專(zhuān)利名稱(chēng)：用于植入前因子的新型檢測(cè)方法以及植入前因子肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植入前因子(preimplantation factor,以下簡(jiǎn)稱(chēng)為PIF),它是受孕和胚胎可存活性(embryo viability)的早期標(biāo)志物。本發(fā)明還涉及檢測(cè)PIF活性的新方法，以及PIF肽。
2.
背景技術(shù)：
不育是困擾世界上數(shù)百萬(wàn)對(duì)夫婦的重要健康問(wèn)題。人類(lèi)孕體的早期死亡是一個(gè)常見(jiàn)現(xiàn)象，而這也是造成不育的一方面因素。在自然的單個(gè)胎兒(single conceptions)中，約有73%都在妊娠的第6周之前死亡(Boklage CE.，從受孕至足月生產(chǎn)之間人類(lèi)胎兒的存活概率.國(guó)際生育學(xué)雜志(Int J Fertil) 1990; 35:75)。這主要是由于在植入之前或植入后的很短時(shí)間內(nèi)所發(fā)生的早期胚胎死亡。大齡婦女的生育率較低，而由年輕婦女捐獻(xiàn)卵母細(xì)胞后生育率提高，與上述現(xiàn)象相關(guān)的數(shù)據(jù)表明對(duì)于獲得成功的妊娠而言，卵母細(xì)胞的質(zhì)量很重要(Navot D, Bergh PA, Williams MA等,較差的卵母細(xì)胞質(zhì)量而不是植入失敗引起了與年齡相關(guān)的雌性生育力的下降，柳葉刀(Lancet) 1991; 337:1375)。體外受精(in vitro fertilization,以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“IVF”)技術(shù)已經(jīng)被發(fā)展起來(lái)，用于解決不育的問(wèn)題。但是，在體外培養(yǎng)用于植入的胚胎時(shí)的人工條件下，維持胚胎的可存活性甚至更困難一些。在體外，胚胎的生長(zhǎng)速度要比在體內(nèi)時(shí)慢，通常只有25 — 65%的胚胎能夠發(fā)育到囊胚階段(在Gomel V, Leung PCK,編的“體外受精和輔助生殖”(Invitro fertilization and assisted reproduction)第 10屆世界大會(huì)(Procc 10th WorldCongress)，1997:1 中的 Gardner DK, Lane M, KOuridakis K, Schoolvcraft WB.,基于生理學(xué)復(fù)合體的無(wú)血清培養(yǎng)基增強(qiáng)哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育(Complex physiologically basedserum-free culture media increase mammalian embryo development))現(xiàn)有技術(shù)尚不倉(cāng)泛鑒別出那些可能植入和存活的胚胎。人絨毛膜促性腺激素(hCG)是目前正在使用的用于體內(nèi)受精和早期胚胎植入的標(biāo)志物，但是，它只有在植入后的幾天才能被檢測(cè)到。由于缺乏胚胎可存活性的適當(dāng)標(biāo)志物，因此，目前很多不能植入的胚胎都被轉(zhuǎn)移了，從而降低了獲得成功妊娠的機(jī)會(huì)。為了解決胚胎可能無(wú)法存活的問(wèn)題，更多數(shù)量的胚胎被同時(shí)轉(zhuǎn)移到了未來(lái)母親的體內(nèi)。大量胚胎的轉(zhuǎn)移可能導(dǎo)致多次懷孕(multiple pregnancies),這是固有的危險(xiǎn),但如果只轉(zhuǎn)移少量胚胎，又可能有沒(méi)有一個(gè)胚胎能植入的風(fēng)險(xiǎn)，從而失去一整個(gè)IVF周期。很明顯，需要改進(jìn)對(duì)胚胎的選擇，并定義準(zhǔn)確的標(biāo)志物以確定胚胎的可存活性。此外，使用非侵入性方法，通過(guò)在培養(yǎng)基中檢測(cè)對(duì)可存活的、能植入的胚胎特異的產(chǎn)物，將使得人們可以選擇出那些最有可能產(chǎn)生成功妊娠的胚胎，而不會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生傷害。決定妊娠成功與否的另一個(gè)因素是孕體與母體免疫系統(tǒng)之間的相互作用。在受精后的很短時(shí)間內(nèi)，應(yīng)該發(fā)生妊娠的系統(tǒng)母體識(shí)別(a systemic maternal recognition ofpregnancy)。由特異性早期胚胎信號(hào)所激發(fā)的母體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，可能是該過(guò)程中的關(guān)鍵。一旦卵母細(xì)胞被受精，合子直到孵化中的囊胚(hatching blastocyst)都被透明帶(thezone pellucida)所包圍，透明帶是堅(jiān)硬的半透明的膜。因此，當(dāng)胚胎還在輸卵管和子宮腔內(nèi)發(fā)育時(shí)，胚胎一母體之間的交流(communication)就已經(jīng)通過(guò)胚胎所分泌的化合物而同時(shí)發(fā)生了。

