7為A (SEQ ID NO: 956) 。
29. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X7為S (SEQ ID NO: 957) 。
30. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X10為A (SEQ ID NO: 958) 。
31. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X10為S (SEQ ID NO: 959) 。
32. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X10為R (SEQ ID NO: 960) 。
33. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X14為S (SEQ ID NO: 961) 。
34. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X14為C (SEQ ID NO: 962) 。
35. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X14為K (SEQ ID NO: 963) 。
36. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X14為A (SEQ ID NO: 964) 。
37. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X26為D (SEQ ID NO: 965) 。
38. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X26為E (SEQ ID NO: 966) 。
39. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X39為D (SEQ ID NO: 967) 。
40. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X39為E (SEQ ID NO: 968) 。
41. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X40為A (SEQ ID NO: 969) 。
42. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X40為E (SEQ ID NO: 970) 。
43. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X43為A (SEQ ID NO: 971) 。
44. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X43為K (SEQ ID NO: 972) 。
45. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X44為A (SEQ ID NO: 973) 。
46. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X44為S (SEQ ID NO: 974) 。
47. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中X44為E (SEQ ID NO: 975) 。
48. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中第45位的亮氨酸是存在 的（SEQ ID NO: 976)。
49. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中第45位的亮氨酸是不存 在的（SEQ ID NO: 977)。
50. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中第46位的脯氨酸是存在 的（SEQ ID NO: 978)。
51. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中在ABD中第46位的脯氨酸是不存 在的（SEQ ID NO: 979)。
52. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD與白蛋白結(jié)合，使得相互 作用的匕"值為至多5 X 10-5 s-1。
53. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD與白蛋白結(jié)合，使得相互 作用的匕"值為至多5 X 10-6 s-1。
54. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD序列選自本文所公開的 或來自表1的或來自圖1的或SEQ ID NO: 301-444的ABD序列中的任一個。
55. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD序列選自以下氨基酸序 列：所述氨基酸序列選自 SEQ ID N0:304-305、SEQ ID N0:307-308、SEQ ID N0:310-311、 SEQ ID NO:313-314、SEQ ID NO:316-317、SEQ ID NO:319-320、SEQ ID NO:322-323、SEQ ID NO:325-326, SEQ ID NO:328-329, SEQ ID NO:331-332, SEQ ID NO:334-335, SEQ ID NO: 337-338、SEQ ID NO: 341-342 和 SEQ ID NO: 349-350 中的任一個。
56. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含選自來自表1或 圖1的序列中任一個的氨基酸序列的序列。
57. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD序列還包含一個或多個 另外的氨基酸殘基，其位于式（i)或（iii)中定義的序列的N-端和/或C-端。
58. 前述權(quán)利要求的工程改造的多肽，其中所述一個或多個另外的氨基酸殘基包括在 ABD序列的N-端的絲氨酸殘基。
59. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述一個或多個另外的氨基酸殘 基包括在ABD序列的N-端的甘氨酸殘基。
60. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述一個或多個另外的氨基酸殘 基包括在ABD序列的N-端的谷氨酸殘基或半胱氨酸殘基。
61. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述一個或多個另外的氨基酸殘 基包括在ABD序列的N-端的丙氨酸殘基。
62. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述一個或多個另外的氨基酸殘 基包括在ABD序列的C-端的甘氨酸殘基。
63. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述一個或多個另外的氨基酸殘 基包括在ABD序列的C-端的半胱氨酸殘基。
64. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD包含選自SEQ ID N0:445-450和SEQ ID N0:462-463中任一個的氨基酸序列。
65. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD包含不超過兩個半胱氨 酸殘基。
66. 前述權(quán)利要求的工程改造的多肽，其中所述ABD包含不超過一個半胱氨酸殘基。
67. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述毒蜥外泌肽序列或毒蜥外泌 肽類似物序列或其片段與所述ABD序列經(jīng)由所述多肽的第X 14位的半胱氨酸殘基的硫醇基 綴合。
68. 權(quán)利要求1的工程改造的多肽，其中所述ABD為GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDK AKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 463)或GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEAL· KDAILAAL (SEQ ID NO: 700)。