已經(jīng)表明，以孕婦的血清和可存活胚胎為條件的培養(yǎng)基，可以提高血小板和T淋巴細(xì)胞在⑶2抗體存在下形成玫瑰花結(jié)的量。正如在1997年7月8日授權(quán)的Barnea等人的美國(guó)專(zhuān)利5，646，003以及1999年11月9日授權(quán)的Barnea等人的美國(guó)專(zhuān)利5,981, 198中已經(jīng)公開(kāi)的那樣，植入前因子(PIF)的存在可以通過(guò)將淋巴細(xì)胞、血小板、來(lái)自懷孕受試者的熱失活的血清、豚鼠補(bǔ)體以及Tll (抗⑶2)單克隆抗體(Dakko，丹麥)混合在一起而檢測(cè)出來(lái)，其中，懷孕受試者的PIF提高了血小板和淋巴細(xì)胞之間形成的玫瑰花結(jié)的量。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PIF(i)由二細(xì)胞期前的可存活的早期人和小鼠胚胎所分泌；在IVF之后，在胚胎轉(zhuǎn)移后的3 — 4天，可以在外周循環(huán)中檢測(cè)到；(iii)與73%的帶回家的嬰兒有關(guān)，而在早期PIF陰性結(jié)果中則為3% ；(iv)在子宮內(nèi)受孕后5 — 6天可以檢測(cè)出來(lái)；(V)在未懷孕的血清或不可存活的胚胎中不存在；以及(vi)除了人之外，還存在于多種懷孕的哺乳動(dòng)物中，包括小鼠、馬、奶牛和豬。此外，如果發(fā)生自然流產(chǎn)，在hCG分泌減少前的兩周，就已經(jīng)觀(guān)察到了 PIF從循環(huán)系統(tǒng)中的消失。在上述PIF檢測(cè)中所使用的單克隆抗體，其靶標(biāo)是被稱(chēng)為CD2的淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原。⑶2存在于約80 — 90%的人外周血淋巴細(xì)胞上，以及超過(guò)95%的胸腺細(xì)胞、所有形成紅細(xì)胞玫瑰花結(jié)的T淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞的一個(gè)亞型上。⑶2在T細(xì)胞活化中的各種作用已經(jīng)被提出，包括作為粘附分子以減小T細(xì)胞活化所需抗原的量，以及作為T(mén)細(xì)胞活化的共同刺激分子(costimulatory molecule)分子或直接促進(jìn)劑。而且，已經(jīng)暗示，0)2在誘導(dǎo)免疫無(wú)能、細(xì)胞因子生產(chǎn)的調(diào)節(jié)以及T細(xì)胞正選擇的調(diào)控中起作用。⑶2的天然配基是結(jié)構(gòu)相關(guān)的IgSF CAMs⑶58 (LFA-3)，一種組織分布較廣的細(xì)胞表面粘附配基。此外，⑶2可以與⑶48、⑶59以及⑶15 (Lewis x)相關(guān)的糖結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用。CD2以很低的親和力與CD58結(jié)合，而解離常數(shù)卻非常大。CD2及其配基CD58的側(cè)向再分布也影響了細(xì)胞粘附的強(qiáng)度。CD2粘附性的調(diào)控影響了 CD2增強(qiáng)抗原敏感度的能力。不能進(jìn)行親和力調(diào)控的CD2細(xì)胞系在抗原特異性應(yīng)答上表現(xiàn)出了明顯的不足。CD2親和力提高所產(chǎn)生的粘附力，直接為T(mén)細(xì)胞敏感度做出了貢獻(xiàn)，而后者與CD2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)無(wú)關(guān)。
3.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)PIF存在與否的分析方法，以及通過(guò)此方法鑒定出來(lái)的PIF肽。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)PIF的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法。它至少部分地基于如下觀(guān)察結(jié)果利用了熒光標(biāo)記的抗淋巴細(xì)胞和抗血小板的抗體的流式細(xì)胞術(shù)表明，在PIF存在下，玫瑰花結(jié)的形成增加。它還基于如下觀(guān)察結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)表明，在PIF存在下，與CD2結(jié)合的單克隆抗體減少了。本發(fā)明還涉及PIF肽，當(dāng)PIF肽被加入到Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)物中時(shí)，能夠觀(guān)察到它可以或者Q)減少抗CD2抗體與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合；(ii)增加Jurkat細(xì)胞中CD2的表達(dá)；或者(iii)降低Jurkat細(xì)胞的可存活性。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 ELISA檢測(cè)方法，可以通過(guò)確定待測(cè)樣品對(duì)抗CD2抗體與CD2底物相結(jié)合的效果而檢測(cè)PIF。
4.


圖1A-B.由小鼠胚胎培養(yǎng)物條件培養(yǎng)基(MECCM)的PIF純化；(A)示出了MECCM-3kDA超濾液的高效液相色譜(HPLC)的譜圖，所述超濾液先前已通過(guò)MabCD2親和層
析進(jìn)行了純化；(B)示出了在對(duì)(A)中得到的PIF活性級(jí)分進(jìn)行進(jìn)一步HPLC純化后的譜圖。圖2A-C.從MECCM純化得到的不同PIF肽的Western印跡分析；Mab⑶2被用作一抗，反意(anti-sense)小鼠馬辣根過(guò)氧化物酶(HRP) —生物素鏈霉親和素復(fù)合體被用作二抗。通過(guò)ECL檢測(cè)試劑(Amersham Pharmacia Biotech)鑒定特異性PIF帶。圖3A-B. (A)示出了在新鮮的培養(yǎng)基(CM)、小鼠胚胎培養(yǎng)物條件培養(yǎng)基(MECCM)和Mab⑶2的存在下，淋巴細(xì)胞一血小板玫瑰花結(jié)形成(L-P)的流式細(xì)胞儀測(cè)定。L(Mab⑶45-PE)和P (Mab⑶42a_FITC)的熒光標(biāo)記的特異抗體被用于檢測(cè)L-P復(fù)合物。與培養(yǎng)基(CM)相比，MECCM 的 L-P 形成要高 30 — 40%。(B)示出了 MECCM 對(duì) MabCD2 與 Jurkat細(xì)胞(JC)相結(jié)合的作用的FC。JC與樣品一起進(jìn)行溫育，并進(jìn)一步與Mab⑶2Cy5 —起進(jìn)行溫育。與⑶2結(jié)合的抗體被存在于MECCM中的PIF所降低。箭頭指出了 PIF活性。圖4A-C.從MECCM純化得到的PIF肽的質(zhì)譜譜圖。通過(guò)超濾、滲濾、HPLC, Mab⑶2親和層析以及進(jìn)一步的HPLC而從MECCM純化得到的PIF活性級(jí)分的分子量(MW)通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定。PIF 肽的 MW 為 A) 610 — 995Da ；B) 963 — 1848Da ；以及 C) 1807 — 1846Da。圖5A-F. PIF對(duì)在Jurkat細(xì)胞中的MabCD2結(jié)合(A)、熒光(B)和可存活性(C)的陰性作用以及PIF對(duì)MabCD2結(jié)合⑶、突光(E)和可存活性(F)的陽(yáng)性作用的流式細(xì)胞術(shù)分析。在陽(yáng)性樣品中，PIF與⑶2競(jìng)爭(zhēng)(箭頭指出了 PIF活性)。圖6.合成的PIF肽對(duì)Jurkat細(xì)胞CD2表達(dá)的影響。
5.