69. 權(quán)利要求1的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包含選自以下的肽序列中的任一 個：來自表1、圖1或本文任一個表的序列。
70. 權(quán)利要求1-69中任一項的工程改造的多肽，其中所述ABD序列包括與式i)或iii) 的ABD、或與表1、圖1或本文任一個表的ABD中的任一個具有至少95%同一性的ABD類似 物。
71. 權(quán)利要求1-70中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1是1-30個氨基酸或 少于30個氨基酸的肽。
72. 權(quán)利要求1-71中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1選自20個天然存在 的氨基酸。
73. 權(quán)利要求1-72中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1包含非天然氨基酸， 所述非天然氨基酸通過化學(xué)合成、翻譯后化學(xué)修飾摻入或者通過宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)在 體內(nèi)摻入。
74. 權(quán)利要求1-73中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1氨基酸選自甘氨酸、 丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。
75. 權(quán)利要求1-74中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1氨基酸為甘氨酸。
76. 權(quán)利要求1-74中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1包含的大多數(shù)氨基酸 是無空間位阻的。
77. 權(quán)利要求1-76中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1包括多聚甘氨酸、多 聚丙氨酸、多聚（Gly-Ala)或多聚（Gly-Ser)。
78. 權(quán)利要求1-77中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1包括序列（Gly) 3、 (Gly)4 (SEQ ID NO: 125)、或（Gly)5 (SEQ ID NO: 126)、（Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO: 131) ； (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 132) ； (Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO: 133)； GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 134)、GG、GGG、GGS 或 GGGS (SEQ ID NO: 192)。
79. 權(quán)利要求1-74中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭LI包含Gly和Ala的組 合。
80. 權(quán)利要求1-74中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1包含Gly和Ser的組 合。
81. 權(quán)利要求1-80中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1選自富含甘氨酸的 肽。
82. 權(quán)利要求1-81中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1包含N-端TG二肽。
83. 權(quán)利要求1-82中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1包含C-端AS二肽。
84. 權(quán)利要求1-83中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1包含N-端TG二肽和 C-端AS二肽。
85. 權(quán)利要求1-84中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭L1選自TG-(GGGS)1 (SEQ ID NO: 848)、TG-(GGGS) 2 (SEQ ID NO: 849)、TG-(GGGS) 3 (SEQ ID NO: 850)、 TG-(GGGS)4 (SEQ ID NO: 851)、TG-(GGGS)5 (SEQ ID NO: 852)、（GGGS)l-AS (SEQ ID NO: 853)、（GGGS) 2-AS (SEQ ID NO: 854)、（GGGS) 3-AS (SEQ ID NO: 855)、（GGGS) 4-AS (SEQ ID NO: 856)、（GGGS) 5-AS (SEQ ID NO: 857)、TG-(GGGS) 1-AS (SEQ ID NO: 195)、 TG-(GGGS) 2-AS (SEQ ID NO: 858)、TG-(GGGS) 3-AS (SEQ ID NO: 859)、TG-(GGGS) 4-AS (SEQ ID NO: 860)和 TG-(GGGS)5-AS (SEQ ID NO: 861)。
86. 權(quán)利要求1-85中任一項的工程改造的多肽，其中所述接頭LI TG和/或AS是不存 在的或被選自T、A、S和G的一對氨基酸置換。
87. 權(quán)利要求1-86中任一項的工程改造的多肽，其對血清白蛋白具有小于約ΚΓ6 mol/ L解離常數(shù)的親和力。
88. 權(quán)利要求87的工程改造的多肽，其對血清白蛋白具有小于約ΚΓ9 mol/L解離常數(shù) 的親和力。
89. 權(quán)利要求88的工程改造的多肽，其對血清白蛋白具有小于約ΚΓ12 mol/L解離常數(shù) 的親和力。
90. 權(quán)利要求1-89中任一項的工程改造的多肽，其中所述多肽具有至少1天的作用持 續(xù)時間。
91. 權(quán)利要求90的工程改造的多肽，其中所述多肽具有至少3天的作用持續(xù)時間。
92. 權(quán)利要求91的工程改造的多肽，其中所述多肽具有至少6天的作用持續(xù)時間。
93. 權(quán)利要求92的工程改造的多肽，其中所述多肽在人受試者中具有至少6天的作用 持續(xù)時間。
94. 權(quán)利要求91的工程改造的多肽，其中所述多肽具有至少7天的作用持續(xù)時間。
95. 權(quán)利要求92的工程改造的多肽，其中所述多肽在人受試者中具有至少7天的作用 持續(xù)時間。
96. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽選自本文表 2或表3的序列中的任一個。
97. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽選自：HGEGT FTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVE ALKDAILAALP (SEQ ID NO: 727), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASG SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 728), HGEGTFTSDLSK QLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDA ILAAL (SEQ ID NO: 729), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAK EAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 730), HGEGTFTSDLSKQMEEEA VRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 731), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSD FYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 732), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPS SGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 733), HGE GTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEG VEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 734), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSAS GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 735), HGEGTFTSDLSK QLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDA ILAA (SEQ ID NO: 736).HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEA ANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 737), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRL FIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 738), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKT VEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 739), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSA SGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 740), HGEGTFTSDLSK QLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDA ILAA (SEQ ID NO: 741), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKE AANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 742), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRL FIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 743), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKR LIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 744)和HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPP PSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAA (SEQ ID NO: 745)〇
98. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽選自：HGEGT FTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVE ALKDAILAALP (SEQ ID NO: 727), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASG SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 728), HGEGTFTSDLSK QLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDA ILAAL (SEQ ID NO: 729), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAK EAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 730), HGEGTFTSDLSKQMEEEA VRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 731), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSD FYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 732).HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSS GAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 733).HGEGT FTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVE ALKDAILAAL (SEQ ID NO: 734), HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPKSTGGGGSASGS LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 735), HGEGTFTSDLSKQM EEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAIL AAL (SEQ ID NO: 737), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDS YGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAAL (SEQ ID NO: 738)和HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLK NGGPSSGAPPPSGGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILML (SEQ ID NO: 739)〇
99. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中工程改造的多肽包括Cmpd 5、 Cmpd 9 或 Cmpd 11。
100. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中工程改造的多肽與所述工程改造 的多肽具有至少95%的序列同一性。
101. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中工程改造的多肽與所述工程改造 的多肽具有至少98%的序列同一性。
102. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，與將毒蜥外泌肽給予哺乳動物后誘發(fā) 的免疫反應(yīng)相比，將所述工程改造的多肽給予哺乳動物后不誘發(fā)免疫反應(yīng)或誘發(fā)降低的免 疫反應(yīng)，所述毒蜥外泌肽沒有連接到所述ABD或者連接到如本文所述在PCT公布申請?zhí)朤O 2009/016043中所描述的未經(jīng)修飾以降低免疫原性的ABD。
103. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其用作藥物。
104. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有適于每 日給予兩次的血漿半壽期。
105. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有適于每 日給予一次的血楽半壽期。
106. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有適于每 周給予兩次的血漿半壽期。
107. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有適于每 周給予一次的血楽半壽期。
108. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有至少 40小時的血漿半壽期。
109. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有至少 60小時的血漿半壽期。
110. 前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽具有至少 72小時的血漿半壽期。
111. 包含前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合 物。
112. 權(quán)利要求111的組合物，其是水性的。
113. 權(quán)利要求111的組合物，其是固體。
114. 前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其用作藥物。
115. 前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述工程改造的多肽是凍干固體。
116. 前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其還包含人血清白蛋白。
117. 包含前述權(quán)利要求中任一項的工程改造的多肽的藥物組合物。
118. 權(quán)利要求117的藥物組合物，其包含所述工程改造的多肽和藥學(xué)上可接受的賦形 劑。
119. 權(quán)利要求117-118中任一項的藥物組合物，其是水性的。
120. 權(quán)利要求117-118中任一項的藥物組合物，其是固體。
121. 權(quán)利要求117-120中任一項的藥物組合物，其用作藥物。
122. 前述權(quán)利要求中任一項的藥物組合物，其中所述工程改造的多肽是凍干固體。
123. 權(quán)利要求117-122中任一項的藥物組合物，還包含人血清白蛋白。
124. 權(quán)利要求117-123中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是用于肌內(nèi)、靜 脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)、粘膜、口服、鼻、舌下、肺或含服遞送的藥物組合物。
125. 權(quán)利要求124的藥物組合物，其中所述藥物組合物是用于皮下遞送的藥物組合 物。
126. 權(quán)利要求117-125中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是用于通過注射 遞送的藥物組合物。
127. 權(quán)利要求124的藥物組合物，其中所述藥物組合物是用于口服遞送的藥物組合 物。
128. 權(quán)利要求127的藥物組合物，其中所述藥物組合物是用于口服遞送的藥物組合 物，并且包括固體形式。
129. 權(quán)利要求128的藥物組合物，其中所述藥物組合物是用于口服遞送的藥物組合 物，并且包括片劑、顆粒劑、微粒劑或膠囊劑。
130. 權(quán)利要求117-129中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是持續(xù)釋放的或 長效的藥物組合物。
131. 權(quán)利要求117-130中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是每日給予兩次 的藥物組合物。
132. 權(quán)利要求117-130中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是每日給予一次 的藥物組合物。
133. 權(quán)利要求117-130中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是每周給予兩次 的藥物組合物。
134. 權(quán)利要求117-130中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是每周一次的藥 物組合物。
135. 權(quán)利要求117-134中任一項的藥物組合物，其用于治療需要所述治療的受試者的 疾病或病癥。
136. 權(quán)利要求135的藥物組合物，其中所述疾病或病癥是糖尿病、超重、肥胖、阿爾茨 海默氏病、帕金森病、脂肪肝病、血脂障礙、冠心病、中風(fēng)、短腸綜合征（SBS)、高血脂、非酒精 性脂肪肝炎（NASH)、非酒精性脂肪肝病（NAFLD)、無癥狀性低血糖（HU)、包括結(jié)節(jié)病的限制 性肺病或代謝綜合征X。
137. 權(quán)利要求136的藥物組合物，其中所述疾病或病癥是糖尿病、超重、肥胖、SBS或帕 金森病。
138. 權(quán)利要求137的藥物組合物，其中所述糖尿病是I型糖尿病、II型糖尿病、前驅(qū)糖 尿病、妊娠糖尿病、HIV治療誘導(dǎo)的糖尿病、類固醇誘導(dǎo)的糖尿病或成人中潛在的自身免疫 糖尿?。↙ADA)。
139. 權(quán)利要求1-138中任一項的工程改造的多肽或藥物組合物，其中所述工程改造的 多肽規(guī)定一周給予一次。
140. 用于在受試者中治療疾病或病癥的方法，包括將權(quán)利要求1-110和139中任一項 的工程改造的多肽以有效治療所述疾病或病癥的量給予對其有需要的受試者。
141. 權(quán)利要求140的方法，其中所述疾病或病癥是糖尿病、超重、肥胖、阿爾茨海默氏 病、帕金森病、脂肪肝病、血脂障礙、冠心病、中風(fēng)、短腸綜合征（SBS)、高血脂、非酒精性脂肪 肝炎（NASH)、非酒精性脂肪肝?。∟AFLD)、無癥狀性低血糖（HU)、包括結(jié)節(jié)病的限制性肺病 或代謝綜合征X。
142. 權(quán)利要求140的方法，其中所述疾病或病癥是糖尿病、超重、肥胖、阿爾茨海默氏 病、脂肪肝病、血脂障礙、冠心病、中風(fēng)、SBS、高血脂或帕金森病。
143. 權(quán)利要求142的方法，其中所述疾病或病癥是糖尿病、超重、肥胖、SBS或帕金森 病。
144. 權(quán)利要求143的方法，其中所述疾病或病癥是I型糖尿病、II型糖尿病或前驅(qū)糖 尿病。
145. 權(quán)利要求142的方法，其中所述疾病或病癥是II型糖尿病。
146. 權(quán)利要求142的方法，其中所述疾病或病癥是血脂障礙或高血脂。
147. 編碼權(quán)利要求1-110和139中任一項的工程改造的多肽的多核苷酸。
148. 包含權(quán)利要求147的多核苷酸的表達(dá)載體。
149. 包含權(quán)利要求148的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
150. 制備權(quán)利要求1-110和139中任一項的工程改造的多肽的方法，包括表達(dá)編碼所 述工程改造的多肽的多核苷酸。
151. 使用氨基酸和/或具有受保護(hù)反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸衍生物，通過非生物學(xué)肽合成 制備權(quán)利要求1-110和139中任一項的工程改造的多肽的方法，所述非生物學(xué)肽合成包括： 分步偶聯(lián)氨基酸和/或氨基酸衍生物，以形成具有受保護(hù)反應(yīng)性側(cè)鏈的前述權(quán)利要求中任 一項的多肽，從多肽的反應(yīng)性側(cè)鏈上除去保護(hù)基，并將得到的多肽在水性溶液中折疊。
152. 制備權(quán)利要求1-110和139中任一項的工程改造的多肽的方法，包括：制備毒蜥 外泌肽，制備ABD，并將所制備的ABD與所制備的毒蜥外泌肽綴合。
【文檔編號】C07K1/00GK104271588SQ201280043730
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月8日
【發(fā)明者】M.埃里克森, D.C.利青格爾, S.S.高希, Z.郭, M.P.薩曼特, A.沙馬, L.馬梅多瓦, O.E.萊維, C.?？瞬祭瓘? 申請人:安米林藥品有限責(zé)任公司, 阿斯利康制藥有限公司