具體實(shí)施例方式在第一組實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于確定樣品中是否存在植入前因子的方法，該方法包括檢測(cè)樣品中是否含有抑制抗CD2抗體與CD2抗原相結(jié)合的成分的步驟；其中，抑制抗CD2抗體與CD2相結(jié)合的能力與植入前因子的存在之間具有正相關(guān)性。例如，此類(lèi)方法可以用于流式細(xì)胞術(shù)或者酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法之中，使用本領(lǐng)域公知的其他技術(shù)。在下面的第7部分中，介紹了用于檢測(cè)抗CD2抗體與CD2相結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)方法的一個(gè)非限制性實(shí)例。此處所使用的術(shù)語(yǔ)抗CD2抗體，可以是與CD2特異性結(jié)合的單克隆或多克隆抗體。Pharmigen就出售一種此類(lèi)的單克隆抗體(見(jiàn)下文)。⑶2抗原可以是純化⑶2抗原的形式，也可以由細(xì)胞所攜帶。在本發(fā)明的一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為Jurkat細(xì)胞。表達(dá)CD2的其他細(xì)胞系在本領(lǐng)域中是公知的。
樣品可以是血清樣品(例如，來(lái)自有待檢測(cè)受精/植入/胚胎存留的受試者的血清)，可以是培養(yǎng)液樣品(例如，為在IVF轉(zhuǎn)移前確定胚胎的可存活性)，也可以是有待檢測(cè)PIF肽是否存在的溶液(例如，在PIF作用劑的純化中；參見(jiàn)下面的第6部分)。受試者可以是人類(lèi)受試者(例如疑為已受孕的人)或非人類(lèi)受試者(例如農(nóng)業(yè)動(dòng)物或動(dòng)物園的動(dòng)物)。在第二組實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于確定樣品中是否存在植入前因子的方法，包括通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣品中是否含有能增加淋巴細(xì)胞、血小板和抗⑶2抗體之間形成的玫瑰花結(jié)的成分的步驟，其中，玫瑰花結(jié)形成量的增加與植入前因子的存在之間具有正相關(guān)性。例如，此類(lèi)檢測(cè)可以通過(guò)使用熒光標(biāo)記的以淋巴細(xì)胞和血小板為靶標(biāo)的抗體而進(jìn)行，其中，最好對(duì)抗血小板和抗淋巴細(xì)胞的抗體使用不同的標(biāo)記。所述的增加是相對(duì)于已知的陰性對(duì)照而言的。本發(fā)明也提供了下列分離的肽(I)-種分離的肽，具有選自由如下成員所構(gòu)成的組的序列=Met-Val-Arg-Ile-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala;Met-Val-Arg-IIe-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser;Met-Val-Arg-Ile-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser-Asp;以及 Met-Val-Arg-Ile-Lys-Pro-Gly-Ser-Ala-Asn-Lys-Phe-Ser-Asp-Asp,或者一種包含所述肽的分離的肽,能夠與抗⑶2抗體相結(jié)合并且不是環(huán)子孢子蛋白(circumsporooite protein)；(2) 一種具有序列 Ser-Gly-Ile-Val-Ile-Tyr-Gln-Tyr-Met-Asp-Asp-Arg-Tyr-Val-Gly-Ser-Asp-Leu的分離的肽，或者一種包含所述肽的分離的肽，能夠與抗⑶2抗體相結(jié)合并且不是HIV蛋白；(3) 一種具有序列 Val-Ile-Ile-Ile-Ala-Gln-Tyr-Met-Asp 的分離的妝，或者一種包含所述肽的分離的肽，能夠與抗CD2抗體相結(jié)合；以及(4) 一種分離的肽，具有選自由如下成員所構(gòu)成的組的序列Ser-Gln-Ala-Val-GIn-Glu-His-Ala-Ser-Thr 以及 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr-Asn-Xaa-Gly，其中Xaa可以是任何氨基酸，或者一種包含所述肽的分離的肽，能夠與抗CD2抗體相結(jié)合并且不是人類(lèi)類(lèi)維生素A (retinoid)和甲狀腺激素的沉默介質(zhì)(silencing mediator)。(5) 一種具有序列 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr-Asn-Met-Gly 的分離的肽。6.實(shí)施例PIF肽的鑒定通過(guò)超濾、凍干、高效液相色譜(HPLC)、親和層析和western印跡,將PIF從大體積的MECCM中分離出來(lái)。二細(xì)胞(two-cell-to)囊胚期的小鼠胚胎在含有下列成分的Ham’sF-IO培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)天青霉素、鏈霉素、MgS04、NaHC03、KHC03和乳酸鈣，此外還添加O. 1%的BSA。使用前，MECCM 一直儲(chǔ)存在一 80°C。將一升MECCM利用Amicon 膜(3kDa截止；YM_3kDa, Amicon. Millipore Co.,美國(guó))通過(guò)超濾進(jìn)行純化。利用300ml純水對(duì)濃縮的MECCM進(jìn)行進(jìn)一步的滲濾。此外，也以同樣的方式對(duì)新鮮的培養(yǎng)基(CM，不含胚胎)進(jìn)行處理。只有MECCM-3kDa超濾液和滲濾液表現(xiàn)出了 PIF活性，然后它們被收集起來(lái)并通過(guò)凍干法濃縮。已經(jīng)觀(guān)察到，PIF能夠結(jié)合抗⑶2單克隆抗體(Mab⑶2)。因此，首先通過(guò)親和層析將PIF活性部分進(jìn)行純化，其中使用了瓊脂糖-酰肼-MabCD2活化膠。按下述方法制備抗體親和基質(zhì)。通過(guò)Econo-Pac IODG脫鹽柱，將I. 5mg Mab⑶2 (cloneRPA-2. 10, Pharmigen, Becton Dickinson)與pH 5· 5的偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行緩沖液交換,并進(jìn)一步用高碘酸鈉氧化，并偶聯(lián)至2ml的瓊脂糖-酰肼活化膠上，可以按照制造商提供的說(shuō)明進(jìn)行(Affi-gel Hidrazide免疫親和試劑盒，BioRad實(shí)驗(yàn)室，加州，美國(guó))。然后，利用MabCD2親和層析柱(10x20mm)對(duì)Mab⑶2 — 3kDa超濾液一滲濾液凍干粉進(jìn)行進(jìn)一步純化。將2gMECCM - 3kDa粉末溶于IOml純水中，將pH調(diào)至中性，通過(guò)O. 22m注射器無(wú)菌濾器(CorningInc. , NY,美國(guó))進(jìn)行過(guò)濾，并在重力流動(dòng)的情況下通過(guò)親和層析柱5次。所述柱子用5柱床體積的PH 7. 2的IOOmM磷酸鹽緩沖液沖洗，然后用5柱床體積的O. 5MNaCl沖洗。

結(jié)合上的PIF用3ml O. IM的乙酸洗脫下來(lái)。將洗下PIF的級(jí)分收集起來(lái)，進(jìn)行PIF活性檢測(cè)，并通過(guò)凍干法濃縮?？偭繛?00mg的經(jīng)親和層析進(jìn)一步純化的MECCM_3kDa超濾液被分為三批，在Clipeus C18 制備性柱(Higgins Analytical, Inc.,美國(guó))上進(jìn)行 HPLC。制備性 HPLC 的運(yùn)行參數(shù)為:流速，15ml/min。緩沖液:A = O. I %三氟乙酸(TFA);B = O. I % TFA，溶于99. 9%乙腈中(CH3CN)15梯度0% B，5分鐘，加上O — 60% B 30分鐘，以及O — 100% B 3分鐘。通過(guò)蒸發(fā)進(jìn)一步濃縮HPLC的級(jí)分。將HPLC濃縮的級(jí)分的pH值調(diào)至中性，并再次檢測(cè)PIF活性。幾個(gè)級(jí)分表現(xiàn)出較高的PIF活性(參見(jiàn)圖1A)。這些級(jí)分通過(guò)附加的HPLC，在Vydac C8分析柱(4.6x250mm;Hesperia,加州，美國(guó))上加以純化。附加HPLC的運(yùn)行參數(shù)為流速，lml/min。緩沖液A = O. I %三氟乙酸(TFA);B = O. 1% TFA，溶于99. 9%乙腈中(CH3CNX梯度0% B，5分鐘，加上O — 60% B 30分鐘，以及O — 100% B 3分鐘。幾個(gè)洗脫級(jí)分表現(xiàn)出PIF活性(參見(jiàn)圖1B)，并被進(jìn)一步測(cè)序以確定其氨基酸組成，通過(guò)質(zhì)譜確定它們的分子量(MW)。 由MECCM純化得到的PIF活性級(jí)分在Western印跡(“WB”)中給出了正信號(hào)。在WB中，使用CM超濾凍干部分的溶液作為陰性對(duì)照。WB的條件如下。對(duì)于膠，使用了 SDS-PAGE預(yù)裝膠(pre-casting gels) (BioRad),具有16. 5%瓊脂糖分離膠和4%瓊脂糖濃縮膠。跑膠的溶液中含有 IOOmM Tris, IOOmM Tricine, O. 1%SDS, pH 8.3 (Tris-Tricine 跑膠緩沖液)。由30微升PIF-MECCM純化級(jí)分和10微升Tricine上樣緩沖液[200mMTris (三羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl) pH 6. 8，2 %十二烷基磺酸鈉(SDS)，40%甘油，O. 04%考馬斯亮藍(lán)(CBB-G250) ] (BioRad)組成的樣品，在95°C下溫育5分鐘。冷卻后，將樣品加入到SDS聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)的上樣孔中。為了確定低分子量(MW)多肽的分子量，將10微升用水按1:20稀釋的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)物(BioRad)加入到每塊膠的一個(gè)孔中。電泳時(shí)，樣品和標(biāo)準(zhǔn)物在175v下跑5分鐘，然后在60v下跑I小時(shí)。然后，將獲得的膠進(jìn)行電印跡(electro-blot),使用IOOmM pH為11的CAPS [3-(環(huán)己氨基)-1-丙磺酸]緩沖液作為轉(zhuǎn)移緩沖液。電印跡在80mA下進(jìn)行I小時(shí)，轉(zhuǎn)移到0. 22 μ m硝酸纖維素膜(BioRad)上。然后，利用5 %的封閉溶液(Amersham, Pharmacia, Biotech, NJ,美國(guó))在室溫下封閉硝酸纖維素膜18小時(shí)，然后利用PBS-T[磷酸鹽緩沖液一 0. 05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯(Tween 20)]沖洗4次，持續(xù)20分鐘。進(jìn)行一抗溫育時(shí)，已封閉的膜于室溫下在2 μ g/ml的Mab⑶2 (Pharmigen) — PBS 一 T溶液中溫育2小時(shí),然后按上述方法沖洗。進(jìn)行二抗溫育時(shí)，膜于室溫下在馬抗小鼠IgG —辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物(I : 1000，溶于PBS -T)溶液中溫育I小時(shí)。然后，通過(guò)ECL-化學(xué)熒光系統(tǒng)(Amersham)使PIF帶可見(jiàn)。圖2示出了從MECCM純化得到的PIF肽的典型WB。用于測(cè)定PIF的流式細(xì)胞術(shù)(FC)被發(fā)展起來(lái)，提高了美國(guó)專(zhuān)利5，646，003和5，981，198中所介紹的方法的效率和重現(xiàn)性。尤其是，采用懷孕和未懷孕的人和豬血清，MECCM，CM以及分離的PIF級(jí)分，通過(guò)FC對(duì)玫瑰花結(jié)的形成進(jìn)行了評(píng)估，利用了 Mab⑶2或MabCD2-Cy5 (Cy-鉻偶聯(lián)的抗體)，MabCD45_PE (藻紅蛋白偶聯(lián)的抗體)以及MabCD41a_FITC(異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的抗體)，所有的抗體都來(lái)自Pharmigen。MECCM與CM相比，其標(biāo)記的P-L復(fù)合體比例要高30 - 40% (圖3A)。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)分析中MECCM或懷孕的血清與固定化Mab⑶2的預(yù)溫育，阻止了 P-L的形成。在檢測(cè)分析中，向L-P中加入Mab⑶58(淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的抗原-3或LFA-3)抗體并不能通過(guò)PIF活性樣品的作用而完全阻止玫瑰花結(jié)的形成。發(fā)展了一種利用Jurkat細(xì)胞(JC)和MabCD2_Cy5的FC-PIF定量檢測(cè)法(圖3B)。使用無(wú)限增殖的淋巴細(xì)胞系后，就不再需要新鮮的供體血液以通過(guò)生物測(cè)定法評(píng)估PIF活
性。已經(jīng)確認(rèn)JC-FC檢測(cè)對(duì)于人血清樣品(參加表I)而言是有效的，并且在PIF純化期間被用于評(píng)估級(jí)分的PIF活性。純化的PIF活性級(jí)分的MW通過(guò)質(zhì)譜分析測(cè)定,利用產(chǎn)自Perspective Biosystems(Cambridge, MA,美國(guó))的 Voyager-RP Biospectrometry MALDI-TOF 工作站。將樣品與基質(zhì)相混合，其中，所述基質(zhì)存在于乙腈水為I '2的混合物中，并含有1%的三氟乙酸。譜圖為約200次掃描的平均值。來(lái)自MECCM的PIF肽的MW在610 — 1845Da之間(圖4)。此外，已經(jīng)評(píng)估出了 PIF-活性級(jí)分與Mab⑶2的預(yù)溫育消除了該P(yáng)IF-活性。這些數(shù)據(jù)表明，PIF可能是⑶2或同源肽的一部分。然而，在對(duì)純化的PIF肽進(jìn)行測(cè)序之后，證明了這些肽并不是CD2的一部分，而且，它們的氨基酸序列是獨(dú)特的。通過(guò)JC-FC檢測(cè)證明，MEECM-PIF肽對(duì)T細(xì)胞所表達(dá)的⑶2有三種不同的作用。這些作用涉及減小Mab⑶2與JC的結(jié)合；通過(guò)JC對(duì)⑶2表達(dá)進(jìn)行向上調(diào)節(jié)(up-regulating);或降低JC的可存活性。從小鼠胚胎中得到的純化PIF活性級(jí)分通過(guò)Edman降解進(jìn)行測(cè)序，采用AppliedBiosystems脈沖液體測(cè)序儀(Pulsed Liquid Sequencer)(型號(hào)477A)。用異硫氰酸苯酯對(duì)釋放出來(lái)的氨基酸進(jìn)行衍生處理，以便得到PTH-氨基酸，PTH-氨基酸可以通過(guò)在與測(cè)序儀配合的HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行的反向HPLC檢測(cè)出來(lái)。幾種PIF級(jí)分得到了獨(dú)一無(wú)二的序列。幾種肽給出的序列，其N(xiāo)端的九個(gè)或十個(gè)殘基是完全相同的，這表明這些肽是由相同的分子(參見(jiàn)表II)截短后得到的不同形式。PIF肽被確定為至少三個(gè)獨(dú)特的家族，為來(lái)源于胚胎的或妊娠相關(guān)的小肽。包括三種PIF肽的一個(gè)家族的氨基酸序列與環(huán)子孢子蛋白(Circumsporozoite protein) (_原蟲(chóng)惡性痕原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum))的一個(gè)區(qū)域100%匹配。PIF肽的這一家族通過(guò)JC向上調(diào)節(jié)⑶2的表達(dá)。一種與上述PIF肽家族只有前五個(gè)氨基酸殘基相同的PIF肽(14個(gè)氨基酸)，以及另一種與HIV-I RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶，EC 2. 7. 7. 49 )序列有11個(gè)氨基酸匹配的PIF肽(18個(gè)氨基酸)，也可以通過(guò)JC向上調(diào)節(jié)⑶2的表達(dá)。此外，另一個(gè)包括兩個(gè)PIF肽(9個(gè)和13個(gè)氨基酸)的家族與人受體作用因子(receptor-interacting factor)的序列有10個(gè)氨基酸匹配,后者為類(lèi)維生素A和甲狀腺激素的沉默介質(zhì)(a silencing mediator for retinoid and thyroid hormonereceptor, SMRT)(Chen and Evans, 1995)。該 PIF 肽家族的更短的成員表現(xiàn)出了對(duì) MabO)2與JC結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用，而且更長(zhǎng)的PIF肽降低了 JC的可存活性。值得注意的是，由核受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默在發(fā)育、分化和腫瘤形成中很重要。PIF肽通過(guò)固相肽合成(SPPS)法進(jìn)行合成,使用Applied Biosystems肽合成儀，采用Fmoc (9-芴甲氧羰基)化學(xué)法，其中每個(gè)氨基酸的氨基氮都被Fmoc所封閉。偶聯(lián)時(shí)，利用 3mol/ml 的 2-(1H-苯并三唑-I-基)-1，I, 3, 3-tetrametyIuronium 四氟硼酸酯/I-輕基苯并三唑，在二異丙基乙胺存在下，將N端已被保護(hù)起來(lái)的氨基酸的羧基活化。然后，將活化的氨基酸順序地加入到新生的肽上。在合成完成后，通過(guò)反向HPLC進(jìn)行最后的純化，并通過(guò)MALDI-T0F質(zhì)譜和氨基酸分析對(duì)其加以確認(rèn)。PIF合成肽在J urkat細(xì)胞的⑶2現(xiàn)象中表現(xiàn)出相似的作用(圖6)，也可以被Mab⑶2免疫檢測(cè)到。 7.用于PIF的流式細(xì)胞術(shù)7. I 材料材料包括Jurkat白血病細(xì)胞(JC);克隆培養(yǎng)基；用于流式細(xì)胞儀測(cè)量的Falcon管；Mab CD2_Cy5 (Cy-絡(luò)偶聯(lián)的抗體，clone RPA-2. 10, Pharmigen, Becton Dickinson)；生物樣品(可以是有待檢測(cè)PIF活性的人血清，也可以是假定的或合成的PIF肽的溶液)；PBS - 2%BSA (IOOmM磷酸鹽緩沖液一 2%牛血清清蛋白；陰性對(duì)照)；臺(tái)盼藍(lán)染液；C02細(xì)胞培養(yǎng)箱；流式細(xì)胞儀。7. 2 方法制備JC懸液■利用臺(tái)盼藍(lán)排阻染色法檢測(cè)JC培養(yǎng)物的可存活性。細(xì)胞的可存活性應(yīng)該在80 — 90% 之間?！鲇?IOml PBS — 2%BSA 沖洗 JC 兩次。■在克隆培養(yǎng)基或PBS - 2%BSA中制備JC懸液，含有5，000, 000細(xì)胞/毫升。■將50ml JC懸液分散到falcon管中(250，000細(xì)胞/管)。樣品溫育■加入200 μ I樣品，來(lái)自早期妊娠對(duì)照的血清(3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照)或PBS — 2%BSA(陰性對(duì)照)。輕輕混合。■室溫下溫育20 — 30分鐘。■加入 200 μ I 在 PBS_2%BSA 中以 1: 200 稀釋的 MabCD2_Cy5。輕輕混合?！鍪覝叵聹赜?0 - 30分鐘。流式細(xì)胞儀測(cè)定■測(cè)定每個(gè)管子的熒光(488nm激光激發(fā)波長(zhǎng))。■將活的和全部細(xì)胞與全部死細(xì)胞的熒光(參見(jiàn)圖5)與對(duì)照進(jìn)行比較。■按下述方法計(jì)算PIF活性全部細(xì)胞的熒光/%死細(xì)胞X活細(xì)胞的熒光結(jié)果的解釋PIF陰性的活性應(yīng)該在130 - 340之間；PIF陽(yáng)性樣品在陰性參考范圍之外。本文中引用了多篇參考文獻(xiàn)，在此以引用的方式將其全部?jī)?nèi)容包括在本文中。
表I 37名患者血清中流式細(xì)胞術(shù)PIF檢測(cè)的臨床有效性的確認(rèn)
權(quán)利要求
1.一種具有序列 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr 的分離的妝。
2.一種具有序列 Ser-Gln-Ala-Val-Gln-Glu-His-Ala-Ser-Thr-Asn-Met-Gly 的分離 的肽。
3.一種具有序列 Ser-Gly-Ile-Val-Ile-Tyr-Gln-Tyr-Met-Asp-Asp-Arg-Tyr-Val-Gl 廣Ser-Asp-Leu的分離的肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)PIF存在與否的分析方法，以及通過(guò)此方法鑒定出來(lái)的PIF肽。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)PIF的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法。它至少部分地基于如下觀(guān)察結(jié)果利用了熒光標(biāo)記的抗淋巴細(xì)胞和抗血小板的抗體的流式細(xì)胞術(shù)表明，在PIF存在下，玫瑰花結(jié)的形成增加。它還基于如下觀(guān)察結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)表明，在PIF存在下，與CD2結(jié)合的單克隆抗體減少了。本發(fā)明還涉及PIF肽，當(dāng)PIF肽被加入到Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)物中時(shí)，能夠觀(guān)察到它可以或者(i)減少抗CD2抗體與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合；或者(ii)增加Jurkat細(xì)胞中CD2的表達(dá)；或者(iii)減小Jurkat細(xì)胞的可存活性。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了ELISA檢測(cè)方法，可以通過(guò)確定待測(cè)樣品對(duì)抗CD2抗體與CD2底物相結(jié)合的效果而檢測(cè)PIF。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102875646SQ20121030713
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2002年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月2日
發(fā)明者艾坦·巴尼, 魯賓·雷內(nèi)·岡薩雷斯·佩雷斯, 保羅·C·利維斯 申請(qǐng)人:倍奧英賽普特有限責(zé)任公